ĐỀ TÀI THỰC HIỆN TIÊU bản cố ĐỊNH DỊCH HOÀN CHUỘT ĐỒNG

GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
PHẦN I : ĐẶT VẤN ĐỀ

Sinh sản là một đặc điểm đặc trưng nhất của mọi cơ thể và là bản năng của
mọi sinh vật để bảo tồn nòi giống và cũng là đặc điểm đặc trưng của sinh vật khi so
sánh với phi sinh vật
Ở giới động vật thuộc lớp thú, trong các cấu trúc của hệ sinh dục đực, tinh
hoàn là cơ quan sản sinh tinh trùng và chế tiết hormon sinh dục. Để có cơ sở giải phẩu
nhằm quan sát hình dạng ngoài và quá trình sản suất tinh trùng của tinh hoàn, việc xác
định phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi và mẫu ngâm tinh hoàn là cần thiết.
Ngoài ra kết quả nghiên cứu sẽ thay thế cho nguồn mẫu tiêu bản dịch hoàn đã xuống
cấp không thể tiếp tục dùng để giảng dạy mô học.
Luận văn tốt nghiệp
1
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1. KỸ THUẬT
1.1 Kỹ thuật thực hiện mẫu ngâm:
Thực hiện mẫu ngâm là cố định làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng
như của tế bào nhưng vẫn tôn trọng tới mức tối đa hình thái của chúng. Nói khác đi,
cố định một tổ chức là giết chết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản
chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất
Trước hết một loại thuốc cố định tốt phải đạt được những yêu cầu sau đây:
- Chống được sự nhiễm trùng
- Ngấm nhanh vào tổ chức, giết nhanh tế bào
- Bảo toàn hay chỉ làm thay đổi rất ít những cấu trúc cơ bản của tổ chức và tế
bào, chống lại sự tự tiêu hủy do men nội bào
Một số tác nhân cố định hoá học thông dụng là: cồn, formol, axit axetic, axit
pieric, axit chromic, bicromat kali, clorua mercuric, tetroxyl osmium, axit
trichloraxetic [Hòe,1976]
1.2 Kỹ thuật thực hiện tiêu bản hiển vi cố định:

Thực hiện theo phương pháp tiêu bản cắt lát. Mẫu vật thực hiện theo phương pháp
này qua nhiều giai đoạn phức tạp và có thêm một số thao tác phụ, nếu một trong mỗi giai
đoạn chính chưa đạt được mong muốn thì sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả về sau. Tóm
lược quy trình như sau: định hình - khử nước - tẩm Parafin – đúc khuôn – cắt mẫu - tải
mẫu lên lame - nhuộm kép bằng Hematoxyline-Eosin - khử nước – làm trong mẫu và cố
định mẫu trong Baume Canada.
1.2.1 Cố định.
Nguyên tắc chung:
- Mẫu vật phải được cố định ngay sau khi lấy.
- Không được làm dập nát mẫu.
- Mẫu vật phải có kích thước vừa phải.
- Không để một mặt mẫu dính vào lọ đựng.
Luận văn tốt nghiệp
2
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
- Đủ dung dịch cố định cần thiết.
• Đúng nồng độ.
• Thể tích dung dịch cố định gấp từ 30-60 lần thể tích mẫu.
- Thời gian cố định thích hợp. Mẫu dày tối đa 5mm thì cố định từ 24-48 giờ.
- Dung dịch cố định là dung dịch Bouin chứa acid picric, acid acetic và formol.
- Rửa nước cho sạch màu vàng của Bouin dưới vòi nước chảy [Hòe, 1976]
1.2.2 Khử nước
Quy trình khử nước thông thường chung cho mỗi loại mẫu (có thể gia giảm tùy kích
cở, mẫu, điều kiện của từng phòng thí nghiệm)
a. Cồn II (cồn tuyệt đối sử dụng 2 lần) 4 giờ
b. Cồn I (cồn tuyệt đối sử dụng 1 lần) 4 giờ
c. Cồn tuyệt đối 6 giờ
1.2.3 Tẩm parafin
1.2.3.1 Tẩm dung môi trung gian của parafin (khử cồn)
Dung môi trung gian của Parafin thường dùng nhất là Toluen và xylene. Ngoài ra còn

có nhiều chất có 2 đặc tính khử cồn hòa tan Parafin như Benzen, Ét-xăng bách hương,
Butanol, sunfuacacbon, Những chất sau chỉ dùng hạn chế: ví dụ như Ét-xăng bách
hương dùng cho kỹ thuật xét nghiệm ty lạp thể, butanol dùng cho tổ chức hạch. Để khử
hết cồn dùng :
a. Xylene (hay xylon) II (đã sử dụng 2 lần 4 giờ )
b. Xylene I (đã sử dụng 1 lần 4 giờ)
c. Xylene nguyên chất 6 giờ
Thời gian khử cồn tối đa là 24 giờ, mẫu ngâm quá lâu sẽ cứng và dễ vỡ. [Hòe, 1976]
1.2.3.2 Tẩm parafin (khử xylene)
Trước hết cần chọn loại Parafin tốt và thích hợp. Parafin chỉ có thể ngấm vào mẫu và
loại xylene ra khi nó ở trạng thái lỏng, tẩm parafin chỉ thực hiện đầy đủ khi dung môi
trung gian đã bị loại hoàn toàn. Người ta khử dung môi trung gian bằng cách chuyển
mẫu lần lượt vào những lọ có Parafin ngày càng tinh khiết. Để tiêt kiệm hóa chất và thời
gian, trên thực tế chỉ cần 3 lần tẩm là đủ
Luận văn tốt nghiệp
3
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
a. Parafin I (đã sử dụng 2 lần) 6 giờ
b. Parafin II (đã dùng 1 lần) 6 giờ
c. Parafin III (nguyên chất) 12 giờ
Loại Parafin I và II có thể dùng nhiều lần hơn quy định.
Parafin III phải đảm bảo nguyên chất vì chính nó sẽ dùng để đúc khuôn.
Nói chung, thời gian tẩm lâu hay mau là tùy kích thước và tính chất của mẫu: nếu
nhỏ và lỏng lẽo thì tẩm vài ba giờ, nếu to và cứng thì tẩm từ 24-36 giờ. [Hòe, 1976]
1.2.4 Đúc khuôn
Người ta đổ vào khuôn chất Parafin lỏng đã lọc từ trước (Parafin ở lần chuyển thứ
3, nghĩa là Parafin hoàn toàn mới). Nhúng ngay mẫu vào chất Parafin đang lỏng này.
Dùng kẹp hay kìm đã hơ nóng để định hướng mẫu theo ý muốn. Sau vài phút Parafin sẽ
đông đặc lại và giữ mẫu ở nguyên vị trí. Khi lớp vỏ ngoài Parafin đã đủ cứng, làm ướt cả
khuôn vào trong bát đựng đầy nước lạnh và chú ý đừng làm rạn, vỡ màng mỏng Parafin

bên trên. Khoảng 20-30 phút sau, Parafin sẽ cứng lại và thuần nhất toàn bộ. Cần tránh
làm lạnh ngay khi Parafin còn lỏng, không được cắt mảnh ngay, phải đợi đến 24 giờ sau.
1.2.5 Cắt và dán mẫu
1.2.5.1 Bảo quản máy cắt và lưỡi dao
- Máy cắt mảnh luôn luôn được bảo quản tốt và các phụ tùng được kiểm tra chặt
chẽ.
- Trước khi dùng cần kiểm tra lại vị trí của các trụ của bàn gắn và lưỡi dao, tránh sự
va chạm vào nhau làm sai lệch máy. Xem lại dầu tra vào máy, sự trơn tru…
- Sau khi dùng thì tháo lưỡi dao ra, lau sạch bằng một miếng vải mịn có tẩm
xylene, vít chặt trong hộp để tránh tai nạn. Lau chùi cẩn thận các mảnh vụn nếu không
sẽ làm cho máy bị sét bẩn
1.2.5.2 Cắt mẫu tẩm parafin bằng máy cắt với 3 giai đoạn
- Cắt khối mẫu thành hình tháp, đáy hình thang, để lại khoảng 2-3 mm Parafin
quanh mẫu. Gọt làm sao cho 2 cạnh trên và dưới song song.
- Hơ nóng nhanh khối gỗ và khối mẫu để gắn khối mẫu vào khối gỗ, điều chỉnh
mẫu sao cho ngay ngắn.
Luận văn tốt nghiệp
4
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
- Đặt lưỡi dao vào, định hướng khối và dao trên máy cắt cho thích hợp. Nhiệt độ tối
ưu là nhiệt độ phòng . Độ dày của mẫu cắt :
• 3-5µm đối với mẫu có yêu cầu quan sát tế bào học
• 10-15 µm đối với mẫu có yêu cầu quan sát tổ chức học định khu.
Tốc độ của tay quay tùy thuộc vào tính chất của khối và độ dày của khối, nói chung,
nên quay chậm với các khối dễ vỡ, đặc biệt là gan và lách. Còn đối với khối rắn không
vỡ cần quay nhanh. Hứng các mẫu cắt trên một tờ giấy trắng. [Hòe, 1976]
1.2.5.3 Tải mảnh cắt lên lame
Trước khi nhuộm cần phải tải mảnh cắt và dán mảnh trên lame. Muốn mảnh cắt
dính vào nền lame có thể dùng một chất dính Gêlatin hoặc Albumin, trình tự thực hiện
như sau:

- Nhỏ vài giọt nước hoặc dung dịch dán còn ấm trên lame (dung dịch phải làm ướt
đều kính)
- Đặt lên trên dung dịch một mảnh cắt hay một dãy cắt.
- Đặt lame trên bàn nóng khoảng 50
o
C và theo dõi mảnh cắt tải ra, mảnh cắt phải
nổi trên dung dịch. Không bao giờ bàn nóng quá 50
0
C thì tổ chức sẽ bị khô.
- Nghiêng lame để tháo nước đi một cách thận trọng. Làm thế nào cho dung dịch
dán trôi đi càng nhiều càng tốt.
- Để tiêu bản khô theo tư thế nghiêng (mảnh cắt ở mặt dưới) ít nhất là 12 giờ ở
nhiệt độ bình thường hoặc 20-30 phút trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 45
o
C khi đã
khô kiệt, các mảnh cắt dính rất tốt vào lame [Hòe, 1976]
1.2.6 Loại parafin ra khỏi mảnh cắt
Loại parafin ra khỏi mảnh cắt chỉ tiến hành trước khi nhuộm vì không thể bảo
quản lâu được tổ chức rất hay vụn vỡ, hút ẩm.
- Đối với các tiêu bản đã được nhuộm cả khối:
+ Làm tan parafin bằng xylene.
+ Gắn bằng Baume canada.
- Đối với các tiêu bản chưa nhuộm và dán bằng albumin:
+ Làm đông đặc albumin bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn.
+ Hòa tan parafin bằng xylen từ 1-2 phút.
Luận văn tốt nghiệp
5
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
+ Loại xylen bằng cồn tuyệt đối 1 phút.
+ Cho vào cồn 95

0
: 1 phút.
+ Cho vào nước 5 phút.
1.2.7 Nhuộm Hematoxyline – Eosin
- Cho tiêu bản vào Hematoxyline từ 5- 45 phút tùy theo loại Hematoxyline.
- Rửa tiêu bản trong nước chảy cho đến khi nào tiêu bản màu xanh (từ hồng sang
xanh) khoảng 10 phút ở nước chảy pH=8
- Nhúng vào cồn acid vài giây (1ml acid HCl + 99ml cồn 96
0
)
Cần lắc tiêu bản rồi rửa nước lã cho xanh lại. Kiểm tra lại nếu biệt hóa chưa đủ thì
nhúng lại cồn acid, nếu màu nhạt sau khi rửa qua nước cất, có thể cho lại Hematoxylin từ
10-15 phút. Sau đó biệt hóa trở lại.
- Ngâm tiêu bản trong Eosin từ 2-4 phút (Eosin Y 1% trong cồn để nhuộm nguyên
sinh chất)
- Rửa nước từ 3-4 phút (kiểm tra trên kính hiển vi xem đã đạt yêu cầu chưa).
- Nhúng tiêu bản trong cồn 90
0
khoảng 10-15 giây, sau đó là cồn tuyệt đối I, II, III
(10-30 giây mỗi lần ) để khử nước.
- Chuyển sang ngâm mẫu trong xylene cho đến khi trong mẫu.
Gắn tiêu bản chú ý: sau khi gắn xong, tiêu bản phải trong suốt. Baume Canada thường
dùng trong dung dịch xylen 55%. Cần đậy kín lọ. [Hòe, 1976]
2. CẤU TRÚC MÔ HỌC
2.1. Cấu tạo đại thể của tinh hoàn
Ở người trưởng thành, mỗi tinh hoàn có kích thước trung bình 4 x 2.5 cm, hình
trứng nằm trong bìu. Tinh hoàn được bọc trong một vỏ liên kết xơ gọi là màng trắng có
lá tạng của tinh mạc phủ ngoài. Ở mặt sau trên của tinh hoàn, màng trắng dày lên thành
khối xơ gọi là thể Highmore. Từ màng trắng có nhiều vách liên kết tiến vào trong, chia
tinh hoàn thành nhiều tiểu thuỳ tinh hoàn (150 – 200 tiểu thuỳ). Các tiểu thuỳ có xu

hướng qui tụ về phía thể Highmore. Trong mỗi tiểu thuỳ có 1 – 5 ống sinh tinh cong
queo, uốn lượn trong mô liên kết rất giàu mạch máu, mạch bạch huyết, thần kinh. [Kiệt,
1994]
Luận văn tốt nghiệp
6
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
2.2. Cấu tạo vi thể của ống sinh tinh
Trong mỗi tiểu thuỳ tinh hoàn có nhiều ống sinh tinh. Thành của ống sinh tinh
gồm một lớp vỏ chung và lớp biểu mô tinh. Lớp vỏ chung gồm lớp đáy, lớp dạng cơ và
lớp sợi. Lớp đáy nằm sát màng đáy, không có cấu tạo tế bào, chỉ có sợi collagen xếp theo
nhiều hướng khác nhau. Lớp dạng cơ nằm ngoài lớp đáy, gồm những tế bào chứa nhiều
siêu sợi actin. Lớp dạng cơ giúp ống sinh tinh co dãn được. Ngoài lớp dạng cơ có những
tế bào sợi.
Luận văn tốt nghiệp
7
Hình 1: Hệ niệu - sinh dục nam [Hoa, 2003]
Thận
Niệu quản
Túi tinh
Ống thoát tiểu
Tuyến hành
Ống dẫn tinh
Mào tinh
8. Tinh hoàn
9. Quy đầu
10. Niếu tinh quản
11. Niếu quản tiền
liệt
12. Tuyến tiền liệt
13. Bàng quang

14. Ống phóng tinh
Hình 2: Cấu tạo tinh hoàn bổ dọc [Hoa, 2003]
Ống phóng tinh
Ống thoát tinh
Ống mào tinh
Lưới tinh
Ống lạc(di tích ống trung thận)
Các ống sinh tinh
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
Biểu mô sinh tinh là một biểu mô đặc biệt tựa trên màng đáy và hướng vào lòng
của ống sinh tinh. Biểu mô sinh tinh gồm hai loại tế bào chính: tế bào dòng tinh và tế bào
sertoli
2.2.1. Tế bào dòng tinh
Những tế bào dòng tinh xếp thành 4 – 8 lớp tế bào từ màng đáy cho đến lòng ống
sinh tinh. Những tế bào dòng tinh vừa sinh sản vừa biệt hoá để tạo thành tinh trùng. Ở
người đàn ông trưởng thành, tế bào dòng tinh gồm có: tinh nguyên bào, tinh bào I, tinh
bào II, tinh tử (tiền tinh trùng), tinh trùng.
Quá trình từ tinh nguyên bào đến tinh trùng được gọi là quá trình tạo tinh
(spermatogenese). Quá trình này gồm ba giai đoạn:
- Tạo tinh bào (spermatocytogenese): tinh nguyên bào phân chia theo kiểu nguyên
phân tạo thành tinh bào I.
- Tạo tinh tử, còn gọi là quá trình giảm phân (meiose): tinh bào I tiến hành hai lần
phân chia giảm nhiễm để tạo tinh tử.
- Tạo tinh trùng ( spermiogenese): các tinh tử biến đổi và biệt hoá thành tinh trùng.
Luận văn tốt nghiệp
8
Hình 3: Ống sinh tinh [Hoa, 2003]
1. Thành ống sinh tinh
2. Tế bào kẽ Leydig
3. Lòng ống sinh tinh

1
2
3
Tinh nguyên bào A đậm
Tinh nguyên bào A nhạt
Tinh nguyên bào A nhạt
Tinh nguyên bào A nhạt
Tinh nguyên bào A nhạt
Tinh nguyên bào B
Tinh bào I
Tinh tử giai đoạn cuối
Tinh tử giai đoạn
sớm
Tinh bào II
Thể cặn
Tinh trùng
Hình 4: Sơ đồ phân chia và biệt hóa tế bào dòng tinh [Kiệt, 1994]
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
* Tinh nguyên bào
Tinh nguyên bào là những tế bào sinh dục nguyên thuỷ, nằm sát màng đáy của
ống sinh tinh, kích thước nhỏ khoảng 12 micron, nhân ít nhuộm màu, bào tương có bộ
Golgi nhỏ, ti thể và nhiều ribosom tự do. Tinh nguyên bào gồm hai loại: tinh nguyên bào
A và tinh nguyên bào B.
Các tinh nguyên bào nằm ở phần nền của biểu mô sinh tinh gián phân liên tục để
tạo nhiều thế hệ tế bào, cung cấp trong quá trình sinh tinh. Một số tinh nguyên bào có
chu kỳ tế bào rất dài, ít phân chia, chỉ đóng vai trò dự trữ. Các tế bào này chỉ phân chia
khi có sự thiếu hụt tinh nguyên bào cho quá trình sinh tinh.
Ở người, phân loại theo hình dạng, có 3 loại tinh nguyên bào:
Loại A đậm màu: đóng vai trò dự trữ, loại này sẽ gián phân tạo thành loại tinh
nguyên bào A nhạt khi có sự thiếu hụt

Loại A nhạt màu: gián phân liên tục để tạo tinh nguyên bào loại B
Loại B: gián phân liên tục để tạo tinh bào I có kích thước lớn hơn tinh nguyên
bào, nhân trở nên nhuộm màu đậm hơn do các nhiễm sắc thể co ngắn và dày hơn
[Silber, 1999]
Luận văn tốt nghiệp
9
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm

Sự gián phân liên tục của các tinh nguyên bào đảm bảo nguồn cung cấp cho quá
trình sinh tinh diễn ra liên tục trong suốt đời sống nam giới. Các yếu tố ảnh hưởng lên
quá trình này sẽ làm giảm đáng kể số lượng tinh trùng và tác động lâu dài lên quá trình
sinh tinh. Ở người số lượng tinh trùng được sinh ra phụ thuộc vào
- Số lượng tinh nguyên bào dự trữ (loại A đậm)
- Số lần gián phân từ giai đoạn A đậm đến giai đoạn tinh bào I. Con số này
thường cố định tùy loài.
- Cường độ phân chia của các tinh nguyên bào cũng như của các giai đoạn sau
của quá trình sinh tinh. [ Silber, 1999 ]
** Tinh bào I
Tinh bào I thực hiện phân chia giảm nhiễm lần thứ nhất để cho hai tinh bào II với
23 nhiễm sắc thể. Tinh bào II nhanh chóng phân chia giảm nhiễm lần hai để tạo thành
hai
Luận văn tốt nghiệp
1
7
6
5
4
3
2
10

Tinh nguyên bào A nhạt
Tinh nguyên bào B
Tinh nguyên bào A đậm
Giai đoạn sớm của tinh trùng
Tinh tử
Tinh bào I
Tế bào Sertoli
Hình 5: Các loại tế bào dòng tinh ở lớp biểu mô tinh [David H. Cormack]
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
tinh tử và được đẩy dần vào lòng ống. Tinh tử không phân chia mà tiến hành hàng loạt
các quá trình biến đổi khác nhau để tạo thành tinh trùng. Quá trình biệt hoá từ tinh tử trở
thành tinh trùng gồm bốn giai đoạn: giai đoạn bộ golgi, giai đoạn tạo mũ, giai đoạn thể
cực đầu và giai đoạn chín
- Giai đoạn bộ golgi: tinh tử có kích thước nhỏ hơn các tinh bào (khoảng 7 – 8
micron). Trong bào tương có bộ golgi phát triển, ti thể, ribosom tự do, một đôi trung tử
và một ít lưới nội bào không hạt. Những hạt nhỏ thể cực đầu tích luỹ trong bộ golgi và
sau đó nhập lại để hình thành một hạt cực đầu duy nhất nằm trong túi cực đầu có màng
bọc. Trung tử di chuyển về phía đối diện với thể cực đầu đang hình thành.
- Giai đoạn tạo mũ: túi cực đầu cùng với hạt cực đầu bên trong phát triển và phủ
lên nữa trước nhân của tinh tử để tạo thành mũ cực đầu, hay thể cực đầu (acrosom). nhân
trở nên kết đặc lại, trung tử phát triển để tạo thành đuôi tinh trùng sau này. Ti thể tập
trung quanh đoạn đầu của đuôi hình thành nên lò xo ti thể
- Giai đoạn thể cực đầu: thể cực đầu phát triển tạo thành một cấu tạo nằm trên
nhân, phía đầu của tinh trùng. Trong thể cực đầu có chứa nhiều enzim thuỷ phân như:
Hyaluronidaz, neuraminidaz, phosphataz acid, proteaz có hoạt tính như trypsin. Vì vậy
thể cực đầu đóng vai trò như một lysosom đặc biệt mà enzim của chúng có tác dụng tách
rời tế bào của vòng tia tiêu huỷ màng trong suốt bao quanh trứng trong quá trình thụ tinh
(phản ứng thể cực đầu). Đuôi hình thành và có cấu tạo điển hình giúp tinh trùng chuyển
động về phía trước
Luận văn tốt nghiệp

11
Nhân Bao tâm
Tiền tinh
trùng
(I)
Nhân
Tiền tinh trùng
Túi cực
đầu
I
II
III
IV V
VI
Tinh trùng
Đuôi
Đầu Cổ Đoạn
giữa
Đoạn chính
Đoạn cuối
Hình 6: Sơ đồ biệt hoá tinh tử thành tinh trùng và cấu tạo của tinh trùng
[Kiệt, 1994]
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
- Giai đoạn chín: nhân kéo dài, cô đặc hơn, bào tương dư thừa được tách khỏi tế
bào và được thực bào bởi các tế bào Sertoli. Tinh trùng được giải phóng vào lòng ống
sinh tinh.
Sự chuyển động của tinh trùng là kết quả của quá trình tương tác giữa các siêu
ống, ATP và dynein. Trong những trường hợp dynein thiếu hụt (hội chứng kartagener)
tinh trùng mất khả năng chuyển động, gây ra tình trạng bất thụ. hội chứng này thường
kèm với viêm hô hấp mãn, do các lông chuyển của tế bào trụ có lông chuyển biểu mô hô

hấp cũng bất động. Năng lượng đảm bảo cho sự chuyển động của tinh trùng là những
chất carbohydrate các tuyến phụ thuộc đường sinh dục nam chế tiết ra, trong đó chủ yếu
là đường fructose.
Theo nhiều tác giả thì trong quá trình phân chia từ tinh nguyên bào đến tinh tử,
các tế bào cùng thế hệ luôn luôn còn còn một cầu bào tương nối với nhau. Cầu này sẻ
mất đi khi tinh tử loại bỏ các mảnh bào tương thừa. Các cầu bào tương này đóng vai trò
quan trọng trong việc trao đổi thông tin từ tế bào này sang tế bào khác, cho phép quá
trình phân chia và biệt hoá xảy ra đồng thời với nhau. [Kiệt, 1994 ]
** Tế bào Sertoli
Là những tế bào lớn, hình tháp kéo dài, có đáy tựa trên màng đáy và cực ngọn
hướng vào lòng ống sinh tinh. Các tế bào Sertoli không phân chia và chỉ gồm 1 loại tế
bào. Tế bào Sertoli nằm giữa các tế bào sinh tinh và trải dài từ màng đáy vào đến lòng
ống sinh tinh [Mortimer, 1994]. Tế bào Sertoli có những nhánh bào tương bên ôm lấy
các tế bào dòng tinh. Trong bào tương có nhiều lưới nội bào không hạt, một ít lưới nội
bào hạt, bộ golgi phát triển. Ở vùng đáy tế bào có những thể liên kết giữa hai tế bào
Sertoli gần nhau. Các tế bào Sertoli còn liên kết với nhau bởi liên kết khe.
Sự liên kết giữa các tế bào Sertoli chia biểu mô sinh tinh thành 2 phần: phần nền
và phần ống. Phần nền gồm các tinh nguyên bào và tinh bào non. Phần ống bao gồm các
tinh bào và tinh tử. Sự phân cách này tạo điều kiện cho các tinh nguyên bào gián phân và
biệt hóa.
Các tinh bào non từ phần nền, được sinh ra từ lần gián phân cuối cùng của các tinh
nguyên bào, phải vượt qua phức hợp liên kết giữa các tế bào Sertoli để đi vào phần ống.
Luận văn tốt nghiệp
12
. Tinh trùng
. Tinh trùng
. Nguyên phân
. Màng nền
. Nguyên bào sợi
6. Tế bào kẽ Leydig

7. Tế bào cơ
8. Tinh nguyên bào
9. Tinh bào I
10. Tinh bào II
11. Tinh tử
Hình 7: Thành ống sinh tinh[Hoa,2003]
8
10
9
11
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
** Chức năng của tế bào Sertoli
Các tế bào Sertoli và phức hợp liên kết giữa chúng tạo nên hàng rào máu-tinh
hoàn. Hàng rào máu - tinh hoàn đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tinh. Các
chức năng của phần này bao gồm:
- Nâng đỡ các tế bào sinh tinh
- Vận chuyển chất chuyển hoá, và chất dinh dưỡng từ ngoài vào cung cấp cho các
tế bào sinh tinh
- Kiểm soát và hạn chế sự di chuyển của một số phân tử ngoại bào đi vào biểu mô
sinh tinh
- Thực bào các tế bào sinh tinh bị chết, thoái hóa và các tế bào chất bị thải hồi
trong quá trình biệt hóa của tinh tử.
Luận văn tốt nghiệp
13
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
- Tiết ABP, giúp cho sự vận chuyển của nội tiết tố, một loại protein kết với nội
tiết tố nam. Protein này giúp vận chuyển chủ động testosteron từ bên ngoài vào bên trong
ống sinh tinh và tạo nồng độ testosteron rất cao bên trong biểu mô sinh tinh
- Tiết các chất điều hoà quá trình gián phân và giảm phân của các tế bào sinh tinh,
điều hoà hoạt động chế tiết của tế bào Leydig và chế tiết gonadotropins của tuyến yên

- Điều hoà sự di chuyển của các tế bào sinh tinh trong lớp biểu mô sinh tinh và sự
phóng thích tinh trùng vào lòng ống sinh tinh.
- Tế bào Sertoli tạo thành hàng rào máu – tinh hoàn: các tế bào sinh tinh sau giảm
phân, chỉ xuất hiện trong tinh hoàn sau khi dậy thì, có thể có những kháng nguyên đặc
hiệu “lạ” đối với hệ miễn dịch của cơ thể. Nếu hàng rào máu-tinh hoàn bị phá vỡ do chấn
thương hay do phẫu thuật, tinh trùng sẽ tiếp xúc với máu, có thể kích hoạt tạo kháng thể
kháng tinh trùng trong máu, có thể dẫn đến vô sinh [Mortimer, 1994]. Hàng rào máu –
tinh hoàn ngăn không cho các immunoglobulin lọt vào bên trong ống sinh tinh, chống
tương tác giữa tế bào dòng tinh đang phát triển với hệ miễn dịch, phòng ngừa phản ứng
tự miễn. Điều đó có thể giải thích tại sao ở người suy yếu khả năng thụ thai lại có hiệu
giá kháng thể tinh trùng cao trong huyết thanh [Kiệt, 1994 ]
- Chế tiết chất dịch lỏng để tạo thuận lợi cho sự di chuyển của tinh trùng về phía
các ống dẫn tinh, chế tiết protein liên kết với androgen, chế tiết loại peptit gọi là inhibin
làm ức chế tổng hợp và giải phóng FSH trong thuỳ trước tuyến yên. Ngoài ra, tế bào
Sertoli còn có thể làm biến đổi testosterone thành estradiol.
** Mô kẽ tinh hoàn
Mô kẽ là mô liên kết nằm xung quanh các ống sinh tinh, rất giàu mạch máu, mạch
bạch huyết, thần kinh. Trong mô kẽ có thể quan sát thấy nguyên bào sợi, masto bào, tế
bào kẽ, hay còn gọi là tế bào Leydig. Tế bào Leydig là những tế bào hình cầu, đa diện,
có kích thước khá lớn (15-20 micron). Trong bào tương tế bào Leydig có nhiều hạt lipit
nhỏ, những hạt protein dưới dạng tinh thể Reinke. Tế bào Leydig tổng hợp và chế tiết
hormone sinh dục nam testosteron có tác dụng duy trì quá trình tạo tinh và phát triển các
đặc điểm nam tính phụ. Cholesteron có thể được tích luỹ trong các hạt lipit hoặc được
tổng hợp mới từ acetate. Nhờ có các enzim trong ti thể, cholesteron sẽ biến thành
pregnenolon, rồi qua một số phản ứng để trở thành progesterone, cuối cùng trở thành
testosterone.
Luận văn tốt nghiệp
14
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
U tế bào kẽ có thể gây phát dục sớm ở nam [Kiệt, 1994]

PHẦN III. PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN
1. PHƯƠNG TIỆN VÀ HOÁ CHẤT:
1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài:
Luận văn tốt nghiệp
15
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
Đề tài được thực hiện trong phòng thí nghiệm sinh lý động vật - Bộ môn Sinh-
Khoa Sư phạm - Đại học Cần Thơ.
Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 10/2005đến tháng 05/ 2006
1.2. Phương tiện và hoá chất:
Để thực hiện được tiêu bản hiển vi cố định tinh hoàn chuột đồng trải qua nhiều
khâu phức tạp, cần các phương tiện và hoá chất nhất định như sau:
1.2.1 Phương tiện:
STT TÊN PHƯƠNG TIỆN SỐ LƯỢNG
1 Kính hiển vi 1cái
2 Tửu tinh kế 1 cái
3 Cân kỹ thuật 1 cái
4 Tủ sấy 1 cái
5 Đồng hồ bấm giây 1 cái
6 Máy cắt mẫu 1 cái
7 Khay dựng lame 1 cái
8 Lame 4 hộp
9 Lamelle 3 hộp
10 Chai màu đựng hoá chất 5 chai
11 Hủ yaourt 20 cái
12 Đủa thuỷ tinh 1 cây
13 Cốc đựng Baume Canada 1 chai
14 Khay mổ 1 cái
15 Kim mũi giáo 1 cây
16 Kim phá tuỷ 1 cây

17 Kéo 1 cây
18 Kẹp 1 cây
19 Ống hút nhựa 2 cây
20 Pipete 5 ml 1 cây
21 Bercher 200ml 1 cái
22 Bercher 500ml 1 cái
23 Bercher 1000ml 1 cái
24 Đĩa đồng hồ 1 cái
25 Ống đong 500ml 1 cái
26 Phểu thuỷ tinh 1 cái
27 Thùng nhựa 1 lít 10 cái
28 Hộp đựng mẫu 1 cái
29 Đèn cồn 1 cái
30 Hộp quẹt 1 cái
31 Tủ lạnh 1 cái
32 Giấy thấm 3 hộp
Luận văn tốt nghiệp
16
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
33 Giấy vệ sinh 5 cuồn
34 Lưỡi lam Gillete 4 hộp
35 chuột 20 con
36 Băng keo trong 1 cuồn
37 Băng keo giấy 1 cuồn
38 Film ảnh 1 cuồn
39 Ấm điện 1 cái
40 Hột gà 1 trứng
41 Giấy lịch 1 tấm
42 Khối gỗ 5 cái
43 Dao thái lan 1 cây

44 Dao mổ 1 cây
45 Đèn 75W 8 cái
1.2.2. Hoá chất
STT TÊN HOÁ CHẤT SỐ LƯỢNG
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Nước cất
Cồn tuyệt đối
N-Butanol
Acid Sunfuric đậm đặc
Xylene
Baume Canada
Hematoxyline
Eosin Y
Acid picric
Acid Acetic
Formaldehyd
Parafin

Phenol
Bicromate Kali
10 lít
12 lít
1 lít
250ml
5 lít
15g
3g
3g
30g
250ml
0,5 lít
500g
100ml
50g
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.1. Thực hiện mẫu đại thể (mẫu ngâm):
Luận văn tốt nghiệp
17
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
Thao tác thực hiện mẫu đại thể dịch hoàn chuột đồng khá đơn giản, gồm các bước
sau:
- Chuột sống sau khi bị dìm chết trong nước, tiến hành mổ ngay. Thao tác mổ
được thực hiện ở mặt bụng của chuột
Thực hiện mẫu ngâm dịch hoàn chuột đồng bằng cách giải phẩu chuột, sau đó gở
các đường ống dẫn tinh nối từ tinh hoàn ra dương hành của chuột. Sau khi giải phẫu,
trình bày nội quan, ngâm vào dung dịch formol 10%, sau đó đổi dung dịch khi thấy dung
dịch không còn trong (khoảng 2 tháng)

Hình 8: Sơ đồ các đường mổ trong giải phẩu chuột
- Quan sát hình dạng ngoài, vị trí, của dịch hoàn chuột khi mổ.
2.2 Thực hiện mẫu hiển vi:
Quá trình nghiên cứu cấu trúc dịch hoàn chuột đồng thông qua phương pháp thực
hiện tiêu bản gồm những bước có tính chất nguyên tắc: lấy mẫu, cố định, khử nước, tẩm
parafin lỏng, đúc khuôn, cắt mẫu, nhuộm mẫu, khử nước, làm trong và dán mẫu cố định
Luận văn tốt nghiệp
18
Giai đoạn cắt da Giai đoạn cắt thịt
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
trong Baume Canada. Tất cả phải được thực hiện đúng trình tự, thao tác kỹ thuật và thời
gian xử lý thích hợp. Nếu một trong các khâu không được thực hiện một cách kỹ lưỡng
thì mẫu lame về sau sẽ không đạt được yêu cầu.
2.2.1. Lấy mẫu:
Nguyên tắc lấy mẫu là mẫu phải tươi, nguyên, vì dịch hoàn chuột tương đối mềm
khi còn tươi, do đó trong quá trình giải phẩu chuột phải cẩn thận tránh làm dập mẫu .
Sau khi mổ xoang bụng và cắt lớp da bao quanh hai tinh hoàn, làm lộ hai tinh
hoàn thì cẩn thận dùng kéo luồn qua cắt bỏ các mạch máu nối với tinh hoàn cũng như cắt
bỏ các bao liên kết mỏng bao lấy tinh hoàn và các đường ống dẫn tinh. Trong thao tác
nên nhẹ nhàng tránh bóp mạnh, nếu không sẽ làm biến dạng cấu trúc mô bên trong
Dùng tay tháo gỡ các bao liên kết bám trên tinh hoàn cho thật sạch, bỏ ngay vào
dung dịch cố định Bouin. (Nếu thao tác mổ lâu thì vùi tinh hoàn trở lại dịch mô của
chuột một lúc rồi đem cho vào dung dịch cố định).

Hình 9: Tinh hoàn chuột tại vị trí
Hình 9: Tinh hoàn chuột tại vị trí
2.2.2. Cố định:

Cố định trong dung dịch Bouin (công thức pha xem ở phần phụ lục) trong 24 giờ.
Trong lúc cố định nên có những động tác lắc hoặc khuấy nhẹ để trộn đều dung dịch cũng
Luận văn tốt nghiệp
19
Tinh
hoàn
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
như thay đổi vị trí của mẫu nhằm tránh hiện tượng một mặt mẫu luôn nằm tiếp xúc với
đáy lọ sẽ không được tiếp xúc tốt với dung dịch cố định (về sau mặt này của mẫu sẽ bắt
màu không đều so với những vùng khác).
Thể tích dung dịch cố định phải gấp 30-60 lần thể tích mẫu khi đó thì dung địch
cố định sẽ dễ dàng thấm sâu vào cấu trúc mô, mô cố định sẽ tốt hơn, đồng thời dịch mô
từ mẫu thoát ra không làm loãng dung dịch cố định
2.2.3. Khử nước:
Vớt mẫu trong dung dịch cố định ra rửa dưới vòi nước chảy khoảng 2-3 giờ để
giảm bớt màu vàng của dung dịch Bouin: dùng một chai nước khoáng bị đục thủng đáy,
cho nước vào đầy chai sau đó cho tinh hoàn đã cố định vào, tiếp tục cho nước chảy
khoảng 2 – 3 giờ.
Tiếp theo cho rửa trong lọ nước cất (5 phút x 2 lần) rồi lần lượt chuyển qua các lọ
cồn với độ cồn tăng dần 50
0
, 70
0
, 90
0
, 99
0
5 nhằm khử hết nước có trong mẫu mà không
làm phá huỷ đột ngột các cấu trúc mô. Cụ thể được thực hiện như sau:
- Cồn 50

0
: 2 giờ/ lần x 2 lần
- Cồn 70
0
: 4 giờ/ lần x 2 lần
- Cồn 90
0
: 4 giờ/ lần x 2 lần
- Cồn 99
0
5: 4 giờ/ lần x 2 lần
- n-Butanol : 2 giờ/ lần x 2 lần
2.2.4. Tẩm Parafin:
- Chuyển mẫu từ n-Butanol sang lọ Xylene : 3 giờ/ lần x 2 lần
- Chuyển mẫu vào xylene:parafin lỏng với tỷ lệ (1:1) để trong tủ sấy ở nhiệt độ
60
0
C trong khoảng 12 giờ.
- Chuyển mẫu qua parafin nguyên chất lỏng trong tủ sấy ở nhiệt độ 60
0C
trong 36
giờ. Trộn mẫu thường xuyên để mẫu ngấm đều parafin.
2.2.5. Đúc khuôn:
- Chuẩn bị: dùng giấy lịch (mặt không màu) xếp thành các khuôn có kích thước
3cm x 1.5cm x 1.5cm như hình vẽ:
Luận văn tốt nghiệp
20
4.5cm
1.5cm
9cm

1.5cm
3cm
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm

Hình 10: Khuôn giấy đúc mẫu.
- Chuẩn bị sẵn sàng các hủ đựng sáp nguyên chất ở thể lỏng (khoảng 60
0
C trong
tủ sấy). Đèn cồn, kim mũi giáo và kẹp gấp mẫu.
- Đúc khuôn: đặt khuôn vào nơi bằng phẳng, rót parafin lỏng nguyên chất vào
khuôn, rót cho đầy khuôn. Nhanh chóng dùng kẹp gắp mẫu từ trong parafin tẩm ra và
đặt vào lớp parafin vừa rót. Dùng kim mũi giáo đã hơ nóng trên lửa đèn cồn làm chảy
parafin xung quanh mẫu để chỉnh cho mẫu ở đúng vị trí trong khuôn, Sau khi đã rót
parafin vào mà thấy parafin còn đục và có bọt khí thì dùng kim mũi giáo hơ nóng cho
parafin trong và hết bọt. Sau đó để khuôn đúc yên tại vị trí trong 24 giờ ở nhiệt độ
phòng. Trữ trong tủ lạnh 15
0C
.
2.2.6. Cắt mẫu:
- Chuẩn bị:
* Vật liệu: + Máy cắt mẫu
+ Dao cắt mẫu
+ Dao thái lan
+ Kim mũi giáo
+ Kẹp
+ Giấy
+ Đèn cồn
+ Khối gỗ
* Lấy khuôn parafin có chứa mẫu ra, tháo khuôn giấy ra rồi gọt mẫu đúc Parafin
thành khối hình thang cân.

* Hơ nóng khối gỗ trên ngọn đèn cồn, đồng thời hơ nhanh khối mẫu hình thang
cân rồi dán lên khối gỗ.
Luận văn tốt nghiệp
21
Mẫu
Parafin
Mẫu Khối gỗ Khối gỗ có gắn mẫu
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
Hình 11: Dạng khối mẫu đã gọt và gắn vào khối gỗ
- Tiến hành:
* Thận trọng từng động tác một, tránh gió, thở mạnh sẽ làm bay đi những mảnh
cắt hoặc mảnh cắt sẽ bị dơ. Máy cắt để gần nguồn lạnh. Tốt nhất là nên cắt vào lúc sáng
sớm hoặc cắt vào buổi tối.
Hình 12: Bố trí máy cắt mẫu.
* Gắn mẫu sao cho ngay ngắn, thẳng góc với lưỡi dao cắt.
* Gắn dao vào bàn để dao, khoá chặt cần cố định dao.
* Điều chỉnh cho lưỡi dao nghiêng một góc khoảng 15
0
, khóa chặt cần điều chỉnh
độ nghiêng của dao.
* Vặn ốc điều chỉnh độ dày lát cắt ở 8µm.
* Di chuyển lưỡi dao tiến lại gần vị trí khối mẫu.
* Mở khoá tay quay và bắt đầu quay với vận tốc vừa phải để lưỡi dao bắt đầu cắt
khối mẫu. Ban đầu cắt với độ dày 20µm. Khi cắt đến mẫu thì điều chỉnh độ dày còn
8µm. Khi đó các lát cắt sẽ dính nhau thành băng, hứng băng mẫu trên một tờ giấy sạch
Luận văn tốt nghiệp
22
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
màu trắng và bảo quản trong hộp giấy ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh (tránh nguồn
nóng vì nguồn nóng sẽ làm nóng chảy Parafin, làm cả băng mẫu dính vào tờ giấy trắng,

mẫu sẽ hư, không thể tải từng lát cắt lên lame)
Hình 13: Các lát cắt kết thành băng.
2.2.7. Tải mẫu lên lame:
- Chuẩn bị:
* Làm sạch lame bằng cách ngâm trong dung dịch Bicromate Kali (công thức
pha có ở phần phụ lục) hoặc ngâm trong dung dịch HCl trong 24 giờ, lấy ra rửa bằng
nước sạch, xà phòng rồi rửa lại thật sạch bằng nước máy rồi đem sấy khô. Lưu ý khi sấy
ta nên đặt lame đứng dựa vào thành của khay mổ để nước trút sạch xuống dưới và không
để lại những vệt trên lame.
* Khi lame đã được sấy khô xong thì đem ra để nguội, dùng 1 lamelle kéo dàn
một lớp mỏng dung dịch Albumin Glycerin (công thức pha ở phần phụ lục) lên lame.
Sau đó đặt lame trong tủ sấy ở nhiệt độ 60
0
đến khi Albumin khô (khoảng 24 giờ)
Luận văn tốt nghiệp
23
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
* Khi lame đã khô lại, nhỏ một giọt nước ấm lên lame. Chọn lát cắt tốt trong dãy
băng mẫu, cứ cách 3 mẫu thì chọn một mẫu, dùng kim mũi giáo hoặc lưỡi lame cắt rời
mẫu ra khỏi băng và dùng kim mũi giáo có dính một ít nước để lấy lát cắt lên, sau đó
chuyển lát cắt lên giọt nước ấm. Khi chuyển cần nhẹ nhàng, tải xuống từ từ đề tránh bọt
khí.
* Cho lame đã tải xong mẫu để dưới đèn tròn 75w, khoảng 45-50
0
C cho đến khi
giọt nước ở lame khô đi, mẫu căng ra và được dán vào lớp Albumin trên lame.
Mẫu chọn Mẫu chọn Mẫu chọn Mẫu chọn
Hình 14: Chọn các lát cắt trên băng mẫu và tải lát cắt lên lame
2.2.8. Nhuộm mẫu:
Áp dụng phương pháp nhuộm kép 2 màu tương phản là Hematoxyline và Eosin Y

(Theo Handbook of Basic Microtechnique), các mẫu đã dán xong cần được nhuộm ngay
trong vòng 24 giờ để tránh bụi và những hư hại do va chạm hay các tác nhân khác.
Giai đoạn nhuộm gồm nhiều khâu phức tạp. Trong đó, cần có nhiều dụng cụ và
hoá chất cần thiết.
- Chuẩn bị:
+ 5 lọ xylen.
Luận văn tốt nghiệp
24
GVHD:Th.S Dương Thị Huỳnh Hoa SVTH: Trần Thanh Liêm
+ Cồn 50
0
, 70
0
, 90
0
, 99
0
5 mỗi thứ 2 lọ.
+ 1 lọ cồn 80
0
+ 4 lọ nước cất
+ 1 lọ Hematoxyline
+ 1 lọ Eosin Y
+ 1 Thau nước máy.
+ 1 đèn cồn
+ 1 hộp quẹt
+ Giấy vệ sinh
+ Giấy thấm
+ Đồng hồ bấm giây
+ 1 kim mũi giáo

+ Kính hiển vi
+ Lame
+ Lamelle
+ Kẹp
+ Khay đựng mẫu
+ Lọ Baume Canada
- Tiến hành:
+ Mẫu sau khi được tải lên lame nên được xem ngay dưới kính hiển vi, nếu mẫu
có lỗi về kỹ thuật thì ta nên tải mẫu khác ngay.
+ Mẫu tốt đã dính lên bề mặt lame có Albumin được hơ nhanh qua ngọn lửa đèn
cồn cho chảy Parafin ra rồi cho vào lọ xylen I (khoảng 5-7 phút), nâng lame lên xuống
cho sạch Parafin. Sau đó chuyển sang lọ Xylen II, cũng với thao tác tương tự rồi chuyển
sang lọ xylen III.
+ Tiếp tục chuyển sang các lọ cồn có nồng độ giảm dần:
Cồn 99
0
5 3-5phút
Cồn 90
0
3-5phút
Cồn 70
0
3-5phút
Cồn 50
0
3-5phút
Nước cất 10 phút
Luận văn tốt nghiệp
25