Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý ems đến sinh trưởng phát triển và hàm lượng alkaloid tổng số của cây dừa cạn (catharanthus g don) nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI






TRẦN THỊ HIỀN



NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ EMS ðẾN SINH
TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG ALKALOID
TỔNG SỐ CỦA CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS
G.DON) NUÔI CẤY IN VITRO




LUẬN VĂN THẠC SĨ







HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI






TRẦN THỊ HIỀN


NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ EMS ðẾN SINH
TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG ALKALOID
TỔNG SỐ CỦA CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS
G.DON) NUÔI CẤY IN VITRO



CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH




HÀ NỘI – 2013
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực
và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược
cám ơn và các thông tin trích dẫn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñược bản luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự
chia sẻ và giúp ñỡ. Qua ñây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới:
- PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã tận tình hướng dẫn, tạo ñiều
kiện, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh luận văn.
- Tập thể các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học- Khoa
Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã nhiệt tình giúp
ñỡ tôi trong quá trình thực tập.
- Tập thể cán bộ Viện nghiên cứu Sinh học Nông Nghiệp – Trường ðại
học Nông nghiệp ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt ñề tài tốt
nghiệp.
- Cảm ơn gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã ñộng viên,
giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Tác giả luận văn

Trần Thị Hiền




Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iv

MỤC LỤC

Lời cam ñoan 0
Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục các chữ viết tắt vii
Danh mục bảng viii
Danh mục hình x
Tóm tắt xii
MỞ ðẦU 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 Giới thiệu chung về cây Dừa cạn 4
1.1.1 Tên gọi 4
1.1.2 Nguồn gốc, phân bố 4
1.1.3 Phân loại 4
1.1.4 ðặc ñiểm thực vật học 5
1.1.5 Trồng trọt và thu hoạch 5
1.2 Các alkaloid – thành phần hóa học quan trọng nhất của Dừa cạn 6
1.2.1 Khái niệm 6
1.2.2 Một số hợp chất alkaloid chính có trong cây Dừa cạn 7
1.3 Tác dụng dược lý của cây Dừa cạn 11

1.3.1 Tác dụng trong dân gian. 11
1.3.2 Tác dụng chống ung thư của alkaloid từ Dừa cạn 11
1.3.3 Ứng dụng các alkaloid của Dừa cạn trong ñiều trị bệnh 13
1.4 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 14
1.4.1 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn trên thế giới 14
1.4.2 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn ở Việt Nam. 17
1.5 ðột biến di truyền và phương pháp xử lý ñột biến bằng EMS 18
1.5.1 ðột biến di truyền 18
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
v

1.5.2 Ethyl methane sulphonate (EMS) – Tác nhân gây ñột biến hóa
học 21
2.6 Các nghiên cứu về xử lý EMS trong công tác chọn giống 22
Chương 2 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 24
2.1 ðối tượng, vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu 24
2.2 Nội dung nghiên cứu: Bao gồm 3 nội dung chính 24
2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 24
2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển và sự
biến dị của các dòng Dừa cạn sau xử lý EMS in vitro 28
2.3 Phương pháp nghiên cứu 29
2.3.1 Bố trí thí nghiệm 29
3.2.2 Phương pháp tiến hành 30
2.3.3 Cách tính các chỉ tiêu 31
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
3.1 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 34
3.1.1 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự phát sinh hình
thái từ mô Dừa cạn in vitro. 34
3.1.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 1,0 mg/l α-NAA ñến sự sinh trưởng

phát triển và hệ số nhân chồi của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa
cạn in vitro. 45
3.1.3 Ảnh hưởng của một số chất ñiều tiết sinh trưởng ñến khả năng
tạo cây hoàn chỉnh in vitro 47
3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phổ ánh sáng và cường ñộ chiếu sáng
ñến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Dừa cạn in vitro 53
3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển
của cây Dừa cạn in vitro. 55
3.2.1 Nghiên cứu xử lý ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn trong dung
dịch có bổ sung EMS 57
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vi

3.2.2 Nghiên cứu xử lý nuôi cấy ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn
trong môi trường có bổ sung EMS. 60
3.2.3 Nghiên cứu xử lý nuôi ñoạn thân không mang mắt ngủ Dừa cạn
trong môi trường có bổ sung EMS. 63
3.2.4 Phân tích hàm lượng alkaloid của dòng Dừa cạn ñã xử lý EMS in
vitro và cây Dừa cạn không xử lý EMS. 65
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 67
1 Kết luận 67
2 ðề nghị 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68
PHỤ LỤC 71

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA : Benzyl adenin
CT : Công thức
CTTD : Chỉ tiêu theo dõi
CTTN : Công thức thí nghiệm
CV (%) : Sai số thí nghiệm
ðC : ðối chứng
ðTST : ðiều tiết sinh trưởng
EMS : Ethyl methane sulphonate
HSN : Hệ số nhân
IBA : Axit β – indol butyric
Ki : Kinetin
LSD
0,05
: ðộ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%
M : Mẫu
MS : Môi trường Murashige and Skoog
NXB : Nhà xuất bản
TB : Trung bình
α – NAA : Axit α – naphtyl axetic

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
viii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

3.1 Ảnh hưởng của auxin ñến tỷ lệ phát sinh hình thái từ mô Dừa cạn in vitro 35
3.2 Ảnh hưởng của cytokinin ñến tỷ lệ phát sinh hình thái từ mô
Dừa cạn in vitro 37

3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp 2.4D và Kinetin ñến sự phát sinh hình thái
từ mô Dừa cạn in vitro 41
3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và BA ñến sự phát sinh hình thái
từ mô Dừa cạn in vitro 43
3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA ñến sự sinh trưởng phát triển
của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro 45
3.6 Ảnh hưởng của α - NAA và than hoạt tính ñến sự tạo rễ của
chồi Dừa cạn in vitro 48
3.7 Ảnh hưởng IBA ñến sự tạo rễ của chồi Dừa cạn in vitro 50
3.8 Ảnh hưởng tổ hợp α - NAA và IBA ñến sự tạo rễ của chồi Dừa
cạn in vitro 51
3.9 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng và cường ñộ chiếu sáng ñến sự sinh trưởng
và phát triển của chồi Dừa cạn in vitro sau 4 tuần nuôi cấy. 54
3.10 Tỷ lệ sống, bật chồi và biến dị của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa
ñược xử lý trong dung dịch bổ sung EMS với thời gian và nồng
ñộ khác nhau. 57
3.11 Ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển của ñoạn thân
mang mắt ngủ Dừa cạn ñược xử lý trong dung dịch bổ sung
EMS với thời gian và nồng ñộ khác nhau. 59
3.12 Tỷ lệ sống, bật chồi và biến dị của ñoạn thân mang mắt ngủ
ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung EMS trong 4 tuần 61
3.13 Ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển cùa ñoạn thân
mang mắt ngủ ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung EMS 61
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ix

3.14 Ảnh hưởng của EMS ñến tỷ lệ sống, tạo callus, tạo chồi và biến
dị của ñoạn thân không mang mắt ngủ ñược nuôi cấy trong môi
trường có bổ sung EMS (sau 6 tuần theo dõi) 63
3.15 Hàm lượng alkaloid tổng số của 6 mẫu ñem phân tích 65

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
x

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Cấu trúc phân tử của Vindoline
7
1.2 Cấu trúc phân tử của Catharanthine
8
1.3 Cấu trúc phân tử của Vinblastine
8
1.4 Cấu trúc phân tử của Vincristine
9
1.5 Cấu trúc phân tử của Vindesine
10
1.6 Cấu trúc phân tử của Vinorelbine
10
1.7 Cấu trúc phân tử của Vinflunine
10
3.1 Ảnh hưởng của một số auxin và cytokinin ñến sự phát sinh hình
thái của mô Dừa cạn
39
3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và 2,4D ñến sự phát sinh hình thái
từ mô Dừa cạn (sau 6 tuần nuôi cấy).
42
3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA ñến sự phát sinh hình thái
từ mô Dừa cạn

44
3.4 ðộng thái tạo chồi từ callus Dừa cạn nuôi cấy trên môi trường
phát sinh hình thái tốt nhất (MS+1,0mg/l α-NAA+2,0mg/l BA)
qua các giai ñoạn
45
3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA sự sinh trưởng phát triển và
hệ số nhân chồi của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro
46
3.6 Ảnh hưởng của α - NAA và than hoạt tính ñến sự tạo rễ từ chồi
Dừa cạn in vitro
49
3.7 Ảnh hưởng của IBA ñến sự tạo rễ từ chồi Dừa cạn in vitro
51
3.8 So sánh sự tạo rễ của 3 môi trường tạo rễ bổ sung chất ñiều tiết
sinh trưởng khác nhau
52
3.9 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng và cường ñộ chiếu sáng ñến sự
sinh trưởng phát triển của chồi Dừa cạn in vitro
55
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
xi

3.10 Các dạng biến dị thu ñược trong quá trình nuôi cấy in vitro sau
xử lý EMS
56
3.11 Sư sinh trưởng phát triển cùa ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn
ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung nồng ñộ thấp EMS
trong 4 tuần
62
3.12 ðoạn thân không mang mắt ngủ nuôi cấy trên môi trường bổ

sung EMS
64
3.13 Sắc ký ñồ sắc ký lớp mỏng 6 mẫu Dừa cạn
66



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
xii

TÓM TẮT
Dừa cạn là một trong những cây thuốc quý ñã ñược sử dụng từ lâu ñời. Các
alkaloid chiết xuất từ Dừa cạn là một nhóm chất hữu cơ ñang ñược các nhà nghiên
cứu rất quan tâm bởi vì tác dụng chữa bệnh của nó, ñặc biệt là chữa bệnh ung thư.
Với mục ñích tìm ra quy trình nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn ñể làm cơ sở cho các
nghiên cứu về tạo giống ñột biến và chuyển gen nâng cao hàm lượng aklaoid sau
này, ñồng thời theo dõi, ñánh giá sinh trưởng, phát triển và hàm lượng alkaloid tổng
số ñược tích lũy trong cây Dừa cạn ñã ñược xử lý EMS in vitro. Vì vậy chúng tôi tiến
hành ñề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS ñến sinh trưởng phát
triển và hàm lượng alkaloid tổng số của cây Dừa cạn nuôi cấy in vitro (Catharanthus
roseus. G. Don)”

Nội dung báo cáo gồm 2 phần chính là: Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn và ảnh
hưởng của xử lý EMS ñến sinh trưởng phát triển và hàm lượng alkaloid tổng số của
cây Dừa cạn in vitro.
Sau khi tiến hành thí nghiệm chúng tôi ñã tìm ra ñược: môi trường phát sinh
hình thái tốt nhất cho nuôi cấy mô lá và mô thân Dừa cạn là: MS+1,0mg/l α-
NAA+2,0mg/l BA; môi trường nhân nhanh tốt nhất là: MS+1,0mg/l α-
NAA+3,0mg/l BA; môi trường tạo rễ tốt nhất là: MS+1,0mg/l IBA; ánh sáng của
ñèn HQNN T8-36W NCM 55 và cường ñộ ánh sáng phù hợp nhất cho cây Dừa cạn

in vitro sinh trưởng phát triển là 3 bóng tương ñương 60(µmol/m
2
/s); xử lý ñoạn
thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro trong dung dịch EMS ở nồng ñộ 0,05%-1h thì
cây có sức sinh trưởng tốt nhất và ở nồng ñộ 0.15% -2h thì tạo ra tỷ lệ biến dị cao
nhất; xử lý nuôi cấy ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro trong môi trường có
bổ sung 0,005% EMS thì mẫu cấy sinh trưởng và phát triển tốt nhất và trong môi
trường có bổ sung 0,02% EMS thì tạo ra tỷ lệ tạo biến dị cao nhất; nuôi ñoạn thân
không mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro trong môi trường có bổ sung EMS trong thời
gian 6 tuần thì mẫu cấy ñược nuôi trên môi trường có bổ sung nồng ñộ 0,005%
EMS là có tỷ lệ sống, tạo callus, tạo chồi và tạo biến dị ñều cao nhất; Chồi Dừa cạn
phát sinh từ ñoạn thân sống sót sau khi xử lý EMS ở nồng ñộ 0,2%-1h và ñược nuôi
cấy in vitro trong môi trường tạo rễ (MS + 1,5 mg/l IBA) trong 6 tuần là mẫu có hàm
lượng alkaloid tổng số cao nhất.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
1

MỞ ðẦU

1. ðặt vấn ñề
Sức khỏe từ lâu vẫn là mối quan tâm hàng ñầu của nhân loại. Sự phát triển
của khoa học kỹ thuật trở thành công cụ hữu ích giúp con người tìm ra nguyên
nhân và cách thức ñể chiến thắng bệnh tật. Tuy nhiên, có nhiều căn bệnh hiện
vẫn là câu hỏi lớn chưa có lời giải ñáp. Ung thư là một trong số ñó. Mỗi năm trên
toàn cầu có thêm 12,7 triệu người mắc bệnh ung thư và 7,6 triệu người chết vì
căn bệnh này. Ung thư ñang dần vượt qua bệnh tim mạch trở thành nguyên nhân
gây tử vong hàng ñầu thế giới.
Trước thực trạng trên, tìm ra phương pháp chữa bệnh ung thư ñã trở thành yêu
cầu ngày càng cấp bách. Nhiều phương pháp, hóa chất ñã ñược sử dụng nhằm mục

ñích ñẩy lùi căn bệnh này. Bên cạnh thuốc có nguồn gốc vi sinh vật thì thuốc có nguồn
gốc thực vật có vai trò hết sức quan trọng trong việc ñảm bảo nhu cầu chữa bệnh ngày
càng tăng.
Dừa cạn Catharanthus roseus. G. Don thuộc họ trúc ñào Apocynaceae là một
trong những loại cây cảnh phổ biến ñồng thời cũng là một loại thảo dược quý.
Trong dân gian Dừa cạn có thể ñược dùng như một vị thuốc ñể ñiều trị một
số bệnh như: cao huyết áp, tiểu ñường, tiêu hoá kém, ñi tiểu ñỏ, giun sán…
Những năm gần ñây, các alkaloid chiết xuất từ Dừa cạn là một nhóm chất
hữu cơ ñang ñược các nhà nghiên cứu rất quan tâm. Năm 1958, Noble và cộng sự ñã
chiết ñược một alkaloid từ lá Dừa cạn là: vinblastine. Sau ñó 4 năm, Svoboda và cộng
sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincristine. ðây là hai trong số các alkaloid ñã
ñược khẳng ñịnh có hiệu quả lâm sàng trên ung thư. Tuy nhiên hàm lượng các
alkaloid này trong Dừa cạn rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá Dừa cạn khô ñối với
vinblastine, còn ñối với vincristine thì ít hơn 10 lần nữa ). Cho nên quá trình tách
chiết hai alkaloid này từ cây Dừa cạn phải trải qua khá nhiều công ñoạn phức tạp vì
vậy giá thành thuốc chữa bệnh ung thư có nguồn gốc từ cây này khá cao.
ðến nay, người ta ñã xác ñịnh ñược trong Catharanthus roseus có hơn 150
alkaloid từ các bộ phận khác nhau và có rất nhiều alkaloid khối lượng phân tử nhỏ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
2

có tác dụng chữa bệnh. Một số alkaloid ñiển hình có thể kể ñến như: Vindoline và
Catharanthine ñược sử dụng trong ñiều trị bí tiểu, hạ lượng ñường trong máu và là
hai tiền chất ñể bán tổng hợp lên vinblastine và vincristine; Ajmalicine là chất có
biệt tính dược học mạnh dùng trong ñiều trị bệnh cao huyết áp, dùng làm thuốc
giảm ñau và ñiều trị các bệnh về thần kinh; Serpentine dùng ñiều trị bệnh cao huyết
áp và an thần.… (Cao Thị Thanh Loan, 2007).
Trong khi nhu cầu về alkaloid Dừa cạn rất lớn và giá của chúng rất cao,
nhưng hàm lượng alkaloid trong nguyên liệu thô thu nhận từ cây Dừa cạn trong tự
nhiên lại rất thấp, nhiều nơi trên thế giới không có ñiều kiện tự nhiên phù hợp ñể Dừa

cạn có thể sinh trưởng phát triển tốt. Do ñó, việc nuôi cấy thu sinh khối lớn Dừa cạn
in vitro và cải thiện hàm lượng alkaloid là hướng ñi mới ñược các nhà khoa học rất
quan tâm. Trên thế giới và Việt Nam ñã có những công bố về ảnh hưởng của chất
ñiều tiết sinh trưởng giúp cải thiện hàm lượng alkaloid chứa trong mô cơ quan Dừa
cạn in vitro nhưng chưa có nghiên cứu nào về ảnh hưởng của hóa chất gây ñột biến
tới sự sinh trưởng, phát triển và hàm lượng alkaloid có trong cây này.
EMS (Ethyl methane sulphonate) là hợp chất hóa học nằm trong nhóm các
hợp chất alkyl hóa, có thể gây nên những ñột biến ñiểm và mất ñoạn nhỏ DNA. Hóa
chất này ñã ñược sử dụng hiệu quả trong công tác chọn tạo giống mới của một số
loại cây: cẩm chướng, cúc…
Với mục ñích tìm ra quy trình nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn ñể làm cơ sở cho
các nghiên cứu về tạo giống ñột biến và chuyển gen nâng cao hàm lượng aklaoid
sau này, ñồng thời theo dõi, ñánh giá sinh trưởng, phát triển và hàm lượng alkaloid
tổng số ñược tích lũy trong cây Dừa cạn ñã ñược xử lý EMS in vitro. Vì vậy chúng tôi
tiến hành ñề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS ñến sinh trưởng
phát triển và hàm lượng alkaloid tổng số của cây Dừa cạn(Catharanthus roseu G.
Don) nuôi cấy in vitro”
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
3

2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài
2.1. Mục ñích
- Nuôi cấy ñược cây Dừa cạn in vitro ñể làm cơ sở cho các nghiên cứu về tạo
giống ñột biến và chuyển gen sau này.
- Bước ñầu xác ñịnh ảnh hưởng của xử lý EMS in vitro ñến sinh trưởng, phát
triển và hàm lượng alkaloid tổng số của cây Dừa cạn in vitro.
2.2. Yêu cầu
- ðánh giá ñược sự phát sinh hình thái của mô lá và ñoạn thân không mang mắt
ngủ Dừa cạn in vitro.
- Xác ñịnh ñược môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng phát triển của ñoạn thân

mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro.
- Xác ñịnh ñược môi trường tối ưu cho tạo rễ cây Dừa cạn in vitro.
- ðánh giá khả năng sinh trưởng và sự biến dị của các dòng Dừa cạn sau xử
lý EMS in vitro
- ðánh giá ñược hàm lượng alkaloid tổng số của Dừa cạn in vitro và cây Dừa
cạn in vitro ñã ñược xử lý EMS.
2.2. Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của ñề tài
Xây dựng ñược quy trình nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn và xác ñịnh ñược ảnh
hưởng của các nồng ñộ EMS xử lý ñến sinh trưởng phát triển và hàm lượng
alkaloid của cây Dừa cạn. Từ ñó, xác ñịnh ñược nồng ñộ xử lý EMS thích hợp tạo
tiền ñề cho công tác chọn tạo giống cây Dừa cạn bằng phương pháp xử lý ñột biến
bằng hóa chất EMS.
Kết quả nghiên cứu của ñề tài chính là cơ sở ñể tiếp tục nghiên cứu tạo dòng
ñột biến, nguồn nguyên liệu cho việc chọn tạo giống Dừa cạn mới. ðồng thời kết
quả cũng là tư liệu giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và chọn tạo
giống cây trồng.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Dừa cạn
1.1.1. Tên gọi
Tên khoa học: Catharanthus roseus (L) G. Don; Vinca rosea L; Lochnera rosea
Reich.
Tên khác: Dừa cạn, Bông dừa, Hoa hải ñằng, Trường xuân hoa, Phjắc pót
ñông (Tày), Dương giác, Madagascar periwinkle
Họ: Trúc ñào (Apocynaceae).

1.1.2. Nguồn gốc, phân bố
Theo Rajiendra Gupta (1970), Dừa cạn có nguồn gốc từ Jamaica, phân bố
dọc theo vùng ven biển Châu Phi và có mặt ở các nước ðông Nam Á.
Vào giữa thế kỷ 18, Dừa cạn ñược trồng ở Paris, sau ñó có mặt ở nhiều vườn
thực vật khác ở Châu Âu.
Ở Việt Nam, Dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương ñối
ñặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh ñến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở
các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, ðà
Nẵng, Bình ðịnh và Phú Yên. Ngoài ra còn có ở Côn ðảo và Phú Quốc. Ở những
vùng phân bố tự nhiên ven biển, Dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi
cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu ñựng ñiều kiện ñất ñai
khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa cạn còn ñược trồng khắp nơi trong nước ñể làm
cảnh và làm thuốc.
1.1.3. Phân loại
Chi Catharanthus (thuộc họ trúc ñào Apocynaceae) gồm có 8 loài, hầu hết là cây
thân thảo lâu năm. Trong số ñó chỉ có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn
ðộ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ Madagascar. Số lượng nhiễm sắc thể
cho tất cả các loài Catharanthus ñều là 2n=16. Tám loài thuộc giống này ñó là:
• Catharanthus coriaceus
•Catharanthus lanceus
• Catharanthus longifolius
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
5

• Catharanthus ovalis
• Catharanthus pusillus
• Catharanthus roseus
• Catharanthus scitulus
• Catharanthus trichophyllus
Loài Catharanthus roseus khá phổ biến và chứa nhiều alkaloid nhất ñược

phân bố rộng rãi trên nhiều nước nhiệt ñới kể cả Việt Nam. Ở các nước Phương
Tây, cây này thường ñược biết dưới tên gọi Madagaska periwinkle hoặc Vinca
rosea L. (Trần Bạch Dương và cộng sự , 2008)
1.1.4. ðặc ñiểm thực vật học
-Thân: Dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40-60 cm, phân nhiều cành,
cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Mọc thành bụi dày.
- Lá: Lá mọc ñối, có hình ovan hay thuôn dài, ñầu lá hơi nhọn, cuống lá hẹp
nhọn, dài 4-6cm, rộng 2-3 cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt.
- Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ ở dưới ñất. Rễ cái ñâm thẳng xuống
ñất, có thể ñạt chiều dài từ 35 - 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn, phát trển theo
chiều ngang, vùng vỏ rễ là nơi tích lũy chủ yếu các alkaloid.
- Hoa: Hoa có màu từ trắng tới hồng sẫm với phần tâm có màu ñỏ, ống tràng
dài 2,5-3cm và tràng hoa ñường kính 2-5cm, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá
gần ngọn.
- Quả: Quả là 1 cặp quả ñại, dài 2-4cm, rộng 2-3mm, mọc thẳng ñứng, hơi ngả
sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, ñầu quả hơi tù, trong quả chứa 12-20 hạt.
- Hạt: Hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng.
1.1.5. Trồng trọt và thu hoạch
Dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu ñược hạn. Trong
ñiều kiện trồng trọt, khi ñược cung cấp ñầy ñủ ñiều kiện cần thiết, cây sinh trưởng
phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu ñược có thể cao gấp ñôi cây mọc từ thiên
nhiên. Cây mọc từ hạt trong tự nhiên vào khoảng 40%, nếu ñược xử lý có thể tăng
lên 90%. (H.Sutarno & Rudjiman, 1999)
Cây trồng từ hạt ra hoa sau 4-5 tháng. Trong thời kì sinh trưởng mạnh, nếu bị
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
6

cắt, cây tái sinh chồi khỏe. Vào năm 1970, Viện Dược Liệu ñã tiến hành nghiên cứu
kỹ thuật trồng Dừa cạn trên quy mô sản xuất. Cây ñược nhân giống bằng hạt, mỗi
hecta cần gieo 500-700gr hạt trong vườn ươm. Thời vụ gieo hạt vào tháng 9-10

hoặc tháng 1-2. Cần ngâm hạt 3-4 giờ, vớt ra ñể ráo rồi gieo lên luống vườn ươm ñã
ñược chuẩn bị kỹ. Sau ñó phủ rơm rồi tưới nước. Sau khoảng một tuần, hạt nảy
mầm, cần tháo bỏ rơm rạ. Khi cây có 3-4 ñôi lá thật (khoảng 40-45 ngày sau khi
gieo) ñánh ñi trồng. Có thể gieo thẳng nhưng cách này tốn công chăm sóc. Dừa cạn
ưa ñất pha cát, ñất phù sa, hơi chịu hạn nhưng kém chịu úng. ðất cần làm kỹ, lên
luống cao 20cm, mặt luống rộng 50-60cm, dùng 10-15 tấn phân chuồng hoai mục
và 120-150 kg super lân ñể bón lót. Trồng với khoảng cách 30x30cm, sau khi trồng
cần tưới ngay ñể cây mau bén rễ. Tưới thúc cho mỗi hecta 100-200kg ure, tưới 2
lần, cách nhau 1 tháng. Mặc dù cây chịu ñược hạn nhưng phải giữ ñủ ẩm thường
xuyên. Chú ý thoát nước nhanh sau khi mưa lớn. Khi mới trồng, cây thường bị sâu
xám phá hoại. Cây trong vườn có thể bị Phytophthora làm cho chết hàng loạt. Cần
tỉa bớt cho ñất thoáng và phun phòng bằng Boxdeaux. Sau khi trồng 3-4 tháng, cây
cho thu hoạch, cành mang lá dài 10-15cm ñược cắt về phơi sấy khô. Ở ñất thoát
nước và chăm bón tốt có thể thu hoạch nhiều lứa. Trung bình 1 hecta thu ñược 1-1,2
tấn lá khô mỗi lứa. (Viện Dược liệu, 2004)
1.2. Các alkaloid – thành phần hóa học quan trọng nhất của Dừa cạn
1.2.1. Khái niệm
Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, và có tính base. Thường
gặp trong nhiều loại thực vật và ñôi khi còn tìm thấy trong một vài loài ñộng vật.
ðặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao ñối với cơ thể con người và
ñộng vật, nhất là ñối với hệ thần kinh. Với chỉ một lượng nhỏ alkaloid là chất ñộc
gây chết người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh ñặc hiệu.
Hàm lượng alkaloid có thể ñạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng
như: khoai tây, chè, cà phê.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
7

1.2.2. Một số hợp chất alkaloid chính có trong cây Dừa cạn
Phần ở trên mặt ñất của cây chứa 0,2 – 1% alkaloid. ðã có khoảng 150
alkaloid ñược phân lập từ Cantharanthus. Nhờ sự phát triển của việc nghiên cứu tế

bào và các phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp mà số lượng các chất
ñược phát hiện ra ngày càng nhiều hơn.
Xét về mặt cấu trúc, các alkaloid chứa trong loài Cantharanthus tồn tại dưới
hai dạng monomer và dimmer. Theo I.S. Johnson và cộng sự thì có thể sắp xếp các
alkaloid này vào 3 nhóm lớn:
1. Các alkaloid monomer (như Vindoline, Catharanthine….)
2. Nhóm các alkaloid dimer indole – dihydroindole (loại vinblastine)
3. Các alkaloid dimer loại không phải vinblastine
1.2.1.1. Vindoline
Vindoline (C
25
H
32
N
2
O
6
) ñược Kamat và cộng sự phân lập từ năm 1958,
Gorman và cộng sự xác ñinh cấu trúc năm 1962, ñược nghiên cứu là có tác dụng hạ
ñường huyết. (Trần Nguyên Hữu và cộng sự, 2003). Các nghiên cứu tiếp theo cho
thấy Vindoline là một dihyroindol có thể dùng làm nguyên liệu ñể sinh tổng hợp và
tổng hợp hóa học tạo các dimer alkaloid.
Vindoline có nhiều trong lá Dừa cạn khoảng 3 tháng tuổi
Là tinh thể có ñiểm chảy 150-155
o
C [a]
26
D = -18
o
/CHCl

3
UV
max
212,254,304nm


Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của Vindoline

1.2.1.2. Catharanthine
Catharanthine (C
21
H
24
N
2
O
2
), ñược N. Neuss và M. Gorman phân lập và xác ñịnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
8

cấu trúc năm 1961, là alkaloid nhân indol tham gia vào cấu trúc của vinblastine.
Catharanthine ñược nghiên cứu là có tác dụng lợi tiểu. (Trần Nguyên Hữu và cộng sự,
2003).
Là tinh thể có ñiểm chảy 126-128
0
C[a]
26
D = +298
o

/CHCl
3
UV
max
226, 284, 292nm

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của Catharanthine

1.2.2.3. Vinblastine và vincristine
Phần ñược nhiều nhà khoa học quan tâm hơn cả là nhóm 20 alkaloid cấu trúc
ñôi phân tử có khả năng chống ung thư, ñáng chú ý là vinblastine và vincristine.
Các alkaloid này ñược cấu tạo từ hai phần: Một vòng indole và một vòng
dihydroindole. Vì vậy chúng ñược gọi là các alkaloid ñôi phân tử hay “bis-indole
alkaloid”. (Trần Nguyên Hữu và cộng sự, 2003).

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của Vinblastine

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
9


Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của Vincristine

• Sinh tổng hợp vinblastine và vincristine (Pahwa, D., 2008)
Vinblastine ñược cấu tạo bởi hai alkaloid ñơn phân tử là catharanthine (indole)
và vindoline (dihyroindole), cả hai chất này ñều có dạng tự do trong cây. Vincristine
có cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay cho nhóm N-methyl ở vòng indole ở
phần vindoline là nhóm N- formyl. Hàm lượng hai alkaloid này trong cây là rất nhỏ
(vincristine chỉ ñạt khoảng 0.0002% khối lượng trong dược liệu khô).
Mặc dù nhu cầu thực tế ñòi hỏi lượng vincristine nhiều hơn lượng vinblastine

nhưng cây lại sản xuất ra nhiều vinblastine hơn. Do ñó, người ta ñã tìm cách chuyển
từ vinblastine sang vincristine hoặc chất khác theo con ñường vi sinh sử dụng
Streptomyces albogryseolus ñể N-demethyl hóa. (Pahwa, D., 2008).
Hai alkaloid chống ung thư tự nhiên khác của Dừa cạn là vindesine và
vinorelbine ñã ñược phát triển thành sản phẩm chống ung thư. Gần ñây, vinflunine
có cấu trúc tương tự fluorinated, ñược chỉ ra có hoạt tính chống ung thư mạnh ñã
ñược ñưa vào các thử nghiệm lâm sàng giai ñoạn III tại Châu Âu từ năm 2005.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
10


Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của Vindesine


Hình 1.6. Cấu trúc phân tử của Vinorelbine

Hình 1.7. Cấu trúc phân tử của Vinflunine
Những thành công của việc bán tổng hợp alkaloid từ Dừa cạn dựa trên một giả
thuyết sinh học liên quan ñến catharanthine và vindoline là tiền chất. Vinblastine,
cũng như các alkaloid dimeric từ Dừa cạn khác, có thể là kết quả của sự kết hợp các
phần vindoline với một dẫn xuất trung gian xuất phát từ Catharanthine. Sau nhiều nỗ
lực nghiên cứu, một alkaloid kiềm vinblastine – có cấu hình S ở C18, ñược tạo thành
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
11

bằng cách áp dụng một chuyển hóa của phản ứng Polonovski, cũng ñược gọi là phản
ứng Polonovski – Potier, hoặc phản ứng nhờ enzyme peroxidase kiềm hay phản ứng
thông qua ion sắt trong môi trường acid, tạo thành alkaloid mới anhydro vinblastine,
có cấu hình 18’S tự nhiên. (Etiévant, C. et al., 2001).
Do ñược tổng hợp ñơn giản từ Catharanthine và Vindoline, anhydro

vinblastine ñược coi là một chất trung gian trọng ñiểm, hấp dẫn trong tổng hợp các
alkaloid dimeric khác. Từ anhydro vinblastine, bằng nhiều cách khác nhau, các nhà
nghiên cứu ñã tổng hợp nên nhiều loại thuốc chống ung thư nổi tiếng hiện nay như
vinblastine, vindesine, vinorelbine và vinflunine. (Tatsuya, S. et al., 2006).
Một số alkaloid có hoạt tính khác như leurosine (20’- epi vinblastine),
ajmalicine (Raubasine), lochnerine, serpentine và tetrahydroalstronine.
1.3. Tác dụng dược lý của cây Dừa cạn
1.3.1. Tác dụng trong dân gian.
Trong dân gian, người ta thường sử dụng nước sắc Cantharanthus roseus
với tác dụng lợi tiểu, hạ ñường huyết, chữa bệnh lỵ, bệnh xuất huyết hoặc chữa vết
thương hở. Ở Châu Âu, Bắc Phi và Trung Phi, nước sắc của Dừa cạn ñược sử dụng
làm thuốc lợi tiểu, giảm xung huyết phổi, chữa bệnh viêm họng. Ở Mỹ, Dừa cạn
ñược dùng dưới dạng thuốc ñắp ñể cầm máu. Người Ấn ðộ sử dụng cây này trong
trường hợp bị côn trùng cắn. Ngoài ra Dừa cạn còn ñược dùng làm thuốc chống
viêm mắt ở Caribe và thuốc chữa ho ở Trung Quốc (Baldwin A.S.et al., 1997).
Hiện nay, Dừa cạn ñã và ñang ñược nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên
cứu tìm hiểu. Nhiều thử nghiệm lâm sàng ñã và ñang ñược thực hiện nhằm chứng
minh các tác dụng chống ung thư của các alkaloid từ Dừa cạn.
1.3.2. Tác dụng chống ung thư của alkaloid từ Dừa cạn
ðầu những năm 1950, Noble tại phòng thí nghiệm Collipv- ðại học Western
Ontario – Canada ñã nghiên cứu lá Dừa cạn với mục ñích tìm hiểu tác dụng của cây
này ñến lượng ñường huyết trong cơ thể. Thay vì các hoạt tính trên, ông nhận thấy
trong lá Dừa cạn có những chất tác dụng mạnh ñến tế bào bạch cầu và tủy xương.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
12

Từ ñó, theo hướng nghiên cứu các chất gây ñộc tế bào hoặc ức chế phân bào bạch
cầu ác tính, cùng với các nhà khoa học khác là Beer và Cutts, Noble ñã chiết ra
ñược chất có hoạt tính chống ung thư ñặt tên là Vincaleukoblastine vào năm 1958,
sau ñó ñổi tên thành vinblastine. (Johnson và cộng sự, 1959).

Cùng ñồng thời trong khoảng thời gian ñó, một nhóm các nhà khoa học khác
bao gồm Svoboda, Johnson, Neuss và Gorman tại phòng thí nghiệm Lilly ñã nghiên
cứu và chứng minh rằng những phân ñoạn alkaloid từ Dừa cạn có tác dụng kéo dài
khả năng sinh sản của tế bảo DBA trên 2 chuột ñược cấy tế bào lympho ung thư cấp
tính (bệnh bạch cầu P-1534). (Johnson và cộng sự, 1959).
Phát hiện ra hoạt tính chống lại bạch cầu P-1534 của Dừa cạn có ý nghĩa rất
quan trọng. Trong một nghiên cứu chuyên sâu về Leurosine, Svoboda ñã tìm ra một
alkaloid cấu trúc ñôi phân tử (dimeric alkaloid) có cấu trúc tương tự như
vinblastine. (Johnson và cộng sự, 1959).
Kể từ sau những thử nghiệm lâm sàng ñầu tiên vào thập niên 1960, các
alkaloid từ Dừa cạn như vinblastine (biệt dược là Velban® hoặc Velbe®) và
vincristine (biệt dược là OncoVin®), ñã ñược sử dụng rộng rãi như các hóa trị liệu
cho nhiều loại ung thư khác nhau: ung thư máu, ung thư mô bạch huyết, ung thư
tinh hoàn và ung thư vú. (Etiévant, C. et al., 2001)
Có thể nói, việc phát hiện ra vinblastine và vincristine là một cột mốc quan
trọng trong sự phát triển của hóa trị liệu ung thư. Nó ñã mở ra nhiều con ñường
nghiên cứu khác nhau như hóa học, sinh học và lâm sàng nhằm phát hiện và chứng
minh các hoạt tính chống ung thư mới của các alkaloid từ Dừa cạn.
Cơ chế chống ung thư của alkaloid Dừa cạn
Ngay sau khi phát hiện ra ñặc tính kháng ung thư in vivo của các alkaloid từ
Dừa cạn, ñã có rất nhiều thí nghiệm nghiên cứu tập trung vào giải thích cơ chế tác
dụng của chúng. Vinblastine liên kết ñặc hiệu với tubulin-protein heterodimeric phổ
biến trong tất cả các tế bào nhân thật. Tubulin và dạng polymer của nó là
microtubules có vai trò quan trọng trong việc duy trì hình thái tế bào, vận chuyển