nghiên cứu thiết kế vectơ pb2gw7 mang gen cryia(c) và đánh giá khả năng chuyển gen trên cây arabidopsis thaliana

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
——————————————



BÙI TRI THỨC



NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR PB2GW7 MANG GEN CRYIA(C)
VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN TRÊN CÂY
ARABIDOPSIS THALIANA



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC









Thái Nguyên – 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
——————————————



BÙI TRI THỨC



NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR PB2GW7 MANG GEN CRYIA(C)
VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHUYỂN GEN TRÊN CÂY
ARABIDOPSIS THALIANA



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.46.30


Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Ngô Xuân Bình



Thái Nguyên – 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tôi đã nhận
được sự hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: PGS. TS Ngô Xuân Bình, đã
giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá
trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm, khoa Sau đại
học, bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống, Ban chủ
nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô giáo, cán bộ khoa Sinh - KTNN đã tạo
điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè
đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tác giả luận văn



Bùi Tri Thức






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,

kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực,chưa được công bố trong bất
kì công trình nào khác.


Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Vi khuẩn A. tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng 4
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn A. tumefaciens 4
1.1.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 5
1.1.3. Cơ chế quá trình chuyển gen nhờ A. tumefaciens 7
1.1.4. Một số hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 9
1.2. Vector chuyển gen dựa trên Ti-plasmid 10
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens 13
1.4. Công nghệ Gateway và vector sử dụng trong đề tài 16
1.4.1. Công nghệ Gateway 16
1.4.2. Vector nhân dòng pENTR
TM
D/TOPO cloning 20
1.4.3. Vector chuyển gen pB2GW7 22
1.5. Vi khuẩn B. thuringiensis và gen cry 23

1.5.1. Những nghiên cứu chung về vi khuẩn B. thuringiensis 23
1.5.2. Những nghiên cứu về gen cry 24
1.5.3. Những nghiên cứu về gen cry1A 25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.6. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây A. thaliana 25
1.6.1. Đặc điểm nông sinh học cây A. thaliana 25
1.6.2. Những nghiên cứu về cây A. thaliana 26
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 28
2.1.1. Vật liêu nghiên cứu 28
2.1.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài 29
2.1.3. Thiết bị sử dụng trong đề tài 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 30
2.2.1. Nhân dòng gen cryIA(c) từ vector OB-Mutant#16-cryIA(c) 30
2.2.1.1. Nhân gen cryIA(c) từ vector OB-Mut-cryIA(c) 31
2.2.1.2. Gắn gen cryIA(c) lên vector tách dòng pENTR
™
/D-TOPO
®
32
2.2.1.3. PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc thu được sau nhân dòng với cặp
mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 32
2.2.1.4. Xác định trình tự đoạn ADN được nhân dòng 32
2.2.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefacien mang vector pB2GW7-cryIA(c) 33
2.2.2.1. Gắn gen cryIA(c) lên vector chuyển gen pB2GW7 34
2.2.2.2. Phân tích các dòng tế bào E. coli thu được sau chọn lọc 35
2.2.2.3. Biến nạp vector pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A.
tumefacicen 35
2.2.2.4. PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau biến

nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 36
2.2.3. Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vector pB2GW7-cryIA(c)
trên cây A. thaliana 36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2.3.1. Tạo cây A. thaliana chuyển gen 36
2.2.3.2. Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên khả năng kháng thuốc
diệt cỏ 37
2.2.3.3. Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp
mồi đặc hiệu của gen bar 37
2.2.3.4 Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp
mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 38
2.2.3.5. Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây A. thaliana chuyển gen 38
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39
3.1. Kết quả nhân dòng gen cryIA(c) từ vector OB-Mutant#16-cryIA(c) 39
3.1.1. Kết quả nhân gen cryIA(c) từ vector OB-Mut-cryIA(c) 39
3.1.2. Kết quả gắn gen cryIA(c) lên vector tách dòng pENTR
™
/D-TOPO
®
39
3.1.3. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn E. coli thu được với cặp mồi đặc
hiệu của gen cryIA(c) 40
3.1.4. Kết quả xác định trình tự đoạn ADN được nhân dòng 41
3.2. Kết quả tạo chủng vi khuẩn A. tumefacien mang vector pB2GW7-
cryIA(c) 45
3.2.1. Kết quả gắn gen cryIA(c) lên vector chuyển gen pB2GW7 45
3.2.2. Kết quả phân tích các dòng tế bào E. coli thu được sau chọn lọc 46
3.2.3. Kết quả biến nạp vector pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A.
tumefacicen 47

3.2.4. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau
biến nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 48
3.3. Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vector pB2GW7-cryIA(c)
trên cây A. thaliana 49
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3.3.1. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên khả năng kháng
thuốc diệt cỏ 49
3.3.2. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen bằng phản ứng PCR với
cặp mồi đặc hiệu của gen bar 50
3.3.3. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen bằng phản ứng PCR với
cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 51
3.3.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây A. thaliana chuyển gen 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53
1. Kết luận 53
2. Đề nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt
Nội dung
A. thaliana
Arabidopsis thaliana
A. tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
A
260 nm
Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm

A
280 nm
Giá trị mật độ quang ở bước sóng 280 nm
ADN
Axít deoxyribonucleic
ADNaza
Deoxyribonuclease (enzyme phân hủy ADN)
Amp
Ampicillin
VAM
Anfa mosaic virus (virut khảm anfa)
ARN
Axít ribonucleic
ARNaza
Ribonuclease (enzyme phân hủy ARN)
AS
Asetoseringon
BC
Bacillus cereus
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
Bp
Base pair - Cặp bazơ nitơ
BT
Bacillus thuringiensis
cADN
Complementary DNA (ngân hàng gen)
VCaM
Cauliflower mosaic virus (virut gây khảm súp lơ)
Cry

Crystal
CTAB
Cetyl trimetyl amonium bromid
ddNTP
Dideoxyribonucleotide triphosphate
E.coli
Escherichia coli
EDTA
Axít etylendiaminetetraacetic
Gen GUS
Gen mã hóa β-glucuronidase
ISAAA
International Survice for the Acquisition of Agri-Biotech
Application
kb
Kilobase
LB
Left border (trật tự biên trái của đoạn T-ADN)
M
Mol/lit
mARN
Messenger RNA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MS
Murashige and Skoog
NCBI
National Center for Biotechnology Information-Trung
tâm thông tin quốc gia về thông tin công nghệ sinh
học.

NPTII
Neomycin phospho transferase gen
OD
Optical density
ori
Origin of replication
PCR
Polymerase chain reaction
rARN
Ribosomal RNA
RB
Right border (trật tự biên phải của đoạn T-ADN)
T-ADN
Transfer DNA (đoạn ADN được chuyển sang tế bào thực
vật)
TAE
Tris-acetate-EDTA
Taq polymeraza
Thermostable DNA polymeraza
TE
Tris : EDTA (10:1)
Ti-plasmid
Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u)
Vir
Virulence (vùng gen gây độc)
YAC
Yeast artificial chromosome (NST nhân tạo nấm men)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Những nét chính của một Ti-plasmid 6
Hình 1.2. Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật 8
Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống vector chuyển gen dựa trên Ti-plasmid 10
Hình 1.4. Tổng quan về phương pháp Gateway 17
Hình 1.5. Sơ đồ minh họa cho phản ứng LR 19
Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo vùng TOPO trong vector pENTR 21
Hình 1.7. Sơ đồ vector pB2GW7 22
Hình 2.1. Sơ đồ nhân dòng gen cryIA(c) bằng vector pENTR 31
Hình 2.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pB2GW7-cryIA(c)
33
Hình 2.3. Sơ đồ tạo cây A. thaliana chuyển gen 36
Hình 3.1. Kết quả PCR gen cryIA(c) từ vectơ pOB-Mutant#16- cryIA(c) 39
Hình 3.2. Kết quả tách dòng gen cryIA(c) trong vi khuẩn E. coli 40
Hình 3.3. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc sau nhân dòng 40
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự xuôi chiều với trình tự gen cryIA(c) được
cung cấp 42
Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự ngược chiều và trình tự gen cryIA(c) được
cung cấp 44
Hình 3.6. Kết quả gắn gen cryIA(c) vào vectơ pB2GW7 45
Hình 3.7. Kết PCR kiểm tra 9 dòng khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu của gen
cryIA(c) 46
Hình 3.8. Sơ đồ cấu tạo vectơ tái tổ hợp pB2GW7-cryIA(c) 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Hình 3.9. Kết quả cắt plasmid của 9 dòng khuẩn lạc bằng enzym SacI 47
Hình 3.10. Kết quả biến nạp vector pB2GW7-cryIA(c) vào vi khuẩn A.
tumefaciens 48
Hình 3.11. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được
sau biến nạp 48
Hình 4.12. Kết quả đánh giá cây A thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng

PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar 50
Hình 4.13. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng
PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) 51



DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu 28
Bảng 3.1: Kết quả so sánh trình tự gen được nhân dòng với trình tự gen trên
ngân hàng gen 44
Bảng 3.2. Kết quả chọn lọc cây A. thaliana trên môi trường chọn lọc 49
Bảng 3.3. Thống kê một số chỉ tiêu nông sinh học của cây chuyển gen so với
cây đối chứng 52




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis là một trong những loại vi khuẩn được
dùng để diệt côn trùng bảo vệ cây trồng. Vi khuẩn này có khả năng sản xuất
ra các protein tinh khiết rất độc đối với ấu trùng của nhiều loài côn trùng
nhưng không độc với động vật có xương sống [27]. Vi khuẩn này có thể sản
sinh ra bốn loại độc tố hại côn trùng khác nhau: ngoại độc tố α, β, γ toxin và
nội độc tố δ. Trong đó, nội độc tố δ quan trọng hơn so với các ngoại độc tố
còn lại. Trong các gen mã hóa cho các nội độc tố δ có 2 nhóm gen được quan

tâm nhiều hơn cả là: nhóm gen cry và nhóm gen vip [27]. Nhóm gen cry có
khả năng mã hóa cho các protein dạng tinh thể, các loại protein này sau khi
xâm nhập vào côn trùng sẽ bị các protease trong ruột côn trùng phân giải
thành các đoạn nhỏ. Trong đó có đoạn mang khối lượng phân tử là 68000
dalton chứa gần 1200 axit amin có hoạt tính gây hỏng ruột côn trùng. Guo đã
phân nhóm gen cry thành 6 nhóm chính, và ký hiệu từ cryI đến cryVI [33].
Trong mỗi nhóm lại có các nhóm phụ được ký hiệu theo chữ cái từ A đến G.
Độc tố cryI diệt ấu trùng bộ cánh vẩy (Lepidoptera), điển hình như các loài
sâu cuốn lá, sâu đo, sâu róm, sâu đục gân lá…, cryII diệt ấu trùng bộ
Lepidoptera và bộ hai cánh Diptera, điển hình như ruồi đục quả…, cryIII gây
độc tính lên ấu trùng bộ cánh cứng Coleoptera, gồm các loại côn trùng như
câu cấu, xén tóc đục thân…, cryIV gây độc tính lên ấu trùng bộ hai cánh
Diptera, cryV hại ấu trùng Lepidoptera và Coleoptera, cryVI diệt tuyến trùng
[33].
Trong thời gian gần đây, các gen mã hóa cho protein gây độc cho côn
trùng đã phân lập được và chuyển chúng vào cây trồng, tạo cây trồng chuyển
gen. Năm 1996 là năm đầu tiên cây trồng chuyển gen Bt được trồng với quy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
mô lớn tại Mỹ [39]. Từ đó tới nay cây chuyển gen không ngừng tăng lên về
chủng loại, bao gồm các cây trồng như ngô, bông, cà chua, khoai tây, lúa,
súp lơ, rau riếp, đậu tương [54]. Năm 2000, nhóm tác giả Bhattacharya (Ấn
Độ) đã chuyển thành công gen cryIA(c) vào cây bắp cải [12].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng đang được tiếp
cận, đầu tư nghiên cứu với sự chú trọng đặc biệt. Từ năm 1997, một số nghiên
cứu chuyển gen đã được tiến hành trên cây thuốc lá [4]. Sau đó các nghiên
cứu thiết kế vectơ phục vụ chuyển gen vào thực vật trong đó có thiết kế vectơ
mang gen cryIA(c) cũng đã được thực hiện [3]. Năm 2001, Đặng Trọng

Lượng và cs đã tiến hành thiết kế vectơ mang gen cryIA(c) để đưa vào cây
bắp cải thông qua vi khuẩn A. tumefaciens[5]. Hiện nay, việc nghiên cứu
chuyển gen kháng sâu, trong đó có gen cryIA(c) vào cây trồng ở nước ta là rất
thiết thực [2].
Xuất phát từ thực tiễn nêu trên và để phục vụ cho công tác chuyển gen
tạo cây trồng kháng sâu ở Việt Nam nói chung và chuyển gen tạo cây trồng
kháng sâu tại Thái Nguyên nói riêng. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu thiết kế vectơ pB2GW7 mang gen cryIA(c) và đánh giá khả
năng chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo vectơ pB2GW7 mang gen cryIA(c) và đánh giá khả năng chuyển
gen trên cây Arabidopsis thaliana.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nhân dòng gen cryIA(c) từ vectơ OB-Mutant#16-cryIA(c)
+ Nhân gen cryIA(c) từ vectơ pOB-Mut-cryIA(c);
+ Gắn gen cryIA(c) lên vectơ tách dòng pENTR
™
/D-TOPO
®
;

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
+ PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc thu được sau nhân dòng với cặp mồi
đặc hiệu củ gen cryIA(c);
+ Xác định trình tự đoạn ADN được nhân dòng.
- Nội dung 2: Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A.
tumefaciens) mang vectơ pB2GW7-cryIA(c).
+ Gắn gen cryIA(c) lên vectơ chuyển gen pB2GW7;

+ Phân tích các dòng tế bào E. coli thu được sau chọn lọc;
+ Biến nạp vectơ pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A.
tumefacicens;
+ PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau biến
nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c).
- Nội dung 3: Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ
pB2GW7-cryIA(c) trên cây Arabidopsis thaliana (A. thaliana).
+ Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên khả năng kháng thuốc
diệt cỏ;
+ Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp
mồi đặc hiệu của gen bar;
+ Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp
mồi đặc hiệu của gen cryIA(c);
+ Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây A. thaliana chuyển gen.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn A. tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng
Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ
đã được thiết kế dạng plasmid tái tổ hợp, gắn vào hệ gen của tế bào chủ.
Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng, từ đó
xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang gen chuyển [9].
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau
như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện, dùng siêu âm, dùng vi tiêm, dùng
vi khuẩn A. tumefaciens, Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn
A. tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Đây
chính là phương pháp được chúng tôi sử dụng để chuyển gen vào cây

Arabidopsis thaliana (A. thaliana) [9].
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn A. tumefaciens
A. tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình
chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm, đặc biệt là thực vật có
hoa và một số ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae.
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối tế bào được vi
khuẩn A. tumefaciens chuyển gen vào phát triển mạnh ngay trong điều kiện
cây thiếu hoormon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Đó là do vectơ này đã
chuyển một đoạn T-DNA (Transfer DNA) sang tế bào thực vật và đoạn ADN
này chứa những gen điều khiển quá trình sinh tổng hợp các hoormon sinh
trưởng đó. Tế bào khối u tổng hợp amino acid và các dẫn xuất của đường
được biết đến như là opine [35]. Các loại opine được tổng hợp trong tế bào
khối u gồm nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine, thành
phần và tỷ lệ các loại opine này tùy thuộc vào dòng vi khuẩn A. tumefaciens
khởi đầu sự hình thành khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có
nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
Do đó, nhiều dòng A. tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine
hoặc nopaline [34].
Nghiên cứu về hiện tượng gây khối u này, thấy rằng khả năng chuyển
đoạn T-DNA vào hệ gen thực vật của A. tumefaciens là dựa vào chức năng
của Ti-plasmid. Khi phát hiện ra Ti-plasmid và khả năng của nó, người ta đặc
biệt chú ý khai thác và sử dụng chúng để tạo nên các vectơ chuyển gen, để
chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo ra cây trồng mang những tính
trạng mong muốn [1]. Để làm được điều này, các nhà khoa học đã loại bỏ
toàn bộ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-DNA chỉ giữ lại những
trình tự cần thiết cho quá trình chuyển gen như vùng vir và các trình tự biên

của vùng T-DNA.
1.1.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid (tumor inducing) là một cấu trúc ADN vòng có kích thước
khoảng 200 - 250 kb, có nguồn gốc từ một loài vi khuẩn đất là A. tumefaciens
có khả năng gây bệnh khối u ở thực vật. Đặc điểm quan trọng của Ti-plasmid
là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể, nhưng cũng có thể tồn tại độc lập
bên ngoài nhiễm sắc thể [46].
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng vi khuẩn A. tumefaciens
gây độc. Chúng được duy trì ổn định trong vi khuẩn này ở nhiệt độ dưới 30
o
C.
Bằng phương pháp lai ADN lập bản đồ chuỗi kép dị hợp, người ta đã xác định
được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng và được ký hiệu là vùng A, B, C và
vùng D [35].
Vùng A luôn được chuyển sang tế bào thực vật nên được gọi là vùng T-
ADN;
Vùng B liên quan đến quá trình tái sinh của tế bào vi khuẩn;
Vùng C liên quan đến quá trình tiếp hợp của tế bào vi khuẩn;
Vùng D được gọi là vùng gây độc (virulence region), vùng này chứa các
gen vir giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của
thực vật.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6

Hình 1.1. Những nét chính của một Ti-plasmid [35], [46]
A) Cấu trúc pTiC58
B) Cấu trúc chung của T-ADN
Trong khi tấn công vào tế bào xung quanh vết thương của thực vật, vùng
T-DNA của vectơ Ti-plasmid được chuyển vào tế bào thực vật và gắn ổn định
trong hệ gen nhân. Số lượng bản sao và vị trí gắn của T-DNA trong hệ gen
nhân là hoàn toàn ngẫu nhiên [46].
Vùng T-DNA có kích thước từ 10 - 25 kb, nằm kẹp giữa hai trật tự biên
25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái LB (left border) và biên phải

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
RB (right border). Toàn bộ phần ADN được giới hạn giữa hai trình tự biên
này đều được chuyển sang tế bào thực vật, quá trình chuyển này được định
hướng bởi hai trình tự biên. Sự định hướng này rất quan trọng, nếu thiếu 2
trình tự biên này việc chuyển gen sẽ kém hiệu quả. Trong các gen được mã
hóa ở vùng T-DNA có 3 gen rất quan trọng trong việc phát triển khối u: một

gen mã hóa enzyme AMP - isopentenyl transferase và 2 gen mã hóa cho
enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane - 2 mono oxygenase
và acetamid hydrolase). Sự hoạt động của các gen này sẽ kích thích sự phân
chia của các tế bào thực vật tạo nên khối u ở thực vật [46].
Vùng vir có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển T-DNA sang tế
bào thực vật. Vùng này có kích thước khoảng 40 kb và bao gồm 6 operon: A,
B, C, D, E và G trong đó operon A, B, D và G là hoàn toàn cần thiết cho việc
tạo ra độc tính còn vir C và E liên quan đến việc hình thành khối u. Trừ vir G
và A là đơn cistron còn lại các operon khác đều là đa cistron. Hoạt động của
các operon này có liên quan chặt chẽ đến sự có mặt các hợp chất phenol được
tiết ra từ vết thương của cây. Từ vết thương cây thuốc lá người ta đã tinh chế
và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và α –
hydroxyacetosyringon [46].
1.1.3. Cơ chế quá trình chuyển gen nhờ A. tumefaciens
Đoạn T-DNA muốn chuyển vào tế bào thực vật, trước tiên nó phải được
hoạt hóa, chính hoạt động của các gen trong vùng vir sẽ đảm nhiệm vai trò
này. Hiện tượng này xảy ra khi vi khuẩn A. tumefaciens tiếp xúc với chất
phenol được tiết ra từ vết thương của cây như: Acetosyringon, hydroxy -
acetosyringon. Trong tế bào vi khuẩn A. tumefaciens gen vir A luôn hoạt động
và tạo ra protein vir A. Protein này nằm trong màng tế bào vi khuẩn, đóng vai
trò như một chất thụ cảm với chất Acetosyringon được tiết ra từ vết thương
của thực vật. Tín hiệu do protein này cảm nhận được sẽ được truyền dẫn qua
sự hoạt hóa gen virG. Gen này được hoạt hóa sẽ tổng hợp lên protein vir G,
protein này được gắn vào gen chỉ huy nằm sát gen khởi động thuộc các gen
vir khác. Bằng cách như vậy, protein của gen virG đã được hoạt hóa làm tăng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
quá trình phiên mã của chính nó, đồng thời làm giảm quá trình của các operon

B, C, D và E [51].
Trong tiến trình chuyển T-ADN, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt
trên Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, bắt đầu từ đầu phía biên phải, ở vị trí
giữa bazơ nitơ thứ ba và thứ tư của mạch đơn nằm phía dưới. Từ đó mạch đơn
T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay thế vào đó là một mạch
đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’ - 3’, bắt đầu từ chỗ đứt ở trật tự biên
phải. Điều này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển
T-ADN. Operon D chủ yếu mã hóa cho một loại endonuclease tạo ra các vết
cắt nói trên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng
cường nhờ sự tương tác giữa protein vir D2 với một hoặc hai protein do gen
vir C mã hóa. Protein do gen vir E mã hóa gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi
được cắt ra, để làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào
thực vật. Phức hợp protein - mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc
chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Gen vir B mã hóa cho hơn 11 loại
protein, các protein này tham gia hình thành nên cầu nối cho phức hợp protein
- mạch đơn T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật [51].










Hình 1.2. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật [51]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
1.1.4. Một số hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Hệ thống chuyển gen in vitro
Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro là phải
có được sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của A. tumefaciens và khả năng tái
sinh của các tế bào sau khi lây nhiễm với vi khuẩn [13].
Kết hợp tác động của một số tác nhân trong quá trình biến nạp sẽ cải
thiện hiệu quả của hệ thống chuyển gen in vitro:
- Kết hợp với xử lý sóng siêu âm
Xử lý mô thực vật với A. tumefaciens trong điều kiện sóng siêu âm tạo ra
các tổn thương nhỏ ở mô thực vật, cho phép vi khuẩn này dễ dàng xâm nhập
vào mô tế bào thực vật. Bằng phương pháp này đã cái thiện rõ rệt hiệu quả
chuyển gen, biểu hiện gus tạm thời đã tăng từ 100 lên 1400 lần ở các tế bào
đậu tương, đậu đũa, cây vân sam trắng, lúa mỳ và ngô [57].
- Kết hợp với ly tâm tế bào
Khi chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens kết hợp với ly tâm ở giai
đoạn đồng nuôi cấy đã làm tăng đáng kể tần số chuyển gen [43].
Hệ thống chuyển gen in vivo
Trong hệ thống chuyển gen in vivo người ta tiến hành chuyển gen vào
nguyên cây, đây là phương pháp rất phổ biến đối với loài A. thaliana, một
trong những cây mô hình đối với các nghiên cứu về kỹ thuật di truyền.
Phương pháp này tốn ít thời gian, bỏ qua giai đoạn nuôi cấy mô và tái sinh
sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến dị soma và số lượng cây chuyển thu
được lớn hơn. Kỹ thuật này đã được mô tả ở các cây trồng khác như: đậu
tương, A. thaliana, hoa hướng dương, hoa rum và cây lạc [52].
- Chuyển gen vào hạt
Hạt cây A. thaliana được lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens sau đó
đem trồng và phân tích thu được tần số biến nạp đạt 1% [41].
- Chuyển gen vào cụm hoa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
Một số nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở cây A. thaliana bằng
cách ngâm cụm hoa non trong dịch vi khuẩn A. tumefaciens [21]. Năm 2006,
Chumakov đã chuyển thành công gen nptII vào cây ngô AT-3 bằng cách xử lý
râu ngô của các cây ngô đang sinh trưởng trên đồng ruộng với dịch vi khuẩn
A. tumefaciens chủng GV3101. Phân tích bằng kĩ thuật PCR cho thấy khoảng
6,8% các cây con nảy mầm các hạt thu được ở trên mang gen nptII [19].
- Thấm lọc chân không
Trong điều kiện chân không, sự tiếp xúc giữa A. tumefaciens với tế bào
thực vật sẽ tốt hơn. Đây chính là một điều kiện tốt giúp tăng khả năng chuyển
gen vào thực vật. Năm 2000, Trieu đã chuyển gen thành công vào cây
Medicago truncatula (cây mô hình thuộc họ đậu) phương pháp này[58].
1.2. Vectơ chuyển gen dựa trên Ti-plasmid














Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống vectơ chuyển gen dựa trên Ti-plasmid [45]

(A) vectơ liên hợp và (B) vectơ nhị thể
Vir: vùng gây độc; goi: các vùng tương đồng mà trong phạm vi đó sự tái
tổ hợp (trao đổi chéo) có thể xảy ra để dẫn đến sự hợp nhất giữa hai plasmid;
RB và LB: các đoạn trật tự bên phải và trái 25 bp của T-DNA (LB hoặc RB
hoặc cả hai có thể có ở vectơ trung gian)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
Ti-plasmid không được dùng trực tiếp cho quá trình chuyển gen vì nó có
kích thước lớn và mang các gen gây khối u, hơn thế nữa ADN của Ti-plasmid
có quá nhiều vị trí cắt của enzym giới hạn gây khó khăn cho việc gắn gen và
kiểm tra vị trí gắn gen [61]. Cấu trúc của Ti-plasmid có thể cung cấp cho ta
những yếu tố cần thiết để thiết kế những vectơ hữu ích cho kỹ thuật chuyển
gen. Thường người ta hay sử dụng các Ti-plasmid, mà trong đó vùng T-DNA
gây khối u đã bị tách bỏ và thay thế vào đó là các gen trội chỉ thị chọn lọc -
thường là các gen của vi khuẩn có khả năng kháng chất kháng sinh như
kanamycin, ampicilin [11]. Trước đây người ta hay dùng các gen chỉ thị
được kiểm soát bởi promotor và các tín hiệu polyadenin hóa được tách ra từ
các gen vùng T-DNA như octopine synthase hay nopaline synthase. Gần đây,
người ta hay sử dụng các promotor mạnh hơn được tách ra từ virus khảm bắp
cải, như CaMV35S và CaMV19S. Tuy nhiên, kích thước lớn của Ti-plasmid
rất khó khăn cho việc gắn trực tiếp một phân đoạn ADN vào vùng giữa hai
trật tự biên. Để giải quyết khó khăn này, hai hệ thống vectơ không gây khối u
(hệ thống vectơ nhị thể và hệ thống vectơ liên hợp) đã được thiết kế. Hai hệ
thống này khác nhau ở chỗ: vùng gen vir và hai trật tự biên (LB và RB) cùng
nằm trên một đơn vị tái bản (plasmid) hay trên hai đơn vị khác nhau.
* Hệ thống vectơ liên hợp (co intergrate vectơ)
Đây là loại vectơ được tạo nên do sự hợp nhất của vài ba loại plasmid
khác nhau trước khi nó được biến nạp sang tế bào thực vật. Năm 1983,

Zambryski đã thiết kế thành công vectơ liên hợp pGV3850, đến này hệ thống
này vẫn được ứng dụng rộng rãi [61].
Hệ thống này bao gồm 2 plasmid: Plasmid thứ nhất là Ti-plasmid thể
nhận pGV3850, có nguồn gốc từ pTiC58. Nó chứa vùng gen vir, vùng T-
DNA mà ngoài hai đoạn biên LB và RB cùng một số gen chỉ thị được giữ lại,
còn thì loại bỏ hết (vì thế không có khả năng gây khối u và được thay thế vào
đó là một đoạn tương đồng với đoạn có trên plasmid thứ hai (gọi là plasmid

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
trung gian). Đoạn được thay thế này thực ra là một plasmid như pBR322 của
vi khuẩn E. coli [61].
Plasmid thứ hai (plasmid trung gian) pGV1103, là một plasmid đã được
tách dòng nhờ vi khuẩn E. coli dựa trên vectơ pBR322, và có thể tái sinh
được ở A. tumefaciens [61].
Sau khi được trộn lẫn với nhau, giữa hai loại plasmid xảy ra sự tiếp hợp
nhờ đoạn khởi đầu EcolEI có trong pGV1103. Quá trình tiếp hợp dẫn đến sự
hợp nhất giữa hai loại plasmid nhờ hiện tượng trao đổi chéo xảy ra giữa các
vùng tương đồng của hai loại plasmid pGV1103 và pGV3850. Vì thế vectơ
liên hợp chứa toàn bộ vectơ trung gian trong đó có chứa gen cần chuyển vào
tế bào thực vật [61].
* Hệ thống vectơ nhị thể
Khác với hệ thống vectơ liên hợp, ở hệ thống vectơ nhị thể đoạn T-DNA
và đoạn mang gen vir nằm trên hai plasmid khác nhau. Mặc khác, nó không
có chứa đoạn tương đồng với Ti-plasmid và có khả năng tái bản độc lập trong
cả tế bào E. coli và A. tumefaciens. Đây là ưu điểm của hệ thống vectơ này so
với vectơ liên hợp. Năm 1984, Bevan thiết kế hệ thống vectơ nhị thể pBin19,
đến nay hệ thống vectơ này vẫn còn được dùng phổ biến [11]
Đoạn ADN cần chuyển vào tế bào thực vật nằm kẹp giữa hai trật tự biên

RB và LB. Nó gồm một gen khảm Pnos-NPT(II) 3’ ocs và trật tự polylinker
được tổng hợp bằng con đường hóa học để gắn gen cần chuyển. Gen khảm
này được tao ra bằng cách gắn promotor nopaline (Pnos) vào đoạn mã hóa
enzyme neomycin phosphatransferse II thuộc gen TN5 (NPT-II) của vi khuẩn
và ghép thêm vào đó đoạn kết 3’ của octopine synthase (3’ ocs) [11].
Hệ thống vectơ này được thiết kế từ hai loại plasmid: Plasmid thứ nhất
có nguồn gốc từ pUC19 của vi khuẩn E. coli mang đoạn T-DNA chỉ còn lại
hai trật tự biên RB và LB (toàn bộ phần gen gây khối u đã bị loại bỏ) và một
trật tự nucleotit đặc trưng cho sự nhận biết của enzyme giới hạn - dùng để gắn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
kết gen cần chuyển hoặc các gen chỉ thị cho sự chọn lọc trong tế bào vi khuẩn
hoặc trong tế bào thực vật [45].
Plasmid thứ hai đóng vai trò hỗ trợ là Ti-plasmid, plasmid này đã được
loại bỏ toàn bộ vùng T-DNA (kể cả hai trật tự biên) nhưng vẫn còn giữ lại vùng
gen vir. Vùng gen vir này đóng via trò quan trọng cho việc chuyển của vectơ
nhị thể. Vì thế plasmid thứ hai này có tên gọi là plasmid tái tổ hợp. Loại
plasmid thứ nhất sau khi được nhân lên trong tế bào E. coli thì được chuyển
sang A. tumefaciens chứa loại plasmid thứ hai bằng quá trình tiếp hợp [45].
Nếu như trong vectơ nhị thể nói trên có mang gen chỉ thị kháng
kanamycin và gen GUS thì sau khi các gen này được biến nạp vào mô thuốc
lá, chỉ có những tế bào cây được biến nạp mới có khả năng sống sót trên môi
trường chứa kanamycin. Và sau đó, các mô được tái sinh từ các tế bào được
biến nạp, do có chứa gen GUS nên sẽ sản sinh ra β - glucuronidase có khả
năng phân hủy X-gluc thành một hợp chất trung gian mà khi bị oxy hóa sẽ tạo
ra chất indogo màu xanh đặc trưng [45].
Nếu so sánh hai hệ thống vectơ nói trên với nhau ta thấy rằng giữa chúng
có hai điểm khác nhau như sau: (1) Ở hệ thống vectơ liên hợp, vùng T-DNA

và vùng vir cùng nằm trên một plasmid, trong khi đó ở hệ thống vectơ nhị thể
chúng nằm trên hai vectơ khác nhau; (2) Trước khi chuyển sang tế bào thực
vật, vectơ liên hợp xảy ra sự hợp nhất giữa Ti-plasmid thể nhận với vectơ
trung gian bằng quá trình trao đổi chéo, trong khi ở vectơ nhị thể không xảy
ra quá trình hợp nhất này [45].
1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua A.
tumefaciens
Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào rất
nhiều yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc, sàng lọc và khả năng tái
sinh của các mẫu mô chuyển gen. Đối với phương pháp chuyển gen thông qua