nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katg và gen inha từ các chủng vi khuẩn lao phân lập tại miền trung - việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
_____________

______________




TRỊNH QUỐC PHƯƠNG



NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC
ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN
KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP
TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM






LUẬ N VĂN THẠ C SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C

Thái Nguyên – 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
_____________

______________



TRỊNH QUỐC PHƯƠNG



NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC
ISONIAZID BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN
KATG VÀ GEN INHA TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP
TẠI MIỀN TRUNG – VIỆT NAM


Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số : 60.42.80



LUẬ N VĂN THẠ C SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh




Thái Nguyên – 2011
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bệnh lao là bệnh truyền nhiễm do vi trùng lao (còn gọi là vi trùng Koch hay
BK) gây ra, có thể lây nhiễm từ ngƣời bệnh sang ngƣời lành. Bệnh có thể gặp ở tất
cả các bộ phận của cơ thể, trong đó lao phổi là thể lao phổ biến nhất (chiếm 80 -
85%) và là nguồn lây chính cho ngƣời xung quanh, nhƣng nó cũng dễ ảnh hƣởng
đến hệ thần kinh trung ƣơng dẫn đến bệnh lao màng não, ảnh hƣởng hệ bạch huyết,
hệ tuần hoàn dẫn đến bệnh lao kê.
Bệnh có thể chữa khỏi mà không để lại di chứng nếu nhƣ đƣợc phát hiện sớm,
điều trị kịp thời. Tuy nhiên, nếu ngƣời bệnh điều trị không đúng cách (bỏ dở điều trị
hoặc dùng thuốc không đúng theo chỉ dẫn của thầy thuốc) sẽ gây hậu quả nghiêm
trọng nhƣ: Bệnh không khỏi, dễ để lại di chứng hoặc gây tử vong; gây ra hiện tƣợng
kháng thuốc, nguy hiểm nhất là kháng đa thuốc làm cho việc điều trị càng khó khăn
và tốn kém hơn; tiếp tục là nguồn lây nhiễm trong cộng đồng.
Việc điều trị lao đa kháng thuốc rất phức tạp và khó khăn. Chi phí điều trị
cao, thời gian điều trị kéo dài. Tỷ lệ khỏi bệnh thấp, tỷ lệ bỏ trị và tử vong của bệnh
nhân cao.
Hiện nay, để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc các cơ sở y tế trong nƣớc

vẫn phải dựa vào phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn lao và làm kháng sinh đồ kéo dài
ít nhất 4 - 6 tuần nhƣ vậy sẽ gặp khó khăn trong việc điều trị.
Sinh học phân tử đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao
kháng thuốc và khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên. Thời gian chẩn đoán có thể
rút ngắn xuống còn vài ngày với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Kháng thuốc là do xảy ra đột biến trong các khu vực của hệ gen MTB, nhƣ:
katG, inhA, ahpC, kasA và ndh liên quan đến tính kháng isoniazid (INH), ropB
kháng rifampicin (RIF), embB kháng ethambutol (EMB), pncA kháng pyzamid
(PZA) và rpsL, rrs liên quan đến tính kháng streptomycin (STR).
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
"Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định
đột biến trên gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao phân lập tại Miền
Trung - Việt Nam ".
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phát hiện đột biến trên gen katG và gen inhA liên quan đến tính kháng isoniazid
ở các chủng lao nghiên cứu.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết DNA tổng số từ mẫu đờm của các bệnh nhân
- Kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số bằng đo OD260nm / 280nm = 1,8 -
2,2
- Nhân bản đoạn gen katG và gen inhA từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu
- Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli
- Tách dòng gen katG và gen inhA
- Giải trình tự gen katG và gen inhA
- Phát hiện, phân tích đột biến trên gen katG và gen inhA liên quan đến tính
kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu.

Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U

1.1 Tnh hnh bnh lao
1.1.1. Tnh hnh bệnh lao trên thế gii
Nhƣ chú ng ta đã biế t, lao là mộ t trong nhƣ̃ ng bệ nh nhiễ m trù ng mã n tí nh
xuấ t hiệ n sớ m nhấ t ở loà i ngƣờ i và có khả năng lây truyề n trong cộ ng đồ ng , là mối
đe dọa lớn với tất cả mọi ngƣời trên hành tinh này . Nế u không có sƣ̣ kiể m soá t củ a
con ngƣờ i bằ ng nhƣ̃ ng phƣơng phá p và công cụ hƣ̃ u hiệ u, bệ nh lao có thể bù ng phá t
nhƣ mộ t bệ nh dị ch nguy hiể m , làm chết nhiều ngƣời và tác động xấu đến sự phát
triể n kinh tế xã hộ i.
Hiệ n nay, trên thế giớ i có khoả ng 2,2 tỷ ngƣời đã nhiễm lao (chiế m 1/3 dân
số thế giớ i ), tỷ lệ điều trị thành công trên 85% bằ ng hoá trị liệ u , nhƣng tỷ lệ phá t
hiệ n chỉ đạ t 37% số bệ nh nhân ƣớ c tính . Nhƣ vậ y , còn rất nhiều bệnh nhân lao
không đƣợ c chƣ̃ a trị đa ng tiế p tụ c lây lan cho cộ ng đồ ng và theo ƣớ c tính củ a Tổ
chƣ́ c Y tế Thế giớ i (TCYTTG), mỗ i năm có thêm 1% dân số thế giớ i bị nhiễ m lao
(65 triệ u ngƣờ i) [3], [11].
Năm 1993, Tổ chƣ́ c Y tế Thế giớ i (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạ n g khẩ n
cấ p toà n cầ u củ a bệ nh lao và mố i hiể m họa của nó trong tƣơng lai là bệnh lao kháng
thuố c [3], [11].
Năm 2005, TCYTTG ƣớ c tí nh khu vƣ̣ c Đông Nam Á có 4,8 triệ u bệ nh nhân
lao. Trong đó số ca bệ nh nhân lao mắ c mớ i là gầ n 3 triệ u, chiế m 34% toàn cầu. Số
ngƣờ i chế t ở Đông Nam Á lá 512000 ngƣờ i, chiế m 1/3 toàn thế giới . Châu Phi có
số bệ nh nhân lao là 3,8 triệ u ngƣờ i ; số ca mớ i mắ c là 2,5 triệ u; số chế t do bệ nh lao
là 544000. Hai khu vƣ̣ c nà y có tình hình mắc lao nặng nề nhất thế giới [15].

WHO dƣ̣ bá o chi phí điề u trị cho bệ nh nhân lao ở 27 nƣớ c có số bệ nh nhân
đông nhấ t sẽ lên đế n 16 tỷ USD trong vòng 6 năm tớ i và coi bệ nh lao là vấ n đề y tế
cộ ng đồ ng, là một trong nhƣ̃ ng nguyên nhân chính gây tƣ̉ vong trên thế giớ i . Không
nhƣ̃ ng thế , nhiề u vấ n đề mớ i nả y sinh, thậ m chí đƣợ c đá nh giá là nghiêm trọ ng trên
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
toàn cầu làm cho công tác phòng , chố ng lao gặ p khó khăn , đe dọa phá vỡ nhƣ̃ ng
thành quả đạ t đƣợ c . Báo cáo của WHO đƣợc đƣa ra dựa trên thông tin thu thập
trong thời gian từ 2002-2006 ở 1/2 các nƣớc trên thế giới do các nƣớc còn lại không
hợp tác. Chẳng hạn tại Châu Phi chỉ có 6 nƣớc cung cấp thông tin về lao kháng
thuốc cho WHO. Trƣớc tình hình trên, WHO thúc giục các quốc gia và tổ chức từ
thiện trên thế giới tập trung đầu tƣ vào DOTS- một chiến dịch chuẩn hóa cách phát
hiện, điều trị đƣợc mở rộng. Đồng thời tổ chức y tế này cũng vừa đƣa ra chƣơng
trình DOTS- Plus (chƣơng trình DOTS mở rộng) liên quan đến việc sử dụng thuốc
đa dạng nhằm chống lại các dòng MDR. Việc kiểm soát dịch bệnh ở từng nƣớc sẽ
không thể ngăn chặn sức kháng thuốc của khuẩn lao, chỉ có sự đầu tƣ đồng bộ vào
các chiến dịch phòng chống bệnh trên toàn thế giới mới phát huy tác dụng [3], [13].
Tƣ̀ năm 2000 đến năm 2008, cơ quan phá t triể n quố c tế hoa kỳ (USAID) đã
cung cấ p gầ n 900 triệ u đô la cho chƣơng trình phò ng , chố ng lao toà n thế giớ i .
Trong năm tà i khoá 2009, USAID đã cung cấ p 15 triệ u đô l a cho cơ sở sả n xuấ t
thuố c chố ng lao toà n cầ u (DF). Bệ nh lao là bệ nh củ a ngƣờ i nghè o , lây lan nhanh
trong cộ ng đồ ng có điề u kiệ n số ng chậ t chộ i, thiế u vệ sinh, thông khí và dinh dƣỡ ng
kém. Mƣ́ c độ nặ ng nề củ a bệ nh lao đã ả n h hƣở ng tớ i thu nhậ p quố c dân và chỉ số
phát triển con ngƣời của các quốc gia . Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy , mỗ i
bệ nh nhân lao sẽ mấ t trung bình 3-4 tháng lao động , làm giảm 20-30% thu nhậ p
bình quân của gia đình và nó đã tác động tới 70% đố i tƣợ ng lao độ ng chính củ a xã
hộ i [3], [6].
Đáng buồn là vào thời điểm hiện tại, đã 129 năm kể từ ngày nhà bác học

ngƣời Đức Robert Koch công bố tìm ra nguyên nhân gây ra bệnh lao thì căn bệnh
này vẫn chƣa đƣợc khống chế. Có nhiều cách lý giải thực trạng này song chúng ta
thấy đƣợc một số lý do chủ yếu nhƣ sau: Sự xuất hiện và mức độ hoành hành ngày
càng tràn lan của đại dịch HIV/AIDS; tình hình bệnh lao kháng thuốc; sự xuống cấp
của cơ sở y tế điều trị và chăm sóc bệnh nhân lao cũng nhƣ sự thiếu quan tâm đến
công tác phòng , chống lao tồn tại ở một số quốc gia, đặc biệt là những nƣớc kém
hoặc đang phát triển. Thêm vào đó là tình trạng di dân giữa các quốc gia, từ những
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
nƣớc có số ngƣời mắc lao cao sang những nƣớc có số ngƣời mắc lao thấp; tình trạng
di dân, đô thị hóa trong mỗi quốc gia; tình trạng nghèo đói và đặc biệt là các
phƣơng tiện để chẩn đoán và điều trị lao trong nhiều năm qua vẫn chƣa có đổi mới
đáng kể [38].
1.1.2. Tnh hnh bệnh lao  Việt Nam
Theo Ủy ban điề u phố i liên minh phò ng , chố ng lao toà n cầ u , Việ t Nam xế p
thƣ́ 12 trong 22 nƣớ c có gá nh nặ ng bệ nh lao trên toà n cầ u, cao hơn nhiề u bậ c so vớ i
nhiề u năm trƣớ c đó . Hàng năm, Việ t Nam có khoả ng 150.000 bệ nh nhân lao cá c thế
hệ xuấ t hiệ n và khoả ng 12.000 ca đồ ng nhiễ m lao/HIV. Việ t Nam là nƣớ c có nhiề u
bệ nh nhân lao đƣ́ ng hà ng thƣ́ ba ở khu vƣ̣ c Tây Thá i Bì nh Dƣơng , sau Trung Quố c
và Philippin. Tỷ lệ dân số Việ t Nam mắ c lao là 44%. Tỷ lệ kháng th uố c là 32,5%
khá cao so với trong khu vực . Vớ i nguy cơ mắ c lao ƣớ c tính hà ng năm là 1,7%. Tỷ
lệ chế t do lao khá cao : 26/100.000 dân tƣơng đƣơng vớ i 20.000 ngƣờ i chế t do lao
mỗ i năm. Nhƣ vậ y, ở Việt Nam cứ mỗi ngày có gần 400 ngƣờ i mắ c bệ nh lao và 55
ngƣờ i chế t vì bệ nh lao. Kế t quả điề u tra dịch tễ cho thấ y nguyên nhân bệ nh lao vẫ n
tiế p tụ c tăng ở Việ t Nam do tỷ lệ lao tăng ở nhó m tuổ i trẻ và công tá c giá m sá t lao
chƣa đƣợ c quan tâm đú ng mƣ́ c, nguồ n nhân lƣ̣ c cho công tá c phò ng, chố ng lao ngà y
càng mai một ; 50% số cá n bộ y tế phò ng, chố ng lao cấ p huyệ n chƣa đƣợ c đà o tạ o
đang là thƣ̉ thá ch lớ n vớ i công tá c phò ng, chố ng lao tạ i Việ t Nam [11].

Một khảo sát vào năm 2004 của chƣơng trình chống lao quốc gia cho thấy
địa phƣơng nào có mật độ và lƣu chuyển dân số đông, y tế tƣ và hiệu thuốc phát
triển thì nơi đó có tỷ lệ điều trị thất bại, tái phát, mãn tính của bệnh lao cũng cao
nhất. Cụ thể số bệnh nhân tái phát và thất bại ở Đà Nẵng là 48, Cần Thơ 195 An
Giang 570 và TP.HCM là 1.664 [2].
Nƣớ c ta thuộ c loạ i trung bình về dịch tễ trên thế giớ i. Đội ngũ cán bộ chống
lao cá c cấ p hiệ n nay là 15772 (20/100.000 dân). Số cá n bộ nà y tậ p trung chủ yế u ở
các tỉnh miền Bắc và Bắc Trung bộ . Trong khi đó , các tỉnh phía Nam , bao gồ m
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
TP.HCM nơi có số bệ nh nhân hà ng năm cao nhấ t cả nƣớ c , chỉ đạt 10 cán bộ cho
100.000 dân [3].
Tình hình đồng nhiễm lao/HIV đang là một thách thức lớn và đƣợc đánh giá
là rất nghiêm trọng. Lao là bệnh nhiễm trùng phổ biến nhất và cũng là nguyên nhân
gây tử vong hàng đầu ở ngƣời nhiễm HIV. Theo thống kê của chƣơng trình chống
lao quốc gia, hiện nay tại tất cả các tỉnh, thành phố trong cả nƣớc đều có ngƣời
đồng nhiễm lao và HIV. Ngƣời đồng nhiễm lao/HIV tập trung ở những tỉnh, thành
phố có nhiều ngƣời nhiễm HIV và mắc lao: TP. Hồ Chí Minh, An Giang, Quảng
Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Lạng Sơn Qua khám sàng lọc lao cho 5.114 ngƣời
nhiễm HIV cho thấy, có 18,6% số nhiễm HIV có mắc lao; khoảng 90% số ngƣời
nhiễm lao/HIV ở lứa tuổi 18-40. Đáng chú ý, qua giám sát trọng điểm có 5% số
ngƣời bệnh lao có HIV, tỷ lệ này tăng gấp 10 lần so với năm 1990. Sự gia tăng của
đại dịch HIV/AIDS làm cho bệnh nhân lao lại càng thêm trầm trọng vì 50% số
ngƣời nhiễm HIV sẽ trở thành bệnh lao nếu nhiễm vi khuẩn lao [3].
Theo kết quả điều tra dịch tễ lao toàn quốc 2006-2007, tình hình bệnh lao ở
nƣớc ta cao hơn ƣớc tính của Tổ chức Y tế Thế Giới 1,6 lần. Đặc biệt, bệnh lao
đang có xu hƣớng giảm ở lứa tuổi già và có xu hƣớng tăng ở lứa tuổi trẻ. Ở lứa tuổi
15-24, tỷ lệ phát hiện lao phổi AFB dƣơng tính mới trên 100.000 dân tăng từ 29,5

(năm 2000) lên 37,5 (năm 2008) đối với nam giới còn ở nữ giới là từ 16,9 lên 22,8
[10].
Năm 2006, Chƣơng trình chống lao quốc gia đã xây dựng kế hoạch phòng ,
chố ng lao giai đoạ n 2006-2010. Vớ i mụ c tiêu phá t hiệ n đƣợ c trên 70% số bệ nh
nhân lao và điề u trị khỏ i cho 90% số bệ nh nhân lao đã đƣợ c phá t hiệ n , đến nay,
chiế n lƣợ c DOTS (điề u trị lao bằ ng hoá trị liệ u ngắ n ngà y có kiể m soá t trƣ̣ c tiế p ) đã
đƣợ c triể n khai tạ i 100% số huyệ n trong cả nƣớ c và tiế p tụ c xây dƣ̣ ng kế hoạ ch
phòng, chố ng lao giai đoạ n 2010-2015 [10], [14].
Việt Nam là một trong 7 quốc gia có tình hình lao nghiêm trọng nhất thế giới
(Cambodia, China, Mongolia, Papa New Guinea, Philippines, Vietnam). Đến cuối
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
2003, Việt Nam là nƣớc duy nhất trên thế giới đã đạt đƣợc mục tiêu phát hiện hơn
70% số lao phối AFB(+) mới ƣớc tính và điều trị lành 85% số bệnh nhân lao. Đây là
mục tiêu tiến đến kiểm soát bệnh lao trên toàn thế giới vào năm 2005 do WHO khởi
xƣớng từ năm 1999 [2].
Cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới, nƣớc ta cũng đang phải đối mặt với nhiều
khó khăn , thách thức nhằm duy trì tính bền vững của các hoạt động chống lao,cũng
nhƣ thành tựu đã đạt đƣợc.
Chủ đề Ngày thế giới phòng chống lao năm nay đƣợc WHO đƣa ra là :"Đổi
mớ i để kiể m soá t tố t hơn bệ nh lao", trong đó đặ c biệ t nhấ n mạ nh tớ i việ c đổ i mớ i về
các cộng cụ chẩn đ oán điều trị và phòng bệnh tốt hơn ; đổ i mớ i phƣơng phá p tiế p
cậ n để nhiề u ngƣờ i đƣợ c phá t hiệ n, điề u trị và đổ i mớ i về huy độ ng cá c đố i tá c cù ng
tham gia phò ng , chố ng bệ nh lao Hƣở ng ƣ́ ng chủ đề nà y , tại Việt Nam , đã tiế n
hành triển khai chiến dịch truyền thông nhân ngày 24/3: "Đổi mới tƣ duy của mỗi
ngƣờ i để kiể m soá t bệ nh lao tố t hơn". Thiế t nghĩ đây cũ ng chính là hƣớ ng giả i phá p
thích hợp và hiệu quả nhất trong bối cảnh hiện nay c ủa nƣớc ta để góp phần kiểm
soát và khống chế căn bệnh nguy hiểm này . Vấn đề cố t lõ i cầ n tiế n hà nh trong thờ i

điể m hiệ n tạ i chí nh là đổ i mớ i tƣ duy về phòng và chống bệnh lao [13].
1.1.3.Tnh hnh lao kháng thuốc
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cảnh báo là bệnh lao kháng thuốc (drug-
reisistant tuberculosis) đang lan nhanh hơn là các nhà chuyên gia y tế dự đoán. Tại
một số quốc gia tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh lao kháng thuốc đã lên tới con số chƣa
từng có là 20%. Bác sĩ Mario Raviglione, giám đốc WHO nói "Cách đây 10 năm,
không ai nghĩ tới con số cao nhƣ vậy. Điều này chứng tỏ là chúng ta tiếp tục phạm
sai lầm trong việc điều trị bệnh lao" [3].
Cho tới mãi 50 năm trƣớc loài ngƣời mới tìm ra thuốc chữa lao. Giờ đây
các dòng lao kháng thuốc đã xuất hiện và có 1,7% số ca mắc bệnh trên thế giới là
các ca kháng đa thuốc (MDR). Năm 2006, dòng lao kháng thuốc cực mạnh (XDR)
bắt đầu xuất hiện. Chủng lao XDR này không chỉ kháng những thuốc ở tuyến đầu
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
mà còn kháng ít nhất 3 loại thuốc ở tuyến 2- tuyến phòng thủ cuối cùng chống vi
trùng lao, vốn gây độc hại nhiều hơn cho bệnh nhân cùng với thời gian điều trị và
chi phí đắt đỏ. Sự lây lan của lao kháng thuốc cực mạnh đƣợc tiếp sức bởi đại dich
HIV, hệ thống chăm sóc sức khỏe cộng đồng yếu kém, và sự sao lãng biện pháp
kiểm soát lây nhiễm [7].
Theo ƣớc tính của WHO, trên thế giới có khoảng 424.203 ngƣời bị mắc
MDR, chiếm số lƣợng lớn nhất là khu vực Tây Thái Bình Dƣơng 152.203 trƣờng
hợp, kế đến là khu vực Đông Nam Á và sau là khu vực Đông Âu và Châu Phi. Một
số nƣớc có tỷ lệ MDR ở những bệnh nhân lao mới rất cao là: Cộng hòa Dominica,
Ecuador, Bờ biển Ngà, Latvia, Uzbekistan, Trung quốc, Iran, Israel [6].
Từ nhiều năm nay, Tổ chức Y tế Thế giới đã định nghĩa bệnh lao kháng đa
thuốc (MDR-TB: Multi Drug Resistace- Tuberculosis) là vi khuẩn lao đã kháng lại
isoniazid (rimifon) và rifampicin (đây là những thuốc trong số các thuốc chống lao
hàng đầu gồm: isoniazid (H), rifampicin (R), ethamintol (E) và streptomicin (S).

Giờ đây WHO lại đƣa ra khái niệm bệnh lao cực kháng thuốc (XDR-TB: Extreme
Drug Resistance- Tuberculosis) là vi khuẩn đã kháng lại isoniazid, rifampicin và từ
3 thuốc thuốc chống lao hàng thứ 2 trở nên gồm : kanamycin, ofloxacin, cycloserin,
PAS có nghĩa là XDR-TB = MDR-TB > 3 thuốc hàng thứ 2 [14].
Trƣớc tình hình XDR ngày càng trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến
11/2005, WHO và trung tâm kiểm soát bệnh Hoa Kỳ đã tiến hành phân tích 17.690
mẫu đàm đƣợc gửi từ 40 quốc gia trên toàn thế giới. Kết quả phân tích cho thấy có
20% trƣờng hợp là MDR và 2% là XDR. Khu vực Tây Thái Bình Dƣơng (trong đó
có Việt Nam) thì MDR là 4,2% ở bệnh nhân lao mới và 26% các trƣờng hợp có tiền
căn trị lao [6].
Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tình hình vi khuẩn lao
kháng thuốc ở 35 nƣớc và khu vực trên thế giới, theo công bố này tỷ lệ kháng thuốc
tiền phát trung bình với riêng từng loại thuốc có khác nhau, cụ thể là: kháng
isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, ethambutol 0,3%, streptomycin 2,5%. Tỷ lệ kháng
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
thuốc tiền phát trung bình là 9,9% trong đó kháng 1 thuốc chiếm 6,6%, kháng 2
thuốc chiếm 2,5%, kháng 3 thuốc chiếm 0.6%, 4 thuốc là 0,2% kháng đa thuốc
trung bình là 1,4% [11], [14].
Tình hình kháng thuốc mắc phải với từng loại thuốc cũng khác nhau: Kháng
isoniazid trung bình là 6,3%, rifampicin 0,7%, Ethambutol 0,4%, strtomycin
2,6%.Tỷ lệ kháng thuốc trung bình trên thế giới là 36%, trong đó kháng 1 loại thuốc
12,2%, 2 loại thuốc là 9,7%, 3 loại thuốc là 5,4%, 4 loại thuốc là 4,4%. Lao kháng
đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bình là 13% [11], [14].
Tổ chức Y tế Thế giới ngày 19.3.2010 cảnh báo tình trạng bệnh lao kháng
thuốc đã lan rộng đến mức kỷ lục trong thời gian qua, với khoảng 440.000 bệnh
nhân năm 2008 và 1/3 trong số này đã tử vong. Hiện 27 nƣớc trên thế giới có số
bệnh nhân lao kháng thuốc (MDR-TB) cao nhất, dự báo chi phí điều trị bệnh nhân

lao MDR-TB ở 27 nƣớc này sẽ mất khoảng 3 tỉ USD/năm. Mức độ phổ biến kháng
thuốc qua con đƣờng lây truyền là rất cao - tới 99% - so với kháng thuốc mắc phải
do thất bại trong điều trị. "Các kết quả của chúng tôi dự báo rằng các dòng lao
kháng thuốc sẽ trở nên rất phổ biến trong một vài thập kỉ tới", tiến sĩ Fabio Luciani
đến từ đại học New South Wales, trƣởng nhóm nghiên cứu, cho biết. "Kết quả cũng
cho thấy hạn chế lây truyền bệnh chính là cách làm hiệu quả để giảm thiểu tác động
của kháng thuốc" [6], [37].
Việc nghiên cứu lao kháng thuốc ở Việt Nam đƣợc tiến hành khá sớm. Năm
1958 Phạm Ngọc Thạch và cộng sự đã công bố tỷ lệ kháng thuốc mắc phải với
isoniazid là 53%, với paraminosacylic acid là 26%, với streptomycin là 59% [11].
Theo chƣơng trình chống lao quốc gia, điều tra tình hình kháng thuốc năm
2001-2002 cho thấy, 3% bệnh nhân mới và 23,5% bệnh nhân cũ đã kháng thuốc.
chính vì điều này mà nƣớc ta bị xếp là một trong những điểm nóng về bệnh lao trên
thế giới. Tình trạng thuốc lao lƣu hành tràn lan trên thị trƣờng với nhiều xuất xứ,
nhà nƣớc không kiểm soát đƣợc giá cả và chất lƣợng thuốc, sự thực hiện điều trị
DOTS lỏng lẻo và không đến nơi đến chốn ở một số tỉnh, đã dẫn tới tỷ lệ kháng
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
thuốc lao: SM là 24,1%; INH 20,0%; RIF 3,6%; EMB 1,1%; INH+RIF 0,5%;
INH+SM 10,9%; MDR 2,3% [3], [11].
Các bằng chứng mới nhất về bệnh lao siêu kháng thuốc đã đƣợc xác định ở
nhiều nơi trên toàn cầu. Ở Mỹ 4% các bệnh nhân lao đa kháng thuốc lâm vào tình
trạng siêu kháng thuốc. Còn ở Latvia tỷ lệ bệnh lao siêu kháng thuốc là 19%. Tại
tỉnh Kwazulu Natal của Nam phi, trong số 554 bệnh nhân tử vong có 221 ngƣời
mắc bệnh lao đa kháng thuốc, trong đó có 53 ca bệnh lao siêu kháng thuốc [12].
Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2009, tỷ lệ kháng thuốc của
Việt Nam là 2,7%. Việt Nam đã có mặt trên bản đồ lao siêu kháng của thế giới. Thế
giới có hơn 50 triệu ngƣời nhiễm vi trùng lao kháng thuốc và hơn 400.000 là lao đa

kháng. Dựa trên những con số thu thập đƣợc ở những bệnh nhân thuộc 82 nƣớc và
khu vực, tỷ lệ trung bình lao kháng nhiều thuốc lên đến 5,3% trong tổng số những
trƣờng hợp bệnh lao mới phát hiện. Trong một số vùng trên thế giới, hầu nhƣ cứ 4
trƣờng hợp thì có một trƣờng hợp kháng nhiều thuốc, chẳng hạn nhƣ ở khu vực
Bakou, thủ đô của Azerbaidjan, tỷ lệ kháng nhiều thuốc lên đến 22,3%. Ở
Moldovia, tỷ lệ này là 19%.WHO cũng bày tỏ lo ngại sâu sắc về những trƣờng hợp
bệnh lao gây nên bởi các vi khuẩn có sức đề kháng mạnh, một dạng hầu nhƣ không
thể điều trị đƣợc hiện nay [13].
Hiện có tới 27.000 trƣờng hợp siêu kháng thuốc chống lao trong 45 trên 81
nƣớc và khu vực đƣợc nghiên cứu, và đó cũng chỉ là phần nổi của tảng băng. Hầu
hết bệnh nhân lao kháng thuốc đều phải tự túc điều trị, rất tốn kém, gấp 200 lần so
với chi phí điều trị lao thông thƣờng. Do vậy, chỉ có một số ít bệnh nhân có điều kiện
mới có thể điều trị đến nơi, đến chốn, số còn lại hầu hết điều trị dang dở và trở thành
gánh nặng cho gia đình và xã hội. Sự xuất hiện của lao kháng thuốc đang và sẽ là
mối đe dọa lớn cho sức khỏe của con ngƣời. Do đó việc phát hiện, ngăn chặn sự phát
triển tràn lan của các chủng lao kháng thuốc là việc làm cấp bách hiện nay [13].
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
1.2 Vi khuẩn lao
1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao
Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales,
phân bộ, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [1].
Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis.
Các chủng vi khuẩn lao đƣợc chia làm 2 nhóm: Mycobacterium tuberculosis
complex gồm bốn loài có khả năng gây bệnh ở ngƣời, và nhóm Mycobacteria other
than tuberculosis gồm nhiều loài không gây bệnh ở ngƣời [16].
Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn, có kích thƣớc từ 2 - 4µm, rộng 0,3 -
1,5µm. Trực khuẩn thanh mảnh đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V

hoặc thành dãy phân nhánh nhƣ cành cây. Vi khuẩn lao không di động, không sinh
bào tử, khó bắt mầu với các thuốc nhuộm thông thƣờng do có lớp xốp ở thành tế
bào [4], [16].
Vi khuẩn lao sống hiếu khí, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37
0
C và áp suất của
O
2
là 100mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dƣới xƣơng đòn thƣờng hay mắc lao nhất
vì có áp suất O
2
từ 120 - 130 mmHg (khi đứng) rồi đến thân xƣơng và đầu xƣơng vì
áp suất O
2
ở đây là 100mmHg. Lách, gan, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn và áp
suất O
2
thấp. Chúng phân chia rất chậm từ 16 - 20 giờ, so với các vi khuẩn khác
thời gian chỉ tính bằng phút, nhƣ E.coli thời gian phân chia 20 phút. Tốc độ phân
chia của vi khuẩn lao chậm có thể do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong
việc hấp thụ chất dinh dƣỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome. Thành tế
bào của vi khuẩn lao có chứa peptidoglycan nhƣng chúng không đƣợc phân loại
Gram dƣơng hay âm vì chúng không có đặc tính hóa học này và cấu trúc của các vi
khuẩn lao là các lipit gắn với thành tế bào chứ không phải các protein hay
polysacharide do đó chúng không giữ lại những tinh thể màu tím xuất hiện trong
nhuộm Gram [4], [9], [36].
Vi khuẩn lao đƣợc xác định dƣới kính hiển vi bằng đặc tính nhuộm Ziehl -
Neelsen, nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi xử lí với dung dịch axit, nên đƣợc phân
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
loại là " trực khuẩn kháng axit " (acid fast bacillus, viết tắt AFB), AFB sẽ có màu
đỏ tƣơi trên nền xanh (Hình 1.1). Đặc điểm này rất quan trọng để phát hiện vi khuẩn
lao trong các bệnh phẩm. Ngoài ra, vi khuẩn lao cũng có thể đƣợc quan sát dƣới
kính hiển vi huỳnh quang hoặc nhuộm arylmethane nhƣ auramine [18], [41].

Hình 1.1. Vi khuẩn lao dưới kính hiển vi với đặc tính nhuộm Ziehl - Neelsen
1.2.2. Cấu tạo của vi khuẩn lao
Vi khuẩn lao có cấu tạo rất phúc tạp nhƣng hoàn hảo, ít vi sinh vật nào có
đƣợc. Nhìn dƣới kính hiển vi vi khuẩn lao gồm các lớp (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu tạo thành tế bào của M. tuberculosis
(
cell.htm)
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
- Lớp trong cùng có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu là các
phospholipids gồm 2 nhóm: nhóm ƣa nƣớc hƣớng vào bên trong, nhóm kị nƣớc quay
ra ngoài. Cấu trúc này tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự
thẩm thấu của vỏ ngoài trực khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác nhƣ
các protein truyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh
chất, các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lƣợng, các chất
mang làm trung gian cho quá trình vận chuyển các chất dinh dƣỡng và ion. Các
enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào,
tập hợp và tiết một số enzyme ngoại bào, sao chép DNA [1], [32].
- Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đƣờng arabinose và các phân tử
mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn

có độ cứng nhất định. Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất
đƣợc biết ở prokaryot, có một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thƣờng,
mức độ liên kết giữa peptidoglucan ở thành tế bào M. tuberculosis là 70 - 80% trong
khi ở vi khuẩn E. coli là 20 - 30% [4].
- Lớp ngoài là lớp đƣợc tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các
chất lipid phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức
tạp làm tăng khả năng chống thấm nƣớc của thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn
tồn tại lâu với môi trƣờng bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thực bào và
các tế bào miễn dịch [41].
- Lớp vỏ ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglylipid. Nó
đảm bảo sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với hiện tƣợng
thực bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực khuẩn khó bị
tiêu diệt [4], [33].
1.2.3. Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn lao vào cơ thể qua nhiều đƣờng, thƣờng là qua hô hấp, bên cạnh đó
là các đƣờng tiêu hóa, da, kết mạc mắt Sau khi gây tổn thƣơng tiên phát, vi khuẩn
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
lao có thể theo đƣờng bạch huyết hoặc đƣờng máu tới cơ quan khác gây tổn thƣơng
thứ phát. Nhiều cơ quan: phổi, thận, màng não, xƣơng, hạch, da đều có thể bị vi
khuẩn lao xâm nhập, nhƣng thƣờng bị hơn cả là phổi và vị trí gặp nhiều nhất là đỉnh
phổi, nơi có phân áp oxy 120 mmHg [12].
Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến "Cord factor" (trehalose - 6,6 -
dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu, gây nên những u hạt
mãn tính . Vi khuẩn lao khi xâm nhập vào cơ thể sẽ xuất hiện đáp ứng miễn dịch
qua trung gian tế bào. Đáp ứng miễn dịch sẽ làm chậm quá trình nhân lên của vi
khuẩn lao, gây hạn chế tràn lan của vi khuẩn lao dẫn tới phá hủy tế bào vi khuẩn.
Lúc này, đại thực bào, các tế bào lympho B, lympho T và các nguyên bào sợi kết

tập lại tạo thành các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào. Chức
năng của các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của các tế bào M. tuberculosis mà
còn tạo môi trƣờng tại chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin. Bên
trong các u hạt, tế bào lympho T tiết ra các cytokine, nhƣ interferron, hoạt hóa đại
thực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt hơn. Tế bào bào lympho T cũng tiêu diệt trực
tiếp các tế bào bị nhiễm. Nhƣng điều quan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ
hoàn toàn mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm khuẩn "tiềm ẩn" [23].
1.3. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
Hiện tƣợng kháng thuốc của vi khuẩn lao xảy ra trƣớc hoặc sau khi xâm
nhập cơ thể ngƣời bệnh [1]. Trƣờng hợp kháng thuốc xảy ra trƣớc khi xâm nhập vào
cơ thể ngƣời bệnh gọi là kháng thuốc tiên phát, là hiện tƣợng lây nhiễm bởi một
chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề kháng tự nhiên. Vì vậy, bệnh
nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể
đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng. Còn hiện tƣợng kháng thuốc xảy ra sau
khi xâm nhập vào cơ thể còn gọi là kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng
vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng thuốc chống lao không đúng quy định, không
đúng liều lƣợng, thời gian sử dụng thuốc. Ngƣời ta cho rằng đây là hiện tƣợng đa
kháng thuốc của vi khuẩn lao do đột biến một bƣớc ở nhiều gen. [31], [33].
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
Các nguyên nhân gây ra kháng thuốc là:
+ Thuốc hoặc gen đích trong các chủng kháng thuốc bị biến đổi do đó không
còn khả năng diệt khuẩn.
+ Sản phẩm gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc chống lao đƣợc vi
khuẩn lao sản xuất thừa ra.
+ Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc
vào bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt
nồng độ tối thiểu để có thể diệt khuẩn.

1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán lao kháng thuốc
Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc trong các phòng thí nghiệm trên thế giới
hiện nay gồm có 2 phƣơng pháp đó là phƣơng pháp xác định kiểu hình và phƣơng
páp xác định kiểu gen.
1.4.1. Các phương pháp xác định kiểu hnh
Các phƣơng pháp xác định kiểu hình thông thƣờng có thể là: Phƣơng pháp
xác định tƣơng quan, phƣơng pháp xác định tỷ lệ kháng, phƣơng pháp nồng độ
tuyệt đối.
Các phƣơng pháp mới trong xác định kiểu hình gồm có: Sử dụng phage
(phase-base methods), phƣơng pháp đo màu (colorimetric methods), phƣơng pháp
khử nitrat (the nitrate reductase assay), phƣơng pháp lớp thạch mỏng (the thin -
layer ager method) [19], [33].
Các phƣơng pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩn lao trong
môi trƣờng nuôi cấy có kháng sinh. Từ đó có thể kết luận về sự kháng thuốc của
chủng vi khuẩn nghiên cứu. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là thời gian nuôi cấy
để chẩn đoán quá dài, ít nhất mất 2 - 4 tuần. Điều này làm cho công tác điều trị và
kiểm soát tình hình bệnh lao kháng thuốc còn gặp nhiều khó khăn [21].
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
1.4.2. Các phương pháp xác định kiểu gen
Hiện nay có nhiều phƣơng pháp xác định kiểu gen đƣợc ứng dụng để chẩn
đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, các phƣơng pháp đó bao gồm:
- Giải trình tự gen (Sequencing) [9].
- Lai trên pha rắn (Solid-phase hybridization techniques) gồm: tets LiPa, kỹ
thuật PLH (PCR - reverse lineblot hybridization) hay kỹ thuật Spoligotyping…[31].
- Real-time PCR [19].
- Microarrays [18].
Các phƣơng pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác định đột biến ở

các gen có liên quan đến kháng thuốc tƣơng ứng [40]. Phƣơng pháp sử dụng các kỹ
thuật cao đòi hỏi trang thiết bị máy móc hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình
độ chuyên sâu. Nhƣng thời gian chẩn đoán bằng các phƣơng pháp này nhanh hơn,
có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Các phƣơng pháp xác định kiểu gen vì vậy có ý
nghĩa rất lớn, đã tạo bƣớc đột phá cho công tác điều trị và kiểm soát bệnh lao.
1.5. Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid
Isonaizid có tên khoa học là isonicotinic acid hydrazide, công thức hóa học là
C
8
H
7
N
3
O và là một trong các loại thuốc kháng lao mạnh nhất, nó ở dạng bột màu
trắng dễ hòa tan trong nƣớc. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 0,02 - 0,2 mg/L.


Hình 1.3. Công thức cấu tạo isoniazid [37].
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

17
Vi khuẩn lao kháng isoniazid đƣợc xác định theo phƣơng pháp chẩn đoán
kiểu gen. Các phƣơng pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác định đột biến
ở các gen có liên quan kháng thuốc tƣơng ứng.
Để xác định đột biến trên gen katG và gen inhA hiện có nhiều phƣơng pháp,
song giải trình tự gen vẫn là phƣơng pháp cơ bản, chính xác, rõ ràng nhất [35].
Để giải trình tự gen katG và gen inhA, hiện nay có thể thực hiện trực tiếp từ
sản phẩm PCR. Khi sản phẩm PCR là đơn nhất và có độ dài thích hợp cho việc
phân tích kết quả thì có thể thực hiện giải trình tự trực tiếp [10]. Cũng có thể giải

trình tự thông qua tách dòng, gắn đoạn gen katG hoặc inhA cần nghiên cứu vào
vector. Đoạn gen cùng với vector tái tổ hợp đƣợc nhân lên trong tế bào E. coli. Khi
giải trình tự gen, cả đoạn gen katG hoặc đoạn gen inhA và một phần vector đều
đƣợc xác định trình tự. Giải trình tự thông qua tách dòng đƣợc ứng dụng khi sản
phẩm PCR không đƣợc tốt, đặc biệt là trong các trƣờng hợp gây đột biến nhân tạo
kiểm chứng kháng thuốc và trong nghiên cứu biểu hiện gen [39].
Giải trình tự (DNA squencing) là phƣơng pháp xác định vị trí sắp xếp các
nucleotide trong phân tử DNA. Nguyên lý của phƣơng pháp này là: Tổng hợp các
mạch đơn DNA mới có độ ngắn hơn mạch khuôn, nhờ kĩ thuật đánh dấu và ngắt
đoạn trong quá trình tổng hợp mạch DNA, thu đƣợc các mạch đơn hơn kém nhau
một base từ đó có đƣợc sơ đồ trật tự mạch DNA khuôn mẫu. So sánh trật tự của
mẫu thí nghiệm với trật tự DNA chuẩn ta biết đƣợc vị trí sai lệch (đột biến) [17],
[21].
Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định đƣợc các chủng khuẩn lao
kháng isoniazid là do có đột biến ở gen katG và gen inhA. Codon xảy ra đột biến là
codon 315 [20].
Sự đột biến xảy ra là do thay thế nucleotide ở codon 315 (AGC → ACC hoặc
AGC → ACA) [20].
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

18
1.5.1. Đặc điểm của hệ gen vi khuẩn lao
Hệ gen của vi khuẩn lao đã đƣợc đọc trình tự, có chiều dài 4.411.522.cặp
base trong đó có 3.924 trình tự đƣợc dự đoán là mã hóa protein, tỷ lệ G + C chiếm
đến 65,6%. Genome của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8% trình tự mã hóa protein và
chỉ có 6 gen giả [20], [28].
1.5.2. Gen katG vi cơ chế kháng thuốc isoniazid  vi khuẩn lao
Gen katG là một đoạn DNA có kích thƣớc 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc của
vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase - peroxidase. Ngƣời

ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến
trên gen này. . . [20].
Gen katG mã hóa cho enzyme catalase - peroxidase. Enzyme này hoạt hóa
isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ axyl
isonicotinic - NADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với enzyme katoenoylreductese
(mã hóa bởi gen inhA), theo đó làm ngăn cản cơ chất enoyl - AcpM. Quá trình này
làm ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao [20]. Cơ chế
phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu có liên quan đến đột biến thêm/mất đoạn
hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 và
463 của gen katG mã hóa catalase - peroxidase. Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở
base thứ 2 trên codon 315 của gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn
đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme catalase - peroxidase do đó
M.tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [39]. Do đó phát hiện sự thay đổi
di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phƣơng pháp sàng lọc nhanh và
chính xác cho việc phát hiện các chủng M. tuberculosis kháng isoniazid.
1.5.3. Gen inhA vi cơ chế kháng thuốc isoniazid  vi khuẩn lao
Gen inhA là một đoạn DNA có kích thƣớc 810 bp, nằm trên nhiễm sắc thể
của vi khuẩn lao. Ngƣời ta nhận thấy có khoảng 70 - 80% các chủng vi khuẩn lao
kháng isoniazid có đột biến trên gen này [24], [29].
InhA cũng là một enzyme enoyl - acyl reductase. Enzyme này hoạt hóa
isoniazid gây ảnh hƣởng đến phức INH - NAD làm ức chế quá trình sinh tổng hợp
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

19
acid mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao [26]. Cơ chế đƣợc đề xuất là
isoniazid hoạt động nhờ vào sự hoạt hóa của các peroxidase catalase katG tạo thành
một isonicotinoyl liên kết với NAD (NAD
*
) kết quả là tạo phức INH - NAD và

phức này bị ức chế bởi enzyme anoyl - acyl reductase inhA . Quá trình ức chế này
làm tích lũy acid béo chuỗi dài, ức chế quá trình tổng hợp acid mycolic, và cuối
cùng là tế bào chết [29].
Theo Leung và các đồng tác giả năm 2006, đã phát hiện một đột biến mới có
liên quan tới cơ chế kháng isoniazid. Đó là đột biến diễn ra tại vị trí 581 bp trên gen
inhA làm thay đổi acid amin Ile194Thr (ATC ACC) dẫn đến enzyme enoyl - acyl
reductase bị mất hoạt tính hoặc làm giảm liên kết ái lực của gen inhA và NADH, do
đó enzyme này sẽ không hoạt hóa isoniazid mà tạo ra acid mycolic vì vậy tế bào vi
khuẩn lao sẽ kháng thuốc isoniazid (Hình 1.4).Vì vậy, việc phát hiện sự thay đổi di
truyền trên gen inhA có thể cung cấp một phƣơng pháp sàng lọc nhanh và chính xác
cho việc phát hiện các chủng M.tuberculosis kháng isoniazid [29].
Ứng dụng phƣơng pháp SHPT để xác định đột biến trên gen inhA. Vị trí xảy
ra đột biến là 581 bp trên gen inhA do có sự thay thế nucleotide ATC → ACC.

Hình 1.4. Cơ chế kháng thuốc isoniazid của gen inhA [37]
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

20
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn lao này đƣợc phân lập từ mẫu đờm của các bệnh nhân
lao ở bệnh viện Trung ƣơng Huế. (Bảng 2.1)
Bảng 2.1. Đặc điểm kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn lao
STT
Mã DNA
Mã chủng
Kháng thuốc
1

ĐA1
TB05 - 1
HS
2
ĐA3
TB05 - 97
HRSE
3
ĐA4
TB05 - 108
HRS
4
ĐA5
TB05 - 117
HRS
5
ĐA6
TB05 - 138
HS
6
ĐA7
TB05 - 146
HRSE
7
ĐA10
TB05 - 199
HS
8
ĐA11
TB05 - 213

HS
9
ĐA13
TB05 - 221
HS
10
ĐA15
TB05 - 254
HR
11
ĐO1
TB05 – 49
S
12
ĐO2
TB05 – 79
H
13
ĐO8
TB05 – 214
H
14
ĐO9
TB05 – 223
S
15
ĐO10
TB05 – 231
H
16

ĐO11
TB05 – 237
S
17
ĐO12
TB05 - 243
S
Chú thích: H: isoniazid; R: rifampicin; S: Streptomycin; E: Ethambutol
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

21
2.2. Vật liu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu
2.2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính
Bảng 2.2. Các sinh phẩm hóa chất chính
Tên hóa chất
Hãng sản suất
1. Hóa chất dùng trong PCR
Tris base
Lysozyme
Proteinase K
Agarose
Thang chuẩn DNA
EDTA
Taq-DNA-polymerase
2. Hóa chất dùng trong tách dòng
Pepton
Yeast Extract
Nacl
Agar

Ampicilin
X-gal
IPTG
Accuprep plasmid Mini Extraction Kit
EcoRI
pBT

Applied BioSciences (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Sigma (Mỹ)
Sigma (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)

Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Fermentas (Mỹ)
Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

22
3. Hóa chất phục vụ giải trnh tự gene

Big Dye Terminator V3.1
HiDi Formamid

Applied BioSciences (Mỹ)
Applied BioSciences (Mỹ)

2.2.2. Máy và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tủ ấm ổn nhiệt (hãng Sanyo - Nhật Bản)
Máy PCR (hãng Applied BioSciences - Mỹ)
Máy ly tâm (hãng Heraeus - Mỹ)
Máy đo pH (hãng Thommas Scientific - Mỹ)
Máy chụp ảnh Gel-Doc (hãng Dolphin - Mỹ)
Tủ lạnh -20
0
C, -80
0
C (hãng Nuaire - Mỹ)
Lò vi sóng (hãng Sanyo - Nhật Bản)
Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire (hãng nuaire - Mỹ)
Bể ổn nhiệt (hãng Memmert - Đức)
Máy lắc Gyromax 737R (hãng Amerex Instrument - Đức)
Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop (hãng Analitika - Đức)
Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100 - Avant (hãng Applied BioSciences-Mỹ)
2.2.3. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Dựa vào trình tự gen của chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis đã đƣợc
công bố trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế NCBI, cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế
để khuếch đại vùng đột biến tại codon 315 của gen katG, và tại vị trí 518 bp của gen
inhA. Trên cơ sở đó, các cặp mồi đặc hiệu đƣợc kiết kế tại vùng có độ bảo thủ cao
nhất và phải chứa vị trí đột biến.
Cặp mồi sử dụng cho nhân trình tự gen katG và gen inhA là: (Bảng 2.3).

Luận văn thạc sỹ Trịnh Quốc Phương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

23
Bảng 2.3. Bảng đặc điểm cặp mồi sử dụng nghiên cứu
Mồi
Trình tự
T
m
(
0
C)
KT (bp)
katG-R
5
'
- ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC - 3
'


56

684
katG-F
5
'
- GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG - 3
'

inhA-R

5
'
- TTC CGC TCC GCC GAA CGA CAG - 3
'


58

501
inhA-F
5
'
- CCA CAT CTC GGC GTA TTC G - 3
'


2.2.4. Vector tách dòng được sử dụng trong nghiên cứu
Vector tách dòng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là plasmid pBT [8].
Plasmid này có kích thƣớc 2705 bp, bao gồm bla (gen kháng Carbenicilin) giúp tế
bào vi khuẩn E. coli có thể sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh.
Carbenicilin, gen rep (replicon) có tác dụng giúp cho quá trình nhân lên của plasmid
trong tế bào vi khuẩn E. coli xảy ra nhanh chóng và dễ dàng, gen lacZ mã hóa cho
enzyme β - galactosidase, enzyme này có tác dụng phân hủy chỉ thị X - gal thành
chất có tên gọi là 4-Cl-3-Br-indigo (có màu xanh) giúp cho việc chọn lọc khuẩn lạc
mang plasmid tái tổ hợp dễ dàng hơn. Trên gen lacZ này có một đoạn polylinker
chứa nhiều vị trí nhận biết bởi enzyme cắt giới hạn khác nhau. Sơ đồ của plasmid
pBT đƣợc trình bày ở hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pBT
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

Sơ đồ phƣơng pháp nghiên cứu (Hình 2.2).