đánh giá hiệu lực của arterakin đối với plasmodium falciparum và kháng chloroquin bằng kỹ thuật pcr tại quảng trị, đăk nông năm 2008-2010

đặt vấn đề
Sự xuất hiện của artemisinin (ART) và dẫn xuất vào đầu thập kỉ 70 đã
làm thay đổi hẳn tình hình bệnh sốt rét (SR) trên toàn cầu nói chung và ở Việt
nam nói riêng. Sau vụ dịch năm 1991 làm hơn 1 triệu ngời mắc và 4646 ca tử
vong. với những nỗ lực vợt bậc, chơng trình phòng chống sốt rét (PCSR) của
Việt Nam đã đạt đợc những kết quả đáng kể. Tính đến tháng 11 năm 2010 tỷ
lệ tử vong do sốt rét ở Việt Nam chỉ còn 0,07/ 100.000 dân so với 0,12/
100.000 dân của năm 2001 [11], [14], [28].
Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây về kí sinh trùng sốt rét (KSTSR)
kháng thuốc của Tổ chức Y tế thế giới cho thấy đã có sự giảm hiệu lực điều trị
của artesunat (AS) tại biên giới Thái Lan - Campuchia, Thái Lan - Myanmar
(Noedl, Socheat 2009 và Lim 2010). Đây là các nớc thuộc khu vực tiểu vùng
sông Mekong (GMS) [5], [40], [73], [81].
Việt Nam là một trong 6 nớc thuộc GMS với trên 27,4 triệu dân sống
trong vùng có lu hành SR, có đờng biên giới giáp Lào, Campuchia là khu vực
có hiện tợng P. falciparum kháng chloroquin (CQ) và fansidar ở mức độ cao.
Tình trạng giảm hiệu lực của các thuốc trong nhóm ART cũng đã đợc các tác
giả trong nớc nghiên cứu và phát hiện (Huong et al 2001) [68]. Báo cáo gần
đây của Tạ Thị Tĩnh, Nguyễn Mạnh Hùng năm 2010 về hiệu lực điều trị của
AS đờng uống tại Đak Nhau, Bù Đăng, Bình Phớc cho thấy tỷ lệ đáp ứng lâm
sàng tốt chỉ còn 87,5% [38], [39].
Sự giảm hiệu lực của các thuốc nhóm ART sau hơn 20 năm sử dụng là
một quan tâm đặc biệt của WHO trong khi hiện nay cha có một loại thuốc SR
mới nào có hiệu lực cao tơng tự thay thế [38], [116].
Chiến lợc Đẩy lùi sốt rét đợc WHO phát động từ 2001 trong đó nổi
bật là khuyến cáo về sử dụng thuốc mà một trong những nội dung trọng tâm là
1
sử dụng các thuốc phối hợp có ART hoặc dẫn chất với một thuốc khác gọi tắt
là ACT (artemisinin based combination therapy). Thực hiện khuyến cáo của
WHO, chơng trình PCSRQG đã thay thế các phác đồ đơn trị liệu trớc đây
bằng các ACT trong đó có Arterakin, một thuốc phối hợp gồm 2 thành phần

dihydroartemisinin và piperaquin [44], [53], [117].
Việc giám sát hiệu lực của các thuốc sốt rét đồng thời đánh giá tình
trạng kháng thuốc của P. falciparum với các thuốc khác bằng các kĩ thuật
hiện đại nh Sinh học phân tử cũng là một mục tiêu quan trọng của WHO.
Những thông tin gần đây cho thấy có sự nhạy cảm trở lại của P. falciparum
với CQ. Piperaquin, một thành phần của Arterakin cũng là thuốc tơng tự CQ,
liệu có sự khác biệt nào về hiệu lực của Arterakin trên bệnh nhân mắc SR do
P. falciparum có kháng và không kháng CQ không ?
Chính vì vậy, nghiên cứu này nhằm đạt tới 2 mục tiêu sau:
1. Đánh giá hiệu lực điều trị của Arterakin trên bệnh nhân sốt rét do P.
falciparum cha biến chứng tại Quảng Trị và Đăk Nông
2. Đánh giá kháng chloroquin từ các chủng phân lập của P. falciparum tại
điểm nghiên cứu bằng kĩ thuật PCR.
2
Chơng 1
Tổng quan
1.1. Kí sinh trùng sốt rét và sốt rét kháng thuốc
1.1.1. Đại cơng về kí sinh trùng sốt rét.
Các loài KSTSR:
Kí sinh trùng sốt rét gây bệnh cho ngời có tên khoa học là Plasmodium
thuộc họ Plasmodidea, một dạng đơn bào kí sinh trong máu. Có tới 120 loài
thuộc Plasmodidea đợc phát hiện ở động vật bò sát, chim, và động vật có vú
nh chuột và linh trởng. Ngời không nhiễm KSTSR của chim, động vật bò sát
và một số động vật có vú khác do có miễn dịch tự nhiên [11], [65].
Có 4 loài kí sinh trùng sốt rét cổ điển gây bệnh cho ngời
P. malariae (Laveran, 1881)
P. vivax (Grassi & Feletti, 1890)
P. falciparum (Welch, 1897)
P. ovale (Stephen, 1922)
Tuy nhiên trong vòng 15 năm gần đây P. knowlesi đợc nhắc đến nhiều

ở một số nớc thuộc khu vực Đông Nam châu á khi phát hiện thấy ở ngời. P.
knowlesi đợc phát hiện năm 1931 ở khỉ, năm 2004 thấy ở ngời tại Malaysia,
Singapor, Thailand, Myanmar. Năm 2007 phát hiện ở Việt Nam. Hiện cha xác
định đợc kí sinh trùng (KST) này có lây truyền từ ngời sang ngời hay chỉ lây
từ khỉ sang ngời. Về hình thể P. knowlesi dễ nhầm với P. malariae, sự phân
biệt hai loại KST này chỉ xác định đợc bằng kĩ thuật sinh học phân tử [11],
[47].
Đặc điểm chung của các KSTSR là kí sinh bắt buộc trong hồng cầu
(HC) ngời và động vật có xơng sống. Tuy vậy vật chủ chính là muỗi
3
Anopheles do chu kì sinh sản hữu tính của KST xảy ra ở muỗi. Sự tồn tại trong
cơ thể ngời tùy thuộc vào từng loại KST. Nếu không đợc điều trị và không
chuyển thành sốt rét ác tính (SRAT) thì P. falciparum tồn tại từ 1-2 năm, P.
ovale và P. vivax từ 1-5 năm, P. malariae từ 3-50 năm [12], [64].
Ct: Miệng; Im: Màng trong; M: Ty lạp thể; Mn: Sợi trục; Mt: Các vi ti ống dẫn dới màng;
N: Nhân; Pr: Chóp tận cùng; Rh: Túi electron; Sb: Thể hình cầu (Hốc thực bào).
Hình 1.1 Sơ đồ mô phỏng cấu trúc KSTSR của Aikawa và Seed 1980
KSTSR có kích thớc khoảng 15nm x 10nm. Màng ngoài đợc bao phủ
bởi một lớp áo bề mặt dày 20nm, đậm đặc điện tử và các sợi fibrin. Lớp áo
này có thể bị tác động bởi Trypsin. Lớp áo ngoài này đóng một vai trò nhất
định trong việc bảo vệ KST trớc đáp ứng của hệ thống miễn dịch của vật chủ
[11], [64], [96].
4
Các nghiên cứu của Aikawa cho thấy chóp tận cùng và túi electron có
vai trò quan trọng trong việc giúp KST thâm nhập qua màng tế bào HC. Sự
thay đổi độ dày đặc của electron ở chóp tận cùng làm thay đổi điện thế màng
HC, giúp KST chui qua màng dễ dàng. Thể hình cầu là các không bào tiêu
hóa. Cấu trúc dạng sợi chạy dọc tế bào giúp cho hình thể KST đợc vững chắc.
Ty lạp thể của KST cũng là một cấu trúc quan trọng trong chuyển hóa. chúng
có số lợng vách ngăn nhiều hơn so với ty lạp thể của các động vật có xơng

sống khác. Có thể đây là yếu tố giúp KST sử dụng Glucose tốt hơn ngay cả
trong môi trờng yếm khí, làm giảm đờng máu trong các trờng hợp SRAT
[42], [64], [96].
Chu kì sinh học của KST:
Thoa trùng sau khi đợc truyền từ muỗi sang ngời sẽ tồn tại trong máu
khoảng 30 phút rồi nhanh chóng xâm nhập vào tế bào gan. Đây là giai đoạn
ngoại hồng cầu, hay còn gọi là thời kì ủ bệnh không có triệu chứng, thời kì
này khác nhau ở từng loại KST. Tại gan KST nhân lên vô tính tạo thành
Merozoite, số lợng các Merozoite đợc tạo thành trong cùng một khoảng thời
gian ở tế bào gan cũng khác nhau tùy theo từng loại KST trong đó P.
falciparum có số lợng nhân lên nhiều nhất. Sau khi nhân lên ở tế bào gan các
Merozoite phá vỡ tế bào gan xâm nhập vào HC. Tại đây KST phát triển thành
các thể t dỡng non (Trophozoite) và trởng thành rồi thành thể phân liệt
(Schizonts) non và già phá vỡ HC nhiễm và xâm nhập vào HC khác gây cơn
sốt rét điển hình [12]. [64].
5
Hình 1.2. Chu kì sinh học của KSTSR (CDC 2004)
Số lợng các thể phân liệt trong máu cũng khác nhau với từng loại KST,
P. falciparum là loài có số lợng nhiều nhất, trung bình khoảng 20.000-
500.000/ mm
3
, gấp 3 lần P. vivax và 10 lần P. malariae [12], [64]. Sau khoảng
8-10 ngay, kể từ cơn sốt đầu tiên, một số mảnh phân liệt biệt hóa thành giao
bào đực và giao bào cái (Gametocyte). Giao bào đực và giao bào cái đợc muỗi
Anopheles hút vào dạ dày, ở đấy giao bào cái phát triển thành giao tử cái, giao
bào đực phát triển kéo dài thành 4 -8 thể roi. Mỗi roi là một giao tử đực trởng
thành. Giao tử đực và giao tử cái hòa hợp với nhau tạo thành trứng (Ookinete).
Trứng di chuyển xuyên qua thành dạ dày muỗi và phát triển dới lớp thanh mạc
6
Chu kỳ hồng cầu

Chu kỳ ở muỗi
Chu kỳ ở gan
Giai on gan
Giai on mỏu
mặt ngoài của dạ dày (Oocyste). Trứng lớn dần lên, nhân và nguyên sinh chất
phân chia phát triển thành nhiều thoa trùng hình thoi (Sporozoite). Trứng vỡ,
thoa trùng đến tập trung ở tuyến nớc bọt muỗi. Khi muỗi đốt ngời, thoa trùng
theo đó vào cơ thể tiếp tục thực hiện giai đoạn sinh sản vô tính ở ngời [11],
[12], [64].
Khả năng gây bệnh:
Bốn loại KST cổ điển đều có đặc điểm chung là gây bệnh sốt rét nhng
diễn biến bệnh thì khác nhau tuỳ từng loại KST. Nếu không đợc điều trị kịp
thời thì SR do P. falciparum sẽ chuyển từ SR cha biến chứng thành sốt rét
biến chứng các phủ tạng (SRAT) gây tử vong. SR do P. ovale, P.vivax không
chuyển thành SRAT nhng lại gây tái phát xa. P. falciparum có thể tồn tại
trong cơ thể từ 1-2 năm, P. ovale và P. vivax từ 1-5 năm, P. malariae từ 3-50
năm [11], [25], [64], [105].
Biểu hiệu lâm sàng chỉ thực sự xuất hiện ở giai đoạn nội HC, khi KST
nhân lên và phá vỡ HC hàng loạt sau 8-10 ngày kể từ lúc bị muỗi đốt. Triệu
chứng chung của bệnh SR cha biến chứng là các cơn sốt cao, rét run có tính
chu kì hoặc 24 giờ một cơn, hoặc 48 giờ (sốt cách nhật) tuỳ theo từng loại
KST. Cơn SR điển hình có 3 giai đoạn sốt rét run, sốt nóng, vã mồ hôi, thiếu
máu, lách to. Khi bị SRAT, ngoài các triệu chứng trên còn có các triệu chứng
nặng nh suy sụp đa phủ tạng, hôn mê, suy gan thận cấp do KSTSR làm tổn th-
ơng thực thể các phủ tạng dẫn đến tử vong [2], [104],
Có sự liên quan rõ ràng giữa dáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ với
tình trạng nhiễm KSTSR và mức độ nặng, nhẹ của bệnh. Ngời có miễn dịch
thờng có biểu hiện lâm sàng không điển hình, cơn sốt không mang tính chất
đặc thù của SR. Hiệu quả điều trị ở ngời có miễn dịch cũng cao hơn ở ngời
không có miễn dịch. Muỗi đốt ngời đã có miễn dịch thì giao bào cũng bị ức

chế trong quá trình sinh sản hữu tính ở dạ dày muỗi. Trẻ sinh ra từ những bà
mẹ bị SR tái đi tái lại cũng có miễn dịch thụ động do IgG từ mẹ truyền cho
7
trong quá trình mang thai, tuy nhiên miễn dịch này chỉ tồn tại 3-6 tháng [12],
[77]. Mặc dầu vậy miễn dịch trong SR (cả miễn dịch dịch thể lẫn tế bào)
không bảo vệ đợc cơ thể tránh mắc bệnh SR mà chỉ ức chế quá trình phát triển
của KST. Kháng thể đặc hiệu sẽ giảm dần sau khi tác nhân gây bệnh bị loại
khỏi cơ thể [77], [98].
1.1.2 Các khái niệm liên quan tới kháng thuốc.
Trong vòng vài thập kỷ gần đây, vấn đề KSTSR kháng thuốc đã trở
thành một trong những cản trở chính đối với cuộc chiến chống lại bệnh SR
trên toàn thế giới. Tình trạng kháng thuốc đã đợc chính thức công nhận đối với
3 trong số 5 loại KSTSR gây bệnh cho ngời. Đó là P. falciparum, P. Vivax và
P. malariae, trong đó đáng kể nhất là P. falciparum kháng nhiều thuốc SR và
hiện đang là loài giảm nhạy cảm với ART và dẫn chất, một nhóm thuốc quan
trọng trong điều trị SR [21], [50], [100].
Sự đề kháng của một chủng KSTSR với một loại thuốc mà trớc đó vẫn
có tác dụng đợc định nghĩa nh sau:
" Khả năng một chủng KSTSR có thể sống sót và nhân lên mặc dù ngời bệnh
đã đợc điều trị và hấp thụ một liều lợng thuốc bằng hoặc cao hơn liều quy
định trong giới hạn chịu đựng của cơ thể " (WHO 1976)
Mức độ nhạy cảm của một thuốc đợc xác định theo nghiệm pháp in
vitro 28 ngày trớc đây Là mật độ KST giảm 75% sau 48 giờ điều trị so với
ngày đầu, sau đó sạch hẳn vào ngày thứ 6 và 7 không xuất hiện lại KST trong
vòng 28 ngày sau điều trị . Năm 1986, Bruce-Chwatt và cs đã bổ sung thêm
nh sau:
Một thuốc có tác dụng chống lại KSTSR là thuốc phải có khả năng thâm
nhập vào KST và HC bị nhiễm trong một khoảng thời gian nhât định[115].
Thất bại điều trị là một khái niệm sử dụng nhiều trong nghiên cứu
hiệu lực thuốc SR thời gian gần đây và đợc định nghĩa nh sau:

8
Thất bại điều trị là tình trạng một thuốc mất khả năng làm sạch KST trong
máu hoặc xuất hiện các triệu chứng nặng lên mặc dù đã đợc điều trị đủ liều
theo qui định [115].
Hiện tợng thất bại điều trị không đồng nghĩa với KSTSR kháng thuốc.
Thất bại điều trị còn do các nguyên nhân khác nh thuốc giả, thuốc quá hạn,
uống không đủ liều, sự dung nạp thuốc, đáp ứng miễn dịch v.v.
Kháng chéo là tình trạng KST kháng lại các thuốc có cấu trúc hoá học
hoặc cách tác động tơng tự nh nhau (các thuốc cùng nhóm)
Đa kháng là một chủng KST có khả năng kháng lại từ 2 thuốc khác
nhau về cấu trúc hoá học và cơ chế tác động trở lên (các thuốc khác nhóm nh
CQ và ART hoặc CQ và MEF).
Kháng một phần (kháng tơng đối) là tình trạng thuốc vẫn có tác dụng
nhng phải tăng nồng độ thuốc trong máu cao hơn liều thông thờng, trong giới
hạn chịu đựng của cơ thể.
Kháng hoàn toàn (kháng tuyệt đối) là khi nồng độ thuốc vợt quá ngỡng
chịu đựng của cơ thể mà vẫn không có tác dụng [5], [26], [106].
1.1.3 Kí sinh trùng sốt rét kháng thuốc và các yếu tố ảnh hởng tới kháng
thuốc.
Cho đến nay, đã có nhiều giả thuyết về cơ chế KSTSR kháng thuốc
song cha có một giả thuyết nào đợc khẳng định hoàn toàn.
+ Tăng khả năng thích nghi sinh lý, sinh hóa của KSTSR: Kiểu kháng
thuốc này không bền vững, khi dừng thuốc thì khả năng kháng thuốc của
KSTSR cũng mất dần.
+ Cơ chế kháng di truyền: Là sự xuất hiện đột biến điểm trên một gen
nào đó của KSTSR. Đột biến này quy định một loạt các đặc tính giúp KST
kháng lại một thuốc mà trớc đó vẫn có tác dụng diệt KST. Các đặc tính này đ-
ợc di truyền cho thế hệ sau. Kiểu kháng thuốc này xuất hiện hoàn toàn ngẫu
9
nhiên và bền vững không phụ thuộc vào sự có mặt hoặc tác động của thuốc Sự

đột biến diễn tiến qua 2 bớc. Bớc 1 là sự xuất hiện đột biến một cách ngẫu
nhiên, bớc 2 đột biến này đợc nhân bản lên nhiều lần. Kết quả là làm thay đổi
số lợng phiên bản copy của gen có vai trò xác định vị trí gắn của thuốc hoặc
gen quy định hoạt động của quá trinh bơm thuốc, làm giảm nồng độ thuốc
trong KST [43], [54].
+ Dựa vào cơ chế tác dụng của thuốc sốt rét: Cơ chế kháng một số loại
thuốc SR đã đợc làm rõ nh cơ chế kháng CQ, các sulfamides do biết đợc cơ
chế tác động của các thuốc này [75].
1.1.3.1 P. falciparum kháng thuốc.
Kháng chloroquin và các thuốc cùng nhóm (amodiaquin, PQP):
Cơ chế tác động của chloroquin:
Theo Fitch, KST tiêu hoá hemoglobin và tạo chất ferriprotoporphyrin
(FPIX, còn gọi là hematin), thông thờng chất FP gắn vào một protein của KST
để hình thành phức hợp FP + protein gắn hem tức hemozoin là một sắc tố
SR không độc. CQ cạnh tranh với protein gắn hem để hình thành phức hợp
(FP + CQ) phá huỷ màng lysosom và diệt KST. [46], [49]. Phân tích bằng kính
hiển vi điện tử cho thấy lysosome của KST là nơi bị tác động đầu tiên. CQ có
mặt Theo Fitch, KST tiêu hoá hemoglobin và tạo chất ferriprotoporphyrin
(FPIX, còn gọi là hematin), thông thờng chất FP gắn vào một protein của KST
để hình thành phức hợp FP + protein gắn hem tức hemozoin là một sắc tố
SR không độc. CQ cạnh tranh với protein gắn hem để hình thành phức hợp
(FP + CQ) phá huỷ màng lysosom và diệt KST. [5], [87]. Phân tích bằng kính
hiển vi điện tử cho thấy lysosome của KST là nơi bị tác động đầu tiên. CQ có
mặt trong bào tơng của KST có tính kiềm yếu pH 7.4 đợc hòa tan và thấm qua
màng vào môi trờng lysosome có tính axit, mất điện tích tạo thành QH
+
.
CQH
+
gắn vào ferriprotoporphyrin IX [78], [80].

10
Cơ chế kháng CQ của KST: Dựa vào cơ chế tác động của CQ là phá
huỷ màng Lysosom của KST. Hiện nay giả thuyết về kháng CQ của KST đợc
nhiều ngời chấp nhận là. Do đột biến gen. kiểu kháng này bền vững.
P. falciparum kháng CQ có liên quan chặt chẽ với các đột biến điểm
trên gen vận chuyển CQ (Pfcrt) nh M74I, N75E, K76T, A220S, Q271E,
N326S [46], trong đó đột biến tại điểm 76 trên gen Pfcrt (từ lysine thành
threonin) là liên quan chặt chẽ đến sự kháng thuốc [94]. Các nhà khoa học
cũng đã xác định một số điểm đột biến trên gen đa kháng (Pfmdr1), nh N86Y,
F184Y, S1034C, D1042N, D1246Y. Theo David A (2000) [60], các đột biến
này chỉ đóng vai trò điều chỉnh mức độ kháng CQ và tham gia vào cơ chế
kháng một số thuốc khác nh quinine, mefloquine, artemisinin [45], [46], [89].
Đột biến này dẫn tới sự thay đổi sau:
Đối với KST kháng chloroquin, Sự đột biến ở gen Pfcrt sẽ làm tăng hấp
thụ CQH
+
từ đó một lợng lớn CQ bị đẩy ra ngoài (và phản ứng trùng hợp
Hemozoin của KST không bị ảnh hởng).
Đột biến của Pfcrt còn làm giảm khả năng hấp thu AAH
+
từ đó làm
tăng sự tích tụ H
+
trong lysosom. Sự đột biến này làm rối loạn quá trình cung
cấp năng lợng cho hoạt động của bơm proton H
+
[46].
Sự đột biến này cũng làm rối loạn quá trình cung cấp năng lợng cho
hoạt động của bơm P.glycoprotein trên màng KST từ đó tăng đào thải CQ ra
ngoài nhiều gấp 4 lần [82], [84].

Ngoài ra chloroquin còn tác động tới phospholipase của KST, làm tăng
thấm qua màng từ đó CQ dễ thoát ra ngoài [59]. [68].
11
Nhạy với CQ Kháng với CQ
Hình 1.3. Sự chuyển hoá của chloroquin trong tế bào KST
Kháng các thuốc nhóm antifolates.
KST phân bào cần có ADN. Tiền chất của ADN là purin và pyrimidin
đợc tổng hợp nhờ dihydrofolat reductase acid (DHFR) và dihydropteroate
syntetase acid (DHPS). PABA (para amino benzoic acid) tham gia vào quá
trình tổng hợp DHFR. Các thuốc sulfon, sulfamid, proguanil, primethamin có
cấu trúc gần gũi với PABA nên cạnh tranh với PABA và hậu quả là làm
KSTSR không tổng hợp đợc DHFR và DHPS, từ đó cản trở quá trình tổng hợp
ADN, làm rối loạn quá trình nhân lên của KST [48], [72]. [74], [87].
Những nghiên cứu về di truyền ở Trung Mỹ và Thái Lan cho thấy sự đột
biến trên gen Pdhfr tại bộ mã Ser108Asn. Đột biến ở vị trí này quyết định tính
kháng pyrimethamin (làm thay đổi cấu trúc protein DHFR do thay thế
Isoleucine bằng Asparangin) [75], [88].
12
Cũng tơng tự nh vậy, những nghiên cứu ở Thái Lan với cycloguanil cho
thấy các chủng P. falciparum nào mang đột biến ở Pfdhfr thờng có số lợng
bản copy của gen Gch1 tăng cao. Gch1 mã hoá GTP- cyclohydrolase 1, một
Enzyme quan trọng trong sinh tổng hợp folate và biopterine. Kết quả là làm
Enzyme này mất hoạt tính[48]. [55]. [63].
Với sulfadoxin, cơ chế kháng của P. falciparum đợc xác định là liên
quan tới 5 điểm đột biến trên gen Pfdhps bao gồm các điểm Ser436Ala/Phe,
Ala437Gly, Lys540Glu, Ala581Gly, Ala613Thr/Ser. Đột biến ở điểm 437 và
540 đợc xác định là quyết định tính kháng lại các sulfamides của KST [102].
Kháng thuốc kết hợp pyrimethamin-sulfadoxin.
Cơ chế kháng pyrimethamine-sulfadoxine là ức chế lần lợt hai Enzyme
tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid folic do các đột biến quyết định tính

kháng trên gen Pfdhfr và Pfdhps (Kublin et al. 2002) [72]
Kháng amino- alcohol.
Các nghiên cứu của Price và cs năm 2002 và 2006 cho thấy mối liên
quan mật thiết của gen Pfmdr1 với sự kháng lại mefloquin, halofantrin khi số
lợng bản copy đột biến điểm tại Asn86Tyr trên gen Pfmdr1 tăng lên thì độ
nhạy của các thuốc này giảm đi. [89], [100].
Tại khu vực tiểu vùng sông Mekong, các nghiên cứu in vitro trên thực
địa cũng cho thấy các phác đồ kết hợp của AS + MEF và AM+LUM có tác
dụng chọn lọc những chủng P. falciparum hoang dại nào có chứa Alen Asn86,
(Dokomajillar et al, Happi et al 2009) [101].
Kháng atovaquone và các thuốc tơng tự.
Các nghiên cứu có ứng dụng sinh học phân tử của Musset năm 2006 đã xác
định đợc sự kháng lại Atovaquone có liên quan đến một đột biến đơn độc trên gen
13
cytochrom b (cytB) gồm các điểm Tyr268Asn, Tyr268Ser hoặc Tyr268Cys. Các
đột biến trên cytB làm tăng IC
50
của Atovaquone lên 1000 lần [79].
Kháng Quinine.
Cơ chế kháng Quinine của P. falciparum khá phức tạp. Các nghiên cứu
bằng kính hiển vi điện tử cho thấy ở chromosom 13 của P. falciparum có một
gen liên quan tới quá trình trao đổi các cation H
+
/Na
+
gọi là gen Pfnhe-1. Đột
biến tại điểm ms4760 của gen này liên quan tới ảnh hởng của quinine với
KST [83]. Cũng trong thời điểm này, nghiên cứu đơn dòng từ các chủng phân
lập ở thực địa của Reed và cs năm 2000 lại cho thấy mối liên hệ giữa đột biến
tại 4 điểm Asn86Tyr, Ser1034Syc, Asn1042Asp và Asp1246Tyr của nhiều

gen (Pfmdr1, Pfcrt, Pfnhe-1) với sự giảm nhạy cảm của quinin [67], [91].
Kháng artemisinin và dẫn chất.
Mặc dù cha khẳng định sự kháng với ART nhng s giảm nhậy cảm với
ART và dẫn chất đã đợc nói đến trong một số nghiên cứu gần đây. Arjen M.
Dondorp trong một nghiên cứu ngẫu nhiên mở năm 2007 tại biên giới Thailan
và Campuchia trên 40 bệnh nhân SR thờng bằng phơng pháp đánh giá hiệu lực
thuốc trên invivo và invitro sau đó phân biệt tái phát, tái nhiễm bằng PCR cho
thấy có sự khác biệt về thời gian sạch KST khi dùng liều artesunat (AS) khác
nhau ở mỗi nhóm [41], [58].
Artemisinin (ART) tác động lên các KSTSR bằng cách khử cầu nối
endo-peroxyd rồi giải phóng ra O
2
tự do. Các gốc tự do này sẽ ức chế tổng hợp
protein, gây vón kết nhân, màng nhân, ty lạp thể, lysosom của KST. Poonsakdi
và cs đã chỉ ra rằng men cystein proteaza trong các hốc thực bào của KST mất
hoạt tính do tác động của ART. Đồng thời cũng cho thấy, ART ức chế chuyển
hóa từ hemoglobin thành hemozoin trong KST [85].
14
Theo Nicholas P.J và một số tác giả khác đánh giá độ nhậy của AS trên
invitro bằng phơng pháp đồng vị, kết quả cho thấy là đột biến ở gen kí hiệu là
Pfmdr1 có khả năng gây đa kháng [56] Hoặc đột biến ở gen PfSERCA, gen
qui định sự vận hành của men calcium ATPase6 thuộc hệ lới nội mô [101].
Đột biến tại Ser769Asn của gen này đợc cho là nguyên nhân KST kháng
artemether. (đang đợc kiểm chứng) [82].
Một nghiên cứu khác cũng ở biên giới Campuchia và Thái Lan của
Imwong (2010) lại cho thấy các gen nằm trên ribosom có trọng lợng 6-kb và
gen Pfubp-1 có liên quan tới kháng ART và kháng chéo với các amino-
alcohols [69], [71].
1.1.3.2 P. vivax kháng thuốc.
Kháng chloroquin

Báo cáo đầu tiên về P. vivax kháng CQ vào năm 1980 tại Indonesia và
Paapa Newguinea.
Mặc dù vậy, cho tới nay CQ vẫn đợc sử dụng trong điều trị SR do P.
vivax ở tuyến đầu của nhiều quốc gia trừ Indonesia, quần đảo Salomon và
Vanuatu [110].
Các nghiên cứu về dợc động học đã cho thấy liều có hiệu lực điều trị
của CQ với P. vivax đã tăng lên 70-90ng/ml máu toàn phần. Nghiên cứu
của Borneo và Baerd năm 2009 ở Thái Lan đợc coi là có ý nghĩa về sự
kháng CQ của KST khi nồng độ CQ trong plasma lên > 100ng/ml mà vẫn
thất bại [51], [71].
Cơ chế kháng CQ của P. vivax là đột biến ở Tyr976Phe của gen
Pvmdr-1 [95].
15
Hình 1.4. Tình hình P. vivax kháng CQ và thất bại điều trị
Kháng mefloquine.
Mefloquine vẫn là thuốc có hiệu quả cao với P. vivax, sau một thời gian
sử dụng rộng rãi, gần đây một số nghiên cứu in vitro tại khu vực tiểu vùng
sông Mekong cho thấy tỷ lệ KST mang gen Pvmdr-1 tăng lên nhanh chóng,
đột biến tại Tyr976Phe của gen này đợc cho là liên quan tới mức độ nhậy
cảm của MEF và AS trong những nghiên cứu trớc đây [71],[112].
Kháng sulfadoxin - pyrimethamin.
Những nghiên cứu tế bào học về P. vivax kháng Sulfadoxin-
pyrimethamin cho thấy đột biến ở các điểm 57, 58, 61, 117 trên gen Pvdhfr
liên quan tới tỷ lệ thất bại điều trị của thuốc [74]. [93].
16
Kháng primaquine.
Mặc dù đã có những báo cáo về sự giảm nhậy cảm của primaquine với
P. vivax (Baird 2009). Cho đến nay thuốc này vẫn có hiệu quả cao với thể ngủ
của P.vivax, P. Ovale. Các nghiên cứu này cũng cho thấy độ nhậy của thuốc
khác nhau theo từng khu vực địa lý [50]. [82].

1.1.3.3. P. malariae và P. ovale kháng thuốc.
Chỉ có một nghiên cứu đơn lẻ duy nhất của Maguire và cs năm 2002
báo cáo về tình trạng P. malariae và P. ovale kháng lại CQ tại Indonesia. Tuy
nhiên cơ chế kháng cha đợc làm rõ, cho tới nay CQ vẫn tác dụng tốt với P.
malariae, P. ovale và cả P. knowlesi ở Malaysia [80].
1.1.3.4. Các yếu tố ảnh hởng đến quá trình kháng thuốc
Một số yếu tố thờng đợc nhắc tới liên quan đến quá trình phát sinh, phát triển
kháng thuốc là:
- Uống thuốc không đủ liều, không đúng quy trình.
- Thuốc không đảm bảo chất lợng, hết hạn sử dụng, thuốc giả.
- Việc sử dụng nhiều loại thuốc có tác dụng đối kháng.
- Đáp ứng tự nhiên của cơ thể (hấp thu, chuyển hoá, thải trừ).
Sự phát triển của khoa học Di truyền học, Hoá-dợc, Sinh học phân tử đã bổ
xung các yếu tố ảnh hởng tới sự lan truyền kháng thuốc nh sau [112].
- Tỷ lệ những biến đổi mang tính di truyền xảy ra trong nội bộ cộng
đồng dân c một khu vực địa lí.
- Số lợng KST bị phơi nhiễm bởi thuốc.
- Nồng độ thuốc trong máu tại thời điểm KST bị phơi nhiễm.
- Diễn biến dợc lực và dợc động học của thuốc sốt rét.
- Đặc điểm cá nhân (Liều, thời gian sử dụng, sự dung nạp), tính cộng
đồng (chất lợng thuốc, dễ tìm, sự phân phối) của mô hình sử dụng thuốc.
17
- Tính miễn dịch của cộng đồng và từng cá nhân trong cộng đồng
- Cờng độ của sự lan truyền kháng thuốc.
Nh vậy để loại trừ các yếu tố ảnh hởng tới kết quả các nghiên cứu về hiệu lực
điều trị của các thuốc SR với mục tiêu nhằm phát hiện sớm tình trạng kháng
thuốc thì việc khẳng định tính kháng thuốc bằng các kĩ thuật hiện đại nh PCR
là một trong những yếu tố quyết định. Thêm vào đó, để phát hiện sự giảm
nhậy cảm của một thuốc cũng cần đa vào thiết kế các nghiên cứu về dợc động
học của thuốc dang sử dụng.

Trong suốt một thời gian dài từ những năm 60 của thế kỉ trớc. P.
falciparum luôn là tác nhân chính kháng lại nhiều loại thuốc SR. Hiện nay
KST này cũng đang là nguy cơ kháng lại ART và dẫn chất, một nhóm thuốc đ-
ợc u tiên sử dụng (first line) trong công tác điều trị sốt rét hiện nay. Một nguy
cơ khác đang xuất hiện làm tình hình bệnh SR thêm phức tạp là sự kháng lại
CQ của P.vivax. Nghiên cứu Borneo và cs năm 1999 tại Thái Lan và
Indonesia đã đa ra những bằng chứng có giá trị về việc P. vivax kháng lại CQ
[51]. Chính vì vậy việc giám sát thờng xuyên hiệu lực điều trị của thuốc để đa
ra các chiến lợc sử dụng thuốc phù hợp là vấn đề quan trọng cho mọi Quốc gia
[52].
1.2-Tình hình Sốt rét kháng thuốc khu vực tiểu vùng
sông Mekong và chiến lợc phòng chống
1.2.1. Tình hình Sốt rét kháng thuốc tại khu vực tiểu vùng sông Mekong
(GMS)
Khu vực tiểu vùng sông Mêkông bao gồm các quốc gia và vùng lãnh
thổ sau: Vân Nam (Trung Quốc), Myanmar, Thái Lan, Lào, Camphuchia và
Việt Nam. Với nhiều điểm giống nhau về môi trờng, khí hậu, tình trạng vector
và tình hình SR cùng với các đặc điểm kinh tế xã hội.[117].
18
Theo số liệu của Tổ chức y tế thế giới, tại Đông nam á có tới 88% dân
số sống trong vùng có SR lu hành. Bệnh thực sự trầm trọng không chi do
những yếu tố tự nhiên nh khí hậu nhiệt đới ma nhiều, diện tích đợc bao phủ
bởi rừng lớn, ngèo nàn, dân trí thấp mà còn do sự xuất hiện và lan rộng các
chủng KST kháng lại nhiều loại thuốc SR [12], Ngoài việc kháng lại các
thuốc SR kinh điển theo phác đồ đơn độc trớc đây, KSTSR còn kháng lại
nhiều phác đồ kết hợp thuốc, ngay cả một số kết hợp kiểu ACT
s
cũng đã có
dấu hiệu giảm nhậy cảm [17], [103].
1.2.1.1. Kháng các phác đồ đơn trị liệu

Kháng chloroquine.
Tại khu vực Đông-Nam á. P. falciparum kháng CQ có tỷ lệ cao, nhất
là ở các nớc thuộc GMS. Tình trạng kháng CQ đã đợc thông báo trong các
nghiên cứu năm 2002 ở Thái Lan (>90%), Campuchia (97%), Lào (78%). Đặc
biệt là khu vực biên giới Thái Lan đã xuất hiện tình trang P. vivax kháng CQ
với bằng chứng mang tính khẳng định của sinh học phân tử (xem 1.1.3.2).
Đáng chú ý là sau một thời gian dài không sử dụng, CQ dờng nh có sự nhạy
cảm trở lại với P. falciparum. Những nghiên cứu về di truyền (Wilson 2005)
cho thấy sự giảm đáng kế của số lợng đột biến tại điểm 76 trên gen Pfcrt [57],
[107].
ở Việt Nam, phát hiện P. falciparum kháng CQ đầu tiên đợc ghi nhận
tại Nha Trang năm 1961 [28] rồi nhanh chóng lan rộng lên khu vực Tây
Nguyên và biên giới Tây-Nam có thời điểm (1982) tỷ lệ kháng lên tới 100%.
Các nghiên cứu in vitro tại 23 điểm trên cả nớc thấy tỷ lệ kháng CQ là 74,3%
năm 1990 đã tăng lên 86,5% chủ yếu tập chung ở khu vực Tây Nguyên, Ninh
Thuận (Triệu Nguyên Trung và cs 2000). ở miền Bắc chủ yếu thấy ở khu vực
Vĩnh Linh, Quảng Bình (68,5%). Từ 1996 trở lại đây CQ có xu hớng nhậy
19
cảm trở lại ở một số tỉnh nh ở Đức Cơ tỉnh Gia Lai giảm xuống còn 7,7% năm
1999, ở Ninh Thuận giảm xuống còn 23% năm 2000 [1], [5], [15], [37].
Mặc dù CQ có xu hớng nhạy cảm trở lại với P. falciparum, song WHO
vẫn cho là còn quá sớm để quay trở lại sử dụng CQ ở tuyến đầu, [107], [110].
Kháng sulfadoxine pyrimethamine.
Tỷ lệ kháng cao và mức độ khác nhau ở từng nớc thuộc GMS nh tại
Myanmar, Lào tỷ lệ kháng SP là 23% năm 2003, Campuchia là 100%. ở Việt
Nam tỷ lệ kháng thuốc này đang giảm từ 73,6% năm 1990 xuống còn 24,4%
năm 2000 [24], [109], [111],
Kháng quinin.
Mặc dù P. falciparum kháng quinin đợc phát hiện từ năm 1910 ở
Brazil. Hiện nay quinin vẫn có hiệu lực điều trị cao dới dạng kết hợp với

doxycyclin hoặc clindamycin và cả với AS. Khoảng từ 2002-2007 có nhiều
báo cáo về tỷ lệ tái phát cao ở Thái Lan (30%) với phác đồ 7 ngày ở liều
25mg/kg/ngày. Tại Campuchia hiệu quả điều trị là 100%. Tại Việt Nam, năm
2000 ở Phú Riềng tỉnh Bình Phớc tỷ lệ P. falciparum kháng quinin là 27,7%
[11], [61], [117].
Kháng mefloquin
Mefloquin (MEF) bị P. falcipảum kháng lại lần đầu tiên đợc phát hiện
năm 1982 tại biên giới Thái Lan-Campuchia ở liều điều trị 15mg/kg sau một
thời gian ngắn đa vào sử dụng. Là thuốc vẫn có hiệu lực điều trị trên thế giới
nhng tại các nớc thuộc khu vực GMS, MEF lại bị P. falciparum kháng với tỷ
lệ cao. Với phác đồ đơn trị liệu. Theo số liệu của WHO năm 2004 tỷ lệ
kháng với MEF tại Myanmar và Việt Nam là 40% ở liều 15mg/kg (Huong et
al 2001) [68]. Sau khi sử dụng phác đồ kết hợp MEF + AS hiệu quả điều trị có
20
tăng lên nhng chỉ đợc một thời gian ngắn. Có ý kiến cho rằng liều điều trị thấp
liên quan tới nồng độ thuốc trong huyết tơng làm tăng khả năng kháng MEF
của KST. Nghiên cứu của Dondorp và Imwong từ 2005-2007 cho thấy khi
tăng liều điều trị lên 25mg/kg thì số lợng phiên bản copy cua gene Pfmdr-1
giảm đi và tỷ lệ thất bại điều trị của thuốc này cũng giảm theo (< 5%) [71],
[89].

Kháng artemisinin và dẫn chất:
Khu vực biên giới Thái Lan-Campuchia là nơi đầu tien ghi nhận bằng
chứng của P. falciparum kháng lại ART và dẫn chất [40]. Đã có hơn 20 TES
đợc tiến hành với các thuốc artemether, AS, DHA ở 5 nớc trong đó có Việt
Nam. Kết quả là với liều điều trị qui định, tỷ lệ thất bại khi dùng phác đồ 3
ngày là 48%, 5 ngày là 17% và 7 ngày là 3-10% [92], [113]. Tạ Thị Tĩnh và
cs thực hiện TES tại Đak ơ và Đak Nhau thuộc tỉnh Bình Phớc cho thấy EC50
của DHA từ 1,7mol/l năm 2008 đã tăng lên 2,6mol/l năm 2010 [38].
Năm 2005 Noedl đã đa tiêu chuẩn xác định rõ tình trạng kháng

artemisinin và dẫn chất. Một trong số đó là sự tồn tại của KST trong máu ngời
bệnh ở ngày D
3
[81].
- KST vẫn tồn tại sau 7 ngày điều trị hoặc xuất hiện lại trong vòng 28
ngày sau một đợt dùng ART đờng uống với liều quy định.
- Tình trạng trên xảy ra trong khi nồng độ DHA huyết tong vẫn duy
trì ở mức bình thờng
- Giảm nhạy cảm trên in vitro với DHA
Năm 2009 Dondorp bổ sung về thời gian sạch KST nh sau [58].
Nghi ngờ kháng ART

khi:
- Thời gian sạch KST kéo dài, với sự tồn tại KST ở ngày D
3
. Nh vậy
ngày D
3
đợc xem nh một mốc quan trọng về thời gian trong nghiên
cứu giám sát hiệu lực thuốc SR.

21
Khẳng định kháng ART khi:
- Vẫn tồn tại KST trong 7 ngày hoặc còn KST ở ngày D
3
rồi xuất hiện
lại vào các ngày 28-42 sau khi sử dụng ART đờng uống với nồng
độ thuốc đo đợc trong huyết tơng ở mức quy định có hiệu lực điều
trị [113].
Hình 1.5 . Tỷ lệ P. falciparum (+) ngày D

3
sau điều trị AS liều
2-4mg/kg/ngày tại các nớc thuộc GMS WHO 2010
1.2.1.2. Giảm nhậy cảm với các ACT
s

Trớc những thông tin đáng lo ngại về sự giảm nhạy cảm của KSTSR
với ART và dẫn chất. Năm 2001, WHO khuyến cáo các nớc có SR lu hành sử
dụng các phác đồ kết hợp thuốc thay vì sử dụng các phác đồ một thuốc đơn
22
độc nh trớc đây trong khi điều trị những trờng hợp SR do P. falciparum cha
biến chứng, trong đó thành phần chính là ART hoặc một dẫn chất của ART
gọi tắt là ACT (Artemisinin based Combination Therapy). Dới đây là một số
ACT thông dụng [53], [57].
artemisinin-doxycycline, artemisinin-proguanin
artesunat- mefloquin artesunate-amodiaquine
artesunate-chloroquine artemether - lumefantrin (Coartem)
artesunate-sulfadoxine/pyrimethamine
dihydroartemisinin-piperaquin (Arterakin)
dihydroartemisinin- piperaquin - primaquin - trimethoprim (CV8)
Các phối hợp thuốc này đều nhằm khắc phục tình trạng P. falciparum kháng
thuốc. Sau một thời gian sử dụng, một số phối hợp kiểu ACT đã xuất hiện
giảm nhạy cảm (artemether-lumefantrin, artesunat-amodiaquin) và các phác
đồ kết hợp với sulfadoxine/pyrimethamine [75], [90], [108].
Artesunat-amodiaquin:
Những TES đợc thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới cho thấy tỷ lệ thất
bại điều trị của artesunat-amodiaquin theo dõi 28 ngày là 10% gặp ở
Burkina Faso, Gabon,. Khu vực GMS có Việt Nam và Myanmar [76].
Artesunat-mefloquin:
Kết hợp AS-MEF tỏ ra có hiệu lực cao ở hầu hết các nớc đang sử dụng

trừ Campuchia và Thái Lan có tỷ lệ thất bại điều trị cao 10% theo dõi 28
ngày, thậm chí 20% theo dõi 42 ngày.
Tại Palin (biên giới Campuchia-Thái Lan) sau một thời gian thay thế
bằng dihydroartemisinin-piperaquin, tỷ lệ thất bại điều trị của AS-MEF giảm
từ 9,9 - 14,3% năm 2002 - 2004 xuống còn 0-5% năm 2007-2008. Kèm theo
đó là sự nhạy cảm trở lại của MEF. Đièu này cho thấy hiệu lực của một ACT
23
không chỉ phụ thuộc sự nhạy-kháng của KST đối với ART và dẫn chất mà còn
phụ thuộc vào sự nhạy-kháng của KST với các thuốc thành phần phối hợp. Do
thời gian bán huỷ dài của MEF, WHO đã khuyến cáo nên theo dõi hiệu lực
phác đồ này ít nhất là 42 ngày [89], [114].
Bảng 1.1. Tỷ lệ thất bại của AS + MEF tại khu vực GMS (WHO 2010 )
Artemether lumefantrin.
Với artemether - lumefantrin, trong khi các nghiên cứu ở châu Phi tỷ lệ
thất bại điều trị thấp 5% thì khu vực GMS lại cao. Trong số 28 nghiên cứu
thì các nghiên cứu thực hiện tại Campuchia và Myanmar có tỷ lệ thất bại cao
tới 26,1% (2001) và 28,9% (2002) bằng theo dõi 28 ngày [108].
Các TES cũng cho thấy khi nồng độ lumefantrin đạt 860ng/ml thì tỷ lệ
đáp ứng điều trị cao hơn so với khi dùng liêu 510ng/ml. Theo Price (2006),
thuốc có hiệu lực nhất khi nồng độ thuốc nằm ở diện tích dới đờng cong [89],
[90].
Dihydroartemisinin-piperaquin (Arterakin)
Arterakin là thuốc có hiệu lực cao và là 1 ACT đợc WHO khuyến cáo sử
dụng. Các nghiên cứu về kết hợp này cho thấy tỷ lệ thất bại điều trị đều < 10% trừ
Rwanda có tỷ lệ > 10%. ở Việt Nam hiệu lực của Arterakin vẫn cao, tuy nhiên
24
đã băt đầu xuât hiện những nghiên cứu cho thấy sự giảm nhạy cảm của P.
falciparum với ART, thành phần chính của Arterakin [39], [97], [99].
1.2.2. Chiến lợc phòng chống KSTSR Kháng ART và giảm nhạy với các
act tại tiểu vùng sông mekong.

Trớc những bằng chứng về tình trạng kháng ART và dẫn chất cùng với
sự giảm nhạy cảm của ACT. Khu vực biên giới Myanmar-Thái Lan,
Campuchia-Việt Nam là những khu vực thuộc GMS đang trở thành một điểm
nóng về KST kháng thuốc của thế giới [110], [116].
Chiến lợc của WHO năm 2008 có mục tiêu là tăng cờng khống chế
Vector và quản lý ca bệnh có hiệu quả. Lấy khu vực biên giới Thái Lan-
Campuchia làm mặt trận chính với hơn 500.000 màn tẩm mới cho khu vực 1
và 200000 màn tẩm lại cho khu vực 2 [86], [110].
- Khu vực 1, nơi mà P. falciparum kháng ART đã đợc khẳng định gồm
4 tỉnh của Campuchia (khoảng 270.000 dân) và 2 tỉnh thuộc Thái Lan
(khoảng 110.000 dân).
- Khu vực 2, là khu vực bao quanh khu vực 1, nơi mà những ngời dân
sống ở đó có nguy cơ lây nhiễm KSTSR kháng ART từ khu vực 1 gồm 9 tỉnh
của Campuchia với 4 triệu dân và 7 tỉnh của Thái lan với 7 triệu dân.
Các nhân viên y tế thôn bản sẽ đợc đào tạo lại để nâng cao khả năng
phát hiện và điều trị ca bệnh có hiệu quả. Một dịch vụ cung cấp thuốc miễn phí
cho ngời dân sẽ đợc thiết lập. Mở các phòng khám lu động ở khu vực biên giới
Thái Lan-Campuchia. Một hệ thống phơng tiện giáo dục, truyền rhông bằng cả
hai thứ tiếng Thai-Campuchia cho ngời dân vùng biên giới [62].
Loại trừ KST kháng ART bằng cách phát hiện mọi ca bệnh sốt rét trong
khu vực và đảm bảo điều trị có hiệu quả kể cả với gametocyte. Các mục tiêu
của chiến lợc đợc mô tả tóm tắt dới đây
25