luận văn thạc sĩ nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương (glycine max (l.) merrill) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
  



NGUYỄN TIẾN DŨNG


Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG
(Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens”

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC












Thái Nguyên-2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
  


NGUYỄN TIẾN DŨNG

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60.42.30

Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG
(Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens”

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: T.S. Nguyễn Văn Đồng
PGS.TS. Ngô Xuân Bình

Thái Nguyên-2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới năm 2008 5
Bảng 1.2. Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua các vùng khác nhau 6
Bảng 1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 7
Bảng 1.4. Các chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen 17
Bảng 1.5 Các gen thông báo chỉ thị sinh hóa 20
Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy 38
Bảng 3.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương sau 10 ngày 45
Bảng 3.2. Khả năng kéo dài chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 47
Bảng 3.3. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen 48
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu quả biến nạp gen 53
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm 54
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen 56
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng biến nạp gen 57
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của L-cystein đến hiệu quả biến nạp gen 58
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen 59
Bảng 3.10. Hiệu quả chuyển gen vào một số giống đậu tương 62
Bảng 3.11. Số cây sau chọn lọc của một số giống đậu tương 63
Bảng 3.12. Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tương chuyển gen với cặp mồi 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin 10
Hình 1.2. Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật 12
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể 15
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 16
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pX2-H 31
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tái sinh cây đậu tương 35
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương 37
Hình 3.1. Phát sinh tạo đa chồi ở một số giống đậu tương nghiên cứu 46
Hình 3.2. Phát sinh rễ của một số giống đậu tương 48
Hình 3.3. Biểu hiện gus ở đậu tương khi được lây nhiễm với các chủng vi khuẩn 49
Hình 3.4. Mẫu biến nạp plasmid pX2-H::gfp trong Agrobacterium chủng AGL1 51
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi gfp 52
Hình 3.6. Chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM . 60
Hình 3.7. Biểu hiện của gen gfp được chuyển vào các giống đậu tương 63
Hình 3.8. Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng đậu tương 64
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR . 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AS
:
Acetosyringone
BAP
:
6 - Benzylaminopurine
bp
:
base pair (cặp bazơ)
GFP
:
Green Fluorescent Protein
DNA
:
Deoxyribo Nucleic Acid
EDTA
:
Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
Et-Br
:
Ethidium Bromide

gus
:
-Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase)
hpt
:
Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase
MSC
:
Multi - Cloning Site
NAA
:
α -Napthalene acetic acid
MS
:
Murashige and Skoog, 1962
LB
:
Luria Bertani
NOS
:
Nopalin Sythetase
OD
:
Optical Density (mật độ quang học)
PCR
:
Polymerase Chain Reaction
SDS
:
Sodium Dodecyl Sulfate

TAE
:
Tris-Acetate-EDTA
TE
:
Tris-EDTA
T- DNA
:
Transfer DNA (ADN chuyển)
Ti-Plasmid
:
Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật)
VIR
:
Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u)
X-gluc
:
5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid
2,4-D
:
Dichlorophenoxy acetic acid
& cs
:
và cộng sự



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC

Trang
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Yêu cầu nghiên cứu 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tƣơng 3
1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương 3
1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và tại Việt Nam 6
1.3.1.Trên thế giới 6
1.3.2. Ở Việt Nam 7
1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen 9
1.4.1. Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen thực vật trong tự
nhiên 9
1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 9
1.4.3. Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA 11
1.4.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen 11
1.4.5. Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật 13
1.5. Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens 14
1.5.1. Vector nhị thể 14
1.5.2. Hệ vector liên hợp 16
1.6. Gen chỉ thị 17
1.6.1. Chỉ thị chọn lọc 17
1.6.2 Chỉ thị sàng lọc 18
1.7. Hệ thống tái sinh và biến nạp gen ở giống đậu tƣơng 20
1.7.1. Hệ thống tái sinh ở đậu tương 20
1.7.2. Phương pháp biến nạp gen ở đậu tương 21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. VẬT LIỆU 30
2.1.1. Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 30
2.1.2. Hóa chất 30
2.1.3. Plasmid, primers và vi khuẩn 30
2.1.4. Vật liệu thực vật 31
2.1.5. Địa điểm nghiên cứu 32
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 32
2.3. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu 32
2.3.1. Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 32
2.3.2. Biến nạp plasmid vào tế bào Agrobacterium tumefaciens bằng phƣơng
pháp xung điện 33
2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 33
2.3.4. Phƣơng pháp PCR 34
2.3.5. Ph-¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose
2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh cây hoàn chỉnh 35
2.3.7. Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng 39
2.3.8 Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen 39
2.3.8.1. Sàng lọc thông qua gen chỉ thị GFP 39
2.3.8.2. Phân tích PCR 39
2.3.9. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá và sử lý kết quả 41
2.3.9.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………… 41
2.3.9.2. Phương pháp theo dõi, đánh giá .42
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của một số giống đậu
tƣơng 44
3.1.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương 44
3.1.2. Khả năng kéo dài chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương
nghiên cứu 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3.2. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở đậu tƣơng . 48
3.3. Kết quả biến nạp plasmid vector pX2-H::gfp vào chủng vi khuẩn thích
hợp để biến nạp vào đậu tƣơng 51
3.4. Tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen 52
3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lây nhiễm 52
3.4.2. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm 54
3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen 55
3.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringon (AS) 56
3.4.5. Ảnh hưởng của L-cystein đến khả năng biến nạp 57
3.4.6. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen 59
3.5. Đánh giá hiệu quả chuyển gen của một số giống đậu tƣơng 61
3.5.1. Hiệu quả chuyển gen thông qua gen chỉ thị sàng lọc gfp 61
3.5.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phân tích PCR các dòng đậu tƣơng
chuyển gen. 63
LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO 69







Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill.] là một trong những cây trồng có vị trí quan
trọng trong sản xuất nông nghiệp. Ngoài giá trị dinh dưỡng trong hạt, đậu tương còn là
cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh do có khả năng cải tạo đất. Diện tích cây
đậu tương ở nước ta 5 năm gần đây chỉ trên 170.000 ha, năng suất bình quân xấp xỉ 1,5
tấn/ha, sản lượng hạt trên 210 nghìn tấn, thấp hơn nhiều so với năng suất bình quân
của thế giới [14]. Nguyên nhân chính là do năng suất của giống không cao, tổn thất do
sâu bệnh hại trên đồng ruộng và sau thu hoạch lớn (hàng năm, ước tính thiệt hại về số
lượng sau thu hoạch đối với đậu tương khoảng 6,2 - 14%).
Diện tích đất canh tác nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp do sự phát triển của các
ngành công nghiệp và dịch vụ. Bên cạnh đó, nhu cầu về sản lượng hạt đậu tương để
phục vụ cho phát triển chăn nuôi, công nghiệp chế biến ngày một tăng. Sản lượng đậu
tương không đáp ứng đủ nhu cầu trong nước, do đó phải nhập khẩu từ các nước bên
ngoài (năm 2009, Việt Nam nhập khẩu 2,3 triệu tấn đậu tương từ nước ngoài).
Thêm nữa, những năm gần đây khí hậu toàn cầu đang có dấu hiệu thay đổi phức
tạp. Hiện tượng trái đất nóng lên đã làm cho tình hình hạn hán, lũ lụt ngày càng trở
nên nghiêm trọng. Việt Nam là một trong những nước sẽ chịu nhiều ảnh hưởng. Dự
kiến, nếu mực nước biển dâng cao 1 mét, Việt Nam sẽ mất hơn 12% diện tích đất đai,
nơi cư trú của 23% số dân. Nguồn nước và sản xuất nông nghiệp bị ảnh hưởng nghiêm
trọng. Cùng với đó là sự gia tăng của dịch hại đã tác động không nhỏ đến cây trồng nói
chung và đậu tương nói riêng. Để tăng sản lượng đậu tương, ngoài mở rộng thêm diện
tích trong cơ cấu luân canh thì việc tăng năng suất là giải pháp chính.
Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng trong ngành sản
xuất đậu tương của thế giới hiện nay. Ở nước ta, đậu tương, ngô và bông là 3 cây trồng
đang được nghiên cứu để tạo cây chuyển gen. Một số phòng thí nghiệm của các Viện
nghiên cứu đã có những báo cáo kết quả nghiên cứu cây chuyển gen của Việt Nam như
đậu tương [7], [8], ngô [4]. Tuy nhiên đó mới chỉ là các kết quả nghiên cứu ban đầu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2

Việc tạo giống đậu tương biến đổi gen đòi hỏi phải nghiên cứu một cách có hệ
thống. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu biến nạp gen vào đậu
tương (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu biến nạp gen vào một số giống đậu tương của Việt Nam
3. Yêu cầu nghiên cứu
- Lựa chọn giống đậu tương làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen
- Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen ở đậu tương
- Đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium mang cấu
trúc vector pX2-H



















Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tƣơng
Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và
trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh.
Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có
nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa
ở Trung Quốc qua nhiều triều đại và được đưa vào trồng trọt và khảo sát ở triều đại
Shang (năm 1700 – 1100 B.C) trước công nguyên.
Do xuất phát từ những yêu cầu, căn cứ vào tiêu chí phân loại khác nhau nên
cũng có nhiều cách phân loại đậu tương. Nhưng đến nay, hệ thống phân loại căn cứ vào
đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể được nhiều người sử
dụng [63]. Theo hệ thống này ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja. Chi Glycine
được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm 2 loài: loài
đậu tương trồng Glycine (L.) Merrill và loài hoang dại hàng năm G. Soja Sieb và Zucc.
Đậu tương thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae và
bộ Phaseoleae. Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L.) Merrill [2], [67].
1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương
 Đặc tính chịu hạn
Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu về nước cao hơn
các loại cây khác. Đó chính là do đậu tương có hàm lượng protein và lipit cao, để tổng hợp
1 kg chất khô cần 500-530 kg nước. Trong quá trình nảy mầm nhu cầu về nước của đậu
tương chiếm 50% khối lượng hạt, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [2], [9].
Khi nghiên cứu các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và
di truyền đã cho thấy các đặc tính này liên quan liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo
của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Khả năng chịu hạn của cây

đậu tương mang tính đa gen [9]. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau như: sự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
phát triển của bộ rễ [16], [69], thời gian sinh trưởng [113], cũng như bản chất di truyền
của từng giống. Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm :
- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây.
Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi nghiên
cứu sâu hơn về tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương. Maitra và Cushman (1994)
đã phân lập được cDNA của dehydrin từ lá đậu tương khi bị mất nước, ngoài ra các tác
giả còn phân lập được cDNA của LEA (late embryogeis abudant protein) nhóm D-95
từ lá và rễ cây đậu tương khi bị hạn. Nguyễn Thu Hiền và cộng sự (2005) đã nghiên
cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh và phân lập được gen dehydrin từ một số giống đậu
tương của Việt Nam [5]. Các tác giả khác đã nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn
của cây đậu tương, tiêu biểu là công trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu
tương nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [9], nghiên cứu phân lập, xác định trình tự
gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tương đột biến M103; phân lập gen dehydrin liên
quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị Phương Liên (1999) [10],
Nguyễn Thu Hiền và cộng sự (2005) [5]. Nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tương
bằng phương pháp đột biến thực nghiệm của Chu Hoàng Mậu (2001) [12].
 Đặc tính chống chịu sâu bệnh hại
Một nhóm các nhà khoa học tại Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, đại học bang Iowa (ISU)
và Brazil đã xác định được nhóm gen có khả năng kháng nấm Phakopsora pachyrhizi gây
bệnh rỉ sắt đậu tương châu Á (ASR). Khám phá này giúp bảo vệ đậu nành chống lại bệnh
ARS thông qua nhân giống truyền thống hay phương pháp công nghệ sinh học [22].
Ở Châu Á, bệnh rỉ sắt trên lá đậu tương là loại bệnh nghiên trọng, là một trong
những nguyên nhân chính làm suy giảm năng suất. Nguyên nhân gây ra bệnh rỉ sắt
hiện nay đã được xác định do hai loại nấm khác nhau gây nên (Phakopsora pachyrhizi
và Phakopsora meibomiae). Loại nấm Phakopsora pachyrhizi thường gây bệnh trên

đậu tương ở khu vực Châu Á hoặc Châu Úc [22]. Năm 1902, lần đầu tiên bệnh rỉ sắt ở
đậu tương được phát hiện tại Nhật và cũng là trở ngại cho các nước khu vực nhiệt đới
và cận nhiệt đới. Không lâu sau đó, loại nấm Phakopsora pachyrhizi nhanh chóng lan
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
rộng ra các vùng trồng đậu tương trên toàn thế giới. Một loạt các nước phát hiện ra
loại bệnh này như Hawaii (1994), Zimbabwe (1998), Paraquay (2001) và nhiều nước
khác thuộc khu vực Châu Phi, Nam Mỹ.
Thống kê ở các nước trồng đậu tương trên thế giới đã xác định năng suất đậu
tương bị suy giảm do loại bệnh rỉ sắt gây ra khoảng từ 10 đến 80% tùy từng mùa vụ,
điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác và giống đậu tương gieo trồng.
Ở Việt Nam, Pham và cộng sự (2009) [111] đã đánh giá khả năng kháng bệnh rỉ
sắt của 63 giống đậu tương (trong đó có 3 giống của Việt Nam) qua năm mùa vụ khác
nhau từ 2005 đến 2009 đã xác định được giống DT2000 và Vàng Hà Giang là 2 giống
có khả năng kháng bệnh rỉ sắt tốt nhất.
1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và tại Việt Nam
1.3.1.Trên thế giới
Đậu tương là cây lương thực giàu hàm lượng protein (44%), lipid (12,5 – 25%)
và glucid (10 – 15%) được trồng làm thức ăn cho người và gia súc. Trong hạt đậu
tương có chứa đầy đủ các axít amin cơ bản như isoleucin, leucin, lycin, methionin,
phenylalanin, tryptophan và valin. Cây đậu tương dễ trồng, có tác dụng cải tạo đất,
tăng năng suất các cây trồng khác do hoạt động cố định đạm của loài vi khuẩn
Rhizobium cộng sinh trên dễ cây đậu. Do khả năng thích ứng khá rộng, cây đậu tương
đã được trồng khắp năm châu lục, tập trung nhiều nhất là châu Mỹ 75,68%, tiếp đến là
châu Á 21,27% và một số nước khác trên thế giới [42].
Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tƣơng nhiều nhất thế giới năm 2008
TT
Quốc gia
Diện tích

(Triệu ha)
Sản lƣợng
(Triệu tấn)
1
Mỹ
30,20
80,50
2
Brazil
21,30
60,00
3
Argentina
16,40
46,20
4
Trung Quốc
9,13
15,50
5
Ấn Độ
9,60
9,04
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
6
Paraguay
2,64
6,80

7
Canada
1,20
3,34
8
Bolivia
0,96
1,60
Tổng số trên toàn thế giới
96,87
230,95
(Nguồn: Food & Agriculture Organisation, 2009)
1.3.2. Ở Việt Nam
Một số tài liệu cho rằng cây đậu tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời
vua Hùng và xác định cây đậu tương được trồng trước cây đậu xanh và cây đậu đen
[1]. Ngày nay đậu tương đã trở nên quen thuộc và trồng rộng rãi trên cả nước. Tuy
nhiên đậu tương trồng ở nước ta chủ yếu là sử dụng làm thực phẩm mang tính tự cung
tự cấp. Trong những năm gần đây, cây đậu tương đã phát triển khá nhanh cả về diện
tích và năng suất góp phần tạo ra mặt hàng tiêu dùng quan trọng. Tình hình sản xuất
đậu tương trong nước mấy năm gần đây được trình bày trong bảng 1.2 và 1.3.
Bảng 1.2. Số liệu thống kê sản xuất đậu tƣơng qua các vùng khác nhau ở Việt
Nam, năm 2008
STT
Vùng canh tác
Diện tích
( ha)
Năng suất
(kg/ha)
Sản lƣợng
(tấn/năm)

1
Vùng trung du và miền núi phía Bắc
64100
1152,9
73900
2
Vùng Đồng Bằng Sông Hồng
70100
1440,8
101000
3
Vùng Bắc Trung Bộ và duyên hải
miền Trung
4400
1431,8
6300
4
Vùng Tây Nguyên
25000
1768
44200
5
Vùng Đông Nam Bộ
1800
1166,7
2100
6
Vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long
6900
2246,4

15500
Tổng số
191500
1400,0
268600
(Nguồn: Niêm giám thống kê 2008, NXB Thống kê Hà Nội, 2009)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
Về diện tích: Diện tích gieo trồng đậu tương của nước ta chiếm tỉ lệ nhỏ trong
tổng diện tích gieo trồng (khoảng 1,5 – 1,6%). Những năm gần đây diện tích trồng đậu
tương có xu hướng giảm xuống, nếu lấy năm 2005 làm mốc thì đến năm 2009 diện
tích đã giảm 57,7 nghìn ha (bảng 1.3).
Về năng suất: năng suất đậu tương bình quân của nước ta rất thấp chỉ đạt
khoảng trên 50% so với năng suất bình quân trên thế giới. Tuy nhiên, nhờ những nỗ
lực rất lớn của các nhà khoa học trong công tác nghiên cứu chọn tạo giống và các biện
pháp canh tác, năng suất đậu tương trong 5 năm gần đây đã tăng từ 1,34 tấn/ha (2004)
lên 1,46 tấn/ha (2009). Hiện nay, cả nước đã hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương
(bảng 1.2). Trong đó vùng Đồng bằng Sông Hồng có diện tích lớn nhất, chiếm 36,6%
diện tích đậu tương cả nước; tiếp đến là vùng Trung du miền núi phía bắc (chiếm
33,47%), vùng Tây Nguyên (chiếm 13%), vùng đồng bằng sông Cửu Long 5,7%.
Về sản lượng: sản lượng đậu tương của vùng đồng bằng sông Hồng và Trung
du miền núi phía Bắc chiếm hơn 65% sản lượng đậu tương cả nước. Vùng đồng bằng
sông Cửu Long chỉ chiếm khoảng 3,6% diện tích nhưng năng suất bình quân cao nhất
cả nước đạt trên 22 tạ/ha, sản lượng chiếm 5,7% sản lượng của cả nước (bảng 1.2).
Bảng 1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam trong những năm gần đây
(2004 – 2009)
Năm
Diện tích
(Nghìn ha)

Năng suất
(Tấn/ha)
Sản lƣợng
(Nghìn tấn)
2004
183,8
1,34
245,9
2005
204,1
1,43
292,7
2006
185,6
1,39
258,1
2007
187,4
1,47
257,2
2008
191,5
1,40
268,6
2009
146,4
1,46
213,6
(Nguồn: Niêm giám thống kê 2009, NXB Thống kê Hà Nội, 2010)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
Cùng với nhịp độ tăng dân số, vấn đề sức khỏe của người tiêu dùng được chú
trọng. Xu hướng sử dụng dầu thực vật để thay thế mỡ động vật trong chế biến thức ăn
ngày càng tăng. Hạt đậu tương là một trong những loại nguyên liệu chính được sử
dụng để sản xuất dầu thực vật và là nguồn cung cấp protein cho con người. Việt Nam
đã đặt ra mục tiêu tăng sản lượng đậu tương lên đến 50 triệu tấn/năm vào năm 2010.
Tuy nhiên, sản lượng đậu tương khó tăng nhanh trong những năm tới do năng suất còn
thấp, chi phí cho hóa chất trừ sâu hại cao, làm hạn chế khả năng tăng năng suất, tăng
mùa vụ và diện tích gieo trồng của đậu tương.
1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng
1.4.1. Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên
Những năm đầu thế kỷ 20, Smith và Townsend đã phát hiện ở một số cây hai lá
mầm xuất hiện những khối u và tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn đất Agrobacterium
tumefaciens. Đến cuối những năm 1960, mối quan hệ giữa khối u và vật liệu di truyền
trong loài vi khuẩn này đã được Braun và Schilperoort khám phá. Agrobacterium
tumefaciens có khả năng xâm nhiễm vào thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết
thương của cây chủ. Trong tự nhiên, Agrobacterium chủ yếu tấn công vào cây hai lá
mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa. Một vài loài cây một lá mầm thuộc họ hành tỏi
và thủy tiên mẫm cảm yếu với Agrobacterium tumefaciens [27].
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u do vi khuẩn
Agrobacterium sinh ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện không có hormone sinh
trưởng (auxin và cytokinin). Sở dĩ như vậy là do Agrobacterium đã chuyển một
đoạn DNA (T-DNA) sang tế bào thực vật và T-DNA đã điều khiển quá trình tổng
hợp các chất đó [49], [59]. Ngoài ra, khối u còn tổng hợp opin là các amino axit đặc
biệt và các dẫn xuất của đường. Dạng opin được tổng hợp có thể là nopalin,
octopin, agrocinopin, mannozapin hay agropin phụ thuộc vào từng chủng
Agrobacterium điều khiển quá trình tổng hợp các chất đó. Trong đó nopalin và
octopin là hai dạng opin phổ biến nhất. opin được vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn

cacbon và nitơ nhờ vào gen hoạt động chuyển hóa opin trên plasmid gây khối u thực
vật (tumour inducing plasmid – Ti plasmid) [59].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u đã được quan tâm nghiên cứu nhằm
tìm ra phương thức phòng trừ bệnh cho cây. Tuy nhiên, khi phát hiện ra Ti-plasmid và
khả năng tự chuyển T-DNA vào genome thực vật người ta đã đặc biệt chú ý và khai
thác sử dụng chúng như một vector tự nhiên để chuyển gen quan tâm vào thực vật
nhằm tạo ra cây trồng mang những tính trạng mong muốn [49], [59].
1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng Agrobacterium tumefaciens gây
nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 30
o
C. Đây là một phân tử DNA dạng mạch
vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập, có kích thước
khoảng 200 kb [47]. Phân tích di truyền cho thấy, Ti-plasmid dạng octopin và dạng
nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có 4 vùng tương đồng, trong đó vùng T- DNA và
vùng gây độc (Virulence Region – vùng Vir), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối
u ở thực vật. Vùng gây độc có chứa các gen mã hóa các protein/enzyme Vir. Có 9 loại
protein Vir là A, B, C, G, B1 – 11, D1 – 2, E1 – 2, F, H, J/AcvB [47], [59]. Các
protein Vir này có vai trò quan trọng trong việc chuyển T- DNA sang tế bào thực vật.
Hai vùng còn lại chứa gen mã hóa cho việc sao chép plasmid và chuyển nạp.
Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T – DNA được chuyển từ vi khuẩn sang genome
của các cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở trong đó. Tuy nhiên, vùng này lại không mã
hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T – DNA mà cần có sự trợ giúp
đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng Vir và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn.
Vùng Vir dài khoảng 40 kb đảm nhiệm chức năng gây nhiễm. Ở Ti-plasmid dạng
octopin, vùng Vir chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các gen này mã hóa
đã kích thích sự tách biệt T – DNA, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với

genome cây chủ [59].





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10











Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin

1.4.3. Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA
Kết quả phân tích trình tự gen trên T – DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho
thấy, T – DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ
khoảng 25bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T
– DNA và xâm nhập của T – DNA vào tế bào thực vật. Ở đoạn biên bên phải (Right
border – RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T – DNA. Đoạn bên
trái (Left border – LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T – DNA và là dấu
hiệu để quá trình này kết thúc bình thường [6], [47].

Ti-plasmid dạng nopalin, T – DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng một
đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T – DNA là một đoạn
gen liên tục dài 13 kb. T – DNA mang rất nhiều gen như: (1) các gen mã hóa những
enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) các gen gây khối u như tms1,
tms2, tmr mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và
cytokinin [47], [59].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
1.4.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens
Các tế bào thực vật bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học dẫn dụ vi
khuẩn như: acetosyringone, hydroxy – acetosyringone… Dưới tác dụng của các hợp
chất này, Agrobacterium tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và
chuyển T – DNA vào tế bào thực vật [13], [49], [60]. Quá trình này được sự trợ giúp
đặc biệt của các gen Vir và RB, LB. Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm
ứng, giúp cho các gen vùng Vir hoạt động và tăng cường biểu hiện.
Hoạt động của các gen Vir sinh ra sợi đơn T – DNA làm xuất hiện bản copy sợi
bên dưới của T – DNA [59]. Chỉ đoạn sợi đơn DNA giữa hai trình tự biên (LB và RB)
của T – DNA mới được chuyển vào tế bào thực vật, và được gắn vào genome của tế
bào. Đó là yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển T – DNA. Protein Vir D1, D2
đóng vai trò là chìa khóa trong bước này, chúng nhận ra trình tự biên T – DNA và cắt
sợi bên dưới tại mỗi bên. Điểm cắt là điểm đầu và kết thúc của sợi tái sinh. Sau đó,
protein Vir D2 vẫn còn gắn kết với đầu cuối 5‟ của sợi T – DNA và tế bào thực vật
[49], [60]. Nếu gây đột biến hay loại bỏ đoạn RB thì hầu như mất hoàn toàn khả năng
chuyển T – DNA, còn nếu đột biến LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T – DNA [57].
Điều đó chứng tỏ tổng hợp sợi T – DNA là từ đầu 5‟ đến 3‟, được bắt đầu từ đoạn RB
và kết thúc ở LB.
Phương tiện để chuyển đoạn T – DNA vào nhân tế bào thực vật là phức protein

và sợi T – DNA. Theo đa số các nhà khoa học cho rằng phức hợp sợi đơn T – DNA –
Vir D2 được bao bọc bởi protein Vir E2 có trọng lượng 96 kDa [54]. Sự phối hợp này
giúp ngăn cản sự tấn công của nuclease, hơn nữa sợi đơn T – DNA duỗi thẳng làm
giảm kích thước của phức xuống xấp xỉ 2 nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di
chuyển qua các kênh dẫn truyền trên màng tế bào [49]. Protein Vir E2 chứa đựng hai
tín hiệu định vị trong nhân tế bào thực vật và một protein Vir D2 [19]. Thực tế cho
thấy hai protein này có vai trò quan trọng trong việc dàn xếp sự hấp thụ phức vào
trong nhân tế bào thực vật [132]. Nếu loại bỏ tín hiệu định vị trong nhân thì một trong
các protein này bị giảm, nhưng không ức chế hoàn toàn quá trình chuyển T – DNA và
tương tác giữa T – DNA với genome tế bào thực vật, chứng tỏ có một thành viên khác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
có thể đảm nhận một phần tối thiểu vai trò của protein bị thiếu Protein Vir E cần thiết
đối với quá trình bài xuất protein Vir E2 sang tế bào thực vật [49].











Hình 1.2. Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế
chuyển T - DNA
Protein Vir D4 không thể thiếu đối với sự vận chuyển phức ss – T – DNA. Chức năng
của protein Vir D4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein cần thiết đối với quá

trình di truyền T – DNA.
Các nghiên cứu công bố trước đây đã miêu tả vai trò của operon Vir B có kích
thước 9,5 kb trong quá trình sản sinh cấu trúc bề mặt của tế bào đối với sự vận chuyển
phức từ vi khuẩn sang tế bào thực vật [43].
Protein Vir B là protein có tính kị nước tương tự protein kết hợp trên màng
khác. Phần lớn protein Vir B đã được phát hiện giống như kênh protein xuyên màng.
Tuy nhiên, cũng có thể vài protein Vir B khác được phân phối lại trong quá trình phát
sinh sinh vật và thực hiện chức năng của kênh kết hợp qua tế bào vận chuyển. Đáng
chú ý là trong đó protein Vir B2, Vir B11 là thành phần cơ bản của bộ máy vận chuyển
T – DNA từ tế bào vi khuẩn sang tế bào thực vật. Sau khi T – DNA qua màng tế bào
chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
ra auxin, cytokinin và opin gây lên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận
dẫn đến sự hình thành khối u [43].
1.4.5. Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật
Trong tế bào thực vật, phức ss – T – DNA được đưa qua màng nhân vào nhân.
Hai protein đóng vai trò quan trọng trong bước này là Vir D2 và Vir E2. Tín hiệu định
vị trong nhân của Vir D2 và Vir E2 đóng vai trò chủ yếu. Protein Vir D2 có chức năng
xác định vị trí cho T – DNA trong nhân. Phức ss – T – DNA là phức nucleoprotein lên
đến 20 kb chứa một đầu 5‟ gắn với protein Vir D2. Nhưng phức được bao bọc bởi số
lượng lớn phân tử Vir E2 (xấp xỉ 600/20kb T – DNA) và mỗi phức này có hai tín hiệu
định vị trong nhân. Hai tín hiệu này của Vir E2 đóng vai trò quan trọng đối với việc
nhận liên tục phức T – DNA của nhân, có khả năng kích thích mở lỗ màng nhân. Khả
năng nhận phức của nhân được điều khiển bởi protein kết hợp tín hiệu định vị đặc
trưng trong nhân, protein này được tìm thấy trong tế bào chất của tế bào thực vật [49].
Bước cuối cùng trong quá trình vận chuyển T – DNA là sự tương tác trong
genome tế bào thực vật. Các phản ứng trong sự tương tác T – DNA không có tính điển
hình. Sự tương tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp không theo quy luật. Theo cách nhìn

nhận việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, cần thiết đối với bước lặp lại giữa
cặp vận chuyển T – DNA với Vir D2 và DNA thực vật. Sự tương đồng này rất thấp và
đặc trưng đối với quá trình tái tổ hợp bởi sự xác định vị trí của Vir D2 để gắn kết [49],
[60]. Ở trình tự gần kề hay đầu 3‟ của T – DNA tìm thấy một vài sự tương đồng nhỏ
đối với DNA thực vật, kết quả của sự tương tác đầu tiên giữa sợi T – DNA và DNA
thực vật là tạo ra lỗ hổng ở sợi 3‟ – 5‟ của DNA thực vật. Sau đó DNA thực vật được
cắt ở vị trí đầu 3‟ của lỗ hổng bởi endonuclease và nucleotit của đầu 5‟ bắt cặp với Vir
D2 bởi một nucleotit của đầu 5‟ bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit trong đầu sợi (5‟
– 3‟) DNA thực vật. Phần 3‟ nhô ra của T – DNA cũng như DNA thực vật thay thế bị
phân hủy bởi endonuclease hay 3‟-5‟ enxonuclease. Đầu 5‟ của T – DNA gắn với Vir
D2 còn đầu 3‟ kia cặp đôi với DNA thực vật kéo dài từ bước đầu của quá trình tương
tác, nối liền với vết cắt trong sợi DNA dưới của thực vật. Sự đưa vào của sợi T – DNA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
trong sợi 3‟ – 5‟ của DNA thực vật được bổ sung, tình trạng xoắn sinh ra bởi vết cắt
trong sợi đối ngược được sản sinh [13], [60].
Tình trạng này hoạt hóa phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ sung
được tổng hợp sử dụng để chèn dễ dàng sợi T – DNA như là sợi khuôn [49]. Vir D2 có
vai trò hoạt hóa trong sự hòa hợp chính xác sợi T – DNA vào nhiễm sắc thể thực vật.
Phóng thích protein Vir D2 có thể cung cấp năng lượng chứa đựng trong các liên kết
phosphodieste, như Tyr 29 với nucleotit đầu tiên của sợi T – DNA, qui định đầu 5‟ của
sợi T – DNA không còn [116]. Ngoài ra, quá trình chuyển T – DNA còn có sự tương
tác với các protein do gen trên nhiễm sắc thể của Agrobacterium tumefaciens qui định
và protein trong tế bào thực vật.
1.5. Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
1.5.1. Vector nhị thể
Trên cơ sở phát hiện hai vùng Vir không nằm trên cùng một plasmid với vùng T
– DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T – DNA vào hệ gen thực

vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thể, trong đó vùng T –
DNA và vùng Vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong cùng một chủng
Agrobacterium tumefaciens.
Có hai loại vector được sử dụng trong hệ thống vector nhị thể:
(a) Vector chuyển gen là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật
chủ rộng với đoạn T – DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa hai trình tự
biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới: i) các đơn vị sao
chép để DNA plasmid có thể vừa tự nhân trong cả E.coli và Agrobacterium; ii) các gen
chọn lọc, gen chỉ thị; iii) vùng có chứa nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn (vùng tạo
dòng đa năng nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải để chèn gen mong muốn).
(b) Vector bổ trợ: nằm trong Agrobacterium tumefaciens, với toàn bộ vùng Vir
được gữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T- DNA và RB, LB. Plasmid này được cải
tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì
khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
Hai cấu trúc này cũng được đưa vào Agrobacterium tumefaciens, khi các gen trên
vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T- DNA trên
vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T- DNA sang tế bào thực vật. Quá trình
biến nạp ở vector nhị thể diễn ra như sau: (i) Plasmid nhỏ được nhân lên trong E.coli,
sau đó được chuyển trực tiếp hoặc qua quá trình tiếp hợp vào tế bào Agrobacterium
tumefaciens để chuyển T- DNA vào genome thực vật; (ii) chọn lọc tế bào thực vật
trong những điều kiện thích hợp.
Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững trong
E.coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động. Tuy nhiên, vector nhị thể có một số ưu
điểm như: (i) không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid; (ii) kích thước của
vector khá nhỏ. Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E.coli sang Agrobacterium
tumefaciens đã tăng lên.

Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể

1.5.2. Hệ vector liên hợp
Vector liên hợp được xây dựng dựa trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương đồng
nằm trên plasmid vi khuẩn (như vector của E.coli) với cùng T- DNA trên Ti-plasmid
của Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, người ta giữ lại vùng Vir, loại bỏ vùng mã
hóa chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid.
Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp: