Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch bảo quản tảo Spirulina platensis

Đồ án tốt nghiệp 1
MỞ ĐẦU
Trong những năm cuối cùng của thế kỉ 20, các nhà sinh học đã phát hiện ra
các nhóm sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh. Vi tảo (Microalgae) là những
sinh vật bậc thấp có trong sự chú ý đó vì chúng không chỉ có những cơ chế đặc
thù mà còn sinh trưởng và phát triển cực kì nhanh. Hàng năm có 200 tỉ tấn chất
hữu cơ được tạo thành trên toàn thế giới, trong số đó 170- 180 tỉ tấn là do tảo tạo
thành. Vi tảo chiếm 1/3 sinh khối của thực vật trên trái đất.
Cho đến nay hàng loạt các công nghệ nuôi trồng, thu hoạch, chế biến sinh khối
vi tảo, các loại công nghệ này đang không ngừng được hoàn thiện, hạ giá thành
và nâng cao chất lượng sinh khối, mặt khác sử dụng vi tảo đang được mở rộng
trong các lĩnh vực như dùng làm thức ăn bổ dưỡng cho người và thức ăn cho
động vật, đặc biệt là các ngành nuôi trồng thủy sản, nguồn phân bón sinh học,
năng lượng sạch, các hóa chất trong công nghiệp và dược phẩm, xử lý môi
trường.
Tuy ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về loại tảo này nhưng quy mô ứng dụng
còn chưa rộng. Hiện tại ở Đà Nẵng vẫn chưa có cơ sở nào sản xuất sinh khối để
phục vụ cho các ngành thực phẩm và y học, sở dĩ như thế là do thành phần môi
trường nuôi cấy còn sử dụng quá nhiều hóa chất nên môi trường nuôi cấy đắt, do
đó kém kinh tế dẫn đến chi phí đầu tư cao, các điều kiện để nuôi cấy cũng chưa
tốt nhất và phương pháp thu nhận sinh khối tảo chưa được triệt để, hiệu quả chưa
cao. Ngoài ra, cũng chưa có phương pháp bảo quản giống tốt trong một thời gian
dài để chủ động được nguồn giống để giảm chi phí sản xuất cho những đợt sau.
Trước những lý do như thế chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện
nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo
Spirulina platensis”. Nhằm mục đích tìm ra môi trường ít thành phần hóa chất,
rẻ tiền, phương pháp thu hoạch tốt và các phương pháp bảo quản giống trong một
thòi gian dài để chủ động trong quá trình nuôi cấy và mang lại tính kinh tế.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 2
PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về đối tượng thí nghiệm
1.1.1. Vai trò, vị trí của tảo Spirulina trong công nghệ sinh học (CNSH)
Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảng khoa học
về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo ra các công nghệ
khai thác các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực vật và động vật để sản
xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao phục vụ cho
lợi ích, nhu cầu của con người đồng thời phát triển kinh tế- xã hội và bảo vệ môi
trường [30].
Trong tự nhiên vai trò của giới tảo (Algae) nói chung, nhất là tảo biển với vai
trò quang hợp gắn giữ cacbonic đã tạo ra khoảng 500 tỷ tấn chất hữu cơ có thể
sử dụng được (trong đó có nhiều hoạt chất sinh học quý) và thải ra 90% lượng
oxy trong bầu khí quyển cần cho sự hô hấp của người và động vật. Chính điều
này đã kích thích nghề nuôi tảo biển ra đời và đặc biệt xuất hiện Công nghệ sinh
học vi tảo với bộ 3 nổi tiếng là Chlorella, Scenedesmus và Spirulina, chúng có
nhiều giá trị trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm Trong 3
nhóm tảo trên thì Spirulina hiện được chọn để phát triển sản xuất hơn 2 loại kia
do 5 ưu thế sau:
- Hiệu quả kinh tế cao và góp phần bảo vệ, cải thiện môi trường: Spirulina
không những đơn giản trong nhu cầu dưỡng chất mà còn rất hiệu quả trong sử
dụng năng lượng ánh sáng mặt trời, nước (có thể dùng nước biển, nước lợ, nước
mặn, )…, tạo ra 16,8 tấn oxy/năm Điều này giúp bảo vệ môi trường khí
quyển, giảm hiệu ứng nhà kính (green house).
- Giá trị sử dụng đã vượt ra khỏi ranh giới truyền thống là dùng làm thực
phẩm. Theo Thạc sĩ- Dược sĩ Lê Văn Lăng, giảng viên Trường Đại học Y Dược
TpHCM, Spirulina là nguồn dinh dưỡng quý của tự nhiên. Nó có đủ các thành
phần thiết yếu: protein- lipid- glucid cùng khoảng 30 vi lượng và hầu hết các
vitamin cần thiết cho cơ thể, đáp ứng hoàn hảo công thức chuẩn về chế phẩm
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 3

dinh dưỡng- vi lượng khoáng- vitamin do FAO/WHO công bố và là sản phẩm cải
thiện suy dinh dưỡng rất tốt cho trẻ em, người già, người bệnh sau phẫu thuật
Mặt khác, với các hoạt chất: Phycocyanin, Sulfolipid, Spirulan, Betacaroten, các
khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt…) và các vitamin cần thiết, tảo Spirulina còn
có giá trị dược liệu, giúp cơ thể tăng cường miễn dịch, chống lại bệnh tật. Có thể
dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị các bệnh: viêm gan, suy gan, đục thủy
tinh thể, suy giảm thị lực, rụng tóc… Song song đó, tảo Spirulina cũng có tác
dụng trong phòng chống một số bệnh ung thư do các hoạt chất tăng cường miễn
dịch, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào, chống đột biến gen. Năm 1996- 1997, một
nhóm nhà khoa học người Nhật đã phân lập và xác định cấu trúc một hoạt chất
mới trong Spirulina và đặt tên là Spirulan (Ca-Sp). Các thử nghiệm đã chứng tỏ
Ca- Sp có tác dụng kháng virus HIV type 1 và virus Herpes simplex type 1 [31].
- Tham gia vào việc xử lý môi trường: ngoài việc cung cấp dưỡng khí oxy,
Spirulina còn có khả năng gắn giữ mạnh các cation độc như chì, thuỷ ngân,
cadimi, nên chúng có thể dùng để xử lý chất thải lỏng, xử lý nước thải [29].
- Spirulina có thể là đối tượng chuyển tải các tiến bộ khoa học kỹ thuật rất
hiện đại trong công nghệ sinh học:
+ Nuôi định hướng thu các chất có lợi cho dinh dưỡng và trị bệnh cho người
và động vật. Đã có các tiến bộ về nuôi cấy Spirulina gắn Iod (phòng trị bệnh
thiếu vi chất iod), gắn Selen, gắn Germani (chất chống oxy hoá, chống lão hoá,
phòng chống ung thư )v.v Hoặc nuôi với những tiền chất định hướng cho
sinh khối Spirulina giàu acid béo cần thiết, giàu beta-caroten. Sự thành công
trong tương lai phụ thuộc vào việc chọn giống Spirulina và tìm tòi công nghệ
phù hợp, sẽ cho những lô/mẻ sinh khối Spirulina rất có giá trị trong y dược.
+ Spirulina với công nghệ chuyển nạp gen: Chuyển nạp gen là kỹ thuật phân
lập gen từ cơ thể cho (donor) cấy ghép vào bộ máy di truyền của cơ thể nhận
(receiver) nhằm tạo ra tính trạng mới cần thiết từ cơ thể đó. Kỹ thuật tân tiến này
đang được nghiên cứu với Spirulina ở 2 hướng sau:
• Chuyển gen chịu trách nhiệm di truyền tạo phao khí của Spirulina giúp vi
sinh vật nổi trên mặt nước dễ dàng. Ta biết muốn phòng trừ bệnh sốt rét phải diệt

SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 4
muỗi Anopheles stopenis, bệnh sốt xuất huyết phải diệt muỗi Aedes aegypti, bệnh
giun chỉ phải diệt muỗi Culex quinquefasciatus. Một cách hiệu quả cắt đứt vector
truyền bệnh này là diệt ấu trùng (bọ gậy, lăng quăng ) của chúng. Hiện một số
nghiên cứu cho thấy có những vi sinh vật, hoặc vi nấm có thể thực hiện được
điều này. Tuy vậy, việc phải sống trôi nổi trên mặt nước (môi trường ấu trùng các
loại muỗi gây bệnh sinh sống) để diệt ấu trùng muỗi lại là điểm không có hoặc
yếu kém của các vi sinh vật này. Do vậy có thể tách gen di truyền tạo phao khí
nổi trên mặt nước của Spirulina ghép vào vi sinh vật có ích trên, tạo ra những đặc
điểm mong muốn diệt ấu trùng muỗi gây bệnh [1].
• Chuyển nạp gen tạo chất dẻo sinh học cho Spirulina: có thể ghép vào
Spirulina gen tạo chất polyhydroxyl butylat (P.H.B), gen này có ở vi khuẩn
Aleutroplus, để tạo ra giống Spirulina mới có đặc tính phát triển sinh khối nhanh,
đồng thời chứa P.H.B với hàm lượng thích hợp. Trích ly chất P.H.B để sản xuất
nhựa thay thế nhựa dẻo (như polystyrene) và chất dẻo mới này dễ bị phân huỷ
không làm ô nhiễm môi trường v.v [22].
- Spirulina tương đối thích nghi với mọi quy mô sản xuất: có thể thu hoạch từ
tự nhiên hoặc nuôi ở quy mô nhỏ (hộ gia đình, làng xã), trong điều kiện bán tự
nhiên với kỹ thuật đơn giản như nuôi trồng thuỷ sản, và nuôi ở quy mô công
nghiệp [11].
1.1.2. Phân loại học
Mang nhiều tên gọi khác nhau như Spirulina, Arthrospira và là một chủ đề
được thảo luận nhiều từ trước đến nay, nhất là khi cái tên “tảo” được nhắc đến
lần đầu tiên. Năm 1852, việc phân loại học đầu tiên được viết bởi Stizenberger.
Ông đưa ra tên loài mới là Arthrospira dựa vào cấu trúc chứa vách ngăn, đa bào,
dạng xoắn. Gomont đã khẳng định những nghiên cứu của Stizenberger vào năm
1892, đồng thời Gomont bổ sung thêm loài không có vách ngăn là Spirulina và
loài có vách ngăn là Arthrospira. Như vậy, tên được công nhận là Arthrospira,
nhưng trong những hoạt động khảo sát và nghiên cứu Arthrospira được gọi là

Spirulina, do đó tên Spirulina được sử dụng phổ biến cho đến nay thay cho tên
Arthrospira.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 5
1.1.3. Đặc điểm sinh học của Spirulina
Loài Spirulina (Arthrospira) platensis thuộc[2]:
Chi : Spirulina (Arthrospira)
Họ : Oscillatoriceae
Bộ : Oscillatoriales
Lớp : Cyanophyceae
Ngành : Cyanophyta
1.1.3.1. Đặc điểm hình thái
Tên “Spirulina” xuất phát từ tiếng Latinh “helix” hoặc “spiral” biểu hiện hình
dạng xoắn của nó. Spirulina là tảo đa bào, dạng sợi, sống cộng sinh, các tế bào
được phân biệt bởi vách ngăn, dạng sợi xoắn hình lò xo không phân nhánh, số
vòng xoắn lớn nhất là 6- 8 vòng đều nhau. Đường kính xoắn khoảng 35- 50µm,
bước xoắn là 60µm, chiều dài sợi tảo có thể đạt 250µm. Nhiều trường hợp
Spirulina có kích thước lớn hơn. Các vách ngang chia sợi Spirulina thành nhiều
tế bào riêng rẽ liên kết với nhau bằng cầu liên bào. Sợi tảo Spirulina có khả năng
chuyển động và tự vận động theo kiểu trượt quanh trục của sợi [13].
1.1.3.2. Đặc điểm cấu tạo
Tế bào Spirulina có cấu trúc giống với sinh vật Prokaryote thiếu các hạt liên
kết với màng. Thuộc gram âm, thành tế bào nhiều lớp và được bao bọc bởi màng
polysaccharide nhầy. Thành tế bào Spirulina không chứa celulose mà hệ tiêu hóa
con người không phân cắt được. Spirulina có tỷ lệ chuyển hóa quang hợp khoảng
10% so với chỉ 3% của các thực vật sống trên cạn như đậu nành.
Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân chỉ là vùng giàu axit
nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố trong nguyên sinh chất. Thành tế
bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa celulose mà chứa mucopolyme,
pectin và các loại polysacharid khác. Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế

bào và nối với màng quang hợp thylakoid tại một vài điểm. Spirulina không có
lục lạp mà chỉ chứa thylakoid quang hợp nằm rải rác trong nguyên sinh chất.
Màng thylakoid bao quanh các hạt polyphosphat có đường kính 0,5- 1μ thường
nằm ở trung tâm tế bào. Sắc tố quang hợp chính là phycocyanin, bên cạnh đó còn
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Hình 1.1: Tảo Spirullina platensis
Đồ án tốt nghiệp 6
có chlorophyll a. Ngoài ra, tế bào Spirulina không có không bào thực, chỉ có
không bào chứa khí làm chức năng điều chỉnh tỉ trọng tế bào. Không bào khí có
vai trò rất quan trọng trong việc làm cho Spirulina nổi lên mặt nước [10].
Spirullina là một chi tảo thuộc ngành tảo lam, tế bào Spirulina không có ty thể
và mạng lưới nội chất, tuy nhiên tế bào vẫn có ribosome với hệ số lắng 70S và
một số thể vùi như hạt polyphotphat, glycogen, phycocyanin, cacboxysome và
hạt mesosome [10].
Thành tế bào dưới kính hiển vi điện tử hiện lên gồm 4 lớp: từ lớp L
1
đến lớp
L
4
(L
1
, L
2
, L
3
, L
4
). L
1
và L

3
chứa vật liệu dạng sợi. L
2
là một peptidoglycan giống
như ở tế bào vi khuẩn. L
4
được sắp xếp chạy theo chiều dọc của trục sợi
Spirulina [4].
Hình 1.2. cũng cho thấy một vách ngăn đang hình thành, vách ngăn này gồm
ba lớp: L2 kẹp giữa hai L1, có thể hình dung như hình 1.3.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
L
1
L
4
L
3
L
2
Hình 1.2. Lát cắt tế bào Spirulina
platensis
L
1
L
2
L
1
L
4
L

3
L
2
L
1
Màng sinh chất
Hình 1.3. Mô hình sắp xếp vách tế bào Spirulina
platensis
Đồ án tốt nghiệp 7
Lớp L
1
và L
3
có chức năng vận chuyển điện tử, do đó hai lớp L
2
và L
4
tập
trung các điện tử đó. Độ dày của mỗi lớp từ 10-15nm, nên độ dày của toàn bộ
thành tế bào là khoảng 40- 60nm. Các lớp L
1
, L
3
, L
4
có độ dày bằng nhau, lớp L
1
lớn hơn [2].
1.1.3.3. Đặc điểm sinh thái
Spirulina là chi tảo lam phân bố rộng trong đất, nước ngọt, nước lợ, nước mặn

và suối nước nóng. Đây là một trong khoảng 2500 loài cyanophyta cổ nhất, tự
dưỡng đơn giản, có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể, kể cả các đại
phân tử phức tạp để xây dựng tế bào và có khả năng cố định đạm rất cao, chúng
không thể sống hoàn toàn trong tối…
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển tảo Spirulina chịu ảnh hưởng của các
yếu tố môi trường. Những yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, pH và thành phần dinh
dưỡng không chỉ ảnh hưởng đến quang hợp và sản xuất sinh khối tế bào mà còn
ảnh hưởng tới các hoạt động chuyển hóa của tế bào.
a) Ảnh hưởng của ánh sáng
Ánh sáng là nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến quang hợp của các sinh
vật. Do bản chất tiền nhân của Spirulina nên ánh sáng không ảnh hưởng nhiều tới
quá trình phát triển. Tuy nhiên, Spirulina cũng giống như nhiều loài tảo khác có
khả năng quang tự dưỡng và phụ thuộc vào ánh sáng vì đây là nguồn năng lượng
chính [28].
Hầu hết, các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về đáp ứng của Spirulina đối
với ánh sáng là được thực hiện dưới điều kiện phát triển quang tự dưỡng bằng
việc sử dụng môi trường khoáng và bicarbonate như một nguồn carbon. Từ các
nghiên cứu đó cho thấy sự phát triển của Spirulina trở nên bão hòa ở cường độ
ánh sáng 1µmol m
-2
s
-1
khoảng bằng 10- 15% lượng ánh sáng mặt trời ở bước
sóng 400- 700nm, giá trị này tùy thuộc vào điều kiện phát triển và mối tương
quang giữa chlorophyll và sinh khối [28]. Ngoài ra, cường độ chiếu sáng còn ảnh
hưởng đến các hàm lượng các chất bên trong tế bào tảo. Một số nghiên cứu đã
nhận định rằng khi cường độ chiếu sáng tăng thì hàm lượng của acid béo (PUFA)
giảm [26].
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 8

Theo Seshadri & Thomas (1979), sự tác động của ánh sáng tới Spirulina là bởi
hai yếu tố chính đó là thời gian và cường độ chiếu sáng. Quá trình nuôi cấy ngoài
trời thì cường độ ánh sáng tối hảo cho Spirulina trong khoảng 20- 30klux. Về
thực hành nuôi cấy Spirulina thì cường độ ánh sáng tối ưu là 25- 30klux, ở
khoảng này hoạt tính quang hợp cao nhất, cần điều chỉnh đạt được khoảng cường
độ chiếu sáng này trong nuôi cấy [11]. Ngoài ra, cường độ ánh sáng còn phụ
thuộc vào mật độ nuôi cấy của tảo, vì khi cường độ ánh sáng cao mà mật độ tảo
lớn thì mỗi sợi tảo vẫn nhận được cường độ ánh sáng nhỏ. Nhiều loại vi tảo có
cường độ quang hợp bão hoà ở khoảng 33% tổng lượng cường độ ánh sáng. Vì
vậy trong điều kiện ánh sáng có cường độ cao và thời gian chiếu sáng dài, người
ta thấy xuất hiện hiện tượng quang ức chế có thể làm tảo chết hoặc làm giảm
đáng kể năng suất nuôi trồng [1].
Theo Charenkova C.A (1977) thì thời gian chiếu sáng càng dài thì năng suất
tảo Spirulina càng cao. Năng suất tảo đạt cao nhất khi chiếu sáng liên tục. Như
vậy tảo Spirulina không có chu kỳ quang [1].
b) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Trong khi ánh sáng được xem là nhân tố môi trường quan trọng nhất cho
quang hợp của vi sinh vật thì nhiệt độ là nhân tố cơ bản nhất cho sự sống của
sinh vật. Nhiệt độ ảnh hưởng đến tất cả hoạt động sống của vi sinh vật như quá
trình trao đổi chất, thành phần dinh dưỡng cũng như các đặc tính sinh lý khác.
Nhiệt độ môi trường luôn là một trong những yếu tố nhạy cảm ảnh hưởng đến bất
kỳ sinh vật nào. Nhiệt độ môi trường nuôi là yếu tố cần đáp ứng liên tục, vì rất dễ
bị chi phối và tác động bởi điều kiện xung quanh, mức độ và thời gian chiếu
sáng. Do vậy nhiệt độ là một trong những yếu tố thường xuyên được theo dõi
trong công nghệ nuôi trồng vi tảo [28].
Spirulina phát triển ở nhiệt độ khá cao, chúng có khả năng phát triển mạnh ở
khoảng nhiệt độ 32- 40
0
C. Nhiệt độ cực thuận cho nuôi cấy Spirulina là 35-
38

0
C. Ở nhiệt độ dưới 25
0
C Spirulina phát triển rất chậm, ở nhiệt độ trên 38
0
C
tảo này sẽ chết rất nhanh [21]. Tuy vậy, trong tự nhiên người ta phát hiện
Spirulina ở những suối nước nóng đến 69
0
C.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 9
Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa của tảo. Theo một
nghiên cứu đã cho thấy rằng: ở nhiệt độ 35
0
C không ảnh hưởng xấu lên sản xuất
sinh khối nhưng lại ảnh hưởng tích cực lên sản xuất protein, lipid và phenolic.
Nhiều chủng khác nhau sẽ phát triển ở các khoảng nhiệt độ khác nhau [28].
Có một mối liên hệ giữa nhiệt độ và ánh sáng trong quá trình nuôi cấy tảo.
Giống như hai mặt đối lập của một quá trình thống nhất, chúng đều đóng vai trò
quan trọng quyết định đến năng suất và sinh khối của Spirulina. Sinh trưởng của
tảo đạt cao nhất với một cường độ và thời gian chiếu sáng thích hợp, kèm theo nó
là một chế độ nhiệt tương đối ổn định.
c) Ảnh hưởng của pH
pH môi trường là một trong các nhân tố quan trọng trong nuôi cấy Spirulina.
pH tối ưu cho sự phát triển của chi này là kiềm và kiềm cao. Đây là ưu thế lớn
giúp Spirulina ít bị lây nhiễm bởi các tảo khác [14].
Tuy nhiên, pH là yếu tố nội tại luôn luôn thay đổi, không những do chế độ
chiếu sáng, nhiệt độ hàm lượng các chất dinh dưỡng tạo nên mà còn do tác động
ngược lại của chính trạng thái sinh trưởng của quần thể tảo. Khi tảo phát triển

càng mạnh, pH môi trường bị thay đổi và trở thành yếu tố kìm hãm cho sự sinh
trưởng và phát triển. Do đó, pH môi trường quá cao hay quá thấp đều làm chậm
quá trình sinh trưởng của tảo [20].
Theo Trần Văn Tựa và Nguyễn Hữu Thước (1993) thì pH môi trường từ 8,5- 9
là pH tối ưu cho tảo Spirulina sinh trưởng và phát triển. Ở pH này, nguồn cacbon
vô cơ được tảo đồng hóa nhiều nhất. Tuy nhiên ở pH= 10- 11 Spirulina vẫn có
khả năng phát triển nhưng rất chậm. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng mặc dù
Spirulina là loài tảo sống trong môi trường kiềm nhưng giá trị pH > 10,3 là có
hại cho môi trường nuôi cấy [6].
Vì vậy pH được coi là yếu tố chỉ thị, phản ánh các thành phần nuôi dưỡng
cung cấp cho môi trường nuôi dưỡng tảo, chủ yếu là nguồn bicarbonat và khí
CO
2
hoà tan [11].
d) Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 10
Spirulina có thể sống trong môi trường tự nhiên đến các môi trường nhân tạo
hoặc nửa nhân tạo bằng bổ sung các chất khoáng cần thiết vào nguồn nước tự
nhiên: nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng khoan
Thành phần dinh dưỡng bao gồm cả nguyên tố đa lượng (C, N, P, K, S, Mg,
Na, Cl, Ca và Fe) và nguyên tố vi lượng (Zn, Cu, Ni, Co,W). Tất cả điều ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng của tảo. Trong đó, các nguyên tố vi lượng là thành
phần bắt buộc hay tác nhân kích thích hoạt động của nhiều hệ enzyme, có tác
dụng thúc đẩy sinh tổng hợp chlorophyll và làm giảm sự phân hủy chlorophyll
nhờ làm tăng độ bền vững của phức hệ liên kết giữa chlorophyll và protein.
Ngoài ra, nhiều nguyên tố vi lượng còn làm tăng khả năng tổng hợp carotenoid
[14]. Các nguyên tố vi lượng thật sự cần thiết cho quá trình sinh trưởng của tảo,
tuy nhiên hàm lượng của chúng trong nước tự nhiên là rất thấp, có thể không
cung cấp đủ cho nhu cầu sinh trưởng của tảo do đó việc bổ sung vi lượng vào

môi trường nuôi cấy là hết sức cần thiết. Trong nuôi cấy tảo, vi lượng thường
được bổ sung với một lượng rất nhỏ vì khi hàm lượng vượt quá ngưỡng chịu
đựng của vi tảo, chúng có khả năng gây độc cho tế bào [20].
1.1.4. Đặc điểm sinh sản
Spirulina có hai hình thức sinh sản đó là sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô
tính. Hình thức sinh sản sinh dưỡng được thực hiện bằng cách gãy từng khúc của
sợi tảo, khúc gãy gọi là khúc tản. Từ một sợi tảo mẹ, hình thành nên những đoạn
Necridia (gồm các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản). Trong các Necridia hình
thành các đĩa lõm ở hai mặt và sự tách rời tạo các hormogonia bởi sự chia cắt tại
vị trí các đĩa này. Trong sự phát triển, dần dần phần đầu gắn tiêu giảm, 2 đầu
hormogonia trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi. Các
hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản được lập đi lập lại một
cách ngẫu nhiên, tạo nên vòng đời của tảo. Kiểu sinh sản này thường gặp ở các
sợi tảo có dạng chuỗi tế bào xếp nối nhau. Trong thời kì sinh sản tảo Spirulina
nhạt màu ít sắc tố xanh hơn bình thường [5, 13].
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 11
Trong một số điều kiện sống không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo
bào tử giống vi khuẩn, đó là hình thức sinh sản vô tính. Bào tử tảo có chứa nhiều
chất dinh dưỡng ở dạng dự trữ và được bao bọc bởi một lớp dày, khi gặp điều
kiện thuận lợi, chúng sẽ tạo thành sợi mới. Chu kỳ phát triển của tảo Spirulina rất
ngắn, nuôi trong phòng thí nghiệm thì thời gian thế hệ của nó chỉ kéo dài trong
24 giờ, ở điều kiện tự nhiên là khoảng 3- 5 ngày [7].
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng của tảo Spirulina
- Hàm lượng protein trong Spirulina thuộc vào loại cao nhất trong các thực
phẩm hiện nay 60- 70% trọng lượng khô, cao hơn trong thịt bò 3 lần, trong đậu
tương 2 lần. Cứ 1kg tảo xoắn Spirulina chứa 55mg vitamin B1, 40mg vitamin
B2, 3mg vitamin B6, 2mg vitamin B12, 113mg vitamin PP, 190mg vitamin E,
4.000mg caroten trong đó β-Caroten khoảng 1700mg (tăng thêm 1000% so với
cà rốt), 0,5mg acid folic, inosit khoảng 500- 1.000mg. Phần lớn chất béo trong

Spirulina là acid béo không no, trong đó acid linoleic 13.784mg/kg, γ-linoleic
11.980mg/kg. Đây là điều hiếm thấy trong các thực phẩm tự nhiên khác. Hàm
lượng khoáng chất có thể thay đổi theo điều kiện nuôi trồng, thông thường sắt là
580- 646mg/kg (tăng thêm 5.000% so với rau chân vịt), mangan là 23- 25mg/kg,
Magie là 2.915- 3.81mg/kg, selen là 0,4mg/kg, canxi, kali, phospho đều khoảng
là 1.000- 3.000mg/kg hoặc cao hơn (hàm lượng canxi tăng hơn sữa 500%). Hàm
lượng cacbonhydrat khoảng 16,5%, hiện nay đã có những thông tin dùng glucose
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Hình 1.4. Vòng đời của tảo
Spirulina
Đồ án tốt nghiệp 12
chiết xuất từ tảo Spirulina để tiến hành những nghiên cứu chống ung thư [34,
35].
- Tảo Spirulina có chứa phong phú các acid amin cần thiết như lysin,
threonin rất quan trọng cho trẻ đặc biệt là trẻ thiếu sữa mẹ. Hàm lượng khoáng
chất và các nguyên tố vi lượng phong phú có thể phòng tránh bệnh thiếu máu do
thiếu dinh dưỡng một cách hiệu quả và cũng là nguồn bổ sung dinh dưỡng rất tốt
cho trẻ lười ăn [34].
- Trong tảo Spirulina có chứa nhiều loại chất chống lão hóa như β-caroten,
vitamin E, acid γ-linoleic. Những chất này có khả năng loại bỏ các gốc tự do
thông qua tác dụng chống ôxi hóa, làm chậm sự lão hóa của tế bào, đồng thời sắt,
canxi có nhiều trong tảo vừa dễ hấp thụ vừa có tác dụng phòng và hỗ trợ điều trị
các bệnh thường gặp ở người già như thiếu máu, xốp xương [34].
- Có thể dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị bệnh viêm gan, suy gan, bệnh
nhân bị cholesterol máu cao và viêm da lan tỏa, bệnh tiểu đường, loét dạ dày tá
tràng và suy yếu hoặc viêm tụy, bệnh đục thủy tinh thể và suy giảm thị lực, bệnh
rụng tóc. Với liều dùng vừa phải, Spirulina làm cân bằng dinh dưỡng, tổng hợp
các chất nội sinh, tăng hormon và điều hòa sinh lý [34].
- Tảo tiêu diệt được Candida albicans, một loại nấm thường kí sinh trong
đường ruột của nạn nhân AIDS. Hiện nay Spirulina còn được nghiên cứu invitro,

để ngăn chặn sự tấn công của virus HIV. Ngoài ra, tảo Spirulina có những tác
dụng đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu [32, 33, 34].
1.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina trên thế giới
Người ta bắt đầu biết đến tảo Spirulina qua loại thức ăn Tecuitlatl của người
dân Aztec (Mêhicô) và bánh Dihé của bộ tộc Kanembu (Cộng hòa Chad và
Niger). Việc phát hiện và phát triển tảo Spirulina ra khắp thế giới gắn liền với
lịch sử tìm ra châu Mỹ của Christophe Colomb năm 1492. Mãi đến năm 1960,
khi Leonard và Comperé (người Bỉ) phân tích và công bố giá trị dinh dưỡng của
Tecuitlatl và Dihé chứa hàm lượng protein cao thì Spirulina được giới khoa học
quan tâm nhiều hơn. Năm 1963, Giáo sư Clement thuộc Viện nghiên cứu dầu hỏa
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 13
Pháp là người đầu tiên nghiên cứu nuôi tảo Spirulina ở quy mô công nghiệp
thành công. Năm 1967, nghiên cứu này đã được triển khai tại Công ty Sosa
Texcoco ở Mêhicô, Spirulina đã được nuôi trồng ở quy mô lớn trên suối nước
khoáng giàu bicacbonat. Tiếp sau đó, hàng loạt xí nghiệp sản xuất tảo Spirulina
đã xuất hiện ở Mỹ, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc,…[11].
Nhu cầu về các chất có giá trị cao trong tảo Spirulina dùng để làm thuốc và
thực phẩm chức năng ngày càng tăng. Viện Nghiên cứu truyền nhiễm virus,
trường Y khoa Harvard, Earthrise Farms (California) gần đây công bố nghiên
cứu của họ về khả năng ức chế sự nhân lên của virus HIV- 1 trong dòng tế bào T
của nước chiết từ Spirulina. Nếu một người sử dụng 2- 3g tảo Spirulina sẽ giúp
tăng cường sức khỏe và khả năng tự bảo vệ của cơ thể [27]. Tảo lam Spirulina
platensis có thể là chỉ thị tốt nhất cho một vài loại nước thải. Spirulina có khả
năng loại bỏ kim loại nặng cadimi trong nước thải rất tốt, do độ hấp thụ cũng như
hiệu suất hấp thụ kim loại của nó rất cao [29].
Ngoài các hướng nghiên cứu đã được chỉ ra ở trên, hiện nay đã có nhiều công
bố thông báo về khả năng chuyển gen ở tảo Spirulina bằng việc áp dụng công
nghệ gen, kỹ thuật DNA tái tổ hợp đang được thực hiện ở Nhật Bản và một số

nước, nhằm mục đích tạo ra những chủng giống Spirulina có những đặc tính
mong muốn cho định hướng ứng dụng như tăng cường khả năng tổng hợp acid γ-
linolenic hoặc là tạo chất dẻo sinh học dễ phân hủy…[22].
Việc sử dụng tảo Spirulina platensis trong các nghiên cứu về vũ trụ là hướng
có triển vọng. Ý tưởng về vi hệ sinh thái tự cung tự cấp “MELISSA” (Micro
Ecological Life Support System Alternative) cho các chuyến du hành vũ trụ sử
dụng tảo Spirulina platensis để chuyển nước thải, CO
2
, phân, nước tiểu thành
sinh khối tảo dinh dưỡng, H
2
O sạch và O
2
cung cấp lại cho người đang được
NASA (Cơ quan hàng không và vũ trụ Hoa Kỳ) thử nghiệm ở dạng pilot [24].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina ở Việt Nam
Ở Việt Nam, tảo Spirulina được nhập nội từ Pháp năm 1972 và trở thành đối
tượng nghiên cứu sinh lý, sinh hóa, tại Viện Sinh vật học (nay là Viện Công nghệ
sinh học) do cố Giáo sư- TSKH. Nguyễn Hữu Thước chủ trì. Những thí nghiệm
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 14
nghiên cứu về tác động của ánh sáng, nhiệt độ, pH đã cho phép đẩy nhanh quá
trình thích ứng của tảo này ở điều kiện Việt Nam. Các nghiên cứu tác động của
các nguyên tố khoáng lên sinh trưởng và quang hợp của tảo Spirulina là cơ sở
cho việc thiết lập những môi trường dinh dưỡng rẻ tiền, thích hợp cho nuôi trồng
chúng. Chính trên nền môi trường này, Spirulina đã được đưa vào thử nghiệm
nuôi trồng đại trà tại Hà Nội, Bình Thuận, Bến Tre, Thành phố Hồ Chí Minh [7].
Vào đầu thời điểm năm 1980, ở Thuận Hải, hai sản phẩm Spirulina đã được xí
nghiệp dược phẩm TW24 tung ra thị trường dưới tên gọi “Linavina” và
“Lactogyl” để làm thuốc bổ dưỡng. Sinh khối Spirulina cũng được các đơn vị

như bệnh viện Thống Nhất, bệnh viện phụ sản Từ Dũ, bệnh viện tỉnh Thuận Hải,
trung tâm dinh dưỡng trẻ em thành phố Hồ Chí Minh tiến hành thử nghiệm
chống suy dinh dưỡng ở trẻ em và người già [11, 18].
Trong khoảng thời gian 1981- 1985, Phòng Công nghệ Tảo- Viện Công nghệ
sinh học đã hợp tác chặt chẽ với Bộ môn Hóa Công nghệ trường Đại học Bách
khoa Hà Nội và Công ty Công nghiệp tỉnh Thuận Hải (nay là tỉnh Bình Thuận)
để triển khai nuôi trồng Spirulina ở quy mô lớn tại suối nước khoáng Vĩnh Hảo
giàu bicacbonat và các chất khoáng khác, tận dụng gió, ánh sáng, nhiệt độ cao
quanh năm. Ban đầu, Spirulina được nuôi trồng ở quy mô 60 bể (mỗi bể 45m
3
)
với năng suất 8- 10g khô/m
2
/ngày. Cũng trong thời gian này, hàng loạt nghiên
cứu ứng dụng sinh khối Spirulina cho gia cầm, cá, vịt, ong, tằm cũng đã được
thực hiện.
Năm 1994, Nguyễn Thị Đệ đã tiến hành nghiên cứu vai trò và một số tính chất
của phycobiliprotein chính trong tảo Spirulina [3,17].
Năm 1996, Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, Dương Trọng Hiền đã
khẳng định khả năng ứng dụng của phycobleu tách chiết từ Spirulina platensis
cho bệnh nhân ung thư. Phycobleu có tác dụng nâng cao thể trạng cho bệnh nhân
ung thư vùng đầu, cổ trong thời gian chiếu xạ hoặc sau phẫu thuật và loại sản
phẩm này không gây phản ứng phụ nào [15].
Năm 1997, một nhóm nhà nghiên cứu đã thử nghiệm một số đặc điểm sinh lý,
sinh hóa của Spirulina platensis trong điều kiện chịu mặn NaCl và đã kết luận
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 15
rằng hàm lượng chlorophyll và carotenoid có khuynh hướng tăng khi tăng nồng
độ trong môi trường. Như vậy muốn sản xuất nhiều chlorophyll và carotenoid thì
trong môi trường nuôi cấy có thể bổ sung thêm một ít muối NaCl [12]. Năm

2008, Hoàng Sỹ Nam, Đặng Diễm Hồng đã tiến hành nuôi trồng thử nghiệm 2
chủng tảo Spirulina platensis CNT và Spirulina platensis C1 trong các loại nước
khoáng Thạch Thành- Thanh Hóa, Thanh Tân- Thừa Thiên Huế và Thanh Liêm-
Hà Nam đã cho kết quả là cả 3 loại nước khoáng điều có thể sử dụng để nuôi
trồng tảo, trong đó loại nước khoáng ở Thanh Hóa thì cho chi phí nuôi tảo giảm
được một nửa mà chất lượng tảo vẫn đảm bảo để làm thực phẩm cho người và
động vật nuôi [9].
1.3. Các vấn đề trong nuôi tảo Spirulina platensis
Trước tình hình nhu cầu sử dụng tảo Spirulina trong các lĩnh vực khác nhau
ngày càng tăng ở Việt Nam, song lượng sinh khối tảo này sản xuất ra vẫn còn
chưa đáp ứng đủ, do đó việc lựa chọn, tạo đột biến được những chủng giống tảo
Spirulina tốt là điều kiện trước tiên. Ngoài ra, phải tìm được môi trường dinh
dưỡng thích hợp, rẻ tiền để nuôi trồng loài tảo này ở quy mô lớn, phù hợp với
điều kiện khí hậu Việt Nam nhằm không ngừng nâng cao năng suất và chất lượng
sinh khối tảo là điều cần được quan tâm và có ý nghĩa thực tiễn to lớn.
*Spirulina sản xuất ra đường (carbohydrate hoặc saccharide) trong suốt quá
trình chúng quang hợp. Khi nồng độ các chất này trở nên dư thừa trong cơ thể,
chúng sẽ tiết ra môi trường. Vì những chất đường nhầy nên khi sợi tảo trườn lên
sẽ tạo ra khối nhầy và các sợi tảo sẽ không tiếp xúc được với môi trường dinh
dưỡng nên chúng sẽ bị chết vì đói. Chúng ta phải cảnh giác với 3 nguyên nhân
dẫn đến việc sản sinh đường quá mức, đặc biệt khi nhiệt độ cao đe dọa quang
phân giải. Thứ hai là thiếu nitrogen phức hợp trong môi trường vì nitrogen phức
hợp trong tế bào được sử dụng để chuyển hóa polysaccharide thành protein. Khi
chúng không được chuyển hóa thành protein thì chúng sẽ tiết ra môi trường. Và
sự thừa bicarbonate hoặc thiếu sulfur trong môi trường cũng dẫn tới làm sản sinh
đường dư thừa [12].
*Các vi sinh vật nhiễm tạp:
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 16
- Động vật chân chèo (Rotifers) kích thước từ 100- 2mm

Đôi khi một số động vật chân chèo rơi vào trong môi trường và chúng thường
sử dụng tảo làm thức ăn. Vào ban đêm, tảo tiêu thụ oxygen và sản sinh ra CO
2
,
khí này có tác dụng đầu độc động vật. Vì vậy, nên dừng khuấy vào ban đêm và
tảo sẽ sử dụng oxygen hòa tan và do đó động vật thiếu oxygen chúng sẽ bị chết.
Cách khác để hạn chế động vật là sử dụng chúng. Dùng một lưới dài, hình túi
(mắt lưới đường kính 10m) gắn bên trong bể, tại các góc bên phải theo hướng di
chuyển của môi trường nuôi cấy như vậy các động vật này sẽ bị giữ lại trên lưới.
Những động vật này là thức ăn rất tốt cho tôm hoặc cá con [12, 38] .
- Amoeba
Những loài này khác với động vật nguyên sinh ở chỗ chúng ăn tảo. R.R. Kudo
đã mô tả 74 loài amoeba khác nhau. Có một loài trong số chúng gây nguy hiểm
cho người đó là Entamoeba histolytica. Chúng lan truyền bằng các bào tử “hình
trứng”, các bào tử này bị chết trong nước nhiệt độ 45
0
C trong thời gian 1h và ở
nhiệt độ 55
0
C trong ít giây. Nhiệt độ bên trong của thiết bị sấy sử dụng năng
lượng mặt trời dao động từ 50-60
0
C và qúa trình làm khô diễn ra trong suốt 4h, vì
vậy nguy cơ tiềm ẩn từ những sinh vật loại này bị diệt trừ gần như tuyệt đối [12].
- Tảo
Môi trường nuôi cấy còn bị nhiễm các loại tảo khác. Nhưng do nồng độ muối,
pH cao của môi trường, do đó thường trở nên không thuận lợi với đa số các loài
tảo. Ở nồng độ muối đạt 20 g/l hầu như các loài tảo bị tiêu diệt. Tuy nhiên, loài
tảo silic Navicula, tảo xanh lục, và tảo lục Chlorella vẫn sống sót được trong các
bể nuôi Spirulina. Chúng thường sống ở đáy bể và nếu như mật độ của Spirulina

trở nên dày đặc thì ức chế các tảo khác do ánh sáng không xuống được tới đáy.
Trong trường hợp chúng phát triển mạnh thì người ta sẽ dừng khuấy, thu vớt sinh
khối tảo Spirulina trên bề mặt, chuyển chúng sang bể khác, tiếp theo rửa sạch bể
để loại bỏ tảo nhiễm tạp [12, 38].
*Môi trường nuôi cấy sau khi thu hoạch có mùi tanh nồng nếu thải ra môi
trường sẽ bị ô nhiễm vì có tính kiềm mạnh vì vậy cần xử lý trước khi thải ra
ngoài.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 17
1.4. Mật rỉ (hay rỉ đường)
Mật rỉ là sản phẩm cuối cùng của quá trình sản xuất đường mà từ đó đường
không thể kết tinh một cách kinh tế nữa bởi các công nghệ thông thường. Có hai
loại rỉ đường: rỉ đường mía và rỉ đường củ cải. Ở Việt Nam chỉ dùng rỉ đường
mía. So với rỉ đường củ cải thì rỉ đường mía có lượng saccharose thấp hơn nhưng
lượng đường khử cao hơn. Rỉ đường thường chiếm khoảng 3- 5% trọng lượng
của mía ép hay 100 tấn mía sẽ tạo ra 3- 5 tấn rỉ đường. Thành phần của rỉ đường
mía phụ thuộc vào giống mía, thổ nhưỡng, điều kiện canh tác và công nghệ sản
xuất.
Rỉ đường mía thu được khi chế biến đường thô là một hỗn hợp phức tạp có
chứa các đường lên men, các chất hữu cơ, chất có chứa nitơ cũng như các hợp
chất vô cơ. Trong rỉ đường có 15- 20% là nước, 80- 85% chất khô hoà tan. Trong
chất khô có từ 25- 40 % là đường, trong đó saccharose chiếm 30-35%, đường
glucose, fructose chiếm 15- 20%, còn lại những chất không phải là đường hoà
tan trong nước gồm có 30- 32% là các chất hữu cơ như pectin, furfurol, acid hữu
cơ, caramen, các chất màu, acid amin, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và 18-
20% là chất vô cơ có các ion: K
+
, Na
+
, Cl

-
, Ca
2+
, Mg
2+
, SO
3
2-
… [37].
Tuy nhiên, rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp cho quá trình
nuôi cấy. Muốn sử dụng chúng cho quá trình nuôi cấy đòi hỏi phải có các quá
trình xử lý thích hợp. Các đặc điểm cần lưu ý mật rỉ bao gồm:
- Rỉ đường thường có màu sẫm. Màu này khó bị phá huỷ trong quá trình nuôi
cấy. Sau nuôi cấy chúng sẽ bám vào sinh khối sinh vật và bám vào sản phẩm.
Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thường rất tốn kém và rất khó khăn.
Vì vây phải xử lý trước khi tiến hành quá trình nuôi cấy.
- Hàm lượng đường khá cao (thường nằm trong khoảng 40- 50%). Lượng
đường này chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới
nồng độ thích hợp.
- Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình nuôi cấy là hệ keo trong mật
rỉ. Keo càng nhiều thì khả năng hoà tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 18
của oxy càng kém. Do đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng mật rỉ là phải
phá hệ keo này.
- Vì rỉ đường là chất dinh dưỡng khá lý tưởng nên chúng rất dễ bị vi sinh vật
xâm nhập và phát triển. Như vậy chất lượng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo thời
gian bảo quản.
Để giải quyết những đặc điểm không thuận lợi có trong mật rỉ đối với quá
trình lên men, người ta thường sử dụng acid sunfuric đậm đặc với lượng 3,5kg

cho một tấn mật rỉ. Khi cho H
2
SO
4
vào mật rỉ, ta có ba cách thực hiện quá trình
xử lý này :
+ Cách thứ nhất: Khi cho 3,5kg H
2
SO
4
vào một tấn mật rỉ, người ta khuấy đều
ở nhiệt độ thường trong thời gian 24h, sau đó ly tâm thu dịch trong.
+ Cách thứ hai: Khi cho 3,5kg H
2
SO
4
vào một tấn mật rỉ, người ta đun toàn bộ
lên 85
0
C và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch trong.
+ Cách thứ ba: Cho H
2
SO
4
đến khi pH của mật rỉ đạt được giá trị là 4, người ta
đun nóng đến 120- 125
0
C trong một phút để các chất vô cơ kết tủa, sau đó ly tâm
thu dịch trong.
Thực hiện một trong ba cách trên sẽ thu được dịch mật rỉ đã loại thể keo và

màu. Từ mật rỉ đã qua xử lý này đem pha chế thành các loại môi trường có nồng
độ khác nhau Tuy nhiên giá trị của mật rỉ trong quá trình nuôi cấy thu nhận sinh
khối không chỉ do lượng đường saccharose có trong mật rỉ mà còn do các loại
muối khoáng, các chất kích thích sinh trưởng và các thành phần khác quyết định
[15].
1.5. Giới thiệu về hệ thống ánh sáng đèn Led trong nuôi cấy tảo
Vấn đề môi trường đang là thách thức lớn của nhân loại. Việc thải khí CO
2
của
các nhà máy điện sử dụng nhiên liệu hóa thạch được coi là một trong những
nguyên nhân chủ yếu gây hiệu ứng nhà kính làm cho khí hậu nóng dần lên, dẫn
đến hàng loạt những biến đổi khí hậu trên thế giới trong những năm gần đây. Do
vậy, tiết kiệm điện năng là vấn đề của tất cả các quốc gia trên thế giới không
phân biệt là nước giàu hay nghèo. Tiết kiệm điện năng trước hết là sử dụng hợp
lý các thiết bị tiêu thụ điện trong đó có các thiết bị chiếu sáng, tạo ra môi trường
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 19
ánh sáng tiện nghi cho con người mà còn tiết kiệm chi phí cho điện năng tiêu thụ
và các chi phí khác. Nhưng trong hoàn cảnh thiếu hụt điện năng như bây giờ, đèn
Led là lựa chọn số 1, vừa bởi hiệu quả chiếu sáng cao, vừa bởi hiệu quả tiết kiệm
điện [16].
LED là viết tắt của Light-Emitting-Diode có nghĩa là “đi-ốt phát sáng” là một
nguồn sáng phát sáng khi có dòng điện tác động lên nó. Được biết tới từ những
năm đầu của thế kỷ 20, công nghệ LED ngày càng phát triển từ những diode phát
sáng đầu tiên với ánh sáng yếu và đơn sắc đến những nguồn phát sáng đa sắc,
công suất lớn và cho hiệu quả chiếu sáng cao.
Hoạt động của LED dựa trên công nghệ bán dẫn. Trong khối điốt bán dẫn,
electron chuyển từ trạng thái có mức năng lượng cao xuống trạng thái có mức
năng lượng thấp hơn và sự chênh lệch năng lượng này được phát xạ thành những
dạng ánh sáng khác nhau. Màu sắc của LED phát ra phụ thuộc vào hợp chất bán

dẫn và đặc trưng bởi bước sóng của ánh sáng được phát ra.
Một đặc điểm của đèn LED là ít tiêu hao năng lượng và không nóng. Bóng
đèn truyền thống, đèn neon, đèn halogen đều cần từ 110- 220V mới cháy được,
trong khi đèn LED trắng chỉ cần từ 3- 24V để phát sáng. Nhiệt độ làm việc của
bóng đèn LED cao hơn nhiệt độ môi trường khoảng 5- 8
0
C, thấp hơn so với đèn
huỳnh quang thông thường là khoảng 13- 25
0
C. Đèn LED có hiệu suất sáng cao
hơn, do đó tiết kiệm khoảng 75% điện năng so với các đèn chiếu sáng thông
thường. LED còn có tính chất sáng nhanh, tắt nhanh nên khi nhiệt chưa tạo ra thì
đã ngắt dòng điện, cho nên nhiệt độ tỏa ra không nhiều (nhiệt là nguyên nhân
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Hình 1.5: Đèn Led và hệ thống đèn Led xanh dùng trong nuôi tảo
Đồ án tốt nghiệp 20
chính làm giảm tuổi thọ cho các thiết bị chiếu sáng). Đèn LED có tuổi thọ rất cao
vượt qua 50.000 giờ (tương đương với 6 năm thắp sáng liên tục). Chất lượng ánh
sáng thân thiện, không tia cực tím, không bức xạ tia hồng ngoại, phát nhiệt của
ánh sáng thấp, không chứa thủy ngân và những chất có hại… không nhấp nháy,
không gây nhức mỏi mắt [36].
Do ít tiêu hao năng lượng nên đèn LED có thể sử dụng ở vùng sâu vùng xa mà
không cần nhà máy phát điện công suất cao. Đèn LED trắng có thể sử dụng với
pin mặt trời và gần đây nhất với pin nhiên liệu chạy bằng hỗn hợp nước và rượu.
Đèn pin dùng LED trắng có thể sử dụng dễ dàng khi bị mất điện, vì chỉ cần vài
cục pin vẫn có thể thắp sáng được đèn.
Hiện nay đèn Led được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang
sinh học như là sự tổng hợp chlorophyll ( Tripathy và Brown, 1995), quang hợp
(Tennessen và cộng sự, 1994) và phát sinh hình thái ( Hoenecke và cộng sự,
1992; Robin và cộng sự, 1994) [16].

Một vài loại cây trồng được báo cáo là đã trồng thành công dưới hệ thống Led
như: cây tiêu, dưa, lúa mỳ, bó xôi ( Bula và cộng sự, 1991; Hoenecke, 1992;
Brown và Schuerger, 1994; Yanagi và Okamoto, 1994), những cây khoai tây
nuôi cấy trong ống nghiệm ( Miyashita và cộng sự, 1995) [16].
Từ 1996 đến 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã ứng dụng thành công hệ
thống phát sáng Led trên một số loại cây trồng như dâu tây, bạch đàn, hồ điệp,
lan, cúc…Những cây trồng nuôi cấy dưới hệ thống đèn Led không những sinh
trưởng phát triển tốt ở điều kiện invitro mà còn cả ở điều kiện exvitro. Những
nghiên cứu về giải phẫu học, quang hợp cũng chứng minh rằng những cây nuôi
cấy dưới hệ thống đèn Led thì tốt hơn khi so sánh với hệ thống chiếu sáng bằng
đèn neon.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 21
PHẦN II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài
2.1.1. Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học khu A trường
Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.
2.1.2. Thời gian tiến hành đề tài: Từ 11/03/2012- 01/06/2012
2.2. Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm, hóa chất
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Giống tảo Spirulina platensis được bảo quản tại phòng thí nghiệm công nghệ
sinh học- khoa Hóa- trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng ngày 21/05/2011.
- Giống tảo Spirulina platensis được mua tảo mua ở Phòng công nghệ Tảo
viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào 15/03/2012. Giống ở dạng dung dịch
được đựng trong chai nhựa.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị phục vụ thí nghiệm
- Các dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, lọ penicilline, chai thủy tinh
500ml, bình tam giác, bể nuôi, que cấy trang, que cấy vòng, đèn cồn, đầu típ,
micropipet, ống eppendof… tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học- Khoa

Hóa- Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng.
- Thiết bị, máy móc thuộc phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.
2.2.3. Hóa chất
2.2.3.1. Môi trường Zarrouk [10]
Bảng 2.1. Thành phần hóa chất để pha 1 lít môi trường Zarrouk:
Bảng 2.2. Thành
phần vi lượng A
5
:
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
STT Thành phần Khối lượng (g/l)
1 K
2
HPO
4
0,50
2 NaNO
3
2,50
3 K
2
SO
4
1,00
4 NaCl 1,00
5 MgSO
4
.7H
2

O 0,20
6 CaCl
2
.2H
2
O 0,04
7 FeSO
4
.7H
2
O 0,01
8 EDTA 0,08
9 NaHCO
3
16,8
10 Vi lượng A
5
1ml
Đồ án tốt nghiệp 22
2.2.3.2. Môi trường rỉ đường [1]
Rỉ đường có nhiều ưu điểm để tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật vì sau khi
qua xử lý màu và hệ keo, bắt đầu tiến hành pha môi trường nuôi cấy Spirulina
plantensis.
Bảng 2.3. Thành phần môi trường rỉ đường
STT Thành phần Đơn vị tính Lượng
1 Rỉ đường ml/lít 0,75; 1; 1,5
2 NaHCO
3
g/lít 16,8
2.2.3.3. Các hóa chất chuyên dùng khác: Như các hóa chất để tách chiết

chlorophyll, protein, bảo quản giống của tảo Spirulina như: cloroform, methanol,
glycerol
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp hoạt hóa giống được bảo quản trong Glycerol và đông
khô tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học
Chuẩn bị môi trường Zarrouk theo bảng 2.1 và bảng 2.2 phân phối vào bốn
ống nghiệm đã thanh trùng, cấy giống tảo được bảo quản (21/05/2011) trong
Glycerol và đông khô (được bảo quản trong tủ lạnh đông sâu hiệu Sanyo ở
-21
0
C). Tiến hành hoạt hóa giống ở máy nuôi cấy lắc hiệu Model Grant GLS400
với điều kiện lắc 150 vòng/phút ở 35
0
C trong 24h và 48h.
2.3.2. Quan sát hình dạng giống tảo hoạt hóa và giống tảo mua ở Phòng
công nghệ Tảo viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
STT Thành phần Số lượng mg/100ml
1 H
3
BO
3
286
2 MnSO
4
.7H
2
O 250
3 ZnSO
4

.7H
2
O 22,2
4 CuSO
4
.5H
2
O 7,9
5 Na
2
MoO
4
.2H
2
O 2,1
Đồ án tốt nghiệp 23
Các mẫu tảo sau thời gian hoạt hóa được đem đi quan sát hình thái dưới KHV
quang học hiệu Model Olympus CH2 ở các vật kính 10x và vật kính 40x. Sau đó
chụp ảnh lại và mô tả đặc điểm hình thái.
2.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy
Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm bốn
nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được tiến hành nuôi trong 3 bình serum và tiến
hành lặp lại 3 lần.
Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự tăng
sinh tảo Spirulina. Cấy 30% tảo giống Spirulina vào 250ml môi trường trong
bình serum loại 500ml nuôi trong các điều kiện môi trường khác nhau bao gồm:
môi trường 1: môi trường cơ bản (Zarrouk), môi trường 2: môi trường 0,75ml rỉ
đường + 16,8g NaHCO
3
, môi trường 3: 1ml rỉ đường + 16,8g NaHCO

3,
môi
trường 4: 1,5ml rỉ đường + 16,8g NaHCO
3
.
Các điều kiện nuôi cấy được giữ ổn định: nhiệt độ phòng nuôi: 34- 37
0
C, pH =
8- 11, thể tích môi trường nuôi cấy 300ml, chiếu sáng liên tục 24/24. Môi trường
nuôi cấy và dụng cụ nuôi được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 1atm trong 30
phút. Tiến hành đo OD bằng máy đo quang hiệu Pharmacia Biotech Ultrospec
2000 để xác định tốc độ sinh trưởng của tảo trong các môi trường khác nhau.
2.3.4. Khảo sát các loại ánh sáng ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển
của tảo
Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm hai
nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được tiến hành nuôi trong 3 bình serum và tiến
hành lặp lại 3 lần.
Khảo sát ảnh hưởng của các loại ánh sáng nuôi cấy khác nhau lên sự sinh
trưởng và phát triển của tảo Spirulina platensis. Cấy 30% tảo giống vào 300 ml
môi trường trong bình serum loại 500ml nuôi trong các điều kiện khác nhau bao
gồm: ánh sáng đèn huỳnh quang và ánh sáng đèn Led.
Các điều kiện nuôi cấy được giữ ổn định: nhiệt độ phòng nuôi: 34- 37
0
C, pH =
8- 11, thể tích môi trường nuôi cấy 300ml, chiếu sáng liên tục 24/24. Môi trường
nuôi cấy và dụng cụ nuôi được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 1atm trong 30
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 24
phút. Tiến hành đo OD máy đo quang hiệu Pharmacia Biotech Ultrospec 2000 để
xác định tốc độ sinh trưởng của tảo trong các môi trường và trong điều kiện ánh

sáng khác nhau.
2.3.5. Khảo sát các phương pháp thu hoạch tảo Spirulina platensis
2.3.5.1. Thu hoạch bằng phương pháp lọc thủ công
Dựa vào lực hút của trọng lực ta tiến hành thu hoạch tảo bằng cách lọc thủ
công
Cách tiến hành: Lấy dịch chứa sinh khối cho chảy qua lưới lọc, thu phần sinh
khối trên lưới lọc. Dịch sau lọc có thể tái sử dụng để nuôi lại tảo. Vật liệu lọc ở
đây có thể dùng là vải nhiều lớp hoặc giấy lọc.
2.3.5.2. Thu hoạch bằng phương pháp lọc có bơm chân không
Do khi lọc bằng vải nhiều lớp thì do khoảng cách của các sợi vải lớn nên tảo
vẫn lọt qua được nên hiệu quả thu hoạch không được cao, còn khi lọc bằng giấy
lọc thì hầu như tảo được giữ lại toàn bộ trên giấy lọc nhưng thời gian lọc quá lâu.
Để giảm thời gian lọc ta có thể dùng lọc bằng máy lọc hút chân không.
Cách tiến hành: Đặt giấy lọc phía trên phễu của bình tam giác có nối với hệ
thống bơm chân không, cho dịch sinh khối chảy qua giấy lọc. Dưới tác dụng của
trọng lực và lực hút của bơm chân không nên tốc độ lọc rất nhanh.
2.3.5.2. Thu hoạch bằng chất keo tụ và tuyển nổi
Tiến hành thử nghiệm thu hoạch với chất keo tụ Al
3+
. Ta bổ sung lần lượt
80g/l Al
2
(SO
4
)
3
, AlCl
3
vào mẫu AR
K

và AR
H
, để yên trong 24h sau đó cho sục
khí vào để tảo nổi lên thành cụm và vớt ra ngoài.
2.3.5.3. Thu hoạch bằng phương pháp tự kết tủa
Vì tảo tiêu thụ CO
2
nên độ pH tăng lên dần dẫn tới việc kết tủa của hydroxyt
magie (Mg(OH)
2
) và carbonatcanxi (CaCO
3
) sẽ kéo theo tảo lắng xuống. Dựa
trên cơ sở này ta tiến hành thu hoạch tảo bằng phương pháp tự kết tủa.
2.3.5.4. Thu hoạch bằng phương pháp siêu âm
Nguyên tắc: Dựa vào tác động cộng hưởng của sóng siêu âm làm vỡ các
không bào khí của tảo và kéo theo tảo lắng xuống. Từ tỉ lệ tế bào lắng ta biết
được hiệu quả của phương pháp [5].
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long
Đồ án tốt nghiệp 25
a) Mẫu nuôi kín không sục khí
Cách tiến hành:
Lắc đều mẫu trước khi cho vào bình tam giác với các mức thể tích 50 và
100ml. Ứng với mỗi mức thể tích tiến hành xử lý siêu âm ở máy siêu âm hiệu
Elmasonic S300H lần lượt ở các khoảng thời gian từ 5- 10 phút. Sau khi thí
nghiệm xong để lắng mẫu từ 3- 4 giờ, sau đó hút phần dịch trên và cố định bằng
lugol trung tính để đếm số lượng tảo còn lại sau khi xử lý siêu âm. Thao tác được
tiến hành nhanh chóng và nhẹ nhàng tránh làm động lớp tảo lắng dưới đáy bình.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Tiến hành thí nghiệm tương tự nhưng để yên mẫu trong 3 ngày sau đó mới hút

mẫu ra để kiểm tra xem có sự thay đổi số lượng do sự phục hồi không bào khí
hay không.
b) Mẫu nuôi hở có sục khí
Tiến hành thí nghiệm tương tự như trên.
c) Định lượng tảo trước và sau khi siêu âm
Đếm số lượng tảo trước và sau khi siêu âm, từ đó biết được tảo lắng do tác
động của siêu âm. Từ số lượng tảo lắng ta đánh giá được hiệu quả thu hoạch tảo
bằng sóng siêu âm. Tiến hành định lượng theo phụ lục 1.
2.3.6. Phương pháp đánh giá chất lượng tảo nuôi
2.3.6.1. Định lượng chlorophyll [2]
a) Nguyên tắc:
Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng của các loại sắc tố ở những bước sóng
nhất định để xác định hàm lượng của chúng có trong mẫu sau khi chiết bằng
dung môi thích hợp.
b) Cách tiến hành:
Lấy 10ml mẫu đem lọc, thu phần trên giấy lọc cho vào ống 20ml có vạch chia
thể tích và thêm 5- 15ml methanol. Đồng hóa mẫu với tốc độ 2500 vòng/phút,
trong 5-10 phút bằng máy Voltex hiệu MS1 Minishaker IKA. Sau khi đồng hóa
để ở nhiệt độ phòng trong 10- 20 phút. Tiếp theo, đem dịch chiết ly tâm ở tốc độ
8000- 10000 vòng/phút, trong 5- 7 phút bằng máy ly tâm hiệu Model Rotanta
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức Long