Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất điều chế cồn

Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
MỤC LỤC
Phần 1:Giới thiệu chung 3
Phần 2: Sơ đồ quy trình 4
Phần 3:Ứng dụng của VSV trong công đoạn đường hóa dòch cháo 6
I-Giới thiệu chung về nấm mốc 6
1-Cấu tạo sợi nấm 7
2-Sinh sản của nấm 7
II-Những loài nấm thường dùng 9
1-Rhizopus 11
2-Mucor 11
3-Aspergillus 12
III- Nuôi cấy mốc đường hóa : các chế phẩm enzym đường hóa 16
IV- Đường hoá tinh bột: 21
1-Tác dụng của enzym amylase lên mạch tinh bột 21
2- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa tinh bột 23
Phần 4:Ứng dụng của VSV trong công đoạn lên men dòch đường 31
A-Nấm men 31
I-Saccharomyces cerevisiae 31
1-Đặc điểm 31
2-Một số chủng Saccharomyces cerevisiae thường dùng 32
3-Nghiên cứu so sánh khả năng lên men của chủng 12 với chủng
MTB và 1 vài chủng khác hiện có ở nước ta 33
4- Điều kiện lên men 35
1
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
5-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm men
Saccharomyces cerevisiae 36
II- Cơ chế lên men rượu 40
1- Cơ chế hóa sinh học của q trình lên men 41
2- Tiến hành lên men rượu 44

III- Nhận xét, đánh giá các phương pháp lên men 46
IV- Hiệu suất quá trình lên men từ nấm men 48
B-Vi khuẩn 48
I.Giới thiệu chung 48
II.Các vi khuẩn lên men cồn 49
1.Zymomonas mobilis 50
a.Đặc điểm 50
b.Điều kiện phát triển 52
c. Ni cấy 53
d- Q trình lên men 55
e-Hiệu suất q trình 55
2.Clostridium 57
a.Đặc điểm 57
b.Điều kiện phát triển 58
Phần 5: Hiệu suất và tổn thất trong sản xuất 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67
2
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
PHẦN 1: GIỚI THIỆU CHUNG
Công nghệ cồn etylic là khoa học về phương pháp và quá trình chế
biến các nguyên liệu chứa tinh bột, đường, xenluloza, etylen thành sản
phẩm etylic hay etanol.
Quy trình công nghệ sản xuất cồn etylic có thể chia thành các công
đọan chính gồm : chuẩn bò dòch đường lên men; gây men giống, lên men
dòch đường và xử lý dòch lên men.
Chuẩn bò dòch lên men:
- Nếu nguyên liệu chứa tinh bột thì công đọan này gồm nghiền, nấu,
đường hóa và làm lạnh đến nhiệt độ lên men.
- Nếu nguyên liệu là mật rỉ thì chuẩn bò dòch lên men gồm pha lõang
sơ bộ, xử lý mật rỉ, bổ sung nguồn dinh dưỡng, tách cặn rồi pha

loãng tới nồng độ gây men và lên men
Gây men giống và lên men: muốn lên men trước hết cần phát triển men
giống tới chất lượng và số lượng cần thiết, thường bằng 10% thể tích của
thùng lên men. Sau đó đưa men giống và dòch đường vào thùng rồi khống
chế ở điều kiện xác đònh để nâùm men chuyển hóa đường thành rượu và
CO2. Dòch nhận được sau lên men gọi là giấm chín.
Xử lý dòch lên men: công đoạn này có liên quan tới kiến thức lý học và
chuyển khối. Thực chất là dùng hệ thống chưng luyện phù hợp để tách
rượu và các chất dễ bay hơi khỏi giấm chín, sau đó đem tinh luyện để
nhận được cồn sản phẩm, thỏa mãn tiêu chuẩn và yêu cầu tiêu dùng. Sản
phẩm thu được sau xử lý bao gồm cồn thực phẩm, cồn đầu, dầu fusel hoặc
ancol cao phân tử.
Ngoài các sản phẩm kể trên, chúng ta còn thu được bã rượu có chứa
nhiều chất hữu ích, có thể dùng làm môi trường nuôi cấy và thu nhận
3
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
nấm men thô dùng cho chăn nuôi, chế biến các lọai kháng sinh… Ở một
số nước, người ta đem cô đặc bã rượu tới nồng độ chất khô nhất đònh và
bổ sung trực tiếp vào khẩu phần ăn của vật nuôi. Trong bã rượu từ rỉ
đường còn có thể thu nhận glyxerin, axít glutamic. Trong những năm gần
đây bã rượu từ mật rỉ còn được nghiên cứu và đưa vào phụ gia của vật
liệu xây dựng.
nước ta việc sử dụng bã rượu chưa được nghiên cứu áp dụng nên còn
lãng phí nhiều. Phần lớn bò bỏ đi , chỉ phần rất ít được sử dụng vào mục
đích chăn nuôi.
4
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
PHAÀN 2: SÔ ÑOÀ QUY TRÌNH

Tinh bột

Xử lý nguyên liệu
Quá trình dịch hóa
Đường hóa
Lên men rượu
Chưng cất
Tinh chế
Mật rỉ
Xử lý nguyên liệu
Nguyên
liệu
Nấm
men
Chuẩn bị dịch lên men
Lên men rượu
Tinh chế
O
2
Chế phẩm
amylase của
nấm mốc
Nấm
men
Chưng cất
Cồn
tinh
luyện
5
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
PHẦN 3: ỨNG DỤNG CỦA VSV TRONG
CÔNG ĐOẠN ĐƯỜNG HÓA DỊCH CHÁO

Nấu xong, tinh bột trong dịch cháo đã chuyển sang trạng thái hòa tan
nhưng chưa thể lên men trực tiếp để biến thành rượu được, mà phải trải qua
q trình thủy phân do xúc tác của amylase để biến thành đường. Q trình
trên được gọi là q trình đường hóa, có vai trò rất quan trọng trong cơng
nghệ sản xuất cồn ethylic. Nó quyết định phần lớn hiệu suất thu hồi rượu do
giảm bớt hoặc gia tăng đường và tinh bột sót lại sau khi lên men.
Muốn đạt hiệu quả cao trong q trình thủy phân tinh bột thì phải
chọn được tác nhân đường hóa tốt nhất. Hiện nay, người ta dùng amylase
nhận được từ ni cấy vi sinh vật, trong đó nấm mốc được sử dụng nhiều
nhất, sau đó đến vi khuẩn, cuối cùng là nấm men Endomycopsip. Các yếu tố
cần chú ý khi ni cấy vi sinh vật là chọn giống, mơi trường ni cấy, điều
kiện ni cấy (nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy).
I-GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM MỐC
Nấm mốc (mold) là tên chung để chỉ các lọai nấm hiển vi có cấu
tạo sợi. Chúng thuộc loại thực vật hạ đẳng, có bào tử, không có diệp lục
tố, không có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ khí carbonic mà sử
dụng trực tiếp chất hữu cơ có sẵn để sinh sống.
Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, vì vậy
chúng thường phát triển trên lớp bề mặt của cơ chất, dưới dạng những lớp
lún phún hình sợi, lớp mang nhện hay khối sợi bông. Trong cơ chất,
chúng chỉ sinh trưởng trong các khoang hổng chứa không khí. Nhiều loại
nấm mốc có giá trò lớn trong công nghiệp, trái lại nhiều loại nấm lại gây
nhiều thiệt hại trong công nghiệp, nhất là công nghiệp thực phẩm, y học
…
6
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
1-Cấu tạo sợi nấm
Đa số nấm có hình sợi phân nhánh, đan kết lại với nhau thành một
khối sợi, từng sợi riêng lẻ gọi là sợi nấm (khuẩn ty thể, mycelium). Có 2
loại sợi nấm: sợi nấm có màng ngăn ngang và sợi nấm không có màng

ngăn ngang; trong trường hợp sau, tòan bộ hệ sợi nấm chỉ là 1 tế bào
phân nhánh rất phức tạp. Chiều rộng của sợi nấm thay đổi từ 5-50μm.
Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào trong cơ chất và
hút chất dinh dưỡng ở trong đó (khuẩn ty cơ chất), trong khi đó một phần
hệ sợi nấm phát triển trên bề mặt của cơ chất (khuẩn ty ký sinh), phần sợi
nấm nằm ngoài này nhiều hay ít tùy theo loài và môi trường. Ở nhiều
loài, các sợi của hệ sợi nấm nằm bên ngoài cơ chất là cơ quan sinh sản. Ở
một số nấm khác, sợi nấm đan kết lại dàu đặc với nhau và tạo thành quả
thể.
Cấu tạo tế bào của nấm không khác với cấu tạo của các sinh vật
khác. Màng tế bào cấu tạo bởi cellulose; ở nhiều loại nấm, trong màng tế
bào có chứa kitin. Trong tế bào chất có không bào và các chất khác. Các
chất dự trữ thường gặp ở nấm là glycozen, hạt volutin và các giọt mỡ. Tế
bào nấm có 1,2 hoặc nhiều nhân. Ở nấm, hiện tượng nhiều nhân rất phổ
biến.
2-Sinh sản của nấm
Một đặc điểm của nấm là có nhiều hình thức sinh sản và nhiều cơ
quan sinh sản. Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử, từ bào tử mọc ra sợi
nấm và sau đó là hệ sợi nấm. Mặc dù vậy, bất cứ một đọan sợi nấm hoặc
một mảnh nào của hệ sợi cũng có thể dùng để sinh sản được, các đọan
này khi rơi trên môi trường dinh dưỡng thì phát triển và tạo thành một hệ
7
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
sợi nấm mới. Trong phòng thí nghiệm thường dùng phương pháp này để
nhân giống và phân lập.
Một số nấm sinh sản bằng oidi (bào tử bột). Trong trường hợp này,
sợi nấm bò cắt ra thành từng phần nhỏ đơn bào và mỗi một tế bào đó có
thể phát triển thành một hệ nấm mới. Sợi nấm bò cắt ra, từ ngọn xuống,
và hiện tượng đó có thể tiến hành ở tòan bộ hệ sợi nấm.
Trong sinh sản vô tính của nấm có 2 loại bào tử : bào tử ngoài

(exospore) và bào tử trong (endospore), bào tử ngoài gọi là hạt đính (đính
bào tử, conidi) và sợi nấm mang các hạt đính gọi là cuống hạt đính.
Cuống hạt đính trực tiếp bò thắt lại và sinh ra hạt đính, hoặc có các tế bào
đặc biệt nằm ở đầu cuống phân chia sinh ra các hạt đính. Hạt đính nằm
đơn độc trên cuống hoặc tụ lại thành nhóm hay thành chuỗi, v.v…
8
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
Ở các loài nấm khác, bào tử lại được hình thành trong các tế bào riêng
biệt nằm ở đầu sợi nấm. Những bào tử đó thường có kích thước lớn, hình
cầu, gọi là bọc bào tử (sporangium) hay bào tử nang, sợi nấm mang gọi
cuống bọc bào từ (cuống bào tử nang). Cuống bọc bào từ thường phát
triển trong bọc bào tử làm thành một trụ có nhiều hình dạng khác nhau,
gọi là lõi (columelle) hay nang trụ
Trong sinh sản hữu tính, nấm tạo ra nang (asque) mang nang bào tử
(ascospore), và đảm (basidi) mang đảm bào tử (basisospore), đó là những
cơ quan sinh sản đặc biệt.
Đôi khi nang và đảm xếp đơn độc trên sợi nấm, nhưng thường làm
thành từng nhóm hoặc từng lớp trong quả thể. Về hình dạng, màu sắc và
cấu tạo quả thể thường rất khác nhau. Một số nấm thường có thể sinh sản
bằng cách vô tính và hữu tính. Một số khác không có khả năng sinh sản
hữu tính, đó là những nấm bất toàn. Trong chu kỳ sinh sản của nhiều loài
nấm, ngoài các hình thức sinh sản trên, còn hình thành thêm hạch nấm
(sclecotium) và bào tử màng dầy (chlamydospore). Hạch nấm do sợi nấm
kết chặt lại rắn chắc và thường có màu đen ở mặt ngoài. Chúng có nhiều
hình dạng và kích thước khác nhau, chứa nhiều chất dự trữ, ít nước. Bào
tử màng dầy là những đoạn sợi nấm xếp chặc lại, có màng rất dày. Hạch
nấm và bào tử màng dày là giai đọan nghó của nấm, ở giai đọan này
cbúng có thể vững bền đối với tác dụng của các điều kiện không lợi của
môi trường bên ngòai. Khi rơi vào chỗ có điều kiện chúng lại phát triển
tốt, chúng nảy mầm vá phát triển thành hệ sợi nấm mới hoặc phát triển

thành cơ quan sinh sản
9
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
II- NHỮNG LOÀI NẤM THƯỜNG DÙNG
1 . Rhizopus :
Rhizopus có nhiều loại: Rhi. japonicus, Rhi. Orysee, Rhi. pekaII,
Rhi. Tonkinensis…
Rhizopus có đặc điểm sinh trưởng bằng “giả chi” để lan rộng trên bề
mặt. Ở những điểm tiếp xúc với môi trường đặc, thành ống nghiệm… có
một chùm rễ giả. Ở chỗ có giả căn, thân bò tiếp tục phát triển và sinh ra
các cuốn tử nang chứa nhiều bào tử. Bào tử sinh ra từ nang trụ ở bầu
cuống. Vì một phần nang trụ tiếp xúc với vách nang, do đó khi soi kính,
nửa dưới của nang lộn ngược như cái ô mà cuống nang trụ là cán ô. Lúc
non, bào tử nang trắng, lúc già màu đen, bên trong có nhiều bào tử. Bào
tử hình trứng hay hình bán cầu, mặt thường có nếp nhăn, kích thước 5 -
8μm.Nhiệt độ phát triển thích hợp 32-34
0
C.
Rhizopus sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp nhưng ít gặp. Chủ yếu sinh
sản dinh dưỡng bằng hậu bào tử, khuẩn ty và sinh sản vô tính bằng bào tử
nội sinh. Nhìn bề ngoài dễ nhầm lẫm Rhizopus với Absidi. Absidi khác
với Rhizopus ở chỗ : bào tử nang hình quả lê và giả căn mọc ở giữa thân
bò, không cùng gốc cuống bào tử nang.
10
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
Rhizopus, Absidi thường thấy trên củ, hạt ẩm, bánh mì, cơm, xôi …để
trong không khí vài ngày. Bằng mắt thường thấy khuẩn ty của chúng như
những “tấm” mạng nhện, bào tử nang lúc non trắng, khi già đen nhạt có
những chấm nhỏ. Bào tử dễ bay trong không khí, gặp điều kiện thuận lợi
sẽ nảy mầm.

Rhizopus thường được nuôi cấy, phát triển trên môi trường dòch thể
giàu dinh dưỡng và có thông khí, hệ enzym amylase tương đối hòan chỉnh,
nên thường được dùng trong sản xuất rượu theo phương pháp amilose và
nuôi cấy nấm mốc lỏng (phương pháp bề sâu).
2. Mucor
Mucor và Rhizopus rất giống nhau. Song có thể phân biệt giữa
Mucor và Rhizopus ở 3 điểm : Mucor không có thể giả căn, cuống bào tử
nang có thể sinh ra ở bất kỳ chỗ nào có nang trụ không có hình bán cầu,
không sát với vách bào tử nang
Khuẩn ty của Mucor có 2 loại (+) và (-) màu trắng phân nhánh,
giống nhau về hình thái, khác nhau về sinh lý. Từ một lọai khuẩn ty có
thể sinh sản vô tính. Từ 2 loại khuẩn ty có thể sinh sản hữu tính theo kiểu
tiếp hợp để cho bào tử nang đa hạch, về sau là các bào tử nội sinh.
11
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
Trong sản xuất thường gặp các loại : Mucor rouxii, Mucor mucedo,
Mucor javanicus, Mucor hydrophilus… Nhưng sử dụng phổ biến trong sản
xuất rượu ở nước ta là Mucor rouxii.
Ở Mucor rouxii, ngoài hệ men amylase còn có enzym rượu hóa nên
trong điều kiện yếm khí, enzym của Mucor rouxii có thể biến đường
thành rượu. Hiện tượng này rất hay gặp trong quá trình sản xuất nấm mốc
bề mặt trên môi trường chất rắn có tinh bột giữ ở nhiệt độ cao (39-40
0
C).
Mucor rouxii phát triển mạnh trên môi trường thạch Csepek, khuẩn
ty phân nhánh nhiều, không vách ngăn, đa nhân, khuẩn lạc cao, không
nếp nhăn, bán vào nắp hộp lồng (petrie). Đặc biệt cuống bào tử nang
phân nhánh không có thứ tự nhất đònh. Bào tử nang thường tròn, đường
kính 60-80 μm. Nang trụ 20-25 μm. Bào tử tròn, đường kính 6-7 μm.
Khuẩn ty lúc non màu trắng, già có màu xám nhạt. Bào tử nang từ

màu trắng chuyển dần sang màu hơi vàng, đỏ xám, đen, làm cho màu
khuẩn lạc xám dần. Mặt dưới khuẩn lạc không có nếp nhăn, không màu.
3 . Aspergilus
Aspergilus có thể tìm thấy dễ dàng ở khắp mọi nơi, trên mọi cơ chất.
Vào khoảng năm 1877, ở Nhật, người ta đã phát hiện và sử dụng
Aspergilus vào sản xuất rượu, phân giải acid…
Aspergilus gồm rất nhiều loại, nhưng trong công nghiệp sản xuất
rượu thường dùng các loại : Asp.flavus, Asp.orysee, Asp.batatae,
Asp.awamorii, Asp.niger,Asp.usami…
12
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
Aspergilus có đặc điểm sau : khuẩn ty không màu hay vành nhạt. Có
2 loại : khuẩn ty ký sinh phát triển trên mặt môi trường và khuẩn ty dinh
dưỡng ăn sâu vào trong môi trường. Khuẩn ty phân nhiều nhánh, có nhiều
ngăn tế bào mỗi tế bào có một nhân. Nang và nang bào tử là quả thể màu
vàng kim. Khi Aspergilus hình thành đính bào tử dễ phân biệt với các
mốc khác. Cuống đính bào tử dài và thẳng, không phân nhánh mà đầu
phình to tạo thành chop nang.
Tế bào sinh cuống đính bào tử phân biệt với các tế bào khác gọi là
tế bào chân. Chóp nang có thể hình cầu, hình chùy, hình bán cầu… Xung
quanh đầu có nhiều cuống nhỏ. Tùy loài mà cuống nhỏ có 1 hay 2 tầng.
Theo Thom và Raper (1945), gọi chúng là cuống nhỏ sơ sinh và cuống
nhỏ thứ sinh. Tất cả cuống nhỏ đều có hình chai. Đính bào tử xếp thành
chuỗi dài, càng gần bào tử càng lớn dần. Những chuỗi đính bào tử xếp
đối xứng tỏa tròn trên chóp nang. Đính bào tử thường có hình cầu đơn
bào, đa nhân, bề mặt xù xì. Do cuống đính bào tử và bào tử có màu sắc,
phát triển mạnh, nên màu của chúng trở nên màu của khuẩn lạc. Màu
khuẩn lạc Aspergilus rất khác nhau : đen, ghi, nâu, vàng, vàng lục, lục
vàng, lục, trắng…
13

Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
Màu sắc có thay đổi tùy điều kiện môi trường, thời gian nuôi cấy…
trên môi trường nhất đònh (ví dụ môi trường Csepek); màu khuẩn lạc là
một dấu hiệu để phân loại. Asp rất nhạy đối với nguyên tố vi lượng, tạo
ra màu sắc đặc biệt của khuẩn lạc. Mulder đã xác đònh : Asp. Niger có
màu sẫm nhất khi môi trường có Cu
2+
với nồng độ 0,00025%; ở nồng độ
thấp hơn, màu khuẩn lạc nhạt dần. Khi không có đồng, đính bào tử có
màu vàng (bình thường là đen hay nâu)
 Aspergilus Orysee : nuôi trên thạch Csepek thì trên vùng bào tử có
màu vàng lục trội về màu vàng. Vùng không có bào tử hẹp và
trắng. Khuẩn lạc không có nếp nhăn hoặc không rõ rệt. Bào tử
nang đầu tròn 40-60 μm, cuống đính bào từ dài 0,8-1,5mm, đường
kính 8-12 μm, có thể thấy bằng mắt thường. Đính bào tử hình bầu
dục hay quả lê, kích thước 4-6×5-7 μm. Tế bào chai đặc trưng của
Aspergilus dễ thấy. Bào tử nang lúc non trắng, lúc già vàng lục,
càng già màu càng sẫm. Đính bào tử trần dễ bay. Mốc này sinh ra
các enzym amylase, invectase, maltase, protease và catalase. Hoạt
tính men amylase, protease rất cao. Mốc này phát triển trong
khoảng nhiệt độ 15 - 40
0
C, tối thích 30 - 32
0
C. Mốc này được sử
dụng nhiều rộng rãi trong công nghiệp sản xuất rượu, tương, chao,
thuộc da, nước chấm lên men v.v…
 Aspergilus Flavus : nuôi trên thạch Csepek thì mặt trên vùng bào
tử có màu lục vàng, trội về màu lục. Khuẩn lạc thấp, đính bào tử
nằm sát mặt thạch, do cuống ngắn. Mặt dưới khuẩn lạc thường

không màu, đôi khi vàng nhạt. Bào tử nang đầu tròn 40 - 60 μm.
Cuống đính bào tử ngắn 0,3 - 0,5mm. Đính bào tử tròn hay bầu dục
3,5 - 5 μm. Tế bào chân rõ dễ thấy. Bào tử dễ bay. Aspergilus
orysee rất giống Asp. Flavus, chỉ khác là kích thước lớn hơn, khuẩn
lạc có màu trội hơn về màu vàng. Mốc này sinh ra hệ enzym giống
14
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
A.Orysee, đặc biệt là protease rất hoạt động và chế phẩm tinh khiết
của enzym này được dùng làm tác nhân ổn đònh bia. Ở một số môi
trường có chất béo (trên lạc), mốc này có thể sinh ra độc tố
aflatoxin. Có một số tác giả xếp hai giống mốc này thuộc nhóm
A.orysee-flavus.
 Aspergillus niger : thường gọi là mốc đen. Trên môi trường thạch
Csepek, khuẩn lạc tròn, xốp, vùng bào tử màu nâu đen hoặc đen.
Khuẩn lạc có nếp nhăn rõ. Vùng giữa khuẩn lạc sau 3 - 4 ngày (2 -
4mm) cao hơn xung quanh. Mặt dưới thường không màu, đôi khi
vàng nhạt, thấy rõ nếp nhăn từ tâm khuẩn lạc đi ra.
Bào tử nang đầu tròn, khá lớn (100 - 160 μm). Cuống đính bào tử
dài 0,5 - 1,5mm hoặc hơn, đường kính 7 - 17 μm, thấy rõ bằng mắt
thường. Cuống nhỏ hay thể hình chai, có hai lớp hình lăng trụ. Lớp
đầu dài lớn 15 - 25×3 - 4 μm. Đính bào tử tròn, đường kính 3 - 4
μm. Tế bào chân dễ nhận thấy.
Mốc sinh ra enzym amylase, invectase, maltase, protease,
pectinase, glucooxydase. Mốc này được dùng trong sản xuất rượu ,
sản xuất acid citric, acid fumaric. Protease do mốc này họat động ở
pH 2,5 - 3,5 còn ở protease của A. orysee không hoạt động ở vùng
pH này. Trên thế giới, 90% sản lượng acid citric được sản xuất
bằng phương pháp lên men.
 Aspergillus usami (sử dụng ở nhà máy rượu Hà Nội) là chủng niger
đã được đột biến bằng tia phóng xạ Coban 60. Qua nghiên cứu

chúng tôi nhận thấy Asp.Usami của nhà máy rượu có những đặc
điểm:
 Đính bào tử to, khi già có màu hơi nâu đen
 Nhiệt độ thích hợp 33 - 34
0
C, độ ẩm 90 - 100%
15
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
 Hệ men amylase tương đối đầy đủ, nuôi trên môi trường
rắn (cám, trấu, bột ngô) trong điều kiện thích hợp, chỉ sau
36 - 40 giờ, khả năng tích lũy men cao nhất. Ngoài tích lũy
amylase, Asp.usami còn sinh ra một lượng acid khá lớn (2 -
3% trong môi trường), vì vậy amylase của Asp.usami có thể
thủy phân tinh bột ở pH 4 - 4,5. Mặt khác amylase của
Asp.usami vẫn giữ được hoạt tính ở nhiệt độ cao 60
0
C ±
1
0
C.
Asgergillus awamori và Asgergillus usami gần với A.niger có khả
năng sinh ra nhiều dextrinase và glucomylase, amylase sinh ra ít
hoặc trung bình. Mốc này được dùng nhiều trong công nghiệp rượu
để đường hóa tinh bột.
III- NUÔI CẤY MỐC ĐƯỜNG HÓA : CÁC CHẾ PHẨM ENZYM
ĐƯỜNG HÓA
Nuôi cấy mốc để sản xuất tương hoặc xì dầu ở các nước phương
Đông có từ thời cổ xưa. Năm 1884 J.Takamine (Nhật Bản) đã nuôi cấy
A.orysee trên gạo, sau đó thay gạo bằng cám mì và thu chế phẩm enzym
16

Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
bằng cách chiết qua nước rồi kết tủa bằng cồn. Năm 1915 mốc này được
dùng rộng rãi trong sản xuất rượu ở Mỹ theo quy trình công nghệ của
Takamine và được dùng phổ biến trên thế giới để đường hóa các nguồn
nguyên liệu tinh bột trước khi lên men rượu cho đến nay.
Hiện nay trong công nghiệp rượu thường dùng các chủng khác nhau
của mốc nhóm A.orysee, A.niger, A.awamoni, A.usami, A.batatae theo hai
phương pháp nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm.
 Phương pháp nuôi cấy bề mặt : Khuẩn ty thể của nấm mốc tạo
thành một lớp mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy, lớp khuẩn ty
có thể dày từ 3 - 5cm ; đối với môi trường rắn, khuẩn ty thể xuyên
sâu vào những chỗ hổng của môi trường. Trong công nghiệp sản
xuất rượu, chỉ áp dụng phương pháp nuôi cấy nấm mốc bề mặt trên
môi trường dinh dưỡng chất rắn, có thông không khí hoặc không
thông khí. Đối với phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường
lỏng, chỉ áp dụng trong công nghiệp sản xuất acid citric.
 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc bề sâu: Nấm mốc nuôi cấy trong
môi trường dinh dưỡng dòch thể, có thông không khí. Khuẩn ty thể
hình thành được phân bố và lơ lửng trong môi trường. Đặc biệt,
trong quá trình nuôi cấy, men amylase được khuyếch tán ra môi
trường.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt nấm mốc đường hóa thường dùng cám
mì làm cơ chất. Cám mì cần phải lớn và có hơn 20% tinh bột. Cám được
thêm 1 ít formalin và acid clohydric để tăng hiệu quả thanh trùng dưới áp
lực hơi nước nóng 1 atm trong khoảng 1-2 giờ.
Nói chung nuôi cấy mốc đường hóa theo phương pháp đường hóa
gồm 4 giai đoạn:
 Chuẩn bò giống và nhân giống để thu được mốc trung gian;
17
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn

 Chuẩn bò và thanh trùng môi trường nuôi cấy;
 Nuôi cấy mốc trên khay, mành, nong, nia… trên các giá trong
các buồng nuôi mốc có những điều kiện thích hợp để mốc sinh
ra enzym tối đa;
 Đập nhỏ, sấy và đóng gói mốc cám khô
Mốc giống A. awamori được giữ trong phòng thí nghiệm trên môi
trường thạch – malt ở chỗ tối 18
0
C. Cứ 3 tháng 1 lần cấy truyền trên môi
trường nước malt có 7% chất khô với 3% thạch và 0,09% acid citric.
Mốc trước khi đưa vào sản xuất được cấy trên môi trường thạch –
malt 7 - 8 ngày rồi chuyển vài bình tam giác 500ml có 10g cám mì được
làm ẩm bằng 6ml nước đã acid hóa qua thanh trùng 1 giờ. Nuôi ở buồng
ấm 30
0
C trong 3 ngày, sau đó chuyển sang nuôi ở khay nhôm hoặc mành
với điều kiện tương tự đến khi mốc sinh bào tử nhiều. Mốc cám thu được
này gọi là mốc trung gian dùng để cấy trộn vào môi trường sản xuất tiếp
theo.
Môi trường sản xuất cũng được chuẩn bò tương tự và san đều trên các
khay hoặc mành, nong… Chiều dày lớp môi trường 2,5 - 3cm. Tỷ lệ mốc
cấy chuyền tiếp khoảng 0,2 - 0,4%.
Nuôi mốc trên khay trong các buồng 28 - 32
0
C có thông gió và giữ
độ ẩm không khí 90 - 95%. Thời gian nuôi mốc từ 24 - 26 đến 30 - 36 giờ
và kết thúc khi mốc sắp đến giai đoạn bào tử. Trong quá trình nuôi cần
lật và bẻ nhỏ cám vì hệ sợi mốc phát triển làm cơ chât kết thành bánh.
Mốc cám sau khi nuôi cấy có độ ẩm 40 - 50% cần phải sấy khô
không quá 45

0
C đến khi độ ẩm còn 10 - 12%, nghiền nhỏ. Mốc cám khô
đựng trong các bao hoặc thùng kín, bảo quản ở chổ mát (dưới 20
0
C) và để
18
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
dùng dần. Cũng có thể dùng mốc cám có độ ẩm 45 - 50%(chưa sấy) vào
đường hóa trực tiếp.
Qua nghiên cứu và thực tế thấy dùng cám mì làm cơ chất rắn nuôi
cấy mốc đường thu được kết quả cao nhất. Trường hợp không có cám mì
có thể thay bằng các môi trường có các thành phần sau:
 Môi trường bột ngô : bột ngô nhỏ mòn, vàng – 75%; trấu nhỏ có
1/8 - 1/10 vỏ lúa - 25%; (NH
4
)
2
SO
4
- 0,5%
 Môi trường cám bổi: cám gạo có 0,5% (NH
4
)
2
SO
4
Quá trình nuôi cấy mốc trên những môi trường này tương tự như trên
môi trường cám mì.
Phương pháp nuôi cấy chìm thường dùng các mốc A.niger, A.usami,
A.batatae-61. Quá trình nuôi cấy gồm các giai đọan :

 Chuẩn bò giống và nhân giống
 Pha chế môi trường dinh dưỡng
 Nuôi cấy mốc trong thùng men, thu dòch men có hoạt lực cao.
Mốc giống dùng từ ống nghiệm hoặc từ mốc cám trong các bình tam
giác nhân giống như trong phương pháp bề mặt. Nhân giống có thể qua
cấp 1 ở trong bình tam giác và cấp 2 trong các thùng nhân giống có sục
khí. Môi trường nhân giống gồm: dòch lọc bã rượu từ các nguyên liệu tinh
bột được bổ sung 1,5 bột mì hoặc bột ngô (có khi dùng 2 - 3% cám); 0,5
cao ngô; 0,5% KNO
3
; 0,1 - 0,2% MgO hoặc 0,2% Ca
2
CO
3
; pH=5,6 - 5,8.
Môi trường than trùng 1 - 1,5 atm/giờ. Trong mỗi bình tam giác 750 có
130 - 150 ml môi trường. Nhân giống trong bình tam giác trên máy lắc
200 - 220 v/phút ở 30 - 32
0
C khoảng 72 giờ, sau đó nhân giống tiếp trong
các nồi 2 vỏ có khuấy và sục khí (40 - 60 m
3
/h) ở 30 - 32
0
C khoảng 24 -
30 giờ.
19
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
Môi trường dinh dưỡng nuôi mốc để sinh enzym như sau:
 Dòch lọc bã rượu 97,8%

 Bột 1,5 - 2%
 Cao ngô 0,5%
 MgO hoặc CaCO
3
0,2%
 pH 5,6 - 5,8%
Trong môi trường cần có 1,2 - 1,7g% chất khử (không tính pentose)
và N tổng: 220 - 280 mg%
Môi trường thanh trùng ở 1,5 - 2 atm khoảng 45 - 60 phút. Tiếp theo
tỷ lệ 1 - 5% (đối với A.batatae chỉ cần 1%)
Quá trình nuôi mốc cần phải sục khí (15 - 20 m
3
/giờ) và khuấy, có
thể trong 18 giờ đầu không cần khuấy vì mốc mới phát triển, độ nhớt
thấp, vì vậy chỉ cần sục khí cũng đủ trộn môi trường. Thởi gian nuôi cấy
khoảng 60 - 72 giờ ở 30 - 32
0
C.
Dòch men sau khi nuôi cấy được thêm 0,25 formalin làm chất bảo vệ
và dùng để đường hóa dòch cháo ở nhiệt độ 56 - 57
0
C với tỷ lệ 75 - 100%
(tùy thuộc vào hoạt lực enzym).
Đối với nấm men lên men các dòch đường từ tinh bột trong môi
trường cần phải có các hợp chất nitơ dễ đồng hóa. Trong trường hợp dùng
mốc đường hóa là A.awamori chỉ có các enzym amylase (còn protease
hoàn toàn không có). Vì vậy, trong dòch đường hóa không có các hợp chất
nitơ dễ đồng hóa đối với nấm men. Các hợp chất nitơ này là hỗn hợp các
acid amin đã được thủy phân từ protein dưới tác dụng của enzym
protease. Để giải quyết vấn đề này có thể dùng hỗn hợp chế phẩm

enzym A.orysee nuôi cấy theo phương pháp bề mặt giàu protease và của
A.awamori nuôi cấy theo phương pháp chìm. Sử dụng hỗn hợp này cho
20
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
phép giảm lượng chế phẩm cần thiết xuống 2 lần và nâng cao được hiệu
suất lên men nói chung. Người ta còn dùng hỗn hợp A.orysee nuôi cấy bề
mặt và A.usami-45 hoặc A.batatae nuôi cấy chìm cũng cho kết quả tốt.
Đánh giá chất lượng đường hóa theo hoạt lực amylase, dextrinase,
glucoamylase và protease.
IV- ĐƯỜNG HOÁ TINH BỘT:
Khối nấu không thể trực tiếp lên men rượu (vì trong nấm men
không có phức hệ Enzym Amylase) mà phải thủy phân sơ bộ tinh bột
bằng phức hệ Enzym Amylase của nấm mốc hoặc của malt. Trong sản
xuất, quá trình này được gọi là đường hóa tinh bột ( hay sự đường hóa);
bán sản phẩm nhận được – dòch đường hóa. Trong sản xuất rượu từ
nguyên liệu có chứa tinh bột, đường hóa là 1 trong những quá trình công
nghệ quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men, hiệu suất tổng thu hồi,
chất lượng sản phẩm, chu kỳ sản xuất…
Khi nói đến quá trình đường hóa, là kể cả các giai đoạn làm nguội
khối nấu từ nhiệt độ 105 - 110
o
C xuống nhiệt độ thích hợp cho tác dụng
của men Amylase (60 ± 2
o
C) và làm nguội dòch đường hóa đến nhiệt độ
thích hợp cho lên men (33 - 36
o
C).
1-Tác dụng của enzym amylase lên mạch tinh bột:
Amilose và Amilopectin là hai thành phần chính của nguyên liệu

tinh bột, sau khi nấu, chúng được giải phóng ra và ở trạng thái hòa tan.
Dưới tác dụng của phức hệ men Amylase, trong những điều kiện thích
hợp, Amilose và Amilopectin bò phân cắt, tạo thành những sản phẩm
21
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
trung gian khác nhau (còn gọi chung là Dextrin) và các sản phẩm cuối
cùng là Maltose và Glucose.
Sản phẩm trung gian và cuối cùng được tạo ra phụ thuộc và cấu trúc
của mạch Amilose và Amilopectin và vào phức hệ men Amylase sử
dụng.
Trong cấu trúc mạch Amilopectin củ tinh bột của các loại hạt, không thấy
có sự liên kết của acid Phosphoric (H
3
PO
4
) ở vò trí α 1 - 6Glucoside nhưng
ở tinh bột khoai tây lại có mối liên kết đó:

Phức hệ Enzym Amylase của nấm mốc khác với phức hệ men
Amylase trong malt. Trong phức hệ men Amylase của Malt, hầu như
không thấy có men Glucoamylase (glA), nên sản phẩm cuối cùng của
quá trình lên đường hóa tinh bột bằng men Amylase của thóc tạo Malt là
Maltose, lượng đường Glucose do men α - Amylase tạo ra không
đáng kể. Ngược lại, khi thủy phân tinh bột bằng phức hệ men Amylase
của 1 số loài nấm mốc, thì sản phẩm cuối cùng hầu như là đường
Glucose.
Về vò trí tác dụng của men α - Amylase của nấm mốc lên mạch tinh
bột, có nhiều ý kiến mâu thuẫn. Có ý kiến cho rằng tác dụng của men α -
Amylase trong nấm mốc Asp.Orysee chỉ tạo thành đường Maltose và
Dextrin, tức là tác dụng của α - Amylase của nấm mốc chỉ giống

như men ß - Amylase trong Malt; có ý kiến khác cho rằng dưới tác dụng
22
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
của α - Amylase của nấm mốc, tạo ra hỗn hợp hydrat carbon gồm các
Dextrin có phân tử lượng khác nhau, Glucose, Maltose, và các
Oligosacchrit khác.
Men Oligo - 1,6Glucozidase cắt đứt các liên kết α - 1,6Glucozid trong
phạm vi của Dextrin, Isomaltase chỉ cắt đứt liên kết của các Disaccharide
mà thôi (đường Isomaltose).
Quan sát các hiện tượng xảy ra trong quá trình đường hóa tinh bột bằng
men Amylase, ta thấy:
 Độ nhớt của dung dòch giảm dần.
 Khả năng khử (đối với các dung dòch oxy hóa) tăng lên.
 Phản ứng đònh tính với Iod thay đổi từ màu xanh, tím xanh, đỏ
nâu, đến không màu.
2- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa tinh bột:
a) Nồng độ của men:
Trong sản xuất, tốc độ của sự thủy phân, tinh bột là hàm số của sự
tác dụng tổng cộng của men Amylase trong nấm mốc hoặc trong malt.
Trong phức hệ men Amylase của nấm mốc hoặc trong malt có những men
khác nhau, số lượng khác nhau, hoạt tính khác nhau.
Những điểm đó đưa tới sự thủy phân tinh bột khác nhau (về mức độ
đường hóa, tốc độ đường hóa và sản phẩm cuối của quá trình đường hóa).
Tinh bột được hồ hóa triệt để, nồng độ tinh bột 12%, pH - 5, đường hóa ở
nhiệt độ 57
o
C trong thời gian 30 phút, sau đó làm nguội tới 30
o
C và tiếp
tục phân tích hàm lượng đường sinh ra trong suốt thời gian làm đường

hóa, cho đến khi có kết quả phân tích nhiều lần không thay đổi.
Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng sau:
23
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
Tỷ lệ men sử
dung, %
Lượng đường khử sinh ra, %
Sau 12h Sau 24h 36 - 48h
2
4
6
8
6.42
6.42
8.70
9.50
8.45
8.95
8.95
10.23
9.20
10.46
10.50
_
Những thí nghiệm tương tự với tỷ lệ men sử dụng 8 - 10% cũng chỉ
đạt 9,5 - 10% lượng đường sinh ra. ( Với hàm lượng tinh bột ban đầu cao
hơn thì hàm lượng đường cùng sinh ra cao hơn tương ứng). Vì vậy, khi nói
đến ảnh hưởng của nồng độ men tức là nói đến hoạt tính, số lượng và sự
cân đối của phức hệ Amylase.
b) nh hưởng của nhiệt độ:

Tốc độ phản ứng của men cũng như phần lớn phẩn ứng hóa học tăng
lên khi tăng nhiệt độ. Tính phụ thuộc của hằng số vận tốc với nhiệt độ,
được thể hiện trong phương trình Arenius:
(dlnK)/(dT)=E/(RT
2
)
Trong đó: T nhiệt độ tuyệt đối,
o
K
R hằng số chất khí
Sau khi lấy tích phân phương trình trên trong giới hạn T
1
và T
2
ta có
E = ((lnK
1
-lnK
2
)RT
1
T
2
) / (T
1
-T
2
)
Với K
1

và K
2
là hằng số vận tốc tương ứng với nhiệt độ T
1
và T
2
24
Ứng dụng VSV trong sản xuất cồn
Đặc trưng của phản ứng thủy phân tinh bột bằng Amylase là diễn ra
trong phạm vi nhiệt độ tương đối hẹp, giới hạn là 35 - 63
o
C ( đây là
khoảng nhiệt độ tối thích của Enzym Amylase).
Nếu đường hóa ở nhiệt độ cao là t
o
ap
của Dextrinase thì lượng
Dextrin tạo ra sẽ nhiều trong khi đó Maltose sinh ra ít, hiệu suất quá trình
thủy phân bò giảm.
Tác dụng của nhiệt độ lên các Enzym không phải tức thời, các Enzym giữ
được hoạt tính cao trong 1 thời gian ngắn.
Đôi khi, trong quá trình làm nguội từ 105 - 109
o
C xuồng nhiệt độ
thấp hơn (55 - 60
o
C) ta có thể thêm vào Enzym để tiến hành phân cắt sơ
bộ, làm loãng khối nấu, dễ đưa chúng vào máy làm nguôi.
Nếu đường hóa ở nhiệt độ khoảng 40 - 50
o

C thì thực ra không có lợi
vì chúng dễ nhiễm khuẩn mặc dù có thể tạo ra lượng đường khử lớn hơn.
Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu khoảng 35 - 62
o
C
25