Nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ thuật realtime PCR phát hiện sacbrood virus gây bệnh trên ong mật tại hà nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI




NGUYỄN THỊ THOA


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT
REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS
GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI






LUẬN VĂN THẠC SĨ







HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ THOA


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT
REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS
GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI




CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. PHẠM HỒNG THÁI
TS. NGUYỄN VĂN GIANG



HÀ NỘI – 2013
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ii

LỜI CAM ðOAN


Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và
kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong

bất cứ công trình nào khác.
Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong việc thực hiện luận văn này
ñã ñược cám ơn và thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.
TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Nguyễn Thị Thoa













Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực học hỏi của bản
thân tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô giáo, gia ñình, bạn bè và
ñồng nghiệp.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm
Hồng Thái - Bộ môn Côn trùng - Khoa Nông học - Trường ðại học Nông nghiệp
Hà Nội và TS. Nguyễn Văn Giang - Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Khoa Công nghệ

sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã hết lòng ủng hộ và khích lệ tôi
trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện ñề tài này, ñã dành nhiều thời gian và
công sức chỉ dẫn, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như
thực hiện ñề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hà Viết Cường - Khoa Nông học -
trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và ThS. Trịnh Thị Thủy - Khoa Công nghệ
sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình
nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật và
bộ môn Sinh học phân tử– Khoa Công nghệ sinh học - trường ðại học Nông nghiệp
Hà Nội và tập thể cán bộ nhân viên Ban ñào tạo sau ñại học - Trường ðại học Nông
nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện ñề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp
ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày 10 tháng09 năm 2013
TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Nguyễn Thị Thoa
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN ii
LỜI CẢM ƠN iii
MỤC LỤC iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH ix
DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ðẦU 1
Chương 1 ỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Tầm quan trọng của ngành ong 3
1.1.1 Thế giới 3
1.1.2 Việt Nam 4
1.1.3 Các loài ong ở Việt Nam 5
1.1 Các dịch bệnh chính ñược ghi nhận trên ong mật 6
1.2 Tình hình nghiên cứu về Sacbrood virus 7
1.2.1 Lịch sử phát hiện và tác hại của bệnh virus ấu trùng túi 7
1.2.2 Triệu chứng bệnh ấu trùng túi 8
1.2.3 Cách thức lan truyền của SBV 9
1.2.4 Tác nhân gây bệnh 9
1.3 Các kỹ thuật chẩn ñoán cổ ñiển 11
1.3.1 Kỹ thuật RIA (Radio Immuno Assay) 11
1.3.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 12
1.3.3 RT – PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction) 12
1.4 Kỹ thuật Realtime- PCR 13
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 21
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v

2.1.1 Thời gian 21
2.1.2 ðịa ñiểm 21
2.2 ðối tượng và vật liệu nghiên cứu 21
2.2.1 ðối tượng 21
2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 21
2.3 Nội dung nghiên cứu 21
2.4 Phương pháp nghiên cứu 22
2.4.1 Thu thập mẫu ong 22

2.4.2 Thí nghiệm bảo quản mẫu ong 23
2.4.3 Chẩn ñoán bệnh lâm sàng 23
2.4.4 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu ñã thu thập 24
2.4.5 Xác ñịnh khả năng chẩn ñoán của hai kỹ thuật PCR ñể phát hiện
virus gây bệnh trên ong mật 26
2.5 ðánh giá về ñộ nhạy của phương pháp chẩn ñoán ñể xác ñịnh
nồng ñộ của virus trên ong bệnh 29
2.5.1 Pha loãng mẫu RNA 29
2.5.2 Phản ứng Realtime – PCR 29
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30
3.1 Ảnh hưởng của kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu bệnh lên khả
năng phát hiện 30
3.2 Ảnh hưởng của kỹ thuật tách chiết RNA lên khả năng phát hiện SBV 32
3.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ các mẫu ñã thu thập 32
3.3 Khảo sát tính ñặc hiệu của cặp mồi 32
3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn cặp mồi 32
3.3.2 Thử nghiêm khả năng phát hiện Sacbrood virus trên ong mật tại
Hà Nội 35
3.4 Nghiên cứu, khảo sát khả năng phát hiện của Realtime- PCR 37
3.5 ðánh giá mức ñộ ñặc hiệu của cặp mồi trong kỹ thuật q- PCR 40
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vi

3.6 Xác ñịnh ñộ nhạy của kỹ thuật chẩn ñoán SBV trên ong mật 42
3.6.1 Khả năng chẩn ñoán của hai phương pháp one step RT – PCR và
Realtime – PCR 42
3.6.2 Khả năng phát hiện SBV ở mức ñộ pha loãng mẫu gốc 46
3.6.3 Khảo sát khả năng phát hiện SBV theo thời gian biểu hiện bệnh
tích trên ñàn ong. 50
3.7 Xây dựng quy trình kỹ thuật chẩn ñoán bệnh ấu trùng túi do virus

Sacbrood bằng Realtime – PCR 52
3.7.1 Tách chiết RNA mẫu Ong 52
3.7.2 Tiến hành phản ứng One step Reverse Transcription – PCR (RT
– PCR) 53
3.7.3 Tiến hành phản ứng Realtime – PCR 55
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 56
1 Kết luận 56
2 ðề nghị 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
PHỤ LỤC 60

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CSBV Chinese Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi Trung Quốc)
CP Concentration Point (ðiểm tập trung)
Ct Cycle Threshold (Chu kỳ ngưỡng)
DsRNA Double-stranded RNA (RNA mạch kép)
DWV Deformed Wing Virus ( Virus xoăn cánh ong)
ELISA Enzyme-Linked immunosorbent assay ( Phản ứng ELISA)
EU European Union ( Liên minh Châu Âu)
FAO Food and Agriculture Organization ( Tổ chức Nông lương)
IFA Indirect Fluorescent Antibody ( Kháng thể huỳnh quang gián tiếp)
KBV Kashmir Bee Virus ( Virus Kashmir)
M Marker
MRL Minimum Residue Limits (Dư lượng giới hạn tối thiểu)
ORF Open Reading Frame ( Khung ñọc mở)
OTC Oxytetracycline (Kháng sinh diệt khuẩn Oxytetracycline)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
qRT-PCR
Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi
trùng hợp ñịnh lượng theo thời gian thực)
RT-PCR

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi
trùng hợp phiên mã ngược)
SBV Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi)
SsRNA Single-stranded RNA (RNA mạch ñơn)
Tm Temperature Melting ( Nhiệt ñộ nóng chảy)
TSBV Thai Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi Thái Lan)
UK United Kingdom ( Vương Quốc Anh)
US United States ( Hợp chủng quốc Hoa Kì)
VINAPI
Vietnam National Apiculture Joint Stock Company ( Công ty Cổ
phần Ong Trung ương)

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

3.1 Kiểm tra RT-PCR phát hiện SBV trên các mẫu ấu trùng ong
ñược bảo quản bằng các phương pháp khác nhau 30
3.2 Kết quả tách chiết RNA 32
3.3 Danh sách các cặp mồi sử dụng (Grabensteiner et al., 2001) 33
3.4 Kết quả RT-PCR cho SBV với các cặp mồi SB 1f-2r, SB 14f-15r

và SB11f - SB12r với các mẫu ong mật thu tại 11 huyện trên ñịa
bàn Hà Nội 36
3.5 Chất lượng RNA sau khi tách chiết bằng TRIzol-LS 37
3.6 ðỉnh nhiệt ñộ nóng chảy của 14 mẫu kiểm tra và ñối chứng 39
3.7 Ngưỡng chu kỳ sản phẩm RNA của SVB bắt ñầu nhân bản 39
3.8 Kết quả chẩn ñoán của hai phương pháp RT – PCRvà Realtime - PCR 43
3.9 Kết quả chẩn ñoán của Realtime - PCR 45
3.10 Kết quả Realtime – PCR của các mẫu pha loãng 46
3.11 Giá trị bước nhảy của ngưỡng chu kỳ khi pha loãng nông ñộ gốc 48
3.12 Kết quả Realtime – PCR của mẫu M50 pha loãng 48
3.13 Số lượng bản sao DNA/ µl và chu kỳ khuếch ñại (Yoo et al., 2012) 50
3.14 Giá trị ngưỡng chu kỳ của phản ứng Realtime- PCR ñối với các
ấu trùng ở ñàn ong thí nghiệm 51

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ix

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Biểu ñồ khuếch ñại vẽ lên các ñường biểu diễn khuếch ñại của
các mẫu thử và mẫu chuẩn 16
1.2 Biểu ñồ chuẩn ñường biểu diễn chuẩn mối quan hệ giữa số
lượng bản DNA ñích và chu kỳ ngưỡng tương ứng 17
2.1 Bánh tổ ong nội có biểu hiện bệnh ATT 22
2.2 Bánh tổ ong ngoại có biểu hiện của bệnh ATT 22
2.3 ðuôi ấu trùng hình túi nước 22
2.4 Ấu trùng có biểu hiện nhọn ñầu 22
2.5 Mẫu ong 24

2.6 Mẫu ấu trùng ñược chuẩn bị ñể tách chiết RNA 24
2.7 Dụng cụ chuẩn bị cho tách chiết RNA 25
2.8 Tách chiết RNA 25
2.9 Vị trí cặp mồi SB1f – SB2r trên bộ gen của virus SBV
(Grabensteiner et al., 2001) 26
3.1 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu
RNA chiết từ mẫu ấu trùng ong bệnh ñược bảo quản trong
ethanol 70 % (nhiệt ñộ phòng) 30
3.2 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu
RNA chiết ngay lập tức từ mẫu ấu trùng ong bệnh sau khi thu thập từ
ñàn bệnh 31
3.3 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu
RNA chiết từ mẫu ấu trùng ong thu thập từ ñàn bệnh và bảo quản lạnh 31
3.4 Kết quả kiểm tra tính ñặc hiệu của 5 cặp mồi với mẫu RNA tách
từ ấu trùng biểu hiện dương tính. 34
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
x

3.5 Kết quả RT-PCR cho SBV với cặp mồi SB1f - SBr2 với các mẫu
ong mật thu tại 11 huyện trên ñịa bàn Hà Nội 35
3.6 Mối tương quan giữa hàm lượng và ñộ tinh sạch của RNA tổng
số của 14 mẫu ong ñược tách chiết. 38
3.7 ðỉnh nóng chảy của 14 mẫu khảo sát và mẫu ñối chứng âm. 38
3.8 ðường khuếch ñại của 14 mẫu thí nghiệm và ñối chứng âm 40
3.9 Tỉ lệ chẩn ñoán của hai phương pháp RT –
PCR và
Realtime – PCR 44
3.10 ðường biểu diễn khuếch ñại của các mẫu pha loãng 47
3.11 Mối quan hệ tuyến tính thuận giữa các mức pha loãng nồng ñộ
với giá trị ngưỡng chu kỳ 47

3.12 ðường biểu diễn khuếch ñại của mẫu M50 pha loãng 49
3.13 ðường biểu diễn ñỉnh nóng chảy của mẫu M50 pha loãng 49
3.14 Biểu hiện bệnh tích của ấu trùng sau khi bị nhiễm SBV 50
3.15 Triệu chứng bệnh tích của virus ấu trùng túi 51
3.16 ðường cong khuếch ñại sản phẩm RNA virus 52

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1

MỞ ðẦU

1. Tính cấp thiết của ñề tài
Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt ñới gió mùa, có nguồn hoa và nguồn
mật phong phú rất phù hợp cho phát triển nghề nuôi ong mật. Do ñó, nghề nuôi ong
lấy mật từ lâu ñã và ñang ñóng một vai trò quan trọng bởi nó không những mang lại
lợi nhuận kinh tế to lớn cho người nuôi ong mà còn cung cấp nhiều những ích lợi
trong xã hội cũng như với môi trường.
Tuy nhiên ong mật rất hay bị tấn công bởi một số loại bệnh do vi khuẩn và
nguy hiểm hơn cả là bệnh do virus, bởi vì bệnh do virus không thể ñiều trị bằng
thuốc kháng sinh ñược. Trong các bệnh virus trên ong thì bệnh ấu trùng túi là một
trong những bệnh virus nghiêm trọng nhất trên ong mật hiện nay. Virus này ñều
thuộc chi iflavirus, cùng có mặt ở khắp các lục ñịa và các nơi nuôi ong và gây thiệt
hại rất lớn cho người nuôi ong và ngành nuôi ong.
Sacbrood virus (SBV) gây bệnh chết ấu trùng ong và là 1 virus quan trọng
bậc nhất trên ong khắp thế giới kể cả Việt Nam. SBV nhiễm cả ong Apis mellifera
và Apis cerana (Phùng Hữu Chính 2008, Thái et al., 2011). Ấu trùng túi do
sacbrood virus gây ra, bệnh làm chết ấu trùng chủ yếu ở giai ñoạn sau vít nắp và
tiền nhộng. Khả năng lây nhiễm của virus là rất lớn, một ấu trùng bị chết có thể lây
nhiễm cho 3000 ấu trùng lành.
Mặt khác, việc xác ñịnh loại virus gây bệnh trên ong mật từ trước ñến này

vẫn dựa trên những phương pháp truyền thống như: sử dụng kính hiển vi, RIA,
ELISA…Tuy các phương pháp chẩn ñoán cổ ñiển trên có ñộ nhạy không cao và
khó chẩn ñoán ở giai ñoạn bệnh còn tiềm ẩn. Gần ñây, các nhà khoa học ñang phát
triển một phương pháp chẩn ñoán mới không những có khả năng ñịnh tính (phát
hiện sự tồn tại của virus) mà còn có khả năng ñịnh lượng (biết ñược chính xác nồng
ñộ của virus gây bệnh) ñó chính là kỹ thuật Realtime – PCR. Realtime - PCR là một
cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase của Taq DNA
polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991. Trong phản ứng real-time
PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
2

vào DNA mạch ñôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ) hoặc tác nhân
dùng ñánh dấu mẫu dò ñặc hiệu (FAM, HEX ).
Việc phát triển thêm những phương pháp chẩn ñoán hiện ñại, chính xác ñể
phát hiện sớm những virus tiềm tàng ở những giai ñoạn ñầu là hết sức cần thiết giúp
những người nuôi ong hạn chế ñược sự thất thoát về kinh tế cũng như tình trạng dư
thừa kháng sinh trong mật. Chính vì lý do ñó mà chúng tôi quyết ñịnh nghiên cứu
ñề tài: “Nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ thuật Realtime-PCR phát hiện
Sacbrood virus gây bệnh trên ong mật tại Hà Nội” làm tiền ñề cho việc chẩn ñoán,
ñề xuất các biện pháp phòng chống hiệu quả.
2. Mục ñích, yêu cầu
2.1. Mục ñích
Tìm ra ñộ nhạy, tính ñặc hiệu tối ưu và mối quan hệ giữa nồng ñộ virus với
sự biểu hiện bệnh tích ñể từ ñó xây dựng ñược kĩ thuật chẩn ñoán sớm.
2.2. Yêu cầu
- Xác ñịnh ñược cặp mồi ñặc hiệu.
- Xác ñịnh ñộ nhạy của kỹ thuật chẩn ñoán.
- Xây dựng ñược quy trình kỹ thuật chẩn ñoán.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

3.1. Ý nghĩa khoa học
Bước ñầu ứng dụng kỹ thuật Realtime- PCR ñể phát hiện và ñịnh lượng SBV
phục vụ cho chẩn ñoán và theo dõi ñiều trị. ðộ ñặc hiệu của Realtime – PCR cao
hơn rất nhiều so với PCR cổ ñiển, cho ñộ chính xác cao và kết quả ñáng tin cậy.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Có thể phát hiện bệnh khi còn ở giai ñoạn tiềm ẩn, không mất thời gian ñiện
di ñể ñọc kết quả và phản ứng diễn ra trong hệ thống kín nên tránh ñược khả năng
ngoại nhiễm. Chính vì vậy mà rất cần thiết phát triển phương pháp này rộng rãi
trong lĩnh vực nông nghiệp như chẩn ñoán bệnh cây, bệnh côn trùng…

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tầm quan trọng của ngành ong
1.1.1. Thế giới
Ong mật có thể bị tấn công bởi rất nhiều yếu tố. Một vài yếu tố ñóng vai trò
như vector truyền bệnh cho ong mật. Bệnh có thể lây lan rộng rãi do sự nhập cư hay
do những người buôn bán kinh doanh ñàn ong và các thiết bị dùng trong nghề nuôi
ong. Ngày nay, do sự tăng trưởng phát triển về kinh tế mà các ñàn ong có thể ñược
vận chuyển ñến những nơi rất xa thậm chí là từ châu lục này ñến châu lục khác, do
ñó mà bệnh càng có cơ hội lây lan rộng hơn (FAO, 2006).
Virus gây bệnh trên ong mật (Apis mellifera) ñược nghiên cứu mạnh mẽ
trong suốt giai ñoạn cuối thập kỷ. Nhìn chung thì virus trên ong mật thường lây lan
rộng và hầu hết chúng không có biểu hiện bệnh tích rõ ràng (Allen and Ball, 1996;
Ball and Allen, 1991; Ball and Balley, 1997).
Bệnh Sacbrood trên ong ngoại (Apis mellifera) ñược phát hiện từ năm 1964
(Bailey et al., 1964). Tuy nhiên, ở A. cerana virus này ñược báo cáo lần ñầu tiên
vào năm 1976 ở Thailand. Do sự khác biệt về tính chất lý hóa và huyết thanh của

virus mà virus có tên gọi là Thai Sacbrood Virus (TSBV) ñể phân biệt với virus
Sacbrood của A. mellifera (Bailey et al., 1982). Sự tồn tại của TSBV trong các ñàn
ong A. cerana ở miền Bắc ấn ñộ ñược nghiên cứu bằng kính hiển vi ñiện tử và
phương pháp huyết học trong phòng thí nghiệm (Rana et al., 1986, 1987).
Chinese Sacbrood Virus (CSBV) là tác nhân gây bệnh của bệnh sacbrood
Trung Quốc, ñặt ra một mối ñe dọa nghiêm trọng cho ong mật Apis cerana, và có
xu hướng làm sụp ñổ các ñàn ong gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi ong
(Liu et al., 2010).
Mặc dù sacbrood ñược mô tả lần ñầu tiên vào năm 1913 và ñược cho là
tác nhân gây bệnh vào năm 1917, SBV ñã không ñược mô tả cho ñến năm 1964.
SBV là virus ñầu tiên trên ong mật ñược giải trình tự toàn bộ. Ở Mỹ, toàn bộ
trình tự chuỗi nucleotide của SBV gần ñây mới ñược xác ñịnh. Bằng cách sử
dụng RT – PCR ñể phát hiện trực tiếp, nhanh chóng và chuẩn xác các loại virus.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
4

RT – PCR ñược chứng minh là một công cụ chẩn ñoán nhanh chóng, ñặc hiệu và
nhạy bén ñể phát hiện trực tiếp axit nucleic của SBV trong những mẫu ong bị lây
nhiễm. Sản phẩm khuếch ñại ñược giải trình tự và phân tích phả hệ cho thấy tồn
tại ít nhất ba kiểu gen của SBV.
Sử dụng phương pháp uniplex RT – PCR ñể kiểm tra các dòng ong cho thấy
sự có mặt của một số loại virus bao gồm BQCV, DWV, KBV, SBV và mô tả việc
nhiễm hỗn hợp các loại virus ở ong từ các dòng ong khác nhau. Báo cáo năm 2004
về “Sự lây nhiễm ña virus trên ong mật và sự dị biến hệ gen của các virus trên ong
mật” là báo cáo ñầu tiên về sự nhiễm hỗn hợp 4 loại virus trên ong mật và cũng là
báo cáo ñầu tiên về việc sử dụng phương pháp multiplex RT – PCR trong việc chẩn
ñoán sự lây nhiễm ña virus trong các dòng ong mật. Vào năm 1971, mới chỉ tìm ra
ba loại virus lây nhiễm trên ong mật (Bailey, 1971) nhưng 5 năm sau ñó còn số này
ñã tăng lên là sáu (Bailey, 1976). Chỉ có rất ít thông tin về sự xuất hiện của virus
ong ở A. mellifera ở ðan mạch là có sẵn cũng như không có cuộc ñiều tra toàn diện

nào ñược thực hiện. Một cuộc ñiều tra dựa trên phương pháp RT – PCR ñược xuất
bản bởi Tentcheva et al. (2004) (ABPV, BQCV, CBPV, DWV, KBV) và
Grabensteiner et al. (2001) (SBV) ñã ñược thực hiện ở ðan Mạch chúng có thể là
những loại virus nguy hiểm bậc nhất châu Âu. Cuộc ñiều tra dựa trên mẫu ong của
những người nuôi ong với tỉ lệ chết cao bất thường vào mùa ñông hay có nghi ngờ
ñã nhiễm virus.
Sự xuất hiện, tỉ lệ lây nhiễm và sự phân bố của ABPV, BQCV, CBPV, DWV,
KBV, SBV ñã ñược ñiều tra ở 90 dòng ong ở Áo bị mắc những triệu chứng suy giảm
các cá thể trong ñàn ñột ngột, bại liệt…bằng cách sử dụng RT – PCR. Sự phá hoại
do ký sinh trùng cũng ñược ghi chép lại.
1.1.2. Việt Nam
Ở Việt Nam, không có nhiều những nghiên cứu về SBV trên A. mellifera
ñược xuất bản. Virus lây nhiễm trên ong mật chưa ñược xác ñịnh. Một vài nhà
nghiên cứu ở Việt Nam ñã có những ñiều tra sơ bộ ñể áp dụng chẩn ñoán bệnh lây
nhiễm trên ong mật như SBV (Lê Thanh Hòa et al., 2004; Phạm Hồng Thái et al.,
2011) bẳng sử dụng chẩn ñoán phân tử. Báo cáo “Chẩn ñoán phân tử của Sacbrood
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5

virus và Deformed wing virus lây nhiễm trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam” là báo
cáo ñầu tiên về bệnh SBV và DWV sử dụng RT – PCR làm công cụ chẩn ñoán dùng
mồi ñặc hiệu của ong mật ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam vào năm 2010.
Các kỹ thuật chẩn ñoán bằng sinh học phân tử hầu như ñược sử dụng còn rất
khiêm tốn trong công tác phát hiện sớm bệnh virus hại ong mật. Trong ñó Realtime
- PCR là kỹ thuật chẩn ñoán nhanh, chính xác và ñịnh lượng ñược nồng ñộ virus
vẫn chưa có nhiều công bố ở nước ta. Chính vì thiếu sự chẩn ñoán sớm nên không
ñưa ra ñược cách phòng trị tốt. Người nuôi ong thường không phân biệt ñược
nguyên nhân gây bệnh cho ong là gì nên ñã lạm dụng kháng sinh và gây tồn dư
kháng sinh trong mật ong.
1.1.3. Các loài ong ở Việt Nam

Hai loài ong nuôi phổ biến nhất ở nước ta là ong nội A.cerana và ong ngoại
A.mellifera. Hai loài này có những ñặc ñiểm khác nhau và bổ sung cho nhau.
Ong nội A.cerana là giống ong bản ñịa ở Việt Nam, Trung Quốc và một số
nước khác. Ở nước ta, ong nội phân bố rộng khắp cả nước ngoại trừ rừng tràm U
Minh (Phạm Hồng Thái, 2003). Ong nội có ñặc tính chăm chỉ, chịu ñược ñiền kiện
sống bất lợi, ít dịch bệnh hại, chất lượng mật cao, tuy nhiên năng suất mật thấp,
hung dữ và dễ bốc bay, chia ñàn. Ong nội có thể nuôi ở các quy mô từ hộ gia ñình
tới nuôi chuyên nghiệp, nhưng nó thích hợp hơn với kiểu nuôi ong quy mô nhỏ
trong gia ñình, và cung cấp sản phẩm phục vụ tiêu dùng trong nước. ðể phát triển
ong nội, cần chọn các ñàn có tính tụ ñàn cao, chọn giống ong tốt và quan tâm tới
phòng bệnh ñể nâng cao năng suất mật.
Ong ngoại A.mellifera có nguồn gốc từ châu Âu, châu Phi, ñược nhập vào
nước ta từ những năm 60 với hình thức thương mại và ñã thích nghi với ñiều kiện nước
ta. Loài ong này phát triển tốt ở những nơi có nguồn hoa tập trung, thích hợp với kiểu
nuôi ong chuyên nghiệp với trình ñộ chuyên môn hóa cao. Ong ngoại có kích thước lớn
hơn ong nội, khả năng tụ ñàn và dự trữ mật cao hơn, mật ong ngoại chủ yếu xuất khẩu.
Nhưng ở những nơi có nguồn hoa rải rác và ñiều kiện khắc nghiệt thì việc nuôi ong ngoại
là không thể. Việc nhập ong A.mellifera cũng mang theo các loài ký sinh và bệnh như
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6

bệnh thối ấu trùng châu Âu, bệnh ấu trùng túi , bệnh bào tử trùng Nosema…cho các loài
ong bản ñịa.
Ngoài ra còn một số loài ong hoang dã như ong khoái (A.dorsata), ong ñá
(A.laboriosa), ong ruồi (A.florea). Tuy nhiên việc khai thác mật của các loài này
chiếm tỉ lệ nhỏ và chủ yếu là khai thác, săn bắt trong tự nhiên.
1.1. Các dịch bệnh chính ñược ghi nhận trên ong mật
Có rất nhiều dịch hại ong ñã ñược ghi nhận trên thế giới cũng như tại Việt
Nam. Các loài gây hại cho ong khá ña dạng từ ñộng vật, côn trùng, tới các vi sinh
vật nhỏ bé như vi khuẩn hay virus.

Một số loài chim ăn ong như chim xanh (Merops apiaster), chim én
(Cypselus spp), chim chèo bẻo (Dicurunus spp), nhện, thạch sùng, thằn lằn thường
bắt ong khi chúng ñi làm về. Vào mùa mưa thì các loài cóc, nhái thường xuất hiện
trước cửa tổ ong bắt ong. Các loài vật hại này với số lượng lớn thì sẽ làm giảm số
ong trong ñàn nhanh chóng.
Các côn trùng hại ong như sâu ăn sáp còn gọi là sâu phá bánh tổ (Galleria
mellonenlla, Achroia griselle), trưởng thành của sâu là một loài ngài thuộc họ ngài
ñêm (Noctuidae). Các loài kiến vồng (Oecophylla smaradina), kiến lửa (Solemy
spp), kiến ñen (Monomorium indicum)…. thường gây hại cho ong ở các vùng nhiệt
ñới, khi tấn công ñàn ong chúng ăn cả ấu trùng, nhộng, ong và mật. Ong bò vẽ (Vespa
orientalis) là loài phá ong cũng rất mạnh. Ngoài ra còn có chuồn chuồn cũng là côn
trùng ăn thịt phá hại ong. Khi bị tấn công mạnh thì ñàn ong có thể bốc bay bỏ tổ.
Một số trường hợp ñàn ong bị bệnh ngộ ñộc hóa học. Chất hóa học có thể là
thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ cỏ, thuốc diệt côn trùng… mà ong bị dính phải khi
ñi làm hoặc thuốc ñược phun gần nơi ñặt ong. Khi bị ngộ ñộc ong chết với số lượng
lớn ngoài cửa tổ, một số bò dưới ñất, một số vừa nhảy vừa xoay. ðàn càng ñông thì
số lượng ong chết càng nhiều.
Các loài ve khí sinh của ong có chí lớn (Varroa jacobsoni) thuộc họ
Varroidac chủ yếu ký sinh trên nhông ong ñực, chí nhỏ (Tropilaelaps clareaes) chỉ
ký sinh trên ấu trùng, ve Neocypholaelaps indica Evans ăn phấn hoa …
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
7

Bệnh ỉa chảy nosema do một loài nguyên sinh ñộng vật gây ra có tên là
Nosema apis, bệnh này có thể chữa ñược bằng thay chúa và cho ong ăn kháng sinh.
Các bệnh gây hại trên ấu trùng do vi khuẩn có bệnh thối ấu trùng châu Âu và
thối ấu trùng châu Mỹ. Thối ấu trùng châu Âu (European floubrood) ñược phát hiện
ở châu Âu, do liên cầu khuẩn Melissococus pluton gây ra, và còn ñược gọi là thối ấu
trùng tuổi nhỏ. Bệnh xuất hiện cả ở A.mellifera và A.cerana. Biện pháp chữa trị là
thay chúa và sử dụng kháng sinh. Bệnh thối ấu trùng châu Mỹ do trực khuẩn

Bacillus larvae gây ra. Bệnh này gây hại nghiêm trọng nhất ñặc biệt ở vùng cận
nhiệt ñới và ôn ñới. Khi gặp ñiều khiện bất thuận, vi khuẩn hình thành nha bào, các
nha bào này có thể tồn tại trong ñất, bánh tổ khoảng 10 năm, khi gặp ñiều kiện
thuận lợi có thể hoạt ñộng trở lại ở tất cả các thời ñiểm trong năm.
Bệnh virus trên ong ñược quan tâm nghiên cứu nhiều trong vài thập kỷ gần
ñây bởi sự xuất hiện ngày càng nhiều các loại virus và mức ñộ gây hại của chúng.
Hầu hết các bệnh virus trên ong không có triệu chứng rõ ràng. 18 loài virus trên
ong mật ñã ñược phát hiện và một số ñã ñược giải mã genome (Lê Quang Trung
và cs). Các virus thường truyền qua bọ ký sinh hoặc nhờ sự tiếp xúc giữa các con
ong trong ñàn. Một số bệnh virus như: Acute bee paralysis virus (ABPV) hay
(APV) ñược xem như là tác nhân truyền nhiễm phổ biến của ong. ABPV lan
truyền cùng với sự phá hoại của bọ ký sinh Varroa destructor, cùng Israel acute
paralysis virus (IAPV) gây bệnh bại liệt ở ong. Nó thuộc họ Dicistroviridae ,cùng
Kashmir bee virus (KBV), và Black queen cell virus (BQCV- làm ấu trùng chúa
ñen và chết). Deformed Wing Virus (DWV) làm biến dạng cánh ong, và Sacbrood
virus (SBV) gây thối ấu trùng túi thuộc họ iflaviridae, và là picornavirus.
1.2. Tình hình nghiên cứu về
Sacbrood virus

1.2.1. Lịch sử phát hiện và tác hại của bệnh virus ấu trùng túi
Sacbrood virus ñược ghi nhận lần ñầu tiên năm 1913, và ñược xác ñịnh là do
virus gây ra năm 1917 trên ong Apis mellifera, bệnh có mặt khắp các lục ñịa và các
vùng nuôi ong, nhưng gây thiệt hại không ñáng kể, có thể tự khỏi và không ñược
coi là bệnh nguy hiểm. Cho tới khi dịch lớn sảy ra ở Thụy Sĩ, tiêu diệt nhiều ñàn
ong từ năm 1943- 1946 (Phùng Hữu Chính 2008).
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8

ðối với ong Apis cerana, bệnh xuất hiện thành dịch lần ñầu tiên ở Trung
Quốc năm 1972 và tiêu dệt nhiều ñàn ong ở Thái lan vào năm 1976 (Phùng Hữu

Chính và Vũ Văn Luyên, 1999). Năm 1981, Bailey ñã phân lập ñược chủng virus
gây bệnh trên ong A.cerana ở Thái Lan có ñặc tính sinh lý sinh hóa khác với
sacbrood trên A.mellifera và ông ñặt tên là Thai sacbrood virus (TSBV). Sau ñó,
TSBV lại gây dịch ở bang Bihar của Ấn ðộ vào năm 1979 và trong năm 1980 nó
ñã lan rộng từ ðông sang Tây ở miền Bắc nước này. Nepal từ năm 1981 tới
1984, TSBV ñã lây nhiễm ra khắp cả nước và làm thiệt hại tới 89% tổng số ñàn
ong Apis cerana của nước này. Ở Ấn ðộ, hàng triệu ñàn ong ñã bị mất do SBV chỉ
tính riêng năm1990 (Lê Quang Trung et al., 2009).
Ở Việt Nam, dịch bệnh do SBV gây nên sảy ra năm 1974 khi một số ñàn ong
cao sản của Viện ong Bắc Kinh ñược nhập về Hà Nội sau ñó ñã lan tràn ra toàn
miền Bắc và tiêu diệt 90% số ñàn ong. Dựa trên các triệu chứng lâm sàng, các kỹ thuật
viên của công ty ong, các chuyên gia bệnh trong nước và nước ngoài kết luận là bệnh ấu
trùng túi. Phải tới năm 1989 mới xác ñịnh chính xác sự có mặt của Thai sacbrood virus ở
nước ta (Phùng Hữu Chính 2008, Vũ Văn Luyện. 1999; Phạm Hồng Thái. 2004). Những
năm gần ñây, bệnh virus ấu trùng túi ñã làm giảm 40-80% năng suất mật ở A.mellifera
(Phùng Hữu Chính, 2008).
Chinese sacbrood là một virus phổ biến gây thiệt hại nghiêm trọng với nghề
nuôi ong Trung Quốc. ðây là bệnh gây hại lớn nhất cho ấu trùng ong nhưng cũng
có thể ảnh hưởng tới sức khỏe và hành vi của ong mật trưởng thành. Nó ñược quan
sát ñầu tiên ở tỉnh Guangdong năm 1972 và nhanh chóng lan ra toàn Trung Quốc và
các nước ðông nam á, dẫn ñầu phá hoại ngành công nghiệp ong ở các vùng này.
Các nhà khoa học Trung Quốc ñã xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh là virus có tên
China sacbroodvirus, thuộc họ virus RNA nhỏ, picornaviridea (Zhang et al.2001)
1.2.2. Triệu chứng bệnh ấu trùng túi
Triệu chứng ñầu tiên là sự xuất hiện của các ấu trùng yếu hoặc chết. Ấu
trùng chết sớm sau khi ñạy nắp nhưng trước khi hóa nhộng. Ấu trùng chết có thể
ñược tìm thấy ở lỗ tổ ñã vít nắp và chưa vít nắp khi bệnh nặng. Bánh tổ bị bệnh, nắp
vít lỗ tổ lõm xuống, bị ong thợ cắn thủng, có ấu trùng nhọn ñầu nhô lên miệng lỗ tổ.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9

Màu sắc của ấu trùng bệnh từ trắng ngà chuyển sang trắng bệch, vạch phân
ñốt không rõ. Triệu chứng ñiển hình nhất của bệnh là khi gắp ấu trùng túi lên phía
ñuôi ấu trùng hình thành túi nhỏ có dịch trong suốt hoặc vàng nhạt. Thân ấu trùng
chuyển sang vàng nhạt rồi nâu nhạt hay nâu xám, chóp ñầu nghiêng về phía bụng.
Ấu trùng mới chết không có mùi, khi khô thành vảy cứng nhẵn dạng thuyền. ðàn
ong bị bệnh ấu trùng túi nhẹ thì giảm số quân trong ñàn, nên lụi ñàn, năng suất mật
thấp. Khi bị bệnh nặng có thể 90% số ấu trùng tuổi lớn chết và ñàn ong sẽ bỏ tổ bốc
bay (Phùng Hữu Chính, Vũ Văn Luyện. 1999).
1.2.3. Cách thức lan truyền của SBV
Khả năng lây nhiễm của virus gây bệnh thối ấu trùng túi là rất lớn, một ấu
trùng chết có thể lây nhiễm cho 3000 ấu trùng lành, hay chất lỏng trong ấu trùng
chết có chứa 1mg virus ñủ ñể gây nhiễm cho toàn bộ ấu trùng ong thợ của 1000 ñàn
khỏe. Nhưng sức chống chịu của virus không cao, nó mất khả năng gây bệnh khi
ñun ở 59
o
C trong 10 phút. Ở nhiệt ñộ phòng virus có thể tồn tại 3 tuần. Ở các ấu
trùng chết ñã khô không còn khả năng gây bệnh.
Theo Ball thì trong cơ thể ong trưởng thành, virus nhân lên và tích lũy chủ
yếu ở phần ñầu của ong bị nhiễm nhiều hơn các phần khác của cơ thể. Phần lớn
chúng tồn tại ở phần não và tuyến dưới hầu, một phần chiết của ñầu chứa khoảng
10
9
phân tử virus. Còn trong một ấu trùng túi chết có 10
12
phân tử virus, tương
ñương với 1% khối lượng cơ thể ấu trùng. Và trong phòng thí nghiệm chỉ cần 100
phân tử virus ñể lây nhiễm ong thành công trong giai ñoạn nhộng mắt trắng, ñây là
thời ñiểm lây nhiễm thuận lợi nhât.
Trong ñàn ong, bệnh lan truyền là nhờ ong thợ khi chúng làm vệ sinh tổ,

chúng ăn hoặc gắp bỏ các ấu trùng bệnh, hàm, chân và lông dính virus, khi cho các
ấu trùng khoe ăn thì bệnh sẽ lan truyền. Bệnh lây nhiễm giữa các ñàn là do ong ăn
cướp mật, lấy chung nguồn thức ăn, ñặc biệt là nguồn phấn hoa, do người nuôi ong
nhập cầu ong từ ñàn bệnh vào ñàn khỏe….
1.2.4. Tác nhân gây bệnh
1.2.4.1. ðặc ñiểm của Sacbrood virus
Bộ gen của SBV ñược Ghosh và các cộng sự giải mã và công bố năm 1999. ðây
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10

là bộ gen ñược giải trình tự hoàn thành ñầu tiên trong số các virus côn trùng.
Bộ gen của SBV gồm 8832 nucleotid là tập hợp của 8 over lapping ñã ñược
gửi ở Ngân hàng gen với mã AF092024. Bộ gen của SBV dài hơn bộ gen của
picornavirus của ñộng vật có vú ñiển hình (khoảng 7500 nucleotid) . Thành phần bazơ
là A (29.79%), C (16,35%), G (24,36%) và U (29,48%), như vậy SBV giống với các
picornavirus khác. Bộ gen bao gồm 1 sợi ñơn, cựu dương, cấu trúc dọc mở lớn (ORF)
mã hóa 1 polyprotein có 2858 amino axit, khối lượng phân tử 320698 Da. Vị trí bắt
ñầu dịch mã là mã AUG mã hóa ở nucleotid 179, và kết thúc ORF với 1 codon dừng
UAG ở nucleotide 8775. Sự phân tích này dự ñoán một vùng không dịch mã (UTR)-
5’- SBV của 178 nucleotide, ngắn hơn nhiều ñoạn ñược tìm thấy picornavirus ñộng
vật có vú ñiển hình (600-1250N). Trong khi ñó, UTR- 3 - SBV (80N) là vị trí tương
ñồng với nhiều picornavirus của ñộng vật có vú ñiển hình (40- 126 N).
So sánh trình tự với các polyprotein virus khác cho thấy các vùng tương
ñồng với helicase, protease và RNA-dependent RNA polymerase(RdRp= RNA –
phụ thuộc RNA polymerase) ñặc trưng. SBV cũng giống với các picornavirus ñiển
hình về cấu trúc mã hóa ở ñầu 5 và cấu trúc không mã hóa ở ñầu 3. Trong số nhiều
tác nhân picornavirus- like côn trùng, SBV giống với Infectious flacherie virus
(IFV), cả về chiều dài bộ gen và trật tự gen và cho thấy ñồng nhất 23.2% toàn bộ,
tương ñồng 45.4% trong chuỗi amino axit với virus này và tương ñồng ở vỏ protein.
Từ so sánh trình tự cấu trúc của IFV ñã phát hiện vị trí phân tách của chúng từ tiền

protein và suy luận ra vị trí mã hóa protein capsid của SBV: 5-VP3- VP4- VP1-
VP2- 3  (Ghosh et al.1999)
Về cấu trúc phân tử, hạt SBV có ñường kính 28nm, không có vỏ bao ngoài
và bề ngoài không ñặc trưng với hệ số lắng ñọng 160S. Ba dải protein capsid lớn
của SBV có khối lượng phân tử là 32.5, 30.5 và 29.5 kDa. Nó giống với 3 protein
capsid của picornavirus về kích thước, nhưng Ghos et al (1999) chưa xác ñịnh ñược
protein nhỏ VP4.
Sự tổng hợp polyprotien picornavirus ñi theo sau sự gắn bên trong ribosom
ñể trình tự bên trong 5’ UTR giới hạn một vị trí bên trong ribosom gọi là IRES.
Vùng này thường có khoảng 450N bên trong 5’ UTR và chứa một lượng lớn cấu
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
11

trúc bậc hai- ñược cho là cần thiết cho một chức năng như IRES.Vùng 5’ UTR của
SBV (178N) ñược coi như là một IRES.
1.2.4.2. ðặc ñiểm China Sacbrood virus
Cấu trúc ba chiều của CSBV qua kính hiển vi ñiện tử là 25nm, vỏ capsid 20
mặt với bề ngoài bằng phẳng, 12 pentons ở các ñỉnh khối 20 mặt ñó và 132 lỗ
xuyên qua vỏ. Cấu trúc ba chiều cũng cho thấy ñộ dày tương ứng với bộ gen CSBV,
từ ñó các nhà khoa ñưa ra giả thuyết 20 mặt- bậc cấu trúc RNA, một ñặc ñiểm mới
không giống với bất kỳ picornavirus nào trước ñây ñã công bố.
Bộ gen của virus là RNA sợi ñơn, cực dương và có 4 protein cấu trúc ở vỏ
capsid. CSBV tương ñồng với SBV ở ñặc ñiểm sinh lý và sinh hóa, trong khi kháng
nguyên của chúng khác nhau và không lây nhiễm chéo. Phân tích trình tự cho thấy
CSBV và SBV khác nhau nhưng có mức tương ñồng cao. Trình tự nucleotid của chúng
tương ñồng 87.6% và trình tự axitamin suy luận tương ñồng 94.6%(Zhang et al.2001).
1.3. Các kỹ thuật chẩn ñoán cổ ñiển
1.3.1. Kỹ thuật RIA (Radio Immuno Assay)
RIA (Radio Immuno Assay) hay còn gọi là “ðịnh lượng miễn dịch phóng xạ”
là một trong những kỹ thuật chẩn ñoán y học hạt nhân in vitro. Phương pháp ñịnh

lượng miễn dịch phóng xạ RIA dựa trên tính ñặc hiệu cao của phản ứng miễn dịch,
trong ñó chất cần ñịnh lượng ñóng vai trò là kháng nguyên (KN) cùng với kháng
nguyên ñồng nhất về miễn dịch nhưng ñược ñánh dấu bằng ñồng vị phóng xạ
(KN*) liên kết với một kháng thể (KT) ñặc hiệu ñể tạo thành các phức hợp (KN*-
KT) và (KN-KT). Phương pháp ñịnh lượng miễn dịch phóng xạ là kỹ thuật có ñộ
nhạy và ñộ chính xác cao, có thể ñịnh lượng ñược các phân tử sinh học ở miền
nồng ñộ rất thấp cỡ 10
-9
nanogram, thậm chí tới 10
-12
picogram). Kỹ thuật ñánh dấu
phóng xạ tương ñối ñơn giản. Máy ño tia gamma không quá ñắt. Nhưng phương
pháp này sử dụng hoá chất phóng xạ nên phòng thí nghiệm cần phải ñược thiết kế
phù hợp ñể ñảm bảo các qui ñịnh về an toàn phóng xạ. Bên cạnh ñó ñồng vị phóng
xạ bị phân rã nên thời gian sử dụng thường bị hạn chế.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12

1.3.2. Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) hay còn gọi là “Xét nghiệm
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme”. Dựa trên sự kết hợp ñặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể, trong ñó kháng thể ñược gắn với một enzyme. Khi cho thêm
cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy
phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ ñã xảy ra phản
ứng ñặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường ñộ màu mà biết
ñược nồng ñộ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phương pháp này ñược
thiết kế cho việc phát hiện và ñịnh lượng vật chất như peptides, protein, antibodies,
hormone,… Kỹ thuật này khá nhạy và ñơn giản, cho phép ta xác ñịnh kháng
nguyên hoặc kháng thể ở một nồng ñộ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kỹ thuật
miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn

hơn mà vẫn ñảm bảo ñộ chính xác như nhau. ELISA ñược dùng ñể xác ñịnh nhiều
tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.
1.3.3. RT – PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction)
hay “Phản ứng chuỗi trùng hợp” là một “cuộc cách mạng” trong chẩn ñoán virus
lây nhiễm và ñược coi là phương pháp chuẩn ñể áp dụng. Kỹ thuật PCR
(Polymerase Chain Reaction ) ñược Kary mullis và cộng sự phát minh ra vào năm
1985. Kỹ thuật này tiếp tục ñược hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và
sản xuất thành công enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus
aquaticus và sự thiết kế thành công các máy chu kỳ nhiệt cho phép thay ñổi nhanh
chóng và chính xác nhiệt ñộ cho từng giai ñoạn phản ứng. Trong PCR thông
thường sau 20-30 vòng có tới hàng triệu phân tử ñược copy từ một phân tử DNA (1
ñoạn gen). Kỹ thuật RT-PCR trước khi tiến hành PCR thông thường ARN cần
ñược chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase (enzyme sao mã
ngược). Phương pháp PCR như vậy ñược gọi là RT-PCR. Phương pháp này ñược
áp dụng rộng rãi trong chẩn ñoán nhanh và ñịnh loại virus có nhân là RNA. Ưu
ñiểm của phương pháp này là thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể
khuếch ñại ñược một trình tự ñáng quan tâm. Thực hiện ñơn giản và ít tốn kém.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13

Yêu cầu về ñộ tinh sạch của mẫu không cao. Cần phải có RNA mồi ñặc trưng cho
RNA cần khuếch ñại. ðể có ñoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide
cần khuếch ñại. Kích thước RNA cần khuếch ñại không vượt quá 3kb. Khả năng
ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần). Sai sót còn do sử dụng enzyme Taq-
polymerase khoảng 104 (sai sót cho một lần sao chép).
1.4. Kỹ thuật Realtime- PCR
Realtime – PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch ñại DNA ñích hiển thị
ñược ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên gọi là “real-time”.
Nên do ñặc ñiểm này mà người làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp các thí

nghiệm ñể ñọc và phân tích kết quả ñể xác ñịnh có sản phẩm khuếch ñại ñích hay
không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch ñại ñược hiển thị ngay sau khi
hoàn tất phản ứng khuếch ñại. ðây cũng chính là ưu ñiểm vượt trội hơn của
Realtime – PCR so với kỹ thuật PCR cổ ñiển, người làm thí nghiệm bỏ qua ñược
bước ñiện di ñọc kết quả, tiết kiệm ñược thời gian và tránh ñộc hại. Trong phản
ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch ñôi do quá trình nhân bản thì
các tác nhân liên kết với DNA mạch ñôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản
phẩm vừa ñược tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn. Loại tác
nhân huỳnh quang này có thể sử dụng ñược cho mọi trình tự ñích nên chi phí sẽ
thấp nhưng ñộ ñặc hiệu của sản phẩm phải ñược kiểm tra chặt chẽ thông qua một
bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích ñường cong
nóng chảy (Melting curve analysis).
Trong Realtime – PCR, hiển thị cơ bản ñể người làm thí nghiệm có thể quan
sát ñược trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu ñồ
khuếch ñại (Amlification…). Trên biểu ñồ khuếch ñại này người làm thí nghiệm sẽ
thấy từng ống phản ứng cường ñộ huỳnh quang mà máy ghi nhận ñược trong những
chu kỳ ñầu sẽ rất thấp và hầu như không thay ñổi. Nhưng khi số lượng bản sao của
DNA ñích ñạt ñến một ngưỡng nhất ñịnh thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ ñủ
cường ñộ ñể ñược máy ghi nhận và lúc này ñường biểu diễn khuếch ñại bắt ñầu
ngóc lên. Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở ñi sẽ tăng gấp
ñôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA ñích tăng gấp ñôi sau mỗi
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14

chu kỳ. Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng trưởng ñến một mức ñộ
nào ñó rồi ñạt ñến mức “bình nguyên”.
Một thông số hết sức quan trọng khi phân tích một ñường biểu diễn khuếch
ñại ñó là chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold – Ct). Chu kỳ ngưỡng (Ct) là chu kỳ nhiệt
mà ở tại thời ñiểm này thiết bị real-time ghi nhận ñược tín hiệu huỳnh quang phát ra
từ ống phản ứng bắt ñầu vượt qua cường ñộ huỳnh quang nền. Trong thí nghiệm sẽ

có những ống phản ứng có Ct sớm hơn và có ống phản ứng sẽ có Ct muộn hơn. Dựa
vào chu kỳ ngưỡng ta có thể ñánh giá tương ñối về nồng ñộ virus của các mẫu bệnh.
Muốn ñịnh lượng tuyệt ñối nồng ñộ của virus gây bệnh (số lượng bản copy) ta cần
phải xây dựng ñường chuẩn (Standard curve). Một ñường chuẩn ñược xây dựng với
các nồng ñộ (pha loãng 5 ñến 10 lần) của một trình tự RNA chứng ñã biết và các giá
trị Ct tương ứng. ðể ñịnh lượng trình tự mục tiêu ban ñầu có trong mẫu, người ta ño
giá trị Ct của mẫu, giá trị này lắp vào ñường chuẩn sẽ cho ñược nồng ñộ trình tự mục
tiêu có trong mẫu ban ñầu. ðây là phương pháp thường ñược sử dụng ñể ñịnh lượng
hàm lượng vật liệu di truyền của tác nhân gây bệnh hiện diện trong bệnh phẩm.
*Các vấn ñề kỹ thuật của real-time PCR:
- Biểu ñồ khuếch ñại của real-time PCR
Trong real-time PCR, hiển thị cơ bản ñể người làm thí nghiệm có thể quan
sát ñược trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu ñồ
khuếch ñại(amplification graph). Biểu ñồ này có trục tung (Y) là cường ñộ huỳnh
quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X)
là các chu kỳ nhiệt. Trên biểu ñồ khuếch ñại này người làm thí nghiệm sẽ thấy ñối
với từng ống phản ứng, cường ñộ huỳnh quang mà máy ghi nhận ñược trong những
chu kỳ ñầu sẽ rất thấp và hầu như không thay ñổi, hiển thị bằng một ñường thẳng
nằm ngang, chúng ta có thể gọi ñây là “giai ñoạn ủ” hay “giai ñoạn tiềm phục”, vì
trong giai ñoạn này dù DNA ñích ñã có thể ñược nhân bản thành các bản sao nhưng
do số lượng chưa ñủ ñể giúp cho chất phát huỳnh quang nhận ñược ánh sáng kích
thích phát ra ánh sáng huỳnh quang ñủ cường ñộ ñể máy ghi nhận. Nhưng một khi
số lượng bản sao của DNA ñích ñạt ñến một ngưỡng nhất ñịnh thì ánh sáng huỳnh
quang phát ra sẽ ñủ cường ñộ ñể ñược máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy