Đồ án công nghệ 2 ỨNG DỤNG CỦA PCR

LOGO
www.themegallery.com
ỨNG DỤNG CỦA PCR
GVHD: PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
DANH SÁCH:
1. Trần Công Nhất
2. Nguyễn Thanh Hồng Nhật
3. Hoàng Thị Nhung

LOGO
www.themegallery.com
NỘI DUNG
1
2
4
4
NỘI DUNG CỦA PHƯƠNG PHÁP
GIỚI THIỆU CHUNG
4
4
5
5
2
5
3
5
6
ỨNG DỤNG PCR TRONG KĨ THUẬT DGGE
ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT DGGE
LOGO
www.themegallery.com

I. GIỚI THIỆU CHUNG
GiỚI THIỆU
CHUNG
Được Kary Mullis (Mỹ)
phát minh năm 1985
Là phản ứng nhân tạo tổng hợp
và khuếch đại một đoạn DNA
nằm giữa 2 trình tự gọi là Mồi
PCR đã thực sự làm một cuộc
đại cách mạng sinh học phân tử
LOGO
www.themegallery.com
II.NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP
Khái niệm
1
Lịch sử ra đời của phương
pháp
2
3
Nguyên tắc của phương pháp
Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng
4
Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng
5
Ưu điểm và hạn chế của phương pháp
6
Ứng dụng của PCR
7
LOGO
www.themegallery.com

KHÁI NiỆM
•
PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương
pháp invitro để tổng hợp và khuếch đại một
đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi
oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA
đích với sự tham gia của DNA polymerase.
LOGO
www.themegallery.com
LỊCH SỬ PHƯƠNG PHÁP PCR
1. Lịch sử ra đời của phương pháp
.
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary
Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, ông đã
đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm
1993 cho thành tựu này.
LOGO
www.themegallery.com
1.Lịch sử ra đời của phương pháp

Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA
có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua
nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA
polymerase.

Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng
cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn
thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun
ở nhiệt độ trên 110°C


Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu
tiênđược phân lập được từ Thermus
aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được
dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004)
LOGO
www.themegallery.com
1. Lịch sử ra đời của phương pháp

PCR cần rất nhiều thành phần.Những thành phần đó là:

DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại

Cặp mồi (primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc
vùng cần khuếch đại

DNA-Polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của
DNA.

Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-
polymerase để xây dựng DNA mới.

Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-
polymerase
LOGO
www.themegallery.com

Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ

Máy chu kỳ nhiệt
2. Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến

cuộc đại cách mạng sinh học phân tử:
Thermus aquaticus Thermus thermophilus Máy PCR
LOGO
www.themegallery.com
NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP
Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp
nhau,
mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai
đoạn kéo dài chuỗi:

Giai đoạn biến tính (denaturation): Tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành
dạng mạch đơn.Phân tử DNA sợi đôi được hình thành bởi mối liên kết hydro
giữa hai mạch đơn. Trong quá trình biến tính, nhiệt độ phản ứng gia tăng lên
nhanh chóng đến 95oC và giữ ở nhiệt độ này trong khoảng 15-50 giây. Ở nhiệt
độ này mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn của phân tử DNA sợi đôi bị phá
vỡ. Trong giai đoạn bắt cặp tiếp theo, nhiệt độ phản ứng giảm nhanh chóng
làm cho mối liên kết hydro ban đầu không hình thành lại được kết quả làm tạo
thành hai phân tử DNA mạch đơn.

Giai đoạn bắt cặp (anealation): Gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ
sung.Trong giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ lai thường duy trì khoảng 50- 600C,
trong thời gian 15-60 giây. Quá trình này giúp cho các mồi (primer) tìm kiếm và
bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong
muốn. Nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào số lượng G,C có trong mồi (primer).
LOGO
www.themegallery.com
NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP

Giai đoạn kéo dài chuỗi (elongation): Tổng hợp chuỗi DNA mới
giống chuỗi DNA gốc.Sau khi mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ

sung với trình tự đích, nhiệt độ của phản ứng lại nhanh chóng
chuyển về nhiệt độ thích hợp với hoạt động của enzyme DNA
polymerase thường là 720C và giữ ở nhiệt độ này 30 giây đến 2
phút tùy theo chiều dài của đoạn DNA đích cần tổng hợp. Trong
quá trình tổng hợp DNA polymerase sẽ lấy nucleotide (A,T,G,C) từ
môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của mồi (primer) theo
nguyên tắc bổ sung với trình tự trên phân tử DNA hoặc cDNA đích.
Năng lượng dùng trong quá trình gắn kết này là ATP cũng có trong
môi trường phản ứng. Kết quả quá trình này phản ứng PCR đã tạo
ra hai phân tử DNA mạch đôi mới từ một phân tử DNA mạch đôi
ban đầu
LOGO
www.themegallery.com
/>NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP
LOGO
www.themegallery.com
NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP
/>LOGO
www.themegallery.com
NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP
Sơ đồ tổng hợp nguyên tắc của phương pháp PCR
LOGO
www.themegallery.com
Các chỉ tiêu ảnh hưởng
đến phản ứng PCR
Nồng độ
ion Mg2+
Chu kì của phản
ứng
PCR

Enzyme
DNA
mẫu
Biến
tính
dNTP
Mồi
CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR
LOGO
www.themegallery.com
GiẢI PHÁP TỐI ƯU HÓA CHO PHẢN ỨNG PCR
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có
trong phòng thí nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA, ).Vì vậy các mẫu
DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA, ngoài ra còn có phản
ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong một khu vực
riêng biệt.Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị
phòng riêng biệt với đèn UV.Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi
bước PCR cũng như thay thế các pipet.
Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ
được dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được giữ riêng biệt
với các mẫu DNA khác.Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên
trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn được htực hiện, để
kiểm tra sự nhiễm bẩn.
LOGO
www.themegallery.com
ƯU ĐiỂM VÀ NHƯỢC ĐiỂM

Ưu điểm

Thời gian thực hiện cực nhanh


Đơn giản và ít tốn kém

Độ tinh sạch của mẫu không cần cao

PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do
mất đoạn, thêm đọa hay đột biến điểm.

Dùng để định lượng so sánh bằng cách cho tiến
hành khuếch đại đòng thời trình tự đích và một
trình tự chứng có nồng độ đã biết.
LOGO
www.themegallery.com
ƯU ĐiỂM VÀ NHƯỢC ĐiỂM

Nhược điểm

Trình tự của khích thước cần khuếch đại giới hạn

Sự ngoại nhiễm

Các sai sót gây ra do Taq polymerase

Mật độ sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu thực
phẩm thường thấp.

Phương pháp này không phân biệt được tế bào
sống và tế bào chết

Chi phí cho việc phát hiện các vi sinh vật đơn lẻ

trong thực phẩm thường tốn kém
LOGO
www.themegallery.com

Ứng dụng của PCR

Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen
tổng hợp.

Tạo dòng cDNA.

Gây đột biến điểm.

Xác định kiểu gen của các đột biến.

So sánh mức độ biểu hiện của gen.

Vân tay di truyền.

Kiểm tra huyết thống.

Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng.

LOGO
www.themegallery.com
ỨNG DỤNG PCR TRONG KĨ THUẬT DGGE
Khái niệm DGGE:
LOGO
www.themegallery.com
ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT DGGE

LOGO
www.themegallery.com
ỨNG DỤNG 1
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DIOXIN
VÀ PHÂN LOẠI GEN MÃ HÓA DIOXIN DIOXINGIENAZA
CỦA HỖN HỢP CHỦNG VI KHUẨN KỊ KHÍ
KHÔNG BẮT BUỘC SEDTN20
TỪ ĐẤT NHIỄM ĐỘC HÓA HỌC TẠI ĐÀ NẴNG
LOGO
www.themegallery.com
ĐẶT VẤN ĐỀ:
LOGO
www.themegallery.com
NGUYÊN LIỆU :
Hỗn hợp chủng
SETDN20
Đã được phân
lập bằng
phương pháp
làm giàu
Máy đọc trình tự
tự động
Phần mềm Avan
Data Collection
V1.0 và DNA
Sequencing
Analysis
Cặp mồi nhân
gene mã hóa
enzyme phân

hủy dioxin
LOGO
www.themegallery.com
CÁC PHƯƠNG PHÁP:
Phương pháp phân lập vi khuẩn
Nghiên cứu hình thái tế bào vi khuẩn
Tách chiết DNA tổng số
PCR và nhân dòng đọc trình tự
Phương pháp điện di gel biến tính ( DGGE )