nghiên cứu thu nhận proteaza từ bacillus subtilis và ứng dụng vào sản xuất dịch đạm thuỷ phân

Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
LỜI MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học đang được xem là một ngành mũi nhọn của tương lai, thu
hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học. Trong đó một trong những thành tựu to
lớn của khoa học và công nghệ trong thời gian gần đây là các nghiên cứu về enzym
(men), nó đặc trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấy chục năm vừa
qua. Một thành tựu vô cùng to lớn của enzym là đã khám phá được cấu trúc hoá học
và cơ chế xúc tác diệu kỳ của nó. Đặc biệt là đã tổng hợp được enzym nhân tạo, cho
phép chúng ta trong tương lai không xa có thể tổng hợp được nhiều chất xúc tác mới
theo kiểu xúc tác enzym để sử dụng trong thực tế.
Từ khi enzym được phát hiện thì chúng ta không ngừng đưa nó vào trong thực
tiễn của cuộc sống, phục vụ cho nhiều ngành như công nghiệp, nông nghiệp, y học,
thực phẩm …Enzym được xem là thành phần quan trọng và tất yếu trong thực phẩm.
Bằng cách bổ sung có định hướng và chọn lọc thì có thể tạo cho sản phẩm có được kết
cấu, hương vị, màu sắc và các tính chất đặc thù khác. Chính tầm quan trọng đó mà mấy
chục năm gần đây hình thành và phát triển mạnh kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym.
Hàng năm, trên thế giới có khoảng 20 hãng sản xuất ra hơn 100.000 tấn chế phẩm
enzym. Tuy nhiên, nó tập trung chủ yếu ở các nước phương Tây, còn ở phương Đông
thì còn rất non kém. Ở Việt Nam, nó được xem là một ngành còn mới lạ, mới ở bước
đầu phát triển. Do đó, việc nghiên cứu và sản xuất enzym đang là một thách thức, đồng
thời cũng là triển vọng cho ngành công nghệ sinh học của nước ta .
Trong lượng enzym được sử dụng trên thế giới thì proteaza chiếm đến 60% hàm
lượng enzym. Trước đây, phần lớn các proteaza đều được thu từ nội tạng động vật,
nhưng ngày nay nó đang được thay thế dần bằng proteaza của thực vật và vi sinh vật rẻ
tiền. Để sản xuất proteaza, người ta thường tận dụng các nguồn nguyên liệu từ những
sản phẩm phế thải của các ngành chế biến khác như sản phẩm cặn bã của nhà máy sản
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang

LÊ THỊ THANH
xuất tinh bột, của nhà máy giấy, nhà máy đường …Xuất phát từ tầm quan trọng đó của
các enzym và được sự hướng dẫn của cô giáo T.S Trần Thị Xô tôi chọn đề tài "Nghiên
cứu sử dụng enzym proteaza của Bacillus subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và
ổn định màu sắc của nước mắm ". Sở dĩ tôi chọn nguyên liệu để thu nhận enzym là
Bacillus subtillis là do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzym ở qui mô lớn dùng trong công nghiệp, có thể chủ động về nguồn nguyên liệu,
chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, vào khoảng từ 16 đến 100 giờ, do đó ta có thể
thu hoạch hàng trăm lần một năm, có thể điều khiển sự sinh tổng hợp enzym dễ dàng
hơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzym được tổng hợp hoặc tổng hợp
định hướng enzym, giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn
giản, rẻ tiền .
Nội dung được trình bày trong đề tài gồm 4 phần chính :
Chương I : Tổng quan nguyên liệu .
Chương II : Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu .
Chương III : Kết quả và thảo luận .
Chương IV : Kết luận .
Do thời gian làm đề tài có hạn và những hiểu biết về enzym nói chung và
proteaza nói riêng còn hạn chế. Cho nên phần trình bày không thể tránh khỏi những
vướng mắc và sai sót. Em rất mong được sự góp ý nhiệt tình của các thầy cô và các bạn
để đề tài được hoàn chỉnh hơn.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN NGUYÊN LIỆU
1.1. Enzym và các ứng dụng của chúng
1.1.1. Giới thiệu về enzym
Enzym là những hợp chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20.000÷1.000.000

danton, được cấu tạo từ các L-
α
- axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit. Đó
chính là các protein có hoạt tính xúc tác. Các enzym xúc tác cho hầu hết các phản ứng
đã xảy ra trong cơ thể sống. Đảm bảo cho quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thể
sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo những chiều hướng xác định để
đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.[2,Tr9]
Enzym có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm, hàng triệu lần các chất xúc
tác vô cơ và hữu cơ khác. Đặc biệt là nó thực hiện xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở
nhiệt độ và áp suất bình thường, pH gần như pH sinh lý, hơn nữa enzym lại có khả
năng lựa chọn cao đối với phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác
dụng. Nên việc sử dụng enzym làm xúc tác đem lại hiệu quả rất lớn .
Enzym được phân làm hai nhóm chính:
+ Enzym một cấu tử (enzym đơn giản) là các protein đơn giản làm nhiệm vụ
xúc tác.
+ Enzym hai cấu tử (enzym phức tạp) là các protein phức tạp làm nhiệm vụ
xúc tác. Trong enzym hai cấu tử gồm có hai phần:
• Phần mang bản chất protein gọi là “Apoenzym“ hay “feron“ đảm
bảo tính đặc hiệu cho phản ứng.
• Phần phi protein có tên gọi là “Coenzym“ hay gọi là “Agon” có khả
năng tách ra và tồn tại một cách độc lập bên ngoài protein, tham gia vào quá trình xúc
tác.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
Enzym mang bản chất là protein, có thể hoà tan trong nước, trong dung dịch
muối loãng, trong dung môi hữu cơ có cực, nhưng không hoà tan trong dung môi
không phân cực. Enzym có tính lưỡng tính, dựa vào tính chất này ta có thể tiến hành
phân tách và làm sạch bằng phương pháp điện di. Các enzym cũng là các protein nên

nó chịu tác động của các yếu tố vật lý như nhiệt độ, các yếu tố hoá học như pH, dung
môi, các kim loại Do đó ta cần phải có sự lựa chọn các yếu tố để đảm bảo cho cường
lực xúc tác của enzym là lớn nhất.[14,Tr5]
1.1.2. Các ứng dụng của enzym
Việc nghiên cứu và ứng dụng các enzym đem lại ý nghĩa to lớn. Về mặt lý thuyết,
trong 20 năm gần đây người ta đạt được những thành tựu đáng kể trong nghiên cứu cấu
trúc phân tử enzym và giải thích cơ chế phân tử quá trình sinh tổng hợp enzym trong tế
bào, điều đó cho phép chúng ta trong tương lai không xa sẽ tổng hợp được nhiều chất
xúc tác mới theo kiểu enzym để sử dụng trong thực tế, đem lại hiệu quả kinh tế với các
enzym khó tách từ các nguyên liệu tự nhiên.
Bên cạnh những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lý thuyết về enzym. Các
nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả
cao. Để sử dụng enzym trong thực tế có thể tiến hành theo hai cách sau:
+ Điều hoà định hướng tác dụng của enzym trong các nguyên liệu chứa nó.
+ Tách enzym ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng trong các
quá trình sản xuất.
Khi sử dụng enzym theo hướng thứ nhất trong nhiều trường hợp có thể đơn giản
hơn. Tuy nhiên cách sử dụng này hạn chế phạm vi ứng dụng của enzym vì chỉ có thể
dùng enzym đối với quy trình chế biến chính nguyên liệu của nó. Sử dụng enzym theo
cách thứ hai có hiệu quả hơn vì chế phẩm enzym nhận được có thể sử dụng rộng rãi tuỳ
theo yêu cầu. Hơn nữa còn có thể dễ dàng điều khiển hoạt động của enzym theo ý
muốn và cho phép đề ra quy trình sản xuất.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
Các chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:
trong hoá phân tích để định tính và định lượng các chất, trong nông nghiệp, trong y
học, trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp hoá học và
nhiều ngành công nghiệp khác như công nghiệp dệt, công nghiệp da v.v

1.1.2.1. Ứng dụng trong hoá phân tích để định tính và định lượng
Khi sử dụng enzym để định lượng các chất có thể tiến hành theo hai cách:
+ Để định lượng một chất nào đó ta dùng enzym có tác dụng phân giải riêng
chất ấy. Sau đó dùng một trong các phương pháp phân tích thông thường để định lượng
các chất sau phản ứng, từ đó suy ra lượng chất cần phân tích. Phương pháp này để đạt
được kết quả tốt nhất cần sử dụng enzym có tính đặc hiệu cao và chế phẩm enzym thật
tinh khiết.
+ Nếu chất cần phân tích có tác dụng kìm hãm hoặc kích thích đặc hiệu một
enzym nào đó, ta có thể định lượng bằng cách xác định mức độ ảnh hưởng của chúng
đến hoạt độ enzym, đối chiếu với bảng hoặc đồ thị chuẩn để suy ra lượng chất cần phân
tích .
1.1.2.2. Ứng dụng trong y học
Trong y học có thể sử dụng enzym để chữa bệnh, để sản xuất các sinh tố và các
chất kháng sinh. Nhiều enzym hiện nay được dùng để điều chế thuốc như papain,
pepxin, bromelain…
Có thể dùng enzym, coenzym để tăng thêm lượng enzym cho cơ thể, loại bỏ các
phần mô bị hỏng, bị thối ở các ổ viêm, các vết thương, chữa các bệnh thiếu enzym bẩm
sinh, chẩn đoán nhanh một số bệnh, làm các nội quan nhân tạo hoặc có thể dùng enzym
để chữa các bệnh tiêu hoá kém, hoà tan các cục máu đông làm nghẽn mạch máu. Ngoài
ra có thể dùng enzym để phân giải các thuốc khi cơ thể bị phản ứng mạnh với các
thuốc này hoặc dùng các chất kìm hãm đặc biệt để kìm hãm các quá trình tăng quá mức
gây tác hại cho cơ thể.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
1.1.2.3. Ứng dụng trong công nghiệp
Enzym được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp.
- Trong công nghiệp xà phòng dùng để làm chất tẩy rửa dầu mỡ công nghiệp.
- Sử dụng enzym amylaza để khử hồ trên vải trong công nghiệp dệt.

- Sử dụng proteaza của Asp-oryzae 33 để khử lông trâu bò trong công nghiệp
thuộc da.
- Sử dụng xenlulaza, thuỷ phân bào mòn màng xenluloza để trích ly các chất keo
trong rong biển.
- Trong công nghiệp giấy sử dụng enzym để sản xuất bột giấy và giấy.
1.1.2.4. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Bằng cách sử dụng enzym đã hỗ trợ một cách tích cực cho lĩnh vực thực phẩm
như để tăng độ tơi xốp, độ ngọt, màu sắc cho bánh mì, người ta đưa vào trong bột nhào
0,002-0,003%
α
-amylaza, cũng có thể sử dụng amylaza thay cho HCl, thủy phân tinh
bột để sản xuất glucoza. Còn dựa vào khả năng thủy phân protein của proteaza người ta
bổ sung nó vào trong chế biến thịt, cá, sữa, đồ hộp, cá rán, chế biến nước mắm ngắn
ngày. Hay dùng pectinaza để tăng hiệu suất ép nước làm dịch quả
Khi sử dụng chế phẩm enzym để chế biến các sản phẩm nông nghiệp như chè,
thuốc lá…thì thường tăng nhanh quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinh
dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, sử dụng enzym còn có thể cải tạo hương vị của các loại
rau quả tươi sau khi chế biến, trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác.
1.1.2.5. Ứng dụng trong nông nghiệp
Sử dụng các chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm nông
nghiệp như: Sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt
trước khi gieo. Dùng enzym để sản xuất thức ăn cho động vật nhằm làm tăng giá trị
dinh dưỡng cho thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng thức ăn.
Sử dụng enzym để chuẩn bị thức ăn cho gia súc có thể tiến hành theo hai cách:
+ Thêm trực tiếp enzym vào trước khi dùng.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
+ Thêm enzym để xử lý sơ bộ thức ăn.

Cách thứ nhất đơn giản hơn nhưng cách thứ hai lợi hơn vì khi xử lý ngoài cơ thể
ta có thể dễ dàng tạo điều kiện thích hợp về pH, nhiệt độ cho enzym hoạt động mạnh,
do đó hiệu quả phân giải thức ăn lớn hơn so với cách thứ nhất.
Để sử dụng enzym trong chăn nuôi, tốt nhất là dùng các chế phẩm enzym từ vi
sinh vật và chưa tinh chế, vì thành phần enzym, đặc biệt là các enzym thuỷ phân trong
các chế phẩm này thường phong phú hơn nhiều so với chế phẩm enzym từ động vật.
Do vậy khi thêm chế phẩm enzym vi sinh vật vào thức ăn của động vật trưởng thành,
khoẻ mạnh vẫn có ảnh hưởng rõ rệt. Trong khi đó nếu thêm chế phẩm enzym động vật
lại không có hiệu quả gì.
Khi sử dụng dụng chế phẩm enzym để bổ sung vào thức ăn cần lựa chọn chế
phẩm phù hợp cho từng loại động vật. Vấn đề quan trọng hơn nữa là phải xác định
lượng enzym thích hợp cần thêm vào thức ăn để đạt kết quả tốt nhất. Ngoài ra trong
nông nghiệp có thể sử dụng enzym để xử lý hạt trước khi gieo nhằm rút ngắn thời gian
nảy mầm và tăng sản lượng thu hoạch.[16,Tr13][2,Tr12]
1.2. Enzym proteaza
1.2.1. Giới thiệu về enzym proteaza
Proteaza là enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử
protein và các cơ chất tương tự [2,Tr127 ].
Dưới tác dụng của enzym proteaza, protein bị thuỷ phân theo sơ đồ sau :
Protein pepton polypeptit peptit axit amin.
Đây là quá trình thuỷ phân tương đối phức tạp và có sự tham gia của nhiều loại
proteaza khác nhau. Nhiều proteaza cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận
chuyển axit amin (CO-OH).
Từ thế kỷ XVIII, nhà bác học Pháp Roemur đã phát hiện dạ dày của chim ăn thịt
có khả năng tiêu hoá thịt. Tuy nhiên đến năm 1875 Convisart mới tách được từ dịch
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
tụy, đó là proteaza đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Từ đó nhiều nhà bác học

nghiên cứu và tách được nhiều enzym khác nhau ở dạng tương đối tinh khiết.
Ngoài các enzym hệ tiêu hoá, người ta cũng có những quan sát về những proteaza
trong máu. Schmidt (1869-1872) đã nêu giả thiết trong máu có enzym trombin tham
gia trong quá trình làm đông máu và tác giả thu được enzym này và kết tủa bằng cồn.
Các proteaza thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1874 Group-Besanez công
bố đã nhận được proteaza từ hạt một loại đậu. Tác giả cũng nhận thấy rằng dịch chiết
từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động phân giải protein nhưng bằng chứng này
không vững chắc. Vì vậy Wurtz được xem là người đầu tiên tách được proteaza thực
vật (1879). Ông nêu rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có chứa proteaza, khi dùng
cồn để kết tủa thu được chế phẩm không tinh khiết (100g/1cây) gọi là papain.
Đến đầu nữa thế kỷ XX người ta mới phát hiện thêm các peptithydrolaza khác
như: bromelain-proteaza từ cây dứa, captesin-proteaza của mô cơ động vật. Nhờ kết
tinh được enzym có độ tinh khiết cao nên người ta nghiên cứu được cấu trúc phân tử,
cấu trúc trung tâm hoạt động, tính chất hoá lý và tính đặc hiệu của các proteaza.
Từ năm 1950 trở lại đây đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về proteaza cho
thấy các proteaza khác nhau về cơ chế phản ứng, phân hủy các cơ chất có cấu trúc khác
nhau, điều kiện môi trường hoạt động khác nhau.
1.2.2. Nguồn thu proteaza
Các proteaza khá phổ biến trong động vật, thực vật, vi sinh vật. Tuy nhiên sự
phân bố của chúng không đồng đều trong các mô của các loài và các cơ quan. Có thể
thu nhận proteaza theo 3 nguồn chính sau :
 Từ thực vật :
Thu nhận protein từ thực vật cũng chiếm một tỉ lệ quan trọng trong công nghệ
enzym. Một số enzym thực vật được ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm và công
nghiệp. Trong số đó phải kể đến bromelain có trong dứa, papain có trong đu đủ và
ureaza có trong các cây họ đậu v.v…
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH

Việc nghiên cứu proteaza thực vật được bắt đầu vào thế kỷ XIX gắn liền với công
trình nhà bác học người Nga Kieegov, ông đã chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch
có tác dụng chuyển hoá tinh bột thành đường. Và đến năm 1962 lần đầu tiên Sumner
đã tách proteaza thực vật ở dạng tinh thể (ureaza).
Năm 1995, Võ Sỹ Hùng nghiên cứu thu nhận proteaza từ ruột bí đao, đến năm
1997 các tác giả đã nghiên cứu tìm cách ứng dụng proteaza thu được vào quy trình sản
xuất phomat phù hợp với điều kiện Việt Nam.Trong những năm gần đây, nhiều tác giả
trong nước đã nghiên cứu thu nhận được một số proteaza từ thực vật ở mức độ tinh
khiết khác nhau tuỳ theo mục đích sử dụng như papain từ nhựa đu đủ xanh, bromelain
từ võ, lõi, và lõi đầu dứa với hiệu suất thu hồi chế phẩm thô tương đối cao.
Bromelain được điều chế từ vỏ, lõi, chồi dứa, nguồn cung cấp chính của enzym
này là hãng Biochem, Bangkok Thái Lan.
 Từ động vật :
Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhầy dạ
dày, tim,…những phế liệu của công nghiệp thịt -dùng để tách enzym rất tiện lợi. Dịch
tuỵ có chứa amylaza, lipaza, proteaza, ribonucleaza và một số enzym khác.
Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê nghé, người ta thu chế phẩm Renin để làm đông sữa
trong sản xuất phomat. Người ta cũng sản xuất pepxin từ dạ dày động vật. Từ mô cơ
(gan, thận, phổi, tim, dạ con) tách được captexin A, B, C, D, từ huyết tương tách được
enzym trombin. Tuy nhiên với nguồn nguyên liệu để sản xuất enzym là động vật thì
nguyên liệu đó phải tươi tốt, lấy ngay sau khi giết mổ, bảo quản ở -20
0
C. Đây là vấn đề
khó khăn cho nên thu enzym proteaza từ động vật ít được quan tâm hơn so với thực vật
và vi sinh vật.
 Từ vi sinh vật:
Với lí do về kinh tế, công nghệ mà hai nguồn nguyên liệu động vật, thực vật
không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với qui mô công nghiệp lớn các chế phẩm
enzym nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. Như vậy, trong các
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.

Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật là dồi dào và đầy hứa
hẹn.
Phần lớn enzym được sản xuất từ vi sinh vật. Các vi sinh vật chủ yếu được sử
dụng thuộc loài Bacillus hoặc loài Aspergillus. Năm 1950, hãng Novo của Đan Mạch
chào hàng chế phẩm enzym lên men đầu tiên, là
α
-amylase lấy từ vi khuẩn . Trong
những năm gần đây, với số lượng enzym proteaza bán ra chiếm 60% tổng lượng enzym
thì việc thu nhận proteaza từ vi sinh vật là điều tất yếu.
+ Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh proteaza như:
− Vi khuẩn: Giống Bacillus như: Bac.subtillis, Bac.thermophilus,
Bac.brevis ; giống Clostridium như Cl.perfrigens, Cl.sporogens
− Xạ khuẩn: Từ giống Streptococus như: Str.griseus, Str.rimosus
− Nấm mốc: Giống Asp như: Asp.oryzae, Asp.Niger, Asp.awamori,
Asp.candidus, Asp.flavus
So với proteaza động vật và thực vật, proteaza vi sinh vật có những đặc điểm khác
biệt.Trước hết hệ proteaza vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều
enzym rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra
dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzym giống nhau nên
proteaza vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để
và đa dạng. Nếu khi dùng enzym vào mục đích sử dụng thì rất hiệu quả, tuy nhiên nó
gây khó khăn cho việc tách và tinh chế một enzym.
1.2.3. Phân loại proteaza :
1.2.3.1. Dựa vào cơ chế thuỷ phân :
Phân làm hai nhóm :
 Exoproteaza : là những enzym thuỷ phân các liên kết đầu mút của chuỗi
mạch polypeptid. Các enzym có khả năng thuỷ phân liên kết _NH_ của liên kết peptid

gọi là aminopeptidaza, còn enzym xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu mạch cacbon
-CO- của mạch polypeptid được gọi là cacboxypeptidaza.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
 Endoproteaza : là những enzym xúc tác sự phân giải các liên kết peptid ở
giữa mạch polypeptid như dipeptithydrolaza.
1.2.3.2. Dựa vào trung tâm hoạt động :
Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,v.v… Hartley đã phân loại
proteaza vi sinh vật thành 4 nhóm chính :
− Các proteaza sinh kiềm: có pH tối thích trong vùng kiềm và thường chứa
một nhóm Serine quan trọng. Nhóm này có thể được phát hiện bằng các chất ức chế
nhất định như dizo-propylfluophotphat. Nó bị vô hoạt nhanh chóng ở nhiệt độ lớn hơn
60
0
C, điểm đẳng điện trong khoảng cao 9,5÷10,5, có khả năng phân giải este và liên
kết amit của các dẫn xuất axit và axit amin.
− Các proteaza-kim loại: pH tối thích trong vùng trung tính, trung tâm hoạt
động có chứa nguyên tử kim loại và bị ức chế bởi EDTA, nó sẽ bị mất hoạt tính hoàn
toàn ở nhiệt độ 70
0
C sau 30 phút.
− Các proteaza axit: trung tâm hoạt động có chứa nhóm -COOH có pH tối
thích trong vùng 2÷5 và nó thuộc loại khá bền với nhiệt.
− Các proteaza cystein: có pH tối thích trong vùng trung tính đến kiềm yếu
và bị ức chế bởi thuốc thử SH như P-clomecuribenzoat, trung tâm hoạt động là nhóm
-SH của cystein.
Sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng, không thực sự chính xác vì pH hoạt
động tối thích của mỗi enzym còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất và nhiều yếu tố

khác.[17,Tr177]
1.2.4. Ứng dụng của proteaza :
Các enzym proteaza nói chung được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học
1.2.4.1. Trong quá trình chế biến cá
Khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá proteaza vốn có trong cá sẽ thủy
phân một phần protein của cá. Tuy nhiên quá trình này thường xảy ra chậm và yếu,
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
người ta đưa thêm proteaza từ ngoài vào sẽ làm tăng rõ rệt quá trình thủy phân, rút
ngắn thời gian chế biến. Protein của cá bị thủy phân mạnh nên quá trình loại mỡ, loại
xương khỏi phần thịt cá bị thủy phân (trong sản xuất bột cá) được dễ dàng hơn, lượng
nước mắm cốt thu được cũng nhiều hơn hẳn so với mẫu đối chứng. Thêm proteaza vào
làm biến đổi nhanh chóng cấu tạo của mô cá do đó muối và các gia vị dễ dàng thấm
vào, rút ngắn thời gian muối cá, thời gian xông khói cũng như thời gian xử lý nhiệt khi
chế biến cá. Trong nhiều trường hợp khi thêm proteaza còn làm tăng hương vị của sản
phẩm.
1.2.4.2. Trong công nghiệp thịt
Proteaza được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị của thịt sau khi chế
biến. Người ta xác định rằng nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến
sẽ làm tăng hương vị rõ rệt của sản phẩm nhận được: như papain được sử dụng để làm
mềm thịt, bromelain để thủy phân gan bò Thịt sau khi làm mềm có thể chế biến thành
các thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.
Người ta còn dùng proteaza để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu
giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da Dùng proteaza để thủy phân protein thường ít bị
hao hụt axit amin như khi dùng phương pháp hoá học. Thủy phân protein bằng axit
thường mất khoảng 30÷50% serine, treonine, còn cystein và cystine thì bị thủy phân
hoàn toàn. Để thủy phân sâu sắc protein cần dùng các proteaza có tính đặc hiệu rộng

rãi, tuy nhiên khi thủy phân bằng enzym khó lòng thủy phân hoàn toàn protein. Cho
nên để thủy phân hoàn toàn protein cần dùng hỗn hợp proteaza từ các nguồn khác
nhau.
Một ưu điểm khác của phương pháp thủy phân protein bằng proteaza là không
phá hủy các vitamin có trong nguyên liệu, không làm sẫm màu dịch thủy phân và
không tạo thành các sản phẩm phụ khác.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
1.2.4.3. Trong quá trình chế biến sữa
Proteaza không những có khả năng thủy phân protein mà còn có khả năng đông
tụ sữa. Ở đây có sử dụng những proteaza có tác dụng làm đông tụ sữa: như renin,
pepxin và một số proteaza vi sinh vật khác. Ngoài ra để đáp ứng nhu cầu thực tế, ngày
nay proteaza thực vật cũng được sử dụng để làm đông tụ sữa, trong đó fixin từ các cây
Ficus và bromelain từ dứa cũng được sử dụng vào mục đích này. Tuy nhiên tất cả
proteaza vi sinh vật và thực vật đều khác với Renin của động vật ở chỗ chúng không
những làm đông tụ sữa mà còn có thể thủy phân sâu sắc cazein, do đó có ảnh hưởng
xấu đến chất lượng của phomat. Vì vậy trong quá trình làm phomat, Renin vẫn chiếm
một vị trí đặc biệt trong các proteaza khác. Dưới tác dụng của Renin, cazein của sữa sẽ
đông tụ thành khối đặc không hoà tan và tất cả mỡ của sữa sẽ được giữ trong kết tủa
này. Các proteaza sẽ thủy phân một phần các axit amin các peptit thấp phân tử, các
chất này ảnh hưởng đến hương vị của phomat.
Ngoài ra proteaza cũng được dùng để thu cazein kỹ thuật, dùng trong ngành kỹ
nghệ như: vecni, chất màu, hương liệu, proteaza cũng được dùng trong sản xuất chao.
1.2.4.4. Trong công nghiệp nước giải khát
Proteaza được dùng trong bia, rượu vang, rượu mùi, nước quả và ổn định chất
lượng, cụ thể proteaza thường dùng là papain và bromelain. Ngoài ra proteaza được
dùng trong sản xuất rượu, ở đây nó phân giải các protein có tác dụng kìm hãm
amylaza, do đó tăng nhanh quá trình chuyển hoá tinh bột.

1.2.4.5. Trong công nghiệp da
Proteaza được dùng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da. Các proteaza sẽ làm
mềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một
số liên kết của sợi collagen.
Khi xử lý bằng proteaza tính đàn hồi của da cũng tăng lên. Sử dụng proteaza cũng
rút ngắn được quá trình tẩy lông, lượng lông thu được tăng lên 25÷30% so với phương
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
pháp hoá học. Sử dụng enzym trong công nghệ thuộc da tránh được độc hại cho công
nhân, tránh được ô nhiễm môi trường.
1.2.4.6. Trong công nghệ dược phẩm và y học
Proteaza được dùng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein của
những người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tụy tạng không bình thường, thiếu enzym
dùng phân giải các chất hữu cơ trong cơ thể, chữa bệnh tắc tĩnh mạch.
Proteaza dùng sản xuất môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein trong nuôi
cấy sinh vật để sản xuất chất kháng sinh, chất kháng độc Ngoài ra còn dùng chế
phẩm proteaza để cô đặc và tinh chế huyết thanh kháng độc để chữa bệnh. Trong số
các proteaza: papain dùng chế thuốc trị bệnh, bromelain được dùng để điều trị viêm
loét, rối loạn tiêu hoá, giảm phù nề, tụ huyết, giúp vết thương chóng lành, bromelain có
tính an thần làm tăng khả năng hấp thụ kháng sinh lên bốn lần, bromelain còn dùng để
chữa trị hen suyễn.
1.2.4.7. Trong công nghệ phim ảnh
Proteaza vi khuẩn và xạ khuẩn được dùng để tái sinh các các nguyên liệu cảm
quang khác nhau như phim điện ảnh, giấy phim, phim Rơnghen, phim chụp máy bay
Các proteaza sẽ được phân giải và hoà tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh,
do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý.
1.2.4.8. Trong nông nghiệp
Proteaza dùng trong chăn nuôi để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng

khả năng hấp thụ thức ăn của động vật hoặc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm
bổ sung vào thức ăn gia súc gia cầm.
1.2.4.9. Trong sản xuất tơ tằm
Sợi thu được sau khi kéo ở kén ra thường chứa 30% xerixin. Chỉ cần một lượng
nhỏ xerixin nằm lại trên tơ lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu
không đồng đều và khó trang trí lụa. Để tách lượng xerixin còn lại đó ta dùng chế
phẩm proteaza từ nấm mốc và đặc biệt từ vi khuẩn.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
1.2.4.10. Trong nghiên cứu khoa học
Proteaza được dùng để nghiên cứu cấu trúc phân tử protein. Trong thời gian gần
đây người ta dùng chế phẩm proteaza không hoà tan bằng cách gắn vào những chất
không tan như xenlluloza, sephadex, sepharoza
Enzym được giữ trên chất mang nhờ lực hấp phụ, lực liên kết hoá trị để ứng
dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong thực phẩm, nghiên cứu cấu trúc phân tử
protein.
Ngoài ra proteaza còn được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà
phòng tắm, kem bôi mặt, thuốc đánh răng làm cho da mịn, làm sạch cao răng, chữa
viêm lợi và trong chừng mực nhất định có tác dụng diệt vi khuẩn.
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ
vi sinh vật :
Quá trình sinh tổng hợp enzym nói chung cũng như quá trình tổng hợp proteaza
của vi sinh vật nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : độ ẩm, nhiệt
độ, pH, độ thông khí, thành phần môi trường .v.v…do đó sự sinh tổng hợp proteaza
của Bacillus subtilis cũng không nằm ngoài quy luật chung đó .
1.2.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh
vật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp. Tuỳ theo từng loại vi sinh vật, nhiệt

độ thích hợp khác nhau: các loài nấm mốc t
opt
= 22 ÷32
0
C còn vi khuẩn thì thích hợp ở
nhiệt độ cao hơn t
opt
= 35 ÷55
0
C. Nói chung đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzym
không bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
1.2.5.2. Ảnh hưởng pH của môi trường :
Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi truờng ít ảnh hưởng đến quá
trình sinh tổng hợp enzym ở vi sinh vật. Hơn nữa pH môi trường hầu như không thay
đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật, với các nấm mốc pH
opt
=6 ÷6.5, với vi
khuẩn thì pH= 6.6 ÷7.4.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
Khi dùng phương pháp bề sâu thì pH có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò
quyết định đối với sự tích luỹ proteaza trong môi trường. pH môi trường có thể thay
đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật. pH ban đầu của môi
trường thích hợp cho các loài vi khuẩn là khác nhau, với nấm mốc pH= 3.8 ÷5.6, còn
với vi khuẩn pH = 6.2÷ 7.4.
1.2.5.3. Độ thông khí :
Đây cũng là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp proteaza.
Tuy nhiên ảnh hưởng này khác nhau tuỳ theo vi sinh vật.Trong một số trường hợp,

thiếu oxi tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình
sinh tổng hợp proteaza. Lượng oxi thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp ở các vi sinh
vật khác nhau là khác nhau. Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí
cũng ảnh hưởng khác nhau.Trong một số trường hợp, sự hiếu khí lại kìm hãm mạnh sự
sinh tổng hợp enzym.
1.2.5.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường :
Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzym.
Để tăng lượng enzym trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích
hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng chất cảm ứng. Đối với một vi
sinh vật nhất định, điều kiện cho quá trình tổng hợp các enzym khác nhau không giống
nhau. Nắm vững các quy luật ảnh hưởng của các yếu tố này có thể điều khiển vi sinh
vật tổng hợp định hướng một enzym xác định.
 Ảnh hưởng của nguồn cacbon:
Ở vi khuẩn Bac.subtilis, quá trình tổng hợp proteaza xảy ra khá mạnh khi dùng
cacbon là tinh bột với nồng độ khoảng 2%. Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống dưới 2%
sẽ làm giảm một ít hoạt độ phân giải protein của dịch môi trường nuôi cấy.
 Ảnh hưởng của nguồn nitơ:
Nguồn nitơ hữu cơ thường ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp proteaza vì
chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ thường dùng là :
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
các loại bột khác nhau (có gluten), nước chiết của cám, nấm men đã tự phân giải,
pepton, protein v.v…Ngoài việc chọn nguồn và lượng cacbon và nitơ thích hợp cần
phải chọn tỷ lệ thích hợp. Có như vậy mới bảo đảm cho việc sinh proteaza là lớn nhất.
Ngoài những yếu tố kể trên thì các nguyên tố vi lượng, NaCl, vitamin và các yếu tố
khác cũng ảnh hưởng đến quá sinh tổng hợp.
Người ta đã chứng minh được rằng với Bac.subtilis có thể dùng điều kiện nuôi
khác nhau để thu được các chế phẩm có tỷ lệ khác nhau hoặc là chủ yếu là phức hệ

amylaza hoặc chủ yếu là hệ proteaza. Theo Ortrosko (1977) để thu proteaza từ
Bac.subtilis thì thành phần môi trường gồm: dịch thuỷ phân cazein :0.3%, glucoza :1%,
MgSO
4
.7H
2
O:0.05%, KH
2
PO
4
:0.005%. Còn để thu amylaza thì dùng bằng nước chiết
cám 20% .
1.3. Một số nghiên cứu, ứng dụng của proteaza hiện nay :
1) Theo Thạc sĩ Vũ Xuân Dũng, năm 1997 đã làm nghiên cứu “Phân lập, lựa chọn
chủng vi khuẩn chịu kiềm, chịu mặn, chịu nhiệt có hoạt tính proteaza cao và thăm dò
khả năng ứng dụng vào quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày”. Sau khi phân lập
được chủng vi khuẩn sinh proteaza mạnh kí hiệu là Bacillus D15 và ứng dụng vào sản
xuất nước mắm ngắn ngày. Khi bổ sung 5% dịch nuôi cấy vào chượp cá sau 30 ngày
thuỷ phân thì hàm lượng nitơ toàn phần đạt :22.6g/kg, nitơ foocmol đạt:12.7g/kg, nitơ
amin đạt:7.5g/kg. Dịch lọc từ chượp sau 30 ngày đạt được những chỉ tiêu chuẩn của
chượp chín và đạt được các chỉ tiêu chất lượng về cảm quan: màu vàng sáng, mùi
thơm, vị mặn, ngọt [7,tr125_133
]
2) Dùng Bacillus subtilis CNTP_B_08 có khả năng sinh tổng hợp
α
_amylaza
cao, để ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia nhằm thay thế một phần malt đại mạch
bằng các loại nguyên liệu có sẵn trong nước như: ngô: 30%; gạo: 30%; malt: 40%. Do
đó giá thành sản phẩm hạ 22% (báo cáo khoa học, 43)
3) Nghiên cứu và triển khai sản xuất nước mắm ngắn ngày vào thực tiễn bằng

bromelain từ dứa.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
4) Ảnh hưởng của muối ăn đến quá trình thuỷ phân cá mối bằng proteaza của
Bacillus và nồng độ muối thích hợp là 3% (Tạp chí thuỷ sản ,2003)
5) Theo kết quả nghiên cứu thu nhận và bảo quản proteaza từ chế phẩm lên men
bề mặt của vi khuẩn Bac.subtilis. Proteaza của vi khuẩn hoạt động mạnh nhất 40 ÷50
o
C
ở nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn ( trên 60
o
C ) thì proteaza mất hoạt độ đáng kể chỉ
còn lại khoảng 40%. pH thích hợp cho proteaza hoạt động là 6.4 ÷7. Proteaza vi khuẩn
rất bền với nhiệt độ, ở nhiệt độ 50
o
C, hoạt độ proteaza không giảm sau 6h. Ở nhiệt độ
cao hơn thì hoạt độ proteaza giảm dần theo thời gian và đặc biệt ở nhiệt độ 70
o
C thì
hoạt độ proteaza giảm rất nhanh.
6)"Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh proteaza của
Bac.subtilis" là kết quả của quá trình nghiên cứu của Th.S Đỗ Thị Bích Thuỷ và TS
Trần Thị Xô, năm 2004 đã cho thấy nguồn cacbon và nitơ có tác dụng kích thích cao
nhất là tinh bột hoà tan và cazein. Thành phần nuôi cấy chủng Bac.subtilis ở quy mô
phòng thí nghiệm bao gồm: pepton 1%, cao thịt 0.3%, muối 0.5%, tinh bột hoà tan
1.75%, cao nấm 0.1%. pH ban đầu bằng 6.5 và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp ứng với
môi trường tối ưu để Bac.sutillic sinh proteaza mạnh nhất là 35
o

C.
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH

CHƯƠNG II
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu được sử dụng là cá cơm than được đánh bắt từ biển Quảng Nam
-Đà Nẵng.
Muối biển dạng hạt của Sa Quỳnh - Quảng Ngãi.
Chủng vi khuẩn Bacillus subtillis C
10
từ phòng thí nghiệm bộ môn bảo quản chế
biến nông sản trường Đại học Nông Lâm - Huế.
2.1.2. Các hoá chất
 Hoá chất :
Các hoá chất tinh khiết : K
2
HPO
4
, NaH
2
PO

4
.2H
2
O, foocmol 40%, cồn tuyệt đối,
NaOH 0.1N, H
2
SO
4
0.1N.Các chỉ thị màu: thimolphtalein, phenolphtalein, metyl đỏ.
NaCl tinh khiết, cao nấm, agar-agar từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại Học
Bách Khoa Đà Nẵng .
Pepton, cazein tinh khiết, tinh bột sắn, tinh bột tan, phế liệu tôm từ phòng thí
nghiệm Hoá Sinh bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm_Sinh Học .
 Thiết bị :
Máy li tâm : MIRRO 24R
Tủ ổn định nhiệt, máy lắc từ, thiết bị thanh trùng, thiết bị màng lọc vô khuẩn,
thiết bị phân tích đạm Kiendal, tủ lạnh đông –20
0
C
Máy đo pH, bút đo pH
Các thiết bị xay thô, xay mịn, nghiền
Các loại cân kỹ thuật chính xác đến 10
-2
, 10
-4
Và các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm .
2.2. Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1. Quy trình thu nhận dịch chiết enzym :
 Qui trình thu nhận enzym proteaza từ Bacillus subtilis:
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.

Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH

Các chế phẩm enzym được sử dụng trong thực tế dưới nhiều dạng khác nhau.
Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật trong đó có chứa enzym
được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu các tạp chất đó
không gây tác hại đáng kể đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất sau này. Cũng có nhiều
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Phối trộn môi trường
pH=6
Thanh trùng 121
0
C
30phút
Làm nguội về nhiệt
độ phòng
Nuôi tăng sinh
24h
Bacillus subtilis
Nuôi cấy vi khuẩn
trong MTTƯCB
Nuôi cấy vi khuẩn
trong MTTT,pH=10
Ly tâm tách tế bào
Dịch chiết enzym
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
trường hợp người ta cần đến chế phẩm enzym tinh khiết với mức độ khác nhau tuỳ

theo yêu cầu sử dụng .
Qua tài liệu nghiên cứu về cách thu nhận proteaza vi sinh vật mà enzym được
khuếch tán ra môi trường ( nuôi theo phương pháp chìm ) thì để thu dịch enzym người
ta thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi canh trường bằng cách ly tâm hoặc
ép lọc với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc hoặc các chất tạo kết tủa nếu cần thiết.
Dựa vào các tài liệu đã nghiên cứu, tôi xây dựng qui trình thu nhận enzym để nghiên
cứu như trên.
 Thuyết minh qui trình công nghệ :
• Hoạt hoá giống Bacillus subtilis ( nuôi cấy tăng sinh ):
Giống Bacillus subtilis sau khi phân lập được giữ trong môi trường thạch nghiêng ở
5
0
C. Trước khi đưa vào sản xuất enzym, giống này được hoạt hoá bằng cách chuyển
vào 1ml môi trường tối ưu cơ bản trong ống nghiệm và nuôi cấy lắc 200vòng/phút,
trong 24h, ở 35
0
C.
• Chuẩn bị môi trường: tiến hành theo mục 1 phụ lục
• Nuôi cấy sản xuất enzym: tiến hành theo mục 2 phụ lục:
Quá trình nuôi cấy như sau:
Cho giống tăng sinh vào nuôi trong môi trường thay thế với tỉ lệ giống là 1%.
Quá trình nuôi được thực hiện trong tủ ấm có máy lắc 200vòng/phút, nhiệt độ 35
0
C.
• Tách và tinh chế enzym:
Dịch chiết enzym thô thu được bằng cách ly tâm lạnh ở 4000vòng/phút , ở nhiệt
độ 4
0
C, trong 10 phút .
2.2.2.Xác định hoạt độ enzym proteaza bằng phương chuẩn độ foocmol:

2.2.2.1.Nguyên tắc: Theo mức độ thuỷ phân protein, các nhóm cacboxyl và
nhóm amin tự do trong dung dịch tăng dần, do đó dựa vào sự tăng của một trong các
nhóm này để xác định hoạt độ enzym. Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng foocmol
bao vây nhóm acid amin và chuẩn độ nhóm cacboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
xác định. Từ lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amin
tương ứng.
Hoạt độ enzym được tính bằng miligam đạm amin được tạo thành trong 1h ở điều
kiện nhiệt độ và pH xác định. Một đơn vị hoạt động là lượng enzym mà sau 1h ở 30
0
C
và pH thích hợp có thể phân giải protein tạo thành 1mg đạm amin.
2.2.2.2.Hoá chất : Được thực hiện theo mục 4 phụ lục
2.2.2.3.Cách tiến hành: Được thực hiện theo mục 3 phụ lục
2.2.2.4.Tính kết quả:
Hoạt độ phân giải protein của 1ml dung dịch nghiên cứu là:
HđP=
)(
Vt
fVV
∗
∗∗− 42,1
21
đơn vị
V
1
: số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng chuẩn bình thí nghiệm

V
2
: số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng chuẩn bình kiểm tra
f: Hệ số chỉnh lý của dung dịch dung dịch NaOH 0.1N
t: thời gian enzym tác dụng, h
V: thể tích dung dịch enzym đã dùng, ml
1,42: là số mg đạm amin tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N
2.2.3. Phương pháp xác định nitơ foocmol:
2.2.3.1.Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở dụng foocmol bao vây
nhóm amin và chuẩn độ nhóm carboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ dung dịch
xác định. Từ lượng kiềm dùng chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amin tương
ứng.
2.2.3.2.Cách tiến hành: được thực hiện theo mục 5 phụ lục
2.2.3.3.Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ foocmol của 1lít nước mắm được tính theo công thức :
X =
)(14
10
10010000014,0)(
21
21
VV
VV
−∗=
∗∗∗−
Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
V

1
-Thể tích NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn mẫu phân tích -ml
V
2
-Thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu trắng -ml
10 -Thể tích dịch lấy chuẩn
100 - Hệ số pha loãng
0,0014-số gam nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1 N
1000: hệ số quy đổi ra lít
2.2.4. Xác định hàm lượng nitơ amôniac:
2.2.4.1.Nguyên tắc: Trong thực vật, amôniac tự do chiếm một lượng không
đáng kể. Trong các sản phẩm thực vật, NH
3
có ở dạng tự do cũng như liên kết (chủ yếu
là ở dạng muối của các axit hữu cơ), ở một số phẩm vật thực phẩm như thịt,cá, chao,
nước mắm, các loại đồ hộp thịt cá…amôniac tích tụ một lượng khá lớn, thường tồn tại
dưới dạng muối NH
4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
Việc xác định nó có ý nghĩa đặc trưng cho mức
độ hư hỏng của sản phẩm, để giải phóng NH
3
ra khỏi dung dịch, người ta thường dùng
các kiềm yếu ít tan trong nước như MgO, CaO. Cất amôniac ở nhiệt độ 35-40
0

C và
dưới áp suất thấp khoảng 15-20mmHg.
2.2.4.2.Hoá chất:
NaOH 30%, H
2
SO
4
0.1N, NaOH 0.1N.
Thuốc thử: + Thuốc thử metyl đỏ
+ Thuốc thử phenolphtalein 1% trong cồn tuyệt đối.
2.2.4.2.Cách tiến hành: tiến hành theo mục 6 phụ lục
2.2.4.3.Tính kết quả:
Hàm lượng amoniac (X) được tính bằng g/l theo công thức sau :
X =
)(4,1
50
100050*0014,0)(
21
21
VV
VV
−∗=
∗∗−
Trong đó : V
1
-Thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu trắng -ml
V
2
-Thể tích NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn mẫu phân tích -ml
50-Thể tích nước mắm pha loãng cho vào bình cất máy cất đạm

Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.
Đồ án tốt nghiệp
Trang
LÊ THỊ THANH
0,0014- gam nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1 N
1000:hệ số quy đổi ra lít
2.2.5. Xác định hàm lượng nitơ amin (đạm tan):
Hàm lượng nitơ amin chính là hiệu số giữa nitơ foocmol và nitơ amoniac, đặc
trưng cho lượng đạm tan trong dung dịch.

Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bac.subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm.