Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc bằng sinh khối vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



PHAN HUÊ PHƯƠNG



NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NANO BẠC
BẰNG SINH KHỐI VI KHUẨN B.subtilis và
B.licheniformis






LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2010
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



PHAN HUÊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NANO BẠC
BẰNG SINH KHỐI VI KHUẨN B.subtilis và
B.licheniformis
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
1



MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, khoa học và công nghệ nano đã phát triển như vũ
bão. Các vật liệu nano với những đặc tính kì lạ, đặc biệt về quang, điện, từ, sinh học
đã và đang thâm nhập vào toàn bộ lĩnh vực trong đời sống và kinh tế của thế giới.
Với kích thước nano các loại vật liệu này có thể can thiệp đến từng phân tử -nguyên
tử, điều này đặc biệt quan trọng trong ứng dụng Y-sinh học.
Trong lĩnh vực Công nghệ nano, công nghệ nano bạc đóng vai trò khá quan
trọng. Bạc ở kích thước nano là một kháng sinh tự nhiên và rất mạnh, có khả năng
phòng ngừa nhiều bệnh truyền nhiễm trong đó có cả bệnh AIDS (virus HIV). Nano
bạc có khả năng vô hiệu hóa hầu như tất cả các enzyme cần thiết cho sự trao đổi
oxygen của vi khuẩn, virút và nấm. Nano bạc có khả năng giết chết hơn 650 loại vi
khuẩn khác nhau chỉ trong vòng một phút [31]. Tất cả các vi khuẩn không bị lờn với
kháng sinh bạc và vì thế, các hạt nano bạc không bị mất tác dụng. Ngoài ra, các hạt
nano bạc cũng sẽ giúp tạo ra các oxygen hoạt tính từ trong không khí hoặc từ trong
nước và từ đó phá hủy các màng tế bào của vi khuẩn.
Hiện nay, các ứng dụng của bạc nano đang phát triển không ngừng đặc biệt
là trong lĩnh vực y sinh, do đó nhu cầu về bạc nano trên thị trường sẽ không ngừng
tăng lên. Trong khi đó, tổng hợp bạc nano theo các phương pháp cổ điển (hóa học,

vật lý, hóa lý kết hợp) thường gây nhiều tác động xấu đến môi trường, chi phí đầu
tư rất tốn kém, giá thành cao lại khó sản xuất rộng rãi, nên có thể nói phương pháp
sinh tổng hợp là một xu hướng mang tính tất yếu. Phương pháp tổng hợp theo
hướng này tạo ra các hạt nano bạc đạt tiêu chuẩn về kích thước và phân bố tốt hơn
so với các phương pháp khác đồng thời mở ra triển vọng sản xuất với qui mô lớn.
Các hạt nano cũng có thể được ổn định ngay trong quy trình sản xuất bởi các
polymer sinh học. Nhằm tiếp cận với phương pháp mới này, tôi đã chọn đề tài
“Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc bằng vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis ”
làm luận văn tốt nghiệp.
Đề tài hướng đến các mục tiêu sau:
2



• Thu được vật liệu nano bạc có kích thước nhỏ, độ bền cao (trên 3
tháng) và hiệu suất kháng khuẩn cao (trên 90%) bởi vi khuẩn
B.subtilis và B.licheniformis.
• Xác định các điều kiện (lượng sinh khối, nồng độ AgNO
3
, thời gian
phản ứng) thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp nano bạc ngoại bào
(B.subtilis) và nội bào (B.licheniformis).
• Dùng dung dịch nano bạc thu được để chế tạo vải kháng khuẩn
Những mục tiêu nêu trên được cụ thể hóa qua nội dung thực hiện sau đây:
 Khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu của B.subtilis và B.licheniformis
 Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện (lượng sinh khối vi khuẩn,
thời gian phản ứng, nồng độ AgNO
3
) đến quá trình sinh tổng hợp bạc
nano.

 Phân tích đặc điểm hóa lý của các dung dịch nano bạc thu được (khảo
sát hình dạng, sự phân bố kích thước hạt -TEM, giản đồ nhiễu xạ tia
X-XRD)
 Kiểm tra khả năng ổn định, hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch bạc
nano được sinh tổng hợp từ chủng B.subtilis và B.licheniformis
 Thử nghiệm ngâm tẩm vải non-woven với dung dịch nano bạc tổng
hợp được và kiểm tra hiệu quả kháng khuẩn của mẫu vải sau khi
ngâm.





3




CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
TÀI LIỆU







1.1.Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc trong nước và trên thế

giới
4



Công nghệ nano là một khoa học mới đang phát triển rất nhanh chóng và được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuôc sống như điện tử, hóa học, y sinh
học Trong đó nổi bật là công nghệ nano bạc vì bạc nano có hoạt tính diệt khuẩn
cao, không độc hại với con người và môi trường. Hiện có nhiều phương pháp hóa,
lý hoặc kết hợp hóa - lý được sử dụng để tổng hợp bạc nano. Nhìn chung các
phương pháp này cho hiệu suất cao, thời gian tổng hợp ngắn nhưng lại gây tác động
lớn đến môi trường, sử dụng các hóa chất thiết bị đắt tiền. Do đó, phương pháp tổng
hợp theo hướng sinh học thân thiện với môi trường được đặc biệt chú ý.
Ngoài nước:
Vào năm 2001 Klaus-Joerger nhận thấy vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
AG259 phân lập từ mỏ bạc có thể khử Ag
+
trong dung dịch muối AgNO
3
thành các
hạt Ag nano trong vùng chu chất của nó [13].
Tiếp sau đó, rất nhiều báo cáo cho thấy các chủng vi sinh đơn bào (vi khuẩn)
hoặc đa bào (nấm sợi, nấm đảm) đều có khả năng khử Ag
+
tạo bạc nano theo các cơ
chế ngoại bào hoặc nội bào. Cụ thế như A.Ahmad chứng minh khả năng tổng hợp
nano bạc của nấm Fusariuim oxysporum [10]. Sastry và cộng sự nhận thấy
Verticillium sp và Fusariuim oxysporum khi tiếp xúc với ion Au
3+
và Ag

+
sẽ nhanh
chóng khử các ion này tạo thành hạt nano kim loại [32]. N.Duran nghiên cứu cơ
chế khử Ag
+
thành Ag
0
của F.oxysporum [15]. S.Basavaraja khảo sát quá trình sinh
tổng hợp bạc nano ngoại bào bởi nấm Fusarium semitectum [11]. K.C.Bhainsa xác
định có sự hình thành nano bạc khi cho nấm Aspergillus flavus tiếp xúc với muối
bạc nitrate [36]. K.Kalimuthu khảo sát khả năng tổng hợp nano bạc của vi khuẩn
Bacillus licheniformis [19]. N.Saifuddin nghiên cứu phương pháp tổng hợp nano
bạc nhờ Bacillus subtilis [31]. N.Mokhtari sử dụng Klebsiella pneumonia để thu
nhận bạc nano [27]
Các vi sinh vật sử dụng hệ enzyme khử nitrate để đưa AgNO
3
về Ag tạo nên
những hạt nano có kích thước rất nhỏ, chỉ khoảng dưới 20nm, do đó làm tăng hiệu
quả kháng khuẩn khi so sánh với phương pháp hoá – lý cổ điển [10].
5



Trong nước:
Hiện nay có rất ít công trình khoa học liên quan đến hướng sinh tổng hợp nano
bạc. Nghiên cứu sinh tổng hợp bạc nano bằng nấm Fusarium oxysporum (Nguyễn
Hoàng Ngọc Phương và cộng sự (2009)).
1.2.Vật liệu nano
Để hiểu rõ khái niệm vật liệu nano, chúng ta cần biết hai khái niệm có liên
quan là khoa học nano và công nghệ nano. Theo Viện hàn lâm hoàng gia Anh quốc:

• Khoa học nano là ngành khoa học nghiên cứu về các hiện tượng và
sự can thiệp vào vật liệu theo các quy mô nguyên tử, phân tử và đại
phân tử. Với quy mô này, tính chất của vật liệu khác hẳn so với tính
chất của chúng ở các quy mô lớn hơn.
• Công nghệ nano là việc thiết kế, phân tích đặc trưng, chế tạo và ứng
dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng
và kích thước trên quy mô nano mét.
Vật liệu nano là đối tượng của hai lĩnh vực là khoa học nano và công nghệ
nano, nó liên kết hai lĩnh vực trên với nhau. Kích thước của vật liệu nano từ 0,1 nm
đến 100 nm [2].
1.2.1.Phân loại vật liệu nano
Có rất nhiều cách phân loại vật liệu nano, mỗi cách phân loại cho ra rất nhiều
loại nhỏ nên thường hay làm lẫn lộn các khái niệm. Sau đây là một vài cách phân
loại thường dùng.
Phân loại theo hình dáng của vật liệu
• Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano), ví dụ đám
nano, hạt nano.
• Vật liệu nano một chiều là vật liệu trong đó một chiều tự do, hai chiều có
kích thước nano, ví dụ dây nano, ống nano.
6



• Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó hai chiều tự do, một chiều có kích
thước nano, ví dụ màng mỏng (có chiều dày kích thước nano).
• Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có
một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không
chiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau. Cũng theo cách phân loại theo
hình dáng của vật liệu, một số người đặt tên số chiều bị giới hạn ở kích thước
nano. Nếu như thế thì hạt nano là vật liệu nano 3 chiều, dây nano là vật liệu

nano 2 chiều và màng mỏng là vật liệu nano 1 chiều.
Phân loại theo tính chất vật liệu thể hiện sự khác biệt ở kích thước nano
• Vật liệu nano kim loại.
• Vật liệu nano bán dẫn.
• Vật liệu nano từ tính.
• Vật liệu nano sinh học
•
Nhiều khi người ta phối hợp hai cách phân loại với nhau, hoặc phối hợp hai
khái niệm nhỏ để tạo ra các khái niệm mới. Ví dụ, đối tượng chính của chúng ta sau
đây là "hạt nano kim loại" trong đó "hạt" được phân loại theo hình dáng, "kim loại"
được phân loại theo tính chất hoặc "vật liệu nano từ tính sinh học" trong đó cả "từ
tính" và "sinh học" đều là khái niệm có được khi phân loại theo tính chất.
1.2.2.Hạt nano kim loại
Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được
tạo thành từ các kim loại. Người ta biết rằng hạt nano kim loại như hạt nano vàng,
nano bạc được sử dụng từ hàng nghìn năm nay. Nổi tiếng nhất có thể là chiếc cốc
Lycurgus được người La Mã chế tạo vào khoảng thế kỉ thứ tư trước Công nguyên
và hiện nay được trưng bày ở Bảo tàng Anh. Chiếc cốc đó đổi màu tùy thuộc vào
cách người ta nhìn nó. Nó có màu xanh lục khi nhìn ánh sáng phản xạ trên cốc và có
màu đỏ khi nhìn ánh sáng đi từ trong cốc và xuyên qua thành cốc. Các phép phân
7



tích ngày nay cho thấy trong chiếc cốc đó có các hạt nano vàng và bạc có kích
thước 70 nm và với tỉ phần mol là 14:1.
Tuy nhiên, phải đến năm 1857, khi Michael Faraday nghiên cứu một cách hệ
thống các hạt nano vàng thì các nghiên cứu về phương pháp chế tạo, tính chất và
ứng dụng của các hạt nano kim loại mới thực sự được bắt đầu. Khi nghiên cứu, các
nhà khoa học đã thiết lập các phương pháp chế tạo và hiểu được các tính chất thú vị

của hạt nano. Một trong những tính chất đó là màu sắc của hạt nano phụ thuộc rất
nhiều vào kích thước và hình dạng của chúng [4].
Ví dụ, ánh sáng phản xạ lên bề mặt vàng ở dạng khối có màu vàng. Tuy
nhiên, ánh sáng truyền qua lại có màu xanh nước biển hoặc chuyển sang màu da
cam khi kích thước của hạt thay đổi. Hiện tượng thay đổi màu sắc như vậy là do
một hiệu ứng gọi là cộng hưởng plasmon bề mặt. Chỉ có các hạt nano kim loại,
trong đó các điện tử tự do mới có hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến làm cho chúng
có hiện tượng quang học thú vị như trên [28], [44].
1.2.3.Hạt nano bạc
Bạc nano là những hạt bạc có kích thước nằm trong khoảng 0,1 đến 100nm.
Bạc nano thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer
(polyvinylalcol PVA, polyethylenglycol PEG, polyvinyl pyrolidone PVP) để các
hạt nano bạc không bị kết tụ. Bạc ở kích thước nano có những đặc trưng rất khác so
với bạc bình thường. Đó là một kháng sinh tự nhiên và rất mạnh, có khả năng phòng
ngừa nhiều bệnh truyền nhiễm. Tính chất kháng khuẩn của dung dịch keo nano bạc
đã được tìm hiểu một cách khoa học vào đầu thế kỷ 20, nhưng sự phát minh ra
thuốc kháng sinh đã ngăn cản những nghiên cứu sâu trong lĩnh vực này. Những năm
gần đây do công nghệ nano phát triển và do các kháng sinh càng ngày càng bị lờn
với vi khuẩn, virus nên việc nghiên cứu ứng dụng nano bạc trong lĩnh vực Y sinh
học được quan tâm nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ [28].


Nhìn chung, nano bạc có những đặc điểm đáng quan tâm sau đây:
8



• Diệt trên 650 loại vi khuẩn
• Hiệu quả cao
• Tác dụng nhanh

• Không độc
• Không kích thích
• Không gây dị ứng
Tính kháng khuẩn của nano bạc được giải thích theo một số cơ chế sau:
 Với tính chất xúc tác, nano bạc vô hiệu hoá các enzyme mà vi khuẩn và nấm
cần cho quá trình trao đổi chất của tế bào dẫn đến rối loạn quá trình biến dưỡng của
vi khuẩn. Tác động này làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt nhanh chóng [14], [22].
 Hạt nano bạc liên kết với các nhóm chứa phospho trong phân tử DNA làm
rối loạn quá trình sao chép DNA làm chết vi khuẩn [18], [33].
 Các hạt bac nano tương tác với nhóm -SH của các protein, enzyme trên màng
tế bào dẫn đến sự thay đổi hình thái và gia tăng tính thấm của màng. Sự vận chuyển
vật chất qua màng tăng làm vỡ màng tế bào của vi khuẩn [18], [23].
 Nano bạc giúp tạo ra các oxyen hoạt tính từ trong nước hoặc không khí
tương tác với các lipid màng làm tổn thương màng [26].











Hình 1.1.Cơ chế diệt khuẩn của bạc

9

Nhờ có kích thước rất nhỏ (0,1 nm – 100nm), diện tích bề mặt tổng cộng của
bạc nano rất lớn và hiệu quả hoạt động của bạc nano tăng đáng kể so với hạt bạc có
kích thước lớn hơn (micro) [28]. Đây là ưu điểm của hạt nano bạc so với hạt bạc có
kích thước lớn hơn và với ion. Theo tính toán lý thuyết bạc nano có hoạt tính mạnh
hơn ít nhất 40 lần trên mỗi đơn vị bạc so những dung dịch keo bạc thông thường. Vì
vậy, người ta có thể sử dụng ít bạc hơn để đạt được hiệu quả tương đương. Điều này
rất có ý nghĩa vì theo EPA (Environmental Protection Agency), một người chỉ có
thể dùng tối đa 350 µg/ liều dùng mỗi ngày, nếu nhiều hơn sẽ bị hiện tượng Argyria
hay còn gọi là trúng độc bạc. Nếu dùng 1 – 2 muỗng càphê/ngày (20 ppm) tương
đương 100 – 200 µg/ngày (thấp hơn so với khuyến cáo của EPA về hàm lượng bạc
trong nguồn nước cung cấp ở Mỹ), ta sẽ có hiệu quả phòng bệnh rất tốt. Điều này
đảm bảo cho người dùng có thể sử dụng nano bạc như một chất bổ sung trong bữa
ăn hay trong nước uống mà không bị hiện tượng Argyria [28].
Về ảnh hưởng của nano bạc đến sức khoẻ con người, các nhà khoa học cho
rằng nano bạc có khả năng diệt vi khuẩn, mà tiêu hóa của con nguời có được là do
các vi khuẩn có lợi cho cơ thể và vì thế, họ vẫn nghi ngờ rằng các hạt nano bạc cũng
có thể diệt các vi khuẩn này và ảnh hưởng đến sức khoẻ. Tuy nhiên cho đến nay
chưa thấy công trình nào công bố sự tác hại của nano bạc. Các nghiên cứu tại
Odense Universitets Hospital [28] cũng đã chứng minh rằng các hạt nano bạc được
hấp thu vào trong cơ thể mà không hề gây ra một tác dụng phụ nào cũng như gây
độc cho cơ thể. Các nhà khoa học còn chứng minh các hạt nano bạc sẽ được giải
phóng ra khỏi cơ thể theo thời gian [28]. Các hãng sản xuất những sản phẩm chứa
nano bạc chẳng hạn như Samsung phát biểu rằng các sản phẩm của họ đều được thử
nghiệm và cho đến nay họ vẫn khẳng định tính an toàn của nó đối với sức khoẻ của
người sử dụng [5].



10

1.2.4.Các ứng dụng của nano bạc
1.2.4.1 Trong y học
Với tính chất kháng khuẩn nhanh và hiệu quả các hạt nano bạc đã được ứng
dụng khá rộng rãi trong y học. Một số sản phẩm chứa nano bạc như khăn ăn, khăn
vệ sinh khô cho cả em bé lẫn người lớn, băng đắp bỏng, đắp vết thương, găng tay,
quần áo dùng trong y tế với khả năng diệt khuẩn cao tới 99%.
Hãng dược phẩm Nucryst ở Fort Saskachevan, Alberta (Canada) đã đưa bạc
nano vào miếng băng gạc để băng những vết loét do bỏng vì chúng có tác dụng diệt
khuẩn mạnh hơn so với hạt bạc bình thường. Trước kia hàng ngày phải thay băng
gạc cho bệnh nhân vừa gây đau đớn cho họ, vừa tốn kém nhưng với loại thuốc mới
này chỉ cần thay băng một tuần một lần và thời gian khỏi bệnh nhanh hơn [39].








1.2.4.2 Trong công nghiệp
Bạc nano được đưa vào các polymer như polyethylene (PE), polypropylene
(PP) có khả năng giết chết nhiều loại vi khuẩn: tụ cầu khuẩn vàng, Bacillus
pneumoniae, E.coli…. Ứng dụng của việc phân bố bạc nano trong các chất dẻo,
polymer, hiện nay người ta đã sản xuất các mặt hàng tiêu dùng có tính kháng khuẩn
chứa các hạt nano bạc như tủ lạnh, máy điều hòa, máy giặt, đầu ti (núm vú), bình
sữa cho trẻ sơ sinh, hộp đựng thực phẩm [40]…
Hình 1.2. Sản phẩm khăn và băng gạc có chứa nano bạc

11



Dựa trên tính năng diệt khuẩn của bạc, Samsung đã đưa ra phương pháp sử
dụng ion bạc trong các thiết bị dân dụng: máy điều hòa nhiệt độ, tủ lạnh, máy hút
bụi và máy giặt để khử trùng. Với tủ lạnh tự làm sạch, các bộ phận của tủ lạnh đều
là các loại chất dẻo có hạt nano bạc, sản phẩm này đã tạo một sự kiện phi thường
trong giới khoa học, gần như không có vi khuẩn nào trong tủ lạnh nano. Ngoài ra,
nano bạc là một chất khử mùi cực kỳ hiệu quả nên các hương vị của thức ăn, thức
uống trong tủ lạnh đều được giữ nguyên vẹn. Trong máy giặt, công nghệ nano bạc
tạo thành hệ thống diệt khuẩn của máy mà không cần phải đun sôi nước. Cách làm
này vừa ít hao tốn điện năng nhưng vẫn bảo đảm hiệu quả.
Hãng Mummybear (Hàn Quốc) gần đây đã giới thiệu công nghệ Nano Silver
được ứng dụng vào sản xuất bình sữa và dụng cụ đựng thức ăn cho trẻ. Những sản
phẩm này đã được Bộ y tế, Viện dinh dưỡng, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm,
Vinacontrol cấp chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm và chất lượng [46].
Ngoài ra, hiện nay người ta còn ứng dụng nano bạc trong các sản phẩm như
nước rửa rau, các loại sơn, mỹ phẩm, ca uống nước …

Hình 1.3. Một số ứng dụng của nano bạc trong công nghiệp

12



1.2.4.3 Trong nông nghiệp
Sản phẩm thuốc trừ bệnh cây
MIFUM 0,6 DD được sản xuất với nồng
độ hạt nano bạc 1000 ppm và Chitosan
5000 ppm. MIFUM 0,6 DD được khảo
nghiệm trừ bệnh đạo ôn, lem lép hạt trên
lúa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng và đã
chứng tỏ ưu việt của mình, cà 2 liều
lượng, 0,5 lít MIFUM 0,6 DD và 1 lít
MIFUM 0,6 DD/ha đều cho đạt hiệu quả
cao trong việc phòng trừ bệnh đạo ôn cổ
bông, lem lép hạt trên lúa, nhất là trong
giai đoạn 3 – 7 ngày sau khi phun [41].
1.2.4.4 Trong công nghệ xử lý nước
Việc sử dụng các hạt bạc có kích
thước nano trong công nghệ xử lý nước
tương đối khá mới mẻ. Do bề mặt riêng
khá lớn, hạt bạc có kích thước nano có
hoạt tính khá cao trong vấn đề xử lý nước
nhiễm khuẩn và đã được khá nhiều nhà
khoa học nghiên cứu [17]. Phòng thí
nghiệm Công nghệ Nano đã sử dụng vật
liệu polyurethane mút xốp tẩm nano bạc
(PU/Ag) để xử lý nước uống nhiễm khuẩn

E.coli. Nước qua hệ lọc PU/Ag không còn
vi khuẩn và uống được theo tiêu chuẩn của
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [8].

Hình 1.4.Sản phẩm thuốc trừ
bệnh MIFUM có chứa nano bạc
Hình 1.5.Thiết bị xử lý nước uống nhiễm
khuẩn với cột lọc Polyurethane xốp tẩm
nano b
ạc

13



1.3.Các phương pháp chế tạo hạt nano bạc
Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và
phương pháp từ trên xuống. Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các ion hoặc
các nguyên tử kết hợp lại với nhau. Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo
vật liệu nano từ vật liệu khối ban đầu.
Đối với hạt nano kim loại như hạt nano vàng, bạc, bạch kim, thì phương
pháp thường được áp dụng là phương pháp từ dưới lên. Nguyên tắc là khử các ion
kim loại như Ag
+
, Au
+
để tạo thành các nguyên tử Ag và Au. Các nguyên tử sẽ liên
kết với nhau tạo ra hạt nano. Các phương pháp từ trên xuống ít được dùng hơn
nhưng thời gian gần đây đã có những bước tiến trong việc nghiên cứu theo phương
pháp này.

1.3.1.Phương pháp ăn mòn laser
Đây là phương pháp từ trên xuống. Vật liệu ban đầu là một tấm bạc được đặt
trong một dung dịch có chứa chất hoạt động bề mặt. Một chùm laser xung có bước
sóng 532 nm, độ rộng xung 10 ns, tần số 10 Hz, năng lượng mỗi xung là 90 mJ,
đường kính vùng kim loại bị tác dụng là 1 – 3mm. Dưới tác dụng của chùm laser
xung, các hạt nano có kích thước khoảng 10nm được hình thành và được bao phủ
bởi chất hoạt động bề mặt C
n
H
2n+1
SO
4
Na với n = 8; 10; 12; 14 có nồng độ từ
0,001M đến 0,1M [2].
1.3.2.Phương pháp khử hóa học
Trong phương pháp này, các tác nhân hóa học được sử dụng để khử ion bạc
tạo thành bạc kim loại.
Trong phương pháp này, ion Ag
+

dưới tác dụng của chất khử sẽ tạo ra
nguyên tử Ag
0
, sau đó các nguyên tử này kết hợp với nhau tạo thành các hạt bạc có
kích thước nano [2].
14



Các tác nhân hóa học có thể sử dụng là: NaBH

4
, sodium citrate, citric acid,
EDTA, ethanol, ethylene glycol, hydrogen, hydrogen peroxid, hydroxylamine,
hydrazine, formaldehyde và các dẫn xuất của nó [1], [12], [30]
Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người
ta sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích
và đẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc chất hoạt động bề mặt. Phương pháp
tĩnh điện đơn giản nhưng bị giới hạn bởi một số chất khử. Phương pháp bao phủ
phức tạp nhưng vạn năng hơn, hơn nữa phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt
nano có các tính chất cần thiết cho các ứng dụng. Các hạt nano Ag, Au, Pt, Pd, Rh
với kích thước từ 10 đến 100 nm có thể được chế tạo từ phương pháp này.
1.3.3.Phương pháp khử vật lý
Phương pháp này sử dụng các tác nhân vật lý như điện tử, sóng điện từ năng
lượng cao như tia gamma, tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia laser, tia UV để khử ion
Ag
+
thành nguyên tử Ag
0
[24], [34].
Dung dịch muối bạc không có thêm chất phụ gia nào khác có thể được chiếu
bằng phương pháp chiếu xạ với bức xạ năng lượng cao, quá trình này tạo ra các
electron hydrate hóa và hydro nguyên tử có khả năng khử bạc ion.
Một thí dụ sử dụng phương pháp vật lý để chế tạo hạt nano bạc là dùng các
tia laser xung có bước sống 500 nm, độ dài xung 6sn, tần số 10 hz công suất 12-14
mJ [34] chiếu vào dung dịch AgNO
3
như là nguồn kim loại và sodium dodecyl
sulfate (SDS) như chất hoạt động bề mặt để thu được hạt nano bạc. Kích thước của
hạt nano Ag tạo ra bằng phương pháp laser phụ thuộc vào chiều dài bước sóng và
cường độ của laser [9]. Phương pháp khử vật lý đơn giản hơn phương pháp khử

hóa học, tuy nhiên để tạo tác nhân vật lý cần thiết bị hiện đại và mắc tiền.
1.3.4.Phương pháp khử hóa lý
Đây là phương pháp trung gian giữa hóa học và vật lý. Nguyên lý là dùng
phương pháp điện phân kết hợp với sóng siêu âm để tạo hạt nano. Phương pháp
điện phân thông thường chỉ có thể tạo được màng mỏng kim loại. Trước khi xảy ra
15



sự hình thành màng, các nguyên tử kim loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các hạt
nano bám lên điện cực âm. Lúc này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ
với xung điện phân thì hạt nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung
dịch[2].
1.3.5.Phương pháp khử sinh học
Phương pháp sinh học sử dụng các tác nhân như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm có
khả năng khử ion bạc tạo nguyên tử bạc kim loại.


Từ lâu người ta đã biết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc giữ
vai trò quan trọng trong việc xử lý các độc tố kim loại nhờ khả năng khử các ion
kim loại. Sastry và cộng sự [10] đã nhận thấy có sự hình thành các hạt nano vàng
khi cho loài nấm Verticillum sp tiếp xúc với ion vàng. Klaus và cộng sự [13] cũng
đã chứng minh được có sự hiện của nano bạc trong vùng chu chất của Pseudomonas
stutzeri AG259 khi cho vi khuẩn này tiếp xúc với dung dịch bạc nitrate. Tuy nhiên
việc áp dụng đặc tính khử kim loại để biến vi sinh vật thành các nhà máy sản xuất
các hạt nano kim loại chỉ mới được quan tâm đến trong thời gian gần đây [36].
Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: thiết bị nuôi cấy đơn giản, môi
trường nuôi cấy rẻ tiền, không phụ thuộc nhiều vào hóa chất và thiết bị đắt tiền, dễ
thực hiện, thân thiện với môi trường do không sử dụng các hóa chất độc hại. Ngoài
ra nó có thể áp dụng với quy mô sản xuất lớn mà chi phí đầu tư ban đầu lại rất thấp

[13]. Vì vậy, các nhà nghiên cứu ngày càng quan tâm đến các phương pháp sinh
tổng hợp. Phương pháp sinh tổng hợp tạo ra các hạt nano bạc có độ phân bố khá
đồng đều và có khả năng sản xuất với qui mô lớn do các hạt được ổn định ngay
trong quy trình sản xuất bởi các protein.
Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc:
Nấm: Fusarium oxysporum [10], Fusarium semitectum [11], Aspergillus
fumigatus[13], Aspergillus flavus [36], Phaenerochaete chrysosporium [37],
Penicillium fellutanum [21], Verticillium sp [32]…
16



Vi khuẩn: Pseudomonas stutzeri [13],, Lactobacillus sp [35], Bacillus licheniformis
[19], Bacillus subtilis [31], Klebsiella pneumonia [27]…
Xạ khuẩn: Rhodococcus sp, Thermomonospora [11]…
Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở vi sinh vật vẫn chưa được tìm hiểu
tường tận nhưng đa số giả thuyết cho rằng quá trình này liên quan đến hoạt động
của enzyme khử nitrate (nitrate reductase) do vi sinh vật tiết ra. Quá trình khử bắt
đầu bởi sự vận chuyển electron từ các chất cho electron đến Ag
+
để khử các ion Ag
+

tạo thành các nguyên tử Ag. Các enzyme phụ thuộc NADH như nitrate reductase
đóng vai trò chất vận chuyển điện tử. Bên cạnh các enzyme này, một số
naphthoquinone và anthraquinone tìm thấy ở nấm Fusarium oxysporum cũng có thể
đóng vai trò chất truyền điện tử trong quá trình khử kim loại bởi tính chất oxi hóa
khử đặc trưng của chúng [10],[15].

Hình 1.6. Cơ chế giả thuyết của quá trình sinh tổng hợp nano bạc
17



Dựa vào vị trí của các đám nguyên tử nano bạc được tổng hợp mà người ta
chia quá trình tổng hợp sinh học thành hai dạng:
Tổng hợp nội bào: sản phẩm nano bạc tạo ra nằm bên trong tế bào. Các
chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc nội bào là Psedomonas
stutzeri[13], Rhodococcus sp[11], Verticillium sp [13], Bacillus licheniformis [19]
Vì sản phẩm nano bạc tạo ra nằm trong tế bào nên để nhận được sản phẩm
cần phải phá vỡ màng tế bào bằng hóa chất hoặc sóng siêu âm, sau đó ly tâm tách
bỏ các mãnh vỡ tế bào. Theo S.Basavaraja [11] ưu điểm của quá trình này là có thể
kiểm soát được kích thước hạt nano bạc.
Tổng hợp ngoại bào: sản phẩm được tạo ra nằm bên ngoài tế bào vi sinh vật.
Các chủng Fusarium oxysporum [10], Fusarium semitectum [11], Aspergillus
fumigatus [13], Aspergillus flavus [36], Phaenerochaete chrysosporium [11],
Lactobacillus sp [20], Thermomonospora [11], Penicillium fellutanum [21],
Pleurotus sajor caju [29] … tổng hợp nano bạc theo kiểu này.

Để thu sản phẩm nano bạc ngoại bào cần dùng các phương pháp tách tế bào
ra khỏi dịch nuôi cấy như ly tâm, lọc… sau đó thu lấy phần dịch nổi.
Theo tài liệu [11], ưu điểm của quá trình này là không cần đến các phương
pháp phá màng tế bào để thu nhận sản phẩm.
1.4. Sơ lược về Bacillus licheniformis
1.4.1 Phân loại khoa học vi khuẩn B.licheniformis [16]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: B. licheniformis
18



1.4.2.Đặc điểm hình thái, sinh hóa
Hình thái: Là vi khuẩn Gram dương,
hình que, có khả năng di động và khả năng
tạo nội bào tử gần như hình cầu giúp nó tồn
tại trong thời gian dài khi gặp điều kiện sống
khắc nghiệt.
Bộ gen: có chiều dài là 4,22Mb chứa
khoảng 4200 gen mã hóa cho 4192
protein[47].
Phân bố: Vi khuẩn này hiện diện chủ yếu trong đất, gần đây nó còn được
phát hiện trong lông chim
Đặc điểm sinh hóa: B. licheniformis cho phản ứng catalase dương tính, sử
dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất.

Có thể tổng hợp một lượng lớn enzyme amylase và protease [1]. Có khả năng gây
ngộ độc thực phẩm với các triệu chứng như: đau bụng, tiêu chảy, nôn mữa [7].
1.4.3.Đặc điểm nuôi cấy
Là vi khuẩn ưa nhiệt có thể sống ở nhiệt độ 55
o
C, pH thích hợp cho sự phát
triển là pH=7.
Không giống với các thành viên khác trong nhóm Bacillus là các vi sinh vật
hiếu khí, Bacillus licheniformis là vi sinh vật kị khí tuỳ ý.
Sau 16–18 giờ nuôi cấy, vi khuẩn mọc thành váng trên bề mặt môi trường.
B.licheniformis dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, khuẩn lạc có
màu trắng đục, lồi, bề mặt sần sùi.
Vi khuẩn này thường được sử dụng trong công nghiệp chất tẩy, bột giặt, xử
lý nước do có khả năng tiết enzyme protease, amylase ngoại bào. Được dùng làm
thuốc trừ nấm bệnh trên cây trồng do có khả năng tạo ra kháng sinh chống lại một
số loại nấm [42].
Hình 1.7. Vi khuẩn B.licheniformis
19




1.4.4. Sinh tổng hợp nano bạc bởi B.licheniformis
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp
nano bạc nội bào khi cho nó tiếp xúc với dung dịch muối nitrate bạc [19].
Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở loài này vẫn chưa được xác định
cụ thể. Nhưng theo nhóm tác giả [19] thì B. licheniformis có khả năng tổng hợp
NADH và các enzyme phụ thuộc vào NADH ở bên trong tế bào của nó, trong đó
quan trọng nhất là enzyme nitrate reductase (enzyme khử nitrate). Enzyme này có
vai trò khử gốc NO

3
-
và vận chuyển electron từ chất cho electron là NADH đến chất
nhận là Ag
+
để khử Ag
+
thành Ag
0
.








1.5. Sơ lược về Bacillus subtilis

1.5.1 Phân loại khoa học vi khuẩn B.subtilis [16]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Hình 1.8. Cơ chế tổng hợp nano bạc ở vi khuẩn B.licheniformis
20



Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
1.5.2.Đặc điểm hình thái, sinh hóa
Là trực khuẩn gram dương, hình que,
kích thước 1,5 µm, có tính di động, không
sinh hơi (không đồng hóa đường đến CO
2
), có
khả năng hình thành bào tử theo chu kì phát
triển tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi.
Bộ gen của vi khuẩn này có chiều dài
4,21Mb với hơn 4200 gen mã hóa cho 4106
protein [47].
Lên men đường mạnh với glucose, saccharose, mannose, maltose; không lên
men với mannit, lactose, rhamnose, arabinose [25]. Nhạy cảm với ciprofloxacine,
bactrim, erytromycine; kém nhạy cảm với ampicilline, pennicillin, cefotaxim. Loài
này có thể tạo ra nhiều enzyme protease, amylase, thời gian nuôi cấy để thu được 2
enzyme trên cực đại là 96 giờ, và lượng enzyme này giảm dần ở 120 giờ.
B. subtilis có khả năng tổng hợp nhiều amino acid như citrulline, tyrosine,
proline, aspartic và các amino acid thay thế như lysine, valine, threonine, isoleucine.
Ngoài ra, nó còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh như: Bacillopectin,
Mycobacillin, Subtilin, Bacitracin… có tác dụng ức chế hay tiêu diệt một số vi sinh
vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm và gram dương. Nhờ đó mà B. subtilis
có khả năng cạnh tranh tốt với các vi khuẩn khác [38].
1.5.3.Đặc điểm nuôi cấy
B. subtilis dễ mọc ở các môi trường nuôi cấy thông thường, phát triển tốt
trong môi trường dinh dưỡng có pH = 6,8 – 7,4. Nhiệt độ thích hợp là 37
0
C. Sau

16–18 giờ nuôi cấy, vi khuẩn mọc thành váng trên bề mặt, lắc nhẹ váng vỡ ra và
Hình 1.9. Vi khuẩn B.subtilis
21



chìm xuống đáy, làm đục môi trường nhẹ nhưng không đều. Trên bề mặt thạch,
khuẩn lạc không màu hay có màu trắng đến xám, bề mặt khuẩn lạc bóng và có chóp
lồi ở giữa [3].
1.5.4. Sự tạo thành bào tử
Đa số tế bào sinh dưỡng của B. subtilis đều tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy.
Bào tử có hình bầu dục, kích thước nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng bình thường vài lần
nên trong tế bào có thể có từ 1 -3 bào tử, kích thước của bào tử thường là 0,9 x
0,6µm, nội bào tử nằm gần tâm hoặc lệch tâm, không làm biến dạng tế bào mẹ. Bào
tử chịu được nhiệt độ cao và có thể tồn tại lâu trong điều kiện khắc nghiệt: ở 110
0
C
tồn tại trong 180 phút, sống lâu trong môi trường chất diệt khuẩn như phenol, H
2
O
2
,
…tồn tại đến 15 ngày trong dung dịch phenol 5%. Tính ổn định với nhiệt độ liên
quan đến sự có mặt trong bào tử nhiều ion Ca
+
, acid dipicolinic (acid piridin 2-6
dicarbonic). Acid này liên kết với protein của bào tử thành một phức chất có tính ổn
định cao với nhiệt độ. Bào tử chứa nhiều cysteine hơn so với tế bào sinh dưỡng.
Điều này có liên quan đến tính ổn định cao của bào tử đối với chiếu xạ. Enzyme và
các chất hóa học khác trong bào tử ở trạng thái bất hoạt và chỉ hoạt động khi bào tử

bắt đầu nảy mầm, khi gặp điều kiện thuận lợi tạo thành một tế bào sinh dưỡng mới.
1.5.5. Sinh tổng hợp nano bạc bởi B.subtilis
B. subtilis là một loài vi khuẩn thường gặp, có mặt trong nhiều hệ sinh thái
như đất, nước, không khí và nó không phải là mầm bệnh trong môi trường [31]. Với
những đặc tính này, B. subtilis là một đối tượng tốt để nghiên cứu khả năng sinh
tổng hợp nano bạc bởi vi khuẩn.
1.6. Phương pháp xác định tính chất và kích thước hạt nano bạc
Một vấn đề thiết yếu trong việc nghiên cứu này là xác định và nghiên cứu
các phần tử nano bạc. Bước đầu tiên là xác định các hạt nano bạc có được tạo thành
sau quá trình tổng hợp hay không. Thêm vào đó, mô tả đặc điểm của chúng để khảo
sát kích thước, hình dạng, số lượng cũng quan trọng. Một số thiết bị sử dụng xác
22



định các tính chất lý-hóa của các vật liệu nano: kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic
Force Microscopy – AFM), kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electro Microscopy
– SEM), phổ hấp thụ nguyên tử (Absorbance Atomic Spectroscopy), máy đo phổ tử
ngoại khả kiến (UV-Vis), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), máy đo nhiễu xạ
tia X (XRD) [31]. Trong phạm vi luận văn này, các phương pháp phổ UV-Vis,
TEM và XRD được đề cập
1.6.1. Phương pháp phổ tử ngoại và phổ khả kiến – UV-Vis
Phổ tử ngoại và khả kiến, viết tắt là UV-Vis (Ultraviolet-Visible) là phương
pháp phân tích được sử dụng rộng rãi từ lâu [5], [45].
Phương pháp này dùng để xác định độ tinh khiết của một hợp chất, nhận biết
cấu trúc các chất, phân tích hỗn hợp xác định khối lượng phân tử, dự đoán kích
thước phân tử … khi tiến hành đo phổ của các mẫu thì mỗi mẫu sẽ cho ta một dạng
phổ có chiều cao đỉnh phổ xác định và đặc trưng cho dạng hợp chất đó. Do vậy khi
đo phổ hấp thu của dung dịch bạc nano ta sẽ thu được dạng phổ có đỉnh với chiều
cao lớn nhất ứng với bước sóng khoảng 400 - 450 nm. Từ kết quả đó ta sẽ xác định

được sơ bộ rằng ta đã chế tạo ra dung dịch bạc nano và cũng dự đoán được kích
thước hạt nano bạc theo các công trình công bố [28].











Hình1.10. Máy
đo UV
-
V
is

Cary
-

100


23

1.6.2. Kính hiển vi điện tử truyền qua
Kính hiển vi điện tử truyền qua - Transmission Electron Microscopy (TEM)
là một công cụ rất mạnh trong việc nghiên cứu cấu trúc ở cấp độ nano. Nó cho phép
quan sát chính xác cấu trúc nano với độ phân giải lên đến 0,2 nm. Do đó, phương
pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu vật liệu nano.
Nguyên tắc của phương pháp hiển vi điện tử truyền qua: trong phương pháp này,
hình ảnh thu được chính là do sự tán xạ của chùm electron xuyên qua mẫu [43].
Công dụng chủ yếu của thiết bị này là để xác định một cách chính xác kích
thước của hạt nano mà cụ thể ở đây là hạt nano bạc tạo thành. Dựa vào ảnh chụp các
phần tử nano bạc bằng kính hiển vi điện tử truyền qua chúng ta xác định được kích
thước và hình dáng của hạt nano tạo thành, đồng thời xem xét xem kích thước đó đã
đảm bảo là tốt hay chưa để hoạch định quá trình điều chế nano bạc.











Hình 1.11. Hệ thống hiển vi điện tử truyền qua JEM-1400

24



1.6.3. Máy đo nhiễu xạ tia X

Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray
diffraction) được sử dụng để phân tích các vật
liệu có cấu trúc, nó cho phép xác định hằng số
mạng và các đỉnh đặc trưng cho các cấu trúc đó.
Đối với kim loại, phương pháp XRD cho phép
xác định chính xác sự tồn tại của kim loại trong
mẫu dựa trên các đỉnh thu được so sánh với các
đỉnh chuẩn của nguyên tố đó.













Hình 1.12. Máy XRD D8 Advance