ĐỀ CƯƠNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1
ĐỀ CƯƠNG HOÀN CHỈNH
ĐỀ CƯƠNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
K55CNSHA
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
(cả nhà không tập chung chương này nhé)
Câu 1: Công nghệ tế bào động vật là gì? Hãy cho biết nền tảng khoa học và kỹ
thuật của công nghệ tế bào động vật? Trình bày genomic và bộ gen người?
- Công nghệ Sinh học trên người và động vật (CNSHTN&ĐV) là những kỹ thuật
CNSH tiến hành hoặc ứng dụng trên người và động vật. Ở nước ta, CNSH trên người
chưa thực sự phát triển thành một lĩnh vực độc lập, nên thường được gọi chung là
Công nghệ Sinh học Động vật (CNSH ĐV).
- Nền tảng khoa học và kỹ thuật:
 Genomic và bộ gen người
 Kỹ thuật tế bào động vật in vitro
 Công nghệ Nano và micro
 Cytomics
 Proteomics
 Genomic và bộ gen người
 Genomics là lĩnh vực nghiên cứu về thành phần, tổ chức, chức năng và tiến hóa của
thông tin di truyền chứa trong bộ gen
 Ba lĩnh vực chính của genomics: hệ gen cấu trúc (structure genomics), hệ gen chức
năng (functional genomics), hệ gen so sánh (comparative genomics).
 Hệ gen cấu trúc (structure genomics)
o là khái niệm để chỉ thành phần và cấu trúc một bộ gen. Để tìm hiểu, xác định cấu trúc
gen trong bộ gen, cần lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lí của chúng.
o Bản đồ di truyền (genetic map), hay bản đồ liên kết (linking map) là sự biểu thị vị trí
tương đối của các gen có quan hệ với nhau. Trong đó, ít nhất có vài gen đã biết
trước chính xác vị trí của chúng trên nhiễm sắc thể (NST). Bản đồ di truyền được
thiết lập dựa trên chức năng di truyền thông qua các thí nghiệm tái tổ hợp.
o Bản đồ vật lí (physical map) được thiết lập dựa trên sự phân tích trực tiếp DNA và

khoảng cách giữa các gen được đo theo thông số cặp base, Kilobase hay Megabase
(bp, Kb, Mb). Bản đồ vật lý sẽ cung cấp thông tin về vị trí các gen, các DNA marker
và sự phân mảnh của NST. Thông tin này giúp định vị và lắp đặt các mảnh DNA sau
khi được giải trình tự vào trong bộ gen, sao cho đúng vị trí của chúng.
2
o Để lập bản đồ vật lý, bộ gen của sinh vật được cắt thành những mảnh nhỏ
o Bản đồ vật lý có độ phân giải cao hơn bản đồ di truyền, độ chính xác cao hơn.
o Nhiều kỹ thuật hiện đại giúp bản đồ vật lý:
- Bản đồ dựa trên các vị trí cắt giới hạn.
- Bản đồ dựa trên các điểm đánh dấu trình tự (Sequence tagged site – STS).
- Bản đồ dựa trên các phương pháp lai tại chỗ, có gắn chất huỳnh quang
-(Flourescent in situhydridization – FISH).
- Giải trình tự DNA.
o Hệ gen chức năng (Functional genomics)
o chỉ định các gen, nhận diện và tổ chức các gen này và quan trọng nhất là chỉ ra được
chức năng của chúng
o Mục đích chính của hệ gen chức năng bao gồm cả việc chỉ định tất cả các phân tử
RNA phiên mã từ genome và tất cả các protein được mã hóa từ trong bộ gen
o có thể sử dụng các công cụ tin sinh học như:
- Dự đoán chức năng gen từ trình tự gen

-Phương pháp dò tìm chức năng theo hướng đồng dạng
-Phương pháp dò tìm chức năng dựa trên sự so sánh vùng chủ đạo
-Phương pháp dò tìm chức năng gen dựa trên chất biểu hiện phát sinh chủng loài
(phylogenetic profile method)
-Phương pháp Rossetta Stone
-hương pháp hàng xóm gen (gene neighbor method)
-kỹ thuật microarray
-Xét nghiệm đột biến
o Hệ gen so sánh (comperative genomics)

o cung cấp thông tin về thành phần và tổ chức của hệ gen, không chỉ của các loài khác
nhau mà có thể của những thành viên của cùng một loài => suy luận về chức năng của
gen và sự tiến hóa của genome
o Ở mức độ DNA, người và các sinh vật khác có rất ít khác biệt. Đến nay, người ta đã
hoàn thành việc lập bản đồ bộ gen của các sinh vật mô hình bao gồm tinh tinh, chuột,
ruồi giấm, giun tròn, nấm men, E.coli… và gần đây là chuột túi (2/2005). Các sinh vật
này được sử dụng để so sánh, tìm hiểu bộ gen người.
 Chiến lược giải trình tự bộ gen người
o kỹ thuật ‘’shotgun” là kỹ thuật xác định trình tự gen bằng cách chia nhỏ đoạn gen, xác
định trình tự sau đó sẽ được lắp ghép lại
o Shotgun theo cấp bậc (HS) : Trong chiến lược này, bộ gen được làm vỡ thành một
nhóm các clone trung bình như các NST nhân tạo vi khuẩn. Trình tự của mỗi BAC
được xác định bằng giải trình tự shotgun, và trình tự của bộ gen được tạo ra bằng cách
nối các trình tự BAC. Chiến lược HS cung cấp một con đường chắc chắn cho sản xuất
trình tự chính xác
3
o Shotgun cả bộ gen (WGS: Trong chiến lược này, bộ gen được làm vỡ thành những
trình tự read ngẫu nhiên riêng lẻ, sau đó chúng được kết hợp lại thành bộ gen hoàn
chỉnh. Chiến lược WGS tránh được các công việc chuẩn bị ban đầu, nhưng cũng có
nhiều bất lợi như có nguy cơ cao việc kết hợp nhầm
 Ứng dụng và triển vọng
- Thuốc phân tử (Molecular medicine)
- Các nguồn năng lượng và các ứng dụng môi trường
- Đánh giá rủi ro
- Sinh khảo cổ, nhân loại học, tiến hóa và sự di cư người
- DNA pháp y (DNA forensic)
- Nông nghiệp, sinh sản vật nuôi và chế biến sinh học
Câu 2: Trình bày những hiểu biết của bạn về PROTEOMICS? CYTOMICS,
CÔNG NGHỆ NANO VÀ MICRO
 Khái niệm: Proteomics là khoa học nghiên cứu proteome. Proteome là toàn

bộ các protein được biểu hiện bởi cả genome. Chính vì một số gen mã hóa cho
nhiều protein khác nhau, nên kích thước của proteome thường lớn hơn so với số
lượng gen.
 Các công cụ của proteomics:
 Công cụ đầu tiên của proteomics là dữ liệu: Các dữ liệu protein, EST (expressed
sequence tag) và trình tự bộ gen được thu thập tạo ra mục lục các protein được biểu
hiện trong sinh vật
 Công cụ thứ hai là khối phổ (Mass spectrometry – MS:
- Cung cấp sự đo lường chính xác khối lượng phân tử của một protein nguyên vẹn
như 100 kDa hay hơn
- Cung cấp sự đo khối lượng chính xác các peptide từ quá trình protolytic
- Cung cấp các trình tự của peptide từ quá trình thủy giải
 Công cụ thứ ba là các phần thu gom: Kết hợp các dữ liệu MS với các trình tự protein
đặc biệt có sẵn trong cơ sở dữ liệu. Các phần mềm này sẽ lấy các dữ liệu MS không
được giải thích rõ ràng và kết hợp nó với những trình tự ở cơ sở dữ liệu protein, hay
EST và trình tự bộ gen với các thuật toán đặc biệt
 Công cụ cần thiết thứ tư là kỹ thuật phân tách protein: Sự phân tách các protein làm
đơn giản các hỗn hợp protein thành các protein đơn lẻ hay các nhóm nhỏ và chúng
cho phép phát hiện các khác biệt trong các mức độ protein so sánh giữa hai mẫu
 Các ứng dụng của proteomics
4
 Khai Thác: Là một áp dụng đơn giản của việc xác định tất cả (hay một lượng lớn) các
protein trong một mẫu. Mấu chốt của mining là sắp xếp proteome trực tiếp hơn là suy
luận thành phần của proteome từ các cơ sở dữ liệu biểu hiện gen
 Ghi nhận sự biểu hiện đặc biệt: Là sự xác định các protein trong một mẫu đặc biệt,
cũng như chức năng của một trạng thái đặc biệt của tế bào hay cơ thể hay chức năng
của sự tiếp xúc với thuốc, các kích thích hóa lí. Sự ghi nhận biểu hiện là một dạng đặc
biệt của khai thác được áp dụng phổ biến
 Lập các sơ đồ mạng lưới protein: Là một chiến lược proteomics để xác định, làm thế
nào các protein tương tác với nhau trong các hệ thống sống. Hầu hết các protein biểu

hiện những chức năng của nó trong sự kết hợp gần gũi với các protein khác
 Lập bản đồ các biến đổi protein: Là vấn đề xác định làm thế nào và ở đâu các protein
bị biến đổi. Nhiều biến đổi sau dịch mã điều khiển mục tiêu, cấu trúc, chức năng và sự
lưu thông đổi mới của các protein
 CYTOMICS: nghiên cứu các quá trình sinh hóa, nhằm kết hợp các cơ chế ở
mức thấp hơn vào các quá trình ở mức tế bào và cuối cùng là cơ thể. Các phản ứng
nối chọn lọc hóa học được thiết kế để chỉ biến đổi một thành phần giữa tất cả các
thành phần và vai trò của chúng trong các quá trình ở mức tế bào.
 CÔNG NGHỆ NANO VÀ MICRO:
 Công nghệ nano liên quan đến khả năng sắp xếp các phân tử và các nguyên tử thành
các cấu trúc phân tử. Nó có tác động chính lên máy tính, các vật liệu và sự sản xuất
các công cụ, thiết bị, khả năng can thiệp vào các cấp độ điều trị bệnh.
 Các kỹ thuật thiết kế máy micro đang phát triển nhanh chóng và có nhiều ứng dụng
trong các vi dòng (microfluidic), trong các sensor, sợi quang học…
 Ứng dụng microrobot và các nanorobot trong cơ thể người là điều cần thiết, nhằm
phát triển các hoạt động có mục tiêu của thiết bị, như tách bỏ vật chướng ngại (cục
máu đông), tạo các cấu trúc giàn (scaffold), đo các chỉ tiêu tế bào…
 Sự ra đời của biochip là một tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học nano, chúng
chứa đựng một phạm vi rộng các vấn đề nghiên cứu như genomics, proteomics, sinh
học máy tính và dược học, cũng như một số hoạt động khác
• Kỹ thuật tế bào động vật IN VITRO
 Nuôi cấy các tế bào động vật lượng lớn là nền tảng của sản xuất vaccine virus và
nhiều sản phẩm công nghệ sinh học khác. Các chất sinh học được sản xuất bằng kỹ
thuật DNA tái tổ hợp trong nuôi cấy tế bào động vật như enzyme, hormone, các kháng
thể đơn dòng, interleukin… hay nhân tố kháng ung thư.
5
 Tuy mới phát triển, nhưng các tế bào gốc (stem cell) đã hứa hẹn nhiều ứng dụng to
lớn trong y sinh học.
Câu 3: Cho biết các thành tựu điển hình của công nghệ tế bào động vật? Nêu các
kỹ thuật hỗ trợ sinh sản?

• Các thành tựu điển hình của công nghệ tế bào động vật:
 Hỗ trợ sinh sản
 Động vật biến đổi gen
 Công nghệ tế bào gốc
 Chẩn đoán bệnh
 Liệu pháp gen
 Vật liệu y – sinh
• Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản:
 kỹ thuật IVF (in vitro fertilization):
 Thụ tinh trong ống nghiệm trên người được tiến hành từ năm 1961 nhưng mãi đến
năm 1978 mới có em bé đầu tiên ra đời (bé Louise Brown). Năm 1982, Brackett và
cộng sự (cs), đã nuôi và sử dụng tế bào trứng chín in vitro (của bò). Từ đó, công nghệ
này phát triển vượt bậc.
 Thụ tinh trong ống nghiệm thường kết hợp với kỹ thuật chuyển phôi vào tử cung hay
cấy truyền hợp tử. Để tăng hiệu quả, người ta còn thử nghiệm kỹ thuật chuyển giao tử
vào vòi trứng hay cấy chuyển phôi vào vòi trứng của động vật mang
 kỹ thuật ICSI((Intracytoplasmic sperm injection))
 là kỹ thuật bơm tinh trùng vào trứng với sự hỗ trợ của những thiết bị hiện đại. Tuy
mới ra đời (1993) nhưng ICSI đã cho thấy hiệu quả trong việc điều trị vô sinh, đặc
biệt là vô sinh do khả năng sống và hoạt động của tinh trùng kém. kỹ thuật này đã
thành công ở thỏ, bò, ngựa, chó, heo, ngựa vằn… ICSI điều trị vô sinh trên người
cũng đã thu được những kết quả tốt.
 Tuy nhiên, kỹ thuật ICSI cũng có thể ẩn chứa nhiều nguy cơ:
-Sự lan truyền những bệnh di truyền tiềm ẩn, bởi vô sinh nam thường do sự bất
thường về NST hay những bất thường khác về mặt di truyền.
- Sự không nhất quán chất lượng, thiếu chuẩn hóa tự nhiên của tinh trùng.
- Tiến trình sinh học của sự thụ tinh không hoàn chỉnh.
- Có khả năng sai lệch trong sự biểu hiện gen. Trường hợp này thường xảy ra khi sử
dụng tinh trùng chưa trưởng thành.
 kỹ thuật ROSI (Round spermatid injection – tiêm những tinh trùng hình

tròn)
 đang mở ra hy vọng mới cho những trường hợp nam không thể sản xuất tinh trùng.
Đây là những tế bào hình thành trong quá trình sinh tinh, mang bộ NST đơn bội,
nhưng không có khả năng kích hoạt trứng ở giai đoạn giảm phân II.
 Chuyển phôi (hay cấy chuyền) là quá trình đưa phôi vào cá thể cái nhận.
6
 Chuyển phôi thường kết hợp với một số kỹ thuật hỗ trợ khác như thụ tinh trong ống
nghiệm, cắt phôi, đông lạnh… được ứng dụng để nhân nhanh các động vật nuôi, đặc
biệt là bò
 Điều khiển giới tính phôi là xác định giới tính thông qua phôi có thể được
thực hiện qua việc chọn lọc giới tính tinh trùng, hoặc xác định trực tiếp giới tính
của phôi. Xác định giới tính tinh trùng dựa vào tính tích điện hay khối lượng riêng
của tinh trùng mang NST X hay Y, hoặc dựa vào kiểu hình khác biệt giữa tinh
trùng mang NST X và Y. Máy flow cytometer cho hiệu quả chọn lọc giới tính rất
cao. Phương pháp miễn dịch cũng được ứng dụng thông qua việc xác định
 thể Barr hay phân tích NST tế bào phôi. Các phương pháp di truyền có thể
xác định giới tính phôi ở giai đoạn sớm 12-14 ngày tuổi.
 Tạo dòng (cloning) là tạo ra một bản copy của một cá thể nào đó
 Cừu Dolly là động vật có vú đầu tiên được nhân dòng từ tế bào 2n trưởng thành
 Năm 2004, một con chuột được tạo dòng bằng cách sử dụng bằng cách dùng nhân của
tế bào thần kinh khứu giác
 Có thể tạo dòng các động vật bằng hai phương pháp: cắt phôi hay chuyển nhân. Tuy
nhiên, khi đề cập đến tạo dòng vô tính, người ta thường nghĩ đến việc nhân bản
(cloning), đó là việc chuyển nhân (2n) của tế bào sinh dưỡng.
 Ngày nay, với sự hoàn thiện của kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật, dựa trên nguyên lý
của tạo dòng bằng cắt phôi, kỹ thuật tạo dòng phôi (embryo cloning) được ra đời.
Trong những phương pháp này, phôi ở giai đoạn sớm (morula chẳng hạn, hay sớm
hơn) được tách ra thành từng tế bào và nuôi cấy riêng lẻ, sau một thời gian chúng sẽ
có khả năng tạo ra một phôi mới hoàn chỉn
 Trong chuyển nhân các tế bào phôi, tế bào cho nhân được thu nhận từ giai đoạn

blastocyst. Từ tế bào phôi ở giai đoạn này đã thể hiện một số gen nền (paternal gene)
vốn không có ở nhân của tế bào trứng trưởng thành. Trong chuyển nhân tế bào sinh
dưỡng, người ta cũng đã tiến hành thu nhận nhân tế bào của bất kì cơ quan nào để
chuyển sang tế bào trứng đã loại nhân trước đó
 Những rủi ro có thể xảy ra ở những động vật tạo dòng vô tính bằng nhân tế bào
trưởng thành bao gồm:
1. Sai sót xảy ra trong quá trình thao tác khi mà gen và tế bào tái thiết lập chương
trình (reprogramming)
2. Lỗi trong quá trình sao chép
3. Sự không phù hợp trong điều hòa hoạt động giữa DNA ti thể của tế bào nhận và
DNA nhân của tế bào cho
4. Sự ngắn dần của các telomere
5. Sự đột biến có thể xảy ra trong quá trình tiến hành thao tác
6. Sự bất hoạt NST
 Tuy nhiên, chưa có bằng chứng cụ thể nào cho thấy sản phẩm từ động vật tạo dòng vô
tính bằng nhân tế bào sinh dưỡng cũng như từ con cái chúng là không an toàn
 kỹ thuật IVM (in vitro maturation – nuôi chín trong ống nghiệm):
7
 nhằm thu nhận và làm chín các tế bào sinh dục. Việc này có ý nghĩa lớn đối với các
bệnh nhi được điều trị bằng những tác nhân có khả năng gây đột biến di truyền.
 Nguồn tế bào sinh dục thu từ mẫu mô thường được sử dụng để tiến hành ICSI, nhờ
đó, những người này khi trưởng thành vẫn có thể có con bình thường.

Câu 4: Hãy cho biết quy trình tạo động vật chuyển gen?
(1) Gen có chức năng nào đó được lựa chọn và phân lập trong phòng thí nghiệm
(2) Một con vật cho được gây siêu bài noãn và thu hoạch phôi từ ống dẫn trứng
(3) Gen được đưa vào trứng được thụ tinh bằng kỹ thuật vi tiêm
(4) Phôi chuyển gen được đưa vào con vật nhận mà có thể cho ra đời con non có gen
đã chuyển
(5) Kiểm tra con non đối với gen mới chuyển, lai tạo để tạo con non có tính ổn định di

truyền về tính trạng mới
- Tuy nhiên những ứng dụng này tiềm ẩn nhiều rủi ro, đáng lo ngại cho người sử dụng
- Nguy cơ lớn nhất là việc xuất hiện nhiều virus gây bệnh do sự tái tổ hợp giữa trình
tự của vector chuyển gen với các virus nội sinh.
- Những ứng dụng của dị ghép có thể sẽ cứu sống được nhiều bệnh nhân.
- Hiện tại động vật duy nhất được dùng để thu nhận mô cấy ghép là heo.
Việc cấy ghép bao gồm nhiều kỹ thuật phức tạp: cấy nhưng tế bào đơn
ghép mô hay cấy ghép cả cơ quan trọn vẹn…
- Dị ghép có thể đưa đến những rủi ro lớn cho người nhận mô ghép:
- Các tác nhân gây ngoại nhiễm và retrovirus nội sinh, về nguyên tắc, chúng có thể
truyền nhiễm từ cơ thể này sang cơ thể khác, hay qua sinh sản
- Các tác nhân trên đều có thể vô hiệu bằng biện pháp ngăn chặn thích hợp (tiêm
chủng, chọn lọc loại bỏ…) mặc dù rất khó khăn, vì chúng tồn tại số lượng lớn, đa
dạng, trong khi chuẩn đoán hiệu quả chưa đủ cơ sở
Nảy sinh nhiều tranh cãi về tính an toàn của người tiêu dùng và môi trường: Liệu có
thể loại bỏ hết toàn bộ hoạt tính của của các sản phẩm chuyển gen bằng những hình
thức chế biến thông thường như nấu chín …? Nguy cơ gây di ứng đối với người tiêu
dùng, Độc tố của sản phẩm đối với sức khỏe người tiêu dùng, Rủi ro về môi trường
của thủy sinh vật chuyển gen….
Câu 5: Tế bào gốc là gì? Những mặt thuận lợi và khó khăn của tế bào gốc?
- Khái nhiệm: Tế bào gốc (stem cell) là những tế bào có khả năng trẻ hóa lâu dài và
có thể hoạt hóa thành các loại tế bào chức năng khác…
- Ứng dụng của tế bào gốc có thể theo các hướng:
8
1. Thay thế mô hoặc cơ quan
2. Sửa chữa những tế bào đã bị hỏng
3. Phương tiện (vector) cho những liệu pháp di truyền
4. Phương tiện (vector) cho những tác nhân liệu pháp hóa học
- Thuận lợi:
 Khả năng bị thải loại thấp

 Kết hợp hoàn toàn
 Các tế bào gốc có thể biệt hóa thành tế bào cơ tim, tế bào thần kinh, tế bào cơ… khi
nuôi trong môi trường dinh dưỡng thấp
- Khó khăn:
 Chỉ 25% trứng được nhân dòng trở thành phôi
 Khoảng 5% trong số đó phát triển thành dòng tế bào
 Chi phí điều trị bằng liệu pháp này cao
- Những câu hỏi đặt ra khi hướng đến liệu pháp tế bào gốc
 Có chắc chắn rằng những tế bào gốc phôi nuôi cấy in vitro sẽ cho ra tất cả các loại tế
bào của một cơ thể trưởng thành hay không?
 Có chắc chắn rằng những tế bào gốc phôi khi nuôi cấy in vitro sẽ có chức năng giống
như chúng phát triển bình thường trong phôi hay không?
 Có chắc là khi đem nuôi cấy in vitro những tế bào gốc phôi, chúng sẽ không bị đột
biến? Khó khăn vẫn là vấn đề đạo lý và pháp luật.
Câu 6: Trình bày ứng dụng của công nghệ tế bào động vật trong chẩn đoán
bệnh?
- Chẩn đoán bệnh là những kỹ thuật tiên lượng khả năng mắc bệnh, hay nguyên
nhân mắc bệnh do nhưng tác nhân khác nhau gây ra.
- Chẩn đoán bệnh được chia thành ba phương pháp: chẩn đoán trực tiếp, chẩn đoán
gián tiếp và phương pháp huyết thanh.
Chẩn đoán trực tiếp dựa vào đặc điểm khác biệt, đặc trưng của từng tác nhân gây
bệnh để nhận diện chúng.
Chẩn đoán gián tiếp thường sử dụng là nuôi cấy tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus,
nấm, kí sinh trùng)
- Sự tiến bộ của y sinh học đã giúp việc chẩn đoán phân tử thể hiện được nhiều lợi
thế (độ nhảy cao, nhanh, chẩn đoán được những bệnh mà trước kia không thể tiến
hành như các bệnh di truyền ung thư…).
- Sự ra đời của AND chip, Cellchip, Tissuechip, Biosensor… cho thấy lợi ích to lớn
của chuẩn đoán phân tử . Tuy nhiên chúng còn những giới hạn nhất định, đặc biệt
9

là những vấn đề đạo lý, khi chuẩn đoán bệnh di truyền ở thai nhi hay chuẩn đoán
tiền thai
Câu 7 : Trình bày ứng dụng của công nghệ tế bào động vật trong liệu pháp gen?
- Một đột biến gen sẽ làm thay đổi hoạt động của enzyme, tạo ra hoặc tích trữ một
chất độc nào đó, hoặc thiếu thành phần thiết yếu cho hoạt động của tế bào.
- Chẳng hạn, có một đột biến xảy ra trong gen sẽ mã hóa cho enzyme
phenylalanine dehydroxylase, khiếm khuyết này đã làm amino acid
phenyalalanine không thể biến đổi thành tirosine. Hậu quả là ảnh hưởng lên mô
thần kinh.
- Bởi sự phức tạp trong biểu hiện sinh lí của những gen đột biến, cho nên việc điều
trị bệnh luôn phải được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau
 Loại bệnh mà hậu quả gây nên các khiếm khuyết trong cơ chế chuyển hóa,
thì việc ăn kiêng với cơ chất của enzyme là cần thiết
 Liệu pháp thay thế thường được sử dụng các bệnh suy giảm miễn dịch
trầm trọng hemophilia, bệnh Gaucher. Cấy nghép tủy xương, hay cơ quan
thường được ứng dụng hoặc thay thế cho các mô đã bị tổn thương
 Chữa trị thông qua việc thay thế những gen hỏng bằng gen lành.
- Khó khăn của liệu pháp gen:
o Gen liệu pháp tồn tại trong thời gian ngắn
o Sự đáp ứng miễn dịch cơ thể nhận gen
o Rủi ro từ các vector virus
o Khiếm khuyết đa gen (gây việc khó khăn điều trị bằng liệu pháp gen)
o Liệu pháp gen còn được sử dụng điều trị một số bệnh nan y khác
Câu 8 : Trình bày ứng dụng của công nghệ tế bào động vật trong vật liệu- y sinh?
- vật liệu sinh học (Bio-material) có thể có nguồn gốc tổng hợp nhân tạo, hay tự
nhiên, chúng có khả năng thay thế bộ phận cơ thể sống về cấu trúc, đồng thời đảm
nhiệm chức năng (hay một phần chức năng) của bộ phận ấy và nhất thiết phải
tương thích sinh học với cơ thể.
- Những tiến bộ trong y học và điều trị bệnh bằng kháng sinh đã làm giảm thiểu
nguy cơ truyền nhiễm, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc chế tạo vật liệu

thay thế. Nhiều khớp nối và bộ phận thiết yếu của cơ thể có thể bị bào mòn và phải
được thay thế giúp con người duy trì một cuộc sống tốt hơn.
- Vật liệu sinh học ngày càng đóng vai trò thiết yếu trong việc thay thế và cải thiện
chức năng của mọi hệ thống chính trong cơ thể (hệ xương, hệ tuần hoàn …)
- Những hoạt chất sinh học nhân tạo đã được dùng trong phẫu thuật tim mạch vào
năm 1952
10
- Sau đó là những bước cải tiến để tái cấu trúc mảnh ghép, tăng tính tương hợp sinh
học cho mảnh mô được cấy
- Để tái cấu trúc những động mạch lớn như động mạch chủ, động mạch chậu, người
ta sử dụng nhưng mạch ghép tổng hợp từ ePTFE hoặc Dacron
- Trong suốt những thập niên 90, những vật liệu và các bộ phận nhân tạo đã phát
triển đến mức có thể thay thế nhiều bộ phận con người. Mảnh ghép thành công
đầu tiên là đĩa xương, dùng ổn định vị trí xương gẫy, đẩy nhanh quá trình lành
hóa.
- Sau đó là những thử nghiệm về kỹ thuật vật liệu và công nghệ phẫu thuật thay thế
mạch máu. Van tim và khớp háng được phát triển vào thập niên 60 của thế kỉ
trước. Ngay khi có mảnh ghép đĩa xương, người ta phát hiện chúng bị mất chức
năng nhanh chóng do sự ăn mòn hóa học và sự thiếu tính tương hợp sinh học.
Thiết kế, thu nhận vật liệu và sự tương hợp sinh học.
- Ngoài các vật liệu có chức năng vật lý, thời gian gần đây, CNSH cũng đã phát
triển hàng loạt vật liệu có tính chất sinh hóa, đó là các màng sống có cố định thuốc
và tế bào, nhằm ứng dụng trị liệu hoặc phát triển công nghệ tế bào động vật…
CHƯƠNG 2: TỔ CHỨC PHÒNG THÍ NGHIỆM
Câu 1. Thiết kế PTN
 Phòng thí nghiệm nên được thiết kế với các nguyên liệu chất lượng tốt, phù hợp,
đảm bảo an toàn và hoạt động hiệu quả.
 Khi thiết kế phòng thí nghiệm , các khu thao tác khác nhau phải được tách rời, đặc
biệt là khu nhận mẫu. Nếu các thao tác không thể hiết kế cách biệt nhau thì tất cả
các thao tác ở khu vực này phải tuyệt đối vô trùng.

 Các bề mặt làm việc và nền nhà, bề mặt cần nhẵn bóng, dễ dàng lau chùi giữa các
lần thao tác. Phải có kế hoạch và kĩ thuật tốt để giảm thiểu rủi ro nhiễm xảy ra.
 Các bề mặt tiếp xúc nên được thiết kế bằng vật liệu không hoặc ít thấm nước, chịu
được hóa chất như kiềm, acid, chất tẩy tại khu vực sử dụng cho việc bảo quản
các mẫu trong nito lỏng, nền nhà phải chịu được sự gây nứt vỡ nếu nito chảy ra.
 Phòng thí nghiệm phải được bảo trì, kiểm tra chất lượng định kì bởi các nhà bảo
hành hay các chuyên gia. Phòng được vô trùng định kì bằng UV hay tác nhân
khác.
11
Câu 2. Một số thiết bị trong PTN
Thiết bị thiết yếu:
Buồng thao tác an toàn vsv
 Buồng thao tác an toàn vi sinh vật là loại thiết bị phổ biến và quan trọng nhất trong
các thiết bị sử dụng, nhằm tạo không gian vô trùng. Sản phẩm được bảo vệ thông
qua hệ thống màng lọc HEPA
 Các buồng thao tác có thể thông ra bên ngoài không khí, hay tuần hoàn qua màng
lọc HEPA thứ hai trước khi chuyển vào không khí.
 Mức độ nhiễm phụ thuộc vào các lớp buồng khác nhau và chất lượng màng lọc.
 Buồn thao tác nên được kiểm tra định kì 6 tháng một lần, kiểm tra lại dòng khí và
phin lọc HEPA
 Kiểm tra mức độ vô trùng bên trong không gian buồng cấy bằng cách đặt môi
trường agar TSB trong ít nhất 4h. Buồng thao tác tốt sẽ không xuất hiện nhiễm vi
khuẩn trên đĩa chứa môi trường/
Tủ ấm
 Là thiết bị tạo ra yếu tố lí hóa cần thiết để kết hợp một cách hữu cơ với thành phần
của môi trường nuôi tế bào và cần được kiểm soát nghiêm ngặt. tủ nuôi thường
được cài đặt nhiệt độ 28-37
0
C, 5-10%CO2.
 CO2 và O2 nên được kiểm tra định kì để đảm bảo duy trì nồng độ khí mong muốn

trong tủ nuôi. Nhiệt độ tủ ấm nên được kiểm tra với NAMAS hay nhiệt kế thích
hợp.
Thiết bị nên có
Máy li tâm, kính hiển vi quang học, kính hiển vi đảo ngược, thiết bị kiểm tra nhiệt độ,
máy lắc, máy vortex, máy khuấy từ, máy đếm khuẩn lạc, hệ thống ghi nhận hình ảnh
Câu 3: Quan hệ giữa tế bào và giá thể nuôi.
 Sự khác biệt giữa nuôi cấy in vitro và in vivo đó chính là giá thể để tế bào phát
triển.
 Tế bào có thể bám và biệt hóa chức năng nhờ ECM ( chất nền ngoại bào).
 ECM là các thành phần cơ bản trong liên kết mô có ở các cơ quan sống ( collagen,
lamimin và fibronectin )
12
 EMC được sử dụng trên bề mặt các dụng cụ nuôi cấy để tăng cường khả năng bám
dính cúa tế bào
 Một số tế bào cần bám dính vào giá thể để phát triển.
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Câu hỏi
Câu 1: Nêu đặc điểm của tế bào động vật? Phân tích những ảnh hưởng của các đặc điểm
đó tới quá trình nuôi cấy tế bào động vật?
Câu 2: Nêu các cấp độ nuôi cấy mô và tế bào động vật?
Câu 3: Phân tích mối quan hệ giữa tế bào và giá thể nuôi? (TRÙNG CÂU 3 CHƯƠNG 2)
Câu 4: Phân tích điều kiện lí-hóa trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào?
Câu 5: Trình bày các thành phần môi trường cơ bản và vai trò trong nuôi cấy tế bào động
vật?
Câu 6: Phân tích vai trò của huyết thanh trong môi trường nuôi cấy tế bào động vật?
Câu 7: Nuôi cấy sơ cấp là gì? Nêu tóm tắt quy trình nuôi cấy sơ cấp?
Câu 8: Nêu một số enzym và cơ chế cắt của chúng trong tách tế bào sử dụng cho nuôi cấy
tế bào động vật?
13
(BỔ SUNG PP TÁCH CƠ HỌC VÀ CÁC PP TÁCH KHÁC)

Câu 9: Tóm tắt quy trình trypsin ấm là trypsin lạnh được sử dụng để tách tế bào trong
nuôi cấy tế bào động vật?
Câu 10: Nêu quy trình nuôi cấy tế bào sơ cấp? Nên lưu ý những vấn đề gì?
Câu 11: Tại sao phải tiến hành cấy chuyền? Nêu các thao tác cấy chuyền?
Câu 12: Dòng tế bào là gì? Nêu các kỹ thuật chọn tạo dòng tế bào?
Câu 13: Trình bày vai trò và quy trình xây dựng đường cong tăng trưởng?
Câu 14: Những đặc tính nào vật liệu scaffold đảm bảo được điều kiện trong kỹ thuật nuôi
cấy 3D? Nêu một số loại vật liệu scaffold?
Câu 15: Phân tích các hạn chế của phương pháp nuôi cấy 2D?
Câu 16: Trình bày phương pháp chế tạo scaffold truyền thống? Phân tích các hạn chế của
scaffold kỹ nghệ mô?
Câu 17: Trình bày ứng dụng SFF trong kỹ nghệ mô?
Câu 18: Trình bày một số ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3D?
Câu 19: Trình bày hệ thống nuôi cấy tế bào động vật sử dụng spinner flask?
Câu 20: Trình bày và phân tích các hình thức nuôi cấy? (KHÔNG RÕ Ý LẮM)
Câu 21: Nêu các ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật?
(Mấy câu này trùng chương 4 của 2 Trang làm, lớp mình tự quyết định học theo cái
nào nhá, tại t thấy ai làm cũng tốt )
BỔ SUNG
Câu 22: Nêu quá trình nuôi cấy không huyết thanh
- Bên cạnh những tác động tốt như đã nêu huyết thanh cũng có những điểm không tố. Nuôi
cấy tế bào với môi trường bổ sung huyết thanh chi phí cao,nhất là huyết thanh bò
14
(FBS).Trong thực tế ,có thể tạo ra môi trường tối ưu cho sự phát triển tế bào mà không
cần bổ sung huyết thanh.Một số tế bào nuôi cấy invivo không ( hoặc kém) phát triển
trong huyết thanh,chúng thích ứng với các môi trường cục bộ chuyên biệt,có tính chất
khác biệt rõ rệt với huyết thanh
Nhiều chất trong huyết thanh (vitamin C, cá lipoprotein …) thường không ổn định khi đông lạnh
hay bảo quản lâu.Môi trường bổ sung huyết thanh sẽ có nồng độ hoocmone hay các nhân tố tăng
trưởng không thích hợp với sự phát triển của một số tế bào.

Các tế bào nội mô thanh mạch phát triển trong môi trường tương tự như huyết thanh,nhưng
không hoàn toàn giống huyết thanh.Do vậy ,chúng có khả năng chịu đựng nồng độ huyết thanh
cao hơn tế bào khác.Tuy nhiên,đối với nhiều loại tế bào,huyết thanh không pha loãng sẽ độc,do
đó nên pha loãng 5-10 lần để giảm độc tính
Khi mất nồng độ hoocmone thích hợp,huyết thanh cũng có thể chứa cơ chất ức chế sự phát
triển,biệt hóa hay chức năng.Huyết thanh cũng kích thích sự biệt hóa của các tế bào vào trạng
thái không nguyên phân,làm chúng không thể duy trì dòng tế bào bất tử (Levi và cs ,1997).Để
phát triển tế bào trong môi trường không huyết thanh ,có nhiều cách tiếp cận,tất cả các chiến
lược nạy đều nhằm kết hợp sự thay đổi liên tục với nhiều việc làm giàu các thành phần dinh
dưỡng trong môi trường nuôi.
(1) Tạo sự thích nghi của các tế bào với môi trường không huyết thanh và không bổ sung
hoocmone nào (Evans và cs,1956)
(2) Sử dụng huyết thanh đã được làm giảm ( hay loại bỏ hoàn toàn) các lớp hoocmone không
cần thiết (Nishkawwa và cs,1975)
(3) Bổ sung thường xuyên và môi trương không huyết các nhân tố tăng trưởng, bám dính và
các nhân tố phù hợp khác (Barnes và Sato,1980)
Câu 1: Nêu đặc điểm của tế bào động vật?Phân tích những ảnh hưởng của các đặc
điểm đó tới quá trình nuôi cấy tế bào động vật?
Trả lời:
(1) Tính cơ học yếu
- Tế bào động vật không có vách, kích thước lớn (khoảng 10 μm) => tính bền cơ
học yếu
- Tế bào động vật invitro rất dễ vỡ do khuấy trộn, thao tác, ly tâm không quá
100rmp
15
- => thời gian thao tác cần ngắn, bảo quản di chuyển nhẹ nhàng
(2) Tăng trưởng và phân chia chậm
- Chu kỳ tế bào trong điệu kiện sinh lý 20-40 giờ
- Hiệu suất sản sinh các chất có hoạt tính sinh học của tế bào thấp và chậm
- => cần thời gian dài và khối lượng tế bào lớn để sản xuất các chất có hoạt tính

từ tế bào động vật
(3) Cơ chế kìm hãm ngược (negative feeb-back)
- Cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường của một chất nào đó là
sự gia tăng nồng độ của chất này trong môi trường
- Thay môi trường là cần thiết
- Trong ptn, cơ chế ức chế ngược còn gây tổn thương thế bào, thậm chí làm chết
hàng loạt
(4) Tính chất cần giá đỡ
- Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế
bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia
- Tế bào ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên bề mặt giá thể
- Tuy nhiên, một số dòng ung thư, dòng tế bào liên tục từ mô bình thường sau
khi được thuần hóa, có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng.
(5) Thay đổi kiểu gen và kiểu hình
- Do quá trình dung hợp hai tế bào có nhân khác nhau-> tế bào lai.
- Hoặc quá trình biến nạp: ví dụ: tế bào bình thường mang đặc tính của tế bào
ung thư thông qua quá trình biến nạp bởi một virus cảm ứng hoặc hóa chất
(6) Có thể bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu
- Các dòng tế bào có thể được bảo quản đông lạnh sâu trong nito lỏng (-196
o
C)
trong nhiều năm
- Khi được giải đông và hoạt hóa, tế bào khôi phục khả năng tăng trưởng và
phân chia như ban đầu
(7) Các đặc tính khác
- Kém thích nghi với môi trường
- Nhạy cảm với ion kim loại
- Cần hormone, huyết thanh, để tăng trưởng và phân chia
Câu 2: Nêu các cấp độ nuôi cấy mô và tế bào động vật?
• Nuôi cấy cơ quan

- KT nuôi cấy cơ quan được phát triển từ các phương pháp nuôi cấy mô nhằm phục
vụ nghiên cứu.
- Những mảnh của một cơ quan hay cả cơ quan được nuôi cấy in vitro, vấn đề chính
là duy trì cấu trúc của mô và hướng nó phát triển bình thường.
16
- Môi trường nuôi cấy cơ quan được chế tạo cùng cách với môi trường nuôi mô,
gồm môi trường rắn và lỏng
- Nuôi cấy cơ quan thu nhận từ phôi thai dễ dàng hơn các cơ quan từ cơ thể trưởng
thành. Do đó để nuôi được cơ quan từ cơ thể trưởng thành phải sử dụng môi
trưởng với các thiết bị đặc biệt
• Nuôi cấy mô
- Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp được tiến hành bằng cách đặt các mảnh mô lên trên
bề mặt rắn bằng nhựa, thủy tinh bao phủ các chất dinh dưỡng dạng lỏng.
- Trong điều kiện thích hợp, các mảnh mô sẽ bám vào bề mặt rắn, các tế bào ở phần
rìa của mảnh mô tăng sinh làm nới rộng mảnh mô
Thuận lợi của nuôi cấy mô
- Có thể kiểm soát môi trường: yếu tố lí hóa như nhiệt độ, pH, CO2, O2, áp suất
thẩm thấu có thể được kiểm soát tốt. hầu hết các loại môi trường cần bổ sung
huyết thanh có giá thành cao và chứa các yếu tố không xác định như hoarmone và
các thành phần điều hòa khác. Tuy nhiên dần dần chức năng của protein này đã
được hiểu và thay thế bởi những thành phần xác định
- Tính đồng nhất của mẫu: sau vài thế hệ nuôi cấy in vitro, các dòng tế bào trở nên
đồng nhất. ở mỗi lần cấy truyền, mỗi lần nhân lên, mẫu sẽ nhân lên, đặc tính của
dòng được duy trì qua nhiều thế hệ
- Kinh tế: những tế bào nuôi cấy có thể tiếp xúc trực tiếp với một chất ở nồng độ
thấp và xác định, chất này có thể xâm nhập trực tiếp vào tế bào
Khó khăn của nuôi cấy mô
- Sự thành thạo của người thao tác: KT nuôi cấy mô TB dv cần được thực hiện trong
điều kiện vô trùng tuyệt đối. Hơn nữa TBDV đa bào không thể tồn tại ở dạng cô
lập, không sống được nếu không được cung cấp một môi trường hợp. Do đó cần

một mức độ kĩ năng và hiểu biết của người thực hiện để đánh giá đúng những yêu
cầu của hệ thống và phán đoán những khó khăn nảy sinh
- Số lượng: tiêu hao nhiều công sức + tiền bạc nhưng thu được lượng nhỏ. Giá
thành nuôi cấy cao nên chỉ sử dụng khi thật cần thiết
- Sự không ổn định: do sau một time phân chia liên tục tạo thành các TB với bộ
NST đa bội không hoàn chỉnh. Ngay cả với nuôi cấy trong time ngắn, mặc dù các
TB có thể ổn định vê mặt di truyền, nhưng sự không đồng nhất về tốc độ tăng
trưởng của từng tế bào có thể tạo ra sự thay đổi từ thế hệ này snag thế hệ khác
• Nuôi cấy tế bào
17
 Nuôi cấy sơ cấp: phương pháp sử dụng các tế bào sau khi được tách từ các mảnh
mô và trước lần cấy chuyền đầu tiên. Quy trình: thu nhận các mảnh sinh phẩm, các
mảnh mô sống xử lí sơ bộ để loại vi khuẩn, nấm, các thành phần không mong
muốn tách để tạo huyền phù tế bào đơn trước khi nuôi cấy
 Nuôi cấy thứ cấp: tiến hành sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi sơ cấp.
 Nuôi cấy huyền phù: thường được tiến hành với các tế bào thu nhận từ máu. Đây
là phương pháp nuôi cấy trong không gian 3 chiều với kĩ thuật nhân sinh khối
bằng fermenter, thông qua hệ thống bioreacter nhằm thu nhận một lượng lớn tế
bào mong muốn.
 Nuôi cấy lớp đơn: ứng dụng với những dòng tế bào khác thu nhận từ các mô
rắn( phổi, thận, cơ, xương, mỡ) cần nuôi phát triển thành lớp đone. Các dòng tế
bào bám dính có thể được phân loại như tế bào nội mô, tế bào biểu mô, mô thần
kinh
Câu 3: Phân tích mối quan hệ giữa tế bào và giá thể nuôi?(TRÙNG CÂU CHƯƠNG 2)
- Sự khác biệt rõ ràng giữa môi trường in vitro và in vivo là bề mặt để tế bào
sống bám vào, và hình dạng mà tế bào đó thể hiện trên bề mặt của giá thể.
- Tế bào sống có thể bám, phát triển và biệt hóa chức năng trong nuôi cấy, nhờ
những phát hiện cho biết các thành phần làm nên chất nền ngoại bào (extra
cellualr matrix-ECM).
- ECM là hành phần màng cơ bản trong liên kết mô, có ở tất cả các cơ quan

sống ( thường là collagen, lamimin, fibronectin, ) => làm tăng sự bám dính
của tế bào nuôi cấy.
- Huyết thanh cũng chứa các nhân tố bám dính ở dạng hòa tan như fibronectin
=> HT góp phần làm tế bào nhanh chóng bám vào bề mặt nuôi.
Đặc điểm bám dính của tế bào trong nuôi cấy
- Hầu hết các tế bào động vật đều bám vào một cấu trúc trong mô liên kết, màng
cơ bản hay chất nền khoáng (như xương)
- Một số tế bào phát triển in vivo nhưng không thể phát triển in vitro, nếu không
có thể bám vào đĩa nuôi (hay các tế bào khác) chúng sẽ chết
18
- Các tế bào khối u hoặc bị biến đổi in vitro thường mất nhu cầu bám dính, có
thể phát triển trong môi trường huyền phù. Ngoài ra một số loại tế bào
lymphocyte không bám dính và giá thể
- Nếu tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy, chúng sẽ có hình dài, trải rộng trên
bề mặt đáy hộp nuôi, ngược lại, nếu không bám dính, tế bào sẽ có hình khối
cầu đều.
Câu 4: Phân tích điều kiện lí-hóa trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào?
1. Nhiệt độ
• Hầu hết các tế bào của Homo sapiens được nuôi cấy ở 37
o
C, nhiệt độ tối ưu cho sự
phát triển của đa số các dòng thế bào thu nhật từ người và động vật có vú.
• Nhiệt độ không cao quá 2
o
C so với nhiệt độ tối ưu, > 40
o
C tế bào chết rất nhanh
• Tuy nhiên tế bào có thể chịu được nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ phát triển tối ưu: tế
bào sống được vài ngày ở 4
o

C, bảo quan lạnh sâu ở -196
o
C trong thời gian dài
• Một số tế bào có thể phát triển ở nhiệt độ thấp hơn: tế bào biểu mô, da, tinh trùng
• Nhìn chung dựa vào nhiệt độ của cơ thể để điều chỉnh nhiệt độ nuôi cấy phù hợp
với mẫu mô của từ cơ quan và loài động vật khác nhau.
• Để duy trì nhiệt độ nuôi cấy, sử dụng tủ ấm.
2. pH
• MT quá acid hoặc base sẽ làm giảm sự phát triển của các tế bào
• pH duy trì cân bằng ion thích hợp, chức năng tối ưu của các enzyme nội bào, sự
gắn kết của các hormone và nhân tố tăng trưởng lên các receptor bề mặt
• Sự thay đổi pH có thể làm thay đổi chuyến hóa tế bào, dẫn tới sự cảm ứng sản xuất
protein shock nhiệt => chết tế bào => kiểm tra pH là cần thiết để tối ưu điệu kiện
nuôi cấy
• pH 7.0-7.4 (tb =7.2). Các tế bào fibroblast thích hợp với pH cao hơn (7.4-7.7). pH
tối ưu cho tế bào nuôi cấy còn phụ thuộc vào loài.
3. Áp suất thẩm thấu
• ASTT của môi trường được xác định bởi công thức môi trường. Muối và glucose
là hai tác nhân chính.
• Thay đổi ASTT của tế bào luôn tác động lên sự tăng trưởng và chức năng tế bào.
Tế bào phát triển trong khoảng 290-310mOsm.
• Sự chênh lệch ASTT bên trong và ngoài tế bào có thể gây nên hiện tương ưu
trương và nhược trương gây biến dạng tế bào.
19
• Có thể điều chỉnh ASTT bằng cách thêm NaCl ( 1ml NaCl 5m/lít MT làm tăng
ASTT lên 10 mM)
• Các thành phần MT: ion, amino acid, đóng gớp vào tạo ASTT
4. Các loại khí
• Ba loại khí quan tâm là: CO
2

, O
2
, N
2
với tỉ lệ nhất định
• Để có phân áp oxy (pO
2
) trong tủ nuôi đạt 18% (tương đương pO
2
của mô sống) tỉ
lệ O
2
trong tủ phải chiếm 90-95%, được tạo ra bởi một kiểu tủ ấm CO
2
đặc biệt với
hệ thống trộn không khí CO
2
, N
2.
• Tất cả các tế bào đều cần oxy cho sự chuyển hóa. O
2
đóng vai trò quan trọng trong
sinh trưởng, tăng sinh và biệt hóa tế bào. Tuy nhiên nhu cầu và O
2
của tế bào nuôi
cấy thấp hơn nhu cầu O
2
mô sống.
• Áp suất O
2

trong tủ nuôi cấy thấp hơn áp suất O
2
trong không khí. Trong quá trình
nuôi cấy tĩnh, các phân tử oxy trong không khí có xu hướng khuếch tán vào môi
trường nuôi=> tế bào nằm sâu + các tế bào sử dụng oxy quá nhanh => phát triển
kém, có thể chết => chỉnh thể tích tiếp xúc, điều chỉnh nồng độ O
2
phổ biến là 16-
20%.
• Sự oxy hóa: tế bào nhạy cảm với tác nhân oxy hóa không thể nuôi cấy in vitro nếu
không thêm vào MT chất chống oxy hóa (ví dụ: tế bào Leydig sẽ chết sau 71-90h
nếu MT không bổ sung vitamin E, ). Ngược lại, một số tế bào phát triển tốt trong
MT khử
• CO
2
: khó xác định vì sự biến đổi thuận nghịch CO
2
<=>HCO
3
=> quyết định độ
pH của môi trường. Tùy loại tế bào để chọn nồng độ CO
2
tương ứng.
5. Độ sâu của đáy bình nuôi đến mặt thoáng của môi trường
+ Ảnh hưởng đến nhu cầu O
2
của tế bào
+ Phương pháp nuôi cấy tĩnh, độ sâu của môi trường nuôi thích hợp vào khoảng 2
– 5 mm, tương đương với 0,2 – 0,5 ml môi trường nuôi cấy/cm
2

đáy bình nuôi.
Câu 5: Trình bày các thành phần môi trường cơ bản và vai trò trong nuôi cấy tế
bào động vật?
Các thành phần chủ yếu: muối vô cơ; các amino acid. Carbohydrate; vitamin; acid
béo; lipid; huyết thanh; yếu tố vi lượng; hệ đệm
20
1. Muối vô cơ:
• Một số muối chứa ion Na
+
, K
+
, Ca
++
, như KCl, NaCl,
• Vai trò: - cần bằng áp suất thẩm thấu tế bào
- Giúp điều hòa điện thế màng nhờ các ion
- Cần trong chất nền bào, bám gắn và hoạt động như các cofactor, duy trì cơ chế
vận chuyển các chất qua màng
- Giúp tế bào bám vào giá thể tốt hơn
2. Hệ đệm
• Các hệ đệm thường được sử dụng: hệ đệm bicarbonate với CO
2
là thành phần
chính;hệ đệm phosphate; hệ đệm hữu cơ HEPES, Tris
• Điều hòa pH môi trường, vì các tế bào có khả năng sản xuất lactic acid và CO
2
=>
giảm pH môi trường => ảnh hưởng tới phát triển tế bào
3. Carbohydrate
• Đường được sử dụng chính là glucose và galactose, ngoài ra còn có maltose,

fructose. Nồng độ đường khác nhau 1g/l-4,5g/l
• Cung cấp chất dinh dưỡng cho tế bào; nguồn cung cấp carbon; tạo nên áp suất
thẩm thấu cho môi trường
4. Vitamin
• Thông thường vitamin được sử dụng là riboflavin, thiamine và biotin. Đặc biệt
vitamin nhóm B, một số môi trường có nhiều vitamin A và E
• Là chất thiết yếu cho sự phát triển tế bào; là cơ chất cho nhiều cofartor; chất chống
oxy hóa (như vitamin E)
5. Các protein và peptide
• Các peptide cần thiết như: albumin, transferring, fibronectin và fetuin thường là
những chất có sẵn trong huyết thanh.
• Là các yếu tố cần thiết khi môi trường không có huyết thanh
6. Acid béo và lipid
• Thường là cholesterol và steroid
• Cần thiết trong môi trường nuôi không có huyết thanh và cho một số tế bào đặc
biệt.
7. Yếu tố vi lượng
• Bao gồm: kẽm, đồng, selenium, và các tricarboxylic acid trung gian
• Là chất giúp tách các gốc oxy tự do
8. Huyết thanh
• Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như: amino acid thiết yếu, tiền
chất của nucleic acid, nguyên tố vi lượng,
• Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích tb tăng trưởng và phân chia
21
• Kích thích phục hồi và tránh các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền, các protein
trong huyết thanh làm bất hoạt trysin.
• Cải thiệt tính tan của các chất dinh dưỡng
• Chống oxy hóa: ht kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy
• Làm tăng độ bám dính của tế bào
Câu 6: Phân tích vai trò của huyết thanh trong môi trường nuôi cấy tế bào động vật?

Trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh với
những vai trò:
• Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như: amino acid thiết yếu, tiền
chất của nucleic acid, nguyên tố vi lượng,
• Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích tb tăng trưởng và phân chia
• Kích thích phục hồi và tránh các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền, các protein
trong huyết thanh làm bất hoạt trysin.
• Cải thiệt tính tan của các chất dinh dưỡng
• Chống oxy hóa: ht kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy
• Làm tăng độ bám dính của tế bào
Huyết thanh chứa các chất có nguồn gốc từ các tiểu cầu bị vỡ xuất hiện tại các vị trí bị
tổn thương trong cơ thể, nên vai trò của huyết thanh trong môi trường nuôi tương đương
với vai trò phục hồi tổn thương của cơ thể
Đặc biệt là nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu PDGF (platelet derived growth factor) có tác
dụng kích thích sự phân chia tế bào khi cơ thể bị tổn thương.
Trong huyết thanh không chỉ có các nhân tố kích thích phân bào mà còn có các chất ức
chế sự phân bào và cảm ứng sự phân hóa. Ví dụ: nhân tố biến đổi tăng trưởng TGF-β
(transforming factor- β) có tác dụng ức chế sự phân chia của tế bào thượng bì khí quản,
và làm tế bào biến thành hình có góc cạch, còn làm kìm hãm sự phân chia của dòng tế
bào biều bì người và chuột.
Tuy nhiên, huyết thanh dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lượng
Câu 7: Nuôi cấy sơ cấp là gì? Nêu tóm tắt quy trình nuôi cấy sơ cấp?
22
Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền đầu tiên
(subculture).
Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đâu thường là hỗn hợp các dòng khác nhau, hoặc
chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó những tế bào quan tâm và những tế bào khác
(được coi là tế bào nhiễm)=> loại bỏ bằng cơ học, enzym
Tóm tắt quy trình
3 bước cơ bản:

Bước 1: thu nhận mô (tươi hay đông lạnh) có chứa tế bào sống
• Mẫu thu nhận: bất kỳ mô nào của cơ thể; phải làm sạch mô tại vị trí lấy ( rửa và
sát trùng bằng cồn); đưa mô vào bảo quản trong dung dịch DPBS và nhanh chóng
23
chuyển về phòng thí nghiệm (tùy vào thời gian chuyển có thể để ở điệu kiện 37
o
C,
đông lạnh tạm thời, )
Bước 2: Phẫu tích/ tách rời tế bào, xác định nồng độ
• Xử lý mẫu sơ bộ: rửa nhiều lần bằng PBS có bổ sung kháng sinh (gentamicin,
piniccilin, streptomicin), kháng nấm; cắt bỏ mô chết, phần thừa
• cắt thành mảnh nhỏ 2-3 mm
2
=>sử dụng để nuôi cấy hoặc tách rời tế bào
• Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép)
• Tách bằng enzym: trypsin, collagenase, dispase, chymotrysin, papain,
Bước 3: nuôi cấy
• Mẫu mô được cắt thành mảnh nhỏ sẽ được nuôi cấy mô sơ cấp, sau khi thu nhận tế
bào mới sẽ được cấy chuyển để tạo dòng tế bào hoặc nuôi mảnh mô thứ cấp
• Tế bào sau khi tách được nuôi cơ cấp=> cấy chuyển=>tạo dòng tế bào
Câu 8: Nêu một số enzym và cơ chế cắt của chúng trong tách tế bào sử dụng cho nuôi
cấy tế bào động vật?(câu này nhà mình xem kỹ nhé, xem lại của a,c 54)
Cầu nối gian bào có bản chất là protein (các tế bào liên kết với nhau và với ECM), do vậy
các protease sử dụng để tách tế bào là những enzyme thủy phân protein như: trypsin,
collagenase, elastase, pronase, dispase, có thể riêng lẻ hay kết hợp tùy thuộc và mục đích
1. Trypsin
• Là enzyme kiềm tính, có bản chất là serin protease được tổng hợp ở tụy tạng và
tiết dưới dạng tiền hoạt động là zymogen là trypsinogen
• Cấu trúc: chuỗi polypeptide gồm 249 aa, khối lượng 22,6-23,4 Kda
• pH 6-9, tối ưu 8-9. Rất bền vững trong môi trường acid yếu

• Cơ chế: Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl (−COOH) của lysin hoặc
arginin và gốc amin (−NH
2
) của acid amin bất kì đứng liền kề với nó trong
polypeptid, ngoại trừ liên kết giữa lysin và arginin. Xử lý trypsin dẫn đến sự
cuộn tròn tế bào các liên kết trở nên lỏng lẻo và tế bào dễ dàng được tách
ra bởi tác động cơ học. Canxi là chất bảo vệ trypsin, hoạt tính xúc tác của
trypsin bị giảm 50% khi vắng mặt Ca
2+
vì trypsin trở nên trơ. Một số kim
loại như coban, mangan có khả năng hoạt hóa trypsin. Hoạt tính của
trypsin sẽ bị kìm hãm bởi huyết thanh bò có thai hoặc DFP.
24
• Trypsin không tác động đặc hiệu cho loại protein, vì vậy có thể phân cắt các
protein ở màng và gây vỡ tế bào khi dùng nồng độ cao, hoặc cho tác động
trong thời gian dài.
• Nồng độ thường được dùng: 0.01-0.5%, sử dụng quy trình trypsin ấm (37
o
C) hay
trypsin lạnh (4
o
C)
• Cần trung hòa trypsin bằng huyết thanh ngay sau khi thu được tế bào đơn.
2. Collagenase
• Các collagenase khác nhau có khối lượng phân tử và trung tâm hoạt động khác
nhau ( gốc serin hay kim loại)
• Hoạt động ở pH trung tính hoặc hơi kiềm (7-8), nhiệt độ thích hợp dưới 40
o
C,
giảm hoạt tính ở nhiệt độ trên 45

o
C
• Có 4 loại collagenase:
+ Collagenase loail I: chứa một lượng trung bình những hoạt chất( collagenase,
caseinase, clostripain, trypsin hoạt động) => tách tế bào da, gan, phổi, mỡ và
những tế bào thượng thận
+ Collagenase loại II: chứa hợp chất clostripain nhiều hơn => tách tế bào từ tim,
xương, cơ và sụn
+ Collagenase loại III: có hoạt tính phân giải protein thấp
+ Collagenase loại IV: có hoạt tính trypsin thấp, thường dùng phân tách tế bào tụy
• Collagenase phân cắt không hoàn toàn các cầu nối nên ít làm hư hại tế bào. Kết
hợp với hyaluronidase => phân hủy các chất dịch nội bào, + Dnase =>thủy phân
các DNA thoát ra từ các tế bào li giải
3. Chymotrypsin
• Là một protease gồm 246 aa
• Ở tụy tạng, tiết ở dạng zymogen là chymotrypsinogen
• Hoạt tính kiềm (pH 7-9), thích hợp pH 8-9
• Cơ chế: hoạt động như một endopeptidase, phân giải các peptide tạo thành bởi
nhóm carboxyl của acid amin thơm (như tirosin, phenylalanin, tryptophan,
methyonin và leucin) với nhóm amin của một aa khác.
4. Papain
• Là một endoprotease được cấu tạo từ 212 aa không chứ methyonin
• Trung tâm hoạt động: nhóm (-SH) của cystein 25 và nitrogen hóa trị 3 của histidin
159, được liên kết với nhau bằng cầu nối hydro
• Thủy phân các protein thành các polypeptide và aa
25
• Chịu được nhiệt tương đối cao, dạng khô không biến tính ở 100
o
C-3h, dạng dung
dịch bị mất hoạt tính ở 83,5

o
C-sau 30 phút
• pH 4,5-8,5, bị biến tính ở pH dưới 4,5 hoặc trên 12
• bị kìm hãm bởi các chất oxy hóa như oxy, ozone, hydroperoxyte,
5. Elastase
• Là một protease serine với những nối peptide đặc biệt, có hoạt tính của esterase và
amidase
• Thủy phân lượng lớn protein nền, là enzyme duy nhất có khả năng thủy phân
elastin, một chất nền không bị tác động bởi trypsin, chymotrypsin hay pepsin
• Là enzym được chọn để tách tế bào từ phôi
Tách bằng cơ học
Cắt nhuyễn mô: Dùng lực cơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào. Dùng kéo cắt nhuyễn mảnh
môhuyền phù trong dung dịch PBS thu hỗn hợp chứa tế bào đơn và những cụm tế
bàoĐể lắng, thu dịch trong (là huyền phù thu nhận các tế bào đơn). Hiệu quả tách
không cao, số lượng tế bào đơn thu nhận ít áp dụng cho mẫu mô có kích thước lớn và
không khan hiếm, dùng để làm tăng khả năng tiếp xúc của mô với enzyme trong kĩ thuật
tách bằng enzyme được tiến hành sau đó. Ưu điểm là tế bào có khả năng sống cao
Ép nhuyễn mô: dùng 2 hai phiến lame hoặc pitton của syringe để ép mô trong đĩa petri để
tách rời các tế bào. Áp dụng để tách tế bào ở những mô có liên kết yếu ,mô mà các tế bào
liên kết với nhau chặt chẽ cho hiệu quả không cao
Tách bằng màng lọc tế bào : Màng lọc tế bào động vật thường có đường kính lỗ từ 70 -
100 µm chỉ cho một tế bào lọt qua, sử dụng chúng để làm công cụ tách rời các tế bào rất
hiệu quả. Đặt mẫu mô lên trên màng lọc sử dụng pitton của syringe để chà sát mạnh
mảnh mô, tế bào sẽ va chạm vào lưới lọc và tách rời tế bào đơn có đường kính nhỏ hơn
lỗ lọc sẽ lọt qua.
Câu 9: Tóm tắt quy trình trypsin ấm là trypsin lạnh được sử dụng để tách tế bào trong
nuôi cấy tế bào động vật?