Đồ án công nghệ 2 ỨNG DỤNG PCR words

ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
Phụ lục
PHẦN 1 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP PCR
1.1 Khái niệm
PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch
đại một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi
của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.
1.2 Lịch sử phát triển
1.2.1 Lịch sử ra đời phương pháp PCR
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm
1985, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này.
1
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ

Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần
một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase. DNA
polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA
khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung. Theo
quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong
ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96°C. Tuy
nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi
giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả
cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu
ý suốt trong quá trình PCR.
Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ
vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110°C.
DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng
trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA. Từ đó,
không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể
đơn giản và tự động hơn.
Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ

Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực
nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá
trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai
exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ
chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến
xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể
2
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.
PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần.
Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR
có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = kilo cặp base=1000 cặp
base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base.
Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so
với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ
cặp base.
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm
nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự
bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng,
trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên
trên bề mặt hỗn hợp phản ứng.
1.2.2 Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến cuộc đại cách mạng sinh học phân tử
a, Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ
Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tiến đầu tiên đã
làm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn. Chúng ta thử tưởng tượng nếu không có
men polymerase chịu nhiệt thì thử nghiệm PCR sẽ phức tạp và kém hiệu quả như thế
nào khi mà cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt lại phải thêm men polymerase mới vào vì men cũ
đã bị hủy bởi nhiệt độ trong chu kỳ nhiệt trước đó? Cũng nhờ sự sử dụng các men
polymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đích được
đặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trở nên đặc

hiệu hơn. Cho đến nay, đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được phát hiện
và tổng hợp ra. Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt như
Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis
(Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu),. Có những men polymerase chịu nhiệt được tổng
hợp từ các vi khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các vi khuẩn chịu
nhiệt như Ampli Taq, Vent (exo),. Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính
sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3’-5’exonuclease) như
Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu,. Nhờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa để sử
dụng cho đúng mục đích của mình.
3
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ

Thermus aquaticus Thermus thermophiles
b, Máy chu kỳ nhiệt

Máy PCR
Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằng
cách liên tục chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy cách thủy có nhiệt độ
khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng. Sau đó công việc bằng tay
nhàm chán và nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng kềnh và đắt
tiền. Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực hiện trong các buồng ủ PCR của máy chu
kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt. Một cách tổng quát, máy luân nhiệt gồm các bộ
phận chính như sau:
• Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh
lệnh để máy thực hiện.
• Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện các
mệnh lệnh đến buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ
PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được
thực hiện.
• Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của

bộ vi xử lý. Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên
4
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn.
Ðể làm thay đổi được nhiệt độ trong buồng ủ PCR, có hai phương pháp:
1. Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt,
hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạch. Với phương pháp
này, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máy hoạt
động âm thanh cũng khá ồn ào.
2. Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược. Hiệu quả
Peltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử: Khi áp hai mảnh kim loại
vào nhau và khi có sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại thì sẽ sinh ra
một dòng điện và chính sự lưu thông của dòng điện này khi đo lường ra sẽ phản
ánh sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại. Hiệu quả Peltier ngược lại vận
hành theo kiểu ngược lại, nghĩa là khi tạo ra một dòng điện giữa hai mãnh kim
loại thì sẽ tạo ra được một sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh: bên này nóng,
bên kia lạnh. Khi thay đổi chiều dòng điện thì nhiệt độ của hai mãnh cũng thay
đổi ngược lại: bên này lạnh, bên kia nóng. Các máy chu kỳ nhiệt hiện nay đều
được chế tạo dựa theo phương pháp thứ hai này, nhờ vậy mà máy trở nên rất
gọn nhẹ, giá thành rẽ hơn gấp nhiều lần so với trước đây.
1.3 Nguyên tắc phương pháp PCR
Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của
sao chép DNA trong cơ thể như: Đoạn DNA cần nhân bản phải mở xoắn thành 2 mạch
đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu, điều kiện môi trường
thích hợp và enzym DNA polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt
độ cao (94oC) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với enzym DNA polymerase chịu
nhiệt và hệ thống điều nhiệt cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn
mồi được thiết kế chủ động. Nhờ kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ DNA ban đầu
chúng ta có thể thu được đủ lượng DNA cần thiết để tiến hành các thí nghiệm về
DNA.

Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu
kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi.
Giai đoạn biến tính (denaturation): Tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch
đơn.
Phân tử DNA sợi đôi được hình thành bởi mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn. Trong
quá trình biến tính, nhiệt độ phản ứng gia tăng lên nhanh chóng đến 95oC và giữ ở
nhiệt độ này trong khoảng 15-50 giây. Ở nhiệt độ này mối liên kết hydro giữa hai mạch
5
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
đơn của phân tử DNA sợi đôi bị phá vỡ. Trong giai đoạn bắt cặp tiếp theo, nhiệt độ
phản ứng giảm nhanh chóng làm cho mối liên kết hydro ban đầu không hình thành lại
được kết quả làm tạo thành hai phân tử DNA mạch đơn.
Tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ đột ngột hoặc thời gian biến tính kéo dài có thể làm giảm hoạt
tính của enzyme DNA polymerase. Đối với những enzyme DNA polymerase được sử dụng
trong phản ứng PCR, nhiệt đô ở giai đoạn biến tính thường từ 95
0
C đến 98
0
C. Về thời gian
biến tính, đối với các genome lớn như thực vật thường giai đoạn biến tính được kéo dài trong
5 phút. Ngoài ra, sau khi đã tối ưu phản ứng PCR, để giảm sự ảnh hướng của nhiệt độ và thời
gian biến tính đối với sự hoạt động của enzyme DNA polymerase, enzyme này có thể được bổ
sung sau khi kết thúc giai đoạn biến tính ban đầu. Đối với mỗi hệ thống luân nhiệt của các
hang sản xuất khác nhau, tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ là khác nhau.
Giai đoạn bắt cặp (anealation): Gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.
Trong giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ lai thường duy trì khoảng 50- 600C, trong thời
gian 15-60 giây. Quá trình này giúp cho các mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung
đặc hiệu với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong muốn. Nhiệt độ bắt cặp
phụ thuộc vào số lượng G, C có trong mồi (primer).
Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tm thấp

nhất + 3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường thấp hơn
Tm thấp nhất, có thể dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt
mồi tối ưu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0.5°C). Đối với các cặp Tm cao
hoặc tự bắt cặp, có loop thì có thể khắc phục bằng PCR 2 bước (95°C và 68°C).
Giai đoạn kéo dài chuỗi (elongation): Tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA
gốc.
Sau khi mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung với trình tự đích, nhiệt độ của phản
ứng lại nhanh chóng chuyển về nhiệt độ thích hợp với hoạt động của enzyme DNA
polymerase thường là 720C và giữ ở nhiệt độ này 30 giây đến 2 phút tùy theo chiều dài
của đoạn DNA đích cần tổng hợp. Trong quá trình tổng hợp DNA polymerase sẽ lấy
nucleotide (A, T, G, C) từ môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của mồi (primer)
theo nguyên tắc bổ sung với trình tự trên phân tử DNA hoặc cDNA đích. Năng lượng
dùng trong quá trình gắn kết này là ATP cũng có trong môi trường phản ứng. Kết quả
quá trình này phản ứng PCR đã tạo ra hai phân tử DNA mạch đôi mới từ một phân tử
DNA mạch đôi ban đầu.
Nhiệt độ kéo dài thường tiến hành ở 72°C tuy nhiên, hoạt tính 5'-3' DNA polymerase vẫn
xảy ra ở nhiệt độ 68°C. Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase, chiều
dài sản phẩm và loại template. 1) Đối với DNA đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA)
thì tốc độ có thể đạt tới 15s/kb; 2) đối với DNA genome lớn, phức tạp thì tốc độ thường 30s-
1min/kb. Như vậy sau nhiều chu kỳ khuyếch đại (thường từ 30-40 chu kỳ) từ một phân tử đích
ban đầu phản ứng PCR đã tạo ra vô số phân tử bản sao (khoaûng 106 baûn sao) có kích thước
6
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
xác định mong muốn. Cuối cùng sản phẩm PCR được nhuộm với Ehididum bromide và đem
quan sát sự phát quang dưới tia UV (bước sóng 312 nm) sau khi phân tách sản phẩm PCR trên
gel.
Sơ đồ tổng hợp nguyên tắc của phương pháp PCR
7
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
1.4 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR

1.4.1 Mồi
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu
quả cao. Việc lựa chọn mồi tuân theo các quy tắc đơn giản sau: chiều dài mồi khoảng 18 -
24bp hoặc hơn và phần trăm GC chiếm 35%-60%, do vậy, nhiệt độ gắn mồi vào khoảng
55-58
0
C hoặc cao hơn. Những mồi dài hơn (mồi DMD, 28-30bp) cho phép phản ứng được
thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn và thu được ít sản phẩm không đặc hiệu hơn. Để
kiểm tra các trình tự có khả năng lặp lại, các mồi sử dụng đã được đối chiếu với cơ sở dữ
liệu trình tự tại Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học (National Center for
Biotechnology Information - NCBI) sử dụng các công cụ tìm kiếm (Basic Local
Alignment Search Tool - BLAST).
1.4.2 DNA mẫu
Kết quả phản ứng PCR lệ thuộc rất lớn vào DNA mẫu.
• Phản ứng PCR tối ưu khi DNA thật tinh sạch. Bụi bẩn sẽ làm giảm đáng kể hiệu
suất của phản ứng. Tuy nhiên nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết
quả đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào hoặc ngay cả mẫu DNA
không được bảo quản tốt
• Phản ứng PCR tối ưu cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu. Lượng DNA mẫu sử
dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) khi sử dụng các
DNA polymerase cho hiệu quả cao. Việc giảm lượng mẫu còn hạn chế được sự
khuếch đại ký sinh tạo những sản phẩm phụ không mong muốn.
8
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
1.4.3 Enzyme
Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Ðây là
enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Hiện nay, một số
enzyme mới có hiệu quả hơn.
DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi khuẩn hiện diện trong suối
nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này được viết tắt Taq polymerase.

Tth polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một
enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn
2+
; ngược lại, khi khuôn là
DNA và có ion Mg
2+
, enzyme này lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA.
Nồng độ enzyme được khuyến cáo là 1- 2,5 đv/1µl. Nồng độ phản ứng quá cao
hoặc quá thấp đều khiến phản ứng không đạt kết quả tốt.
Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3´-5
´exonuclease. Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại DNA polymerase
co hay không có hoạt tính.
1.4.4 dNTP
• Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/mỗi
nucleotide. Nồng độ thích hợp trên cho kết quả ổn định, trung thực và chính xác.
• Nồng độ của các dNTP phải bằng nhau để giảm các lỗi sao chép của Taq
polymerase, tránh sự gắn kết nhầm lẫn mã di truyền.
1.4.5 Nồng độ ion Mg
2+

Mg2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA
polymerase chịu nhiệt thường dùng.
• Nồng độ Mg2+ quá thấp (<0,5mM) làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do
hoạt động của Taq polymerase bị ức chế.
• Nồng độ Mg2+ quá thừa làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn, dẫn đến
nhiều sản phẩm không đặc hiệu.
• Nồng độ tối ưu của Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử
nghiệm.
9
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ

1.4.6 Chu kỳ của phản ứng PCR
Trong thực tế, số lượng chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ do
hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng,
sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng hợp không
kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.
1.4.7 Biến tính
• Việc tăng nhiệt độ hoặc thời gian kéo dài thời gian biến tính có thể làm tăng tính
đặc hiệu của PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase.
• Đối với những enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường nên sử dụng nhiệt độ
biến tính 95ºC-98ºC. Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước biến
tính ngắn trước từng chu kỳ nhiệt.
• Đối với từng genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến
5min. Để làm giảm ảnh hưởng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNA
polymerase sau khi biến tính ban đầu.
• Khi đã tối ưu phản ứng PCR thì cần giảm tối thiểu thời gian biến tính mỗi chu
kỳ để tăng lượng sản phẩm. Thông thường là từ 10s-30s.
• Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt là khác
nhau phụ thuộc hãng sản xuất. Một số hệ thống cho phép thay đổi thông số này
khi PCR tối ưu.
1.5 Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng PCR
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí
nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA , ). Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy
trình DNA, ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong
một khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng
riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay
thế các pipet. Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được
dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA khác.
Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn
được htực hiện, để kiểm tra sự nhiễm bẩn.
Các giải pháp cụ thể:

Không có sản phẩm hoặc lượng sản phẩm quá thấp:
10
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
1. Lặp lại thí nghiệm đề phòng lỗi thao tác.
2. Sử dụng ống dNTP mới, có chất lượng đảm bảo.
3. Tăng lượng DNA template, điện di kiểm tra lại nồng độ DNA template.
4. Tinh sạch DNA template bằng chiết phenol, tủa cồn hoặc kit tinh sạch hoặc thôi
gel. Nếu có thể cần tiến hành tách chiết mới DNA template bằng các phương
pháp tách chiết khác nhau.
5. Tăng thời gian kéo dài đối với các sản phẩm PCR trên 0,5 kb.
6. Tăng số chu kỳ PCR lên 35, 40.
7. Hạ thấp nhiệt độ bắt mồi xuống 1 đến 2°C. Hoặc sử dụng touchdown PCR.
8. Dùng PCR đánh bắt với nhiệt độ bắt mồi khá thấp (~45°C) trong 10 chu kỳ đầu
và nâng cao nhiệt độ đến Tm thấp nhất ở 20 chu kỳ tiếp theo.
9. Tăng nhiệt độ biến tính (tối đa 98°C) và điều chỉnh thời gian biến tính DNA đối
với các mẫu DNA của genome lớn hoặc khi khuyếch đại các đoạn lặp SSR.
10.Kiểm tra các điều kiện của primer, thiết kế cặp primer mới để chạy nestPCR.
11.Tăng nồng độ enzyme DNA polymerase
12.Thay đổi loại enzyme DNA polymerase và hệ buffer.
Vệt smear kích thước lớn hơn sản phẩm mong muốn:
1. Giảm nồng độ enzyme DNA polymerase.
2. Rút ngắn thời gian kéo dài
3. Giảm số chu kỳ nhiệt PCR xuống tối đa 25.
4. Tăng nhiệt độ bắt mồi lên 2°C hoặc thử với PCR 2 giai đoạn hoặc nestPCR
5. Thay đổi nhiệt độ biến tính.
6. Thử chạy gradien nồng độ Mg
2+
7. Hạ thấp nồng độ primer.
8. Đối với trường hợp vệt smear thấp hơn băng mong muốn thường được tối ưu
bằng cách tăng thời gian kéo dài cuối cùng ở 72°C từ 8 đến 10 min.

11
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp hơn sản phẩm mong muốn:
1. Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi
2. Tăng thời gian kéo dài thêm 30s.
3. Giảm nồng độ DNA polymerase.
4. Tối ưu hóa nồng độ Mg
2+
.
5. Tinh sạch DNA template bằng thôi gel. Hoặc thủy phân DNA bằng một số RE
trước khi dùng làm template (hiệu quả khi băng sản phẩm phụ kích thước khá
lớn >= 1kb).
6. Giảm nồng độ primer.
7. Thiết kế cặp primer mới.
1.6 Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR
1.6.1 Ưu điểm
• Thời gian thực hiện cực nhanh: chỉ cần mất 3h để khuếch đại một trình tự AND
được quan tâm, so với phương pháp tao dòng của kỹ thuật tái tổ hợp AND phải
mất cả tuần hoặc lâu hơn.
• Đơn giản và ít tốn kém: nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm
các thành phần tối thiểu được sử dụng đồng thời. Trong khi đó phương pháp tạo
dòng điển hình cần các vật liệu đắt tiền như: màng, nucleotide triphosphate
mang dấu phóng xạ và việc thực hiện cần các thao tác đặc biệt.
• Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện các mẫu nucleic
acid thô. Ví dụ: mẫu này hay các dấu vết phân tích trong pháp y.
• Điều nay ngược với kĩ thuật tái tổ hợp ADN, đoạn gen hay vector đều cần tương
đối tinh khiết.
• PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, thêm đọa hay đột
biến điểm.
• Dùng để định lượng so sánh bằng cách cho tiến hành khuếch đại đòng thời trình

tự đích và một trình tự chứng có nồng độ đã biết.
12
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
1.6.2 Hạn chế
Do độ nhạy rất cao nên PCR vừa rất đơn giản, có khuynh hướng sử dụng rộng rãi
nhưng cũng gặp không ít khó khăn.
a. Trong thực nghiệm, trình tự của khích thước cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên
Trừ một vài trường hợp đặc biệt, PCR không hoạt động được với những phân tử
DNA có kích thước lớn hơn 3kb. PCR cho kết quả tốt nhất ở ADN với kích thước dưới
1,5kb.
b. Sự ngoại nhiễm
• Vấn đề cấp thiết trong ứng dụng chẩn đoán, dự phòng vì có thể kết quả rất
nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm khuếch đại của
những lần thao tác trước.
• Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần
khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiến
cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra ngoài và bay lơ lửng trong không
khí và bám vào tường, cửa, các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm,…rồi nhiễm vào các
phản ứng tiến hành sau đó.
c. Các sai sót gây ra do Taq polymerase
Các sao chép bởi Taq polymerase có tỷ lệ khá cao (10
-4
nghĩa là cứ 10.000 Nu thì
enzyme gắn sai một Nu). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích
thước hay chỉ cần xem sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn
nếu cần xác định chính xác trình tự Nucleotide của ADN. Ta không thể loại bỏ hoàn
toàn sai sót này nhưng có thể giảm bớt (ví dụ như: dùng DNA polymerase có tính chịu
nhiệt cao: pfu, ).
d. Mật độ sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên đa số
trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật đọ vi vinh vật đủ cho việc

phát hiện PCR.
e. Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết, do vậy có thể dẫn
đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết.
f. Chi phí cho việc phát hiện các vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm thường tốn kém.
Do vậy để giảm chi phí người ta thường sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng
PCR (gọi là phản ứng Multiplex PCR) để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vật
khác nhau.
13
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
1.7 Ứng dụng của PCR
• Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp.
• Tạo dòng cDNA.
• Gây đột biến điểm.
• Xác định kiểu gen của các đột biến.
• So sánh mức độ biểu hiện của gen.
• Vân tay di truyền.
• Kiểm tra huyết thống.
• Ưng dụng trong chẩn đoán lâm sàng.

PHẦN 2 ỨNG DỤNG CỦA PCR TRONG KỸ THUẬT DGGE
1.Khái niệm DGGE
Kỹ thuật điện di biến tính gradient trên gel (denaturing gradient gel
electrophoresis, DGGE) một dạng kỹ thuật ”dấu vân tay” (fingerprinting) phân tử cho
phép phân biệt các trình tự DNA khác nhau dựa trên sự khác nhau về tỷ lệ (G+C)/
(A+T) giữa các trình tự. Khi được điện di trên một gel có građien chất biến tính, tùy
14
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
theo thành phần nucleotit mà một phân tử DNA sẽ dừng lại ở một vị trí nhất định đặc
trưng: trong phân tử càng nhiều G và C thì phân tử càng lâu bị biến tính và do đó càng
lâu dừng lại trên gel điện di. Vì vậy, vị trí khác nhau trên điện di đồ DGGE phản ánh

sự khác nhau về trình tự của các đoạn DNA được phân tích. Trong từng trường hợp cụ
thể, mỗi vị trí có thể đặc trưng cho một trình tự DNA và phản ánh sự có mặt của một
loài hay cá thể trong quần xã được phân tích.
2.Ứng dụng của kỹ thuật DGGE
Myuzer lần đầu tiên dùng kỹ thuật DGGE để nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật,
xác định tính đa dạng di truyền của quần thể vu sinh vật trong môi trường thiên nhiên.
Gần đây người ta còn mở rộng phương pháp DGGE để tuyển chọn các chủng vi sinh
vật và rút ngắn được rất nhiều khối lượng công việc.
Trong thực tế, nên phối hợp các phương pháp nghiên cứu truyền thống với các
phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử mới có thể nghiên cứu đa dạng vi sinh vật và
cấu trúc quần lạc vi sinh vật trong hệ thống sinh thái vi sinh vật vô cùng phức tạp. Khi
phân tích tính đa dạng vi sinh vật cần sử dụng DNA chung của quần thể vi sinh vật chứ
không thể sử dụng DNA của các vi sinh vật nuôi cấy thuần khiết.
PHẦN 3 ỨNG DỤNG
Ứng dụng 1
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DIOXIN VÀ PHÂN LOẠI GEN MÃ
HÓA DIOXIN DIOXINGIENNAZA CỦA HỖN HỢP CHỦNG VI KHUẨN KỊ
KHÍ KHÔNG BẮT BUỘC SETDN20 TỪ ĐẤT NHIỄM ĐỘC HÓA HỌC TẠI
ĐÀ NẴNG
1. MỞ ĐẦU
15
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
Hiện nay, đất tại một số ‛điểm nóng’ ở các căn cứ quân sự trước đây của Mỹ vẫn
bị ô nhiễm nặng các chất diệt cỏ, polycloinated dibenzodioxin (PCDDs), polycloinated
dibenzofuran (PCDFs) và các hợp chất khác.
Tẩy độc các ‛điểm nóng’ ở Đà Nẵng bằng công nghệ sinh học đang được tiến
hành và cho kết quả rất khả quan, phương pháp này có giá thành thấp và thân thiện với
môi trường. Vai trò của tập đoàn vi sinh vật hiếu khí đã được nghiên cứu còn vi sinh
vật kị khí và kị khí không bắt buộc vẫn chưa được quan tâm nhiều.
Vi khuẩn kị khí và kị khí không bắt buộc đóng vai trò đặc biệt trong quá trình loại

khử halogen các hợp chất hữu cơ chứa halogen khó phân hủy trong đó có dioxin. Điều
kiện của quá trình khử loại halogen nói chung và Clo nói riêng được thực hiện trong
môi trường hoạt động của vi khuẩn kị khí như: vi khuẩn khử sắt, khử sunfat, vi khuẩn
sinh methan. Từ các nghiên cứu đã được công bố, chúng tôi đã thống kê được một số
loại có khả năng loại Clo trong điều kiện kị khí: dehalobacter,
desulfomonile,desulfitobacterium, dehalococcoides.
Phân hủy hiếu khí DD và DBF diễn theo hai cơ chế oxi hóa vị trí bên và vị trí góc
của nhân thơm, trong đó oxi hóa vị trí đầu tiên là ở vị trí góc được thực hiện bởi enzim
dioxygenaza, quá trình này chuyển hóa thành DD và DBF.
Ở việt nam, công nghệ chôn lấp tích cực là tổ hợp của phương pháp cô lập hấp
phụ và phân hủy sinh học đã được nghiên cứu và đang được triển khai khử độc ‛điểm
nóng’ nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Tuy nhiên để nâng cao hiệu quả khử độc của quy trình
công nghệ và áp dụng rộng rãi ở các ‛điểm nóng’ khác cần có thêm hiểu biết sâu về đa
dạng, khả năng phân hủy sinh học và các gen tham gia quá trình phân hủy các chất độc
bởi tập đoàn vi sinh vật bản địa.
Để tìm hiểu vai trò của vi sinh vật trong điều kiện chôn lấp tích cực mà ở đó môi
trường chủ yếu là kị khí và kị khí không bắt buộc, cần tiến hành nuôi cấy tập đoàn vi
sinh vật kị khí ở điều kiện vẫn có ít oxy trong môi trường. Khả năng phân hủy các chất
độc đặc biệt là 2, 3, 7, 8 – TCDD của các vi sinh vật bản địa đã được xác định thông
qua hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20. Ở đây sẽ trình bày kết
quả nghiên cứu khả năng phát triển cũng như khả năng phân hủy của vi sinh vật trên
môi trường chứa dịch chiết đất (chứa 2, 3, 7, 8 – TCDD) đồng thời nghiên cứu sự đa
dạng của hỗn hợp chủng. Sự phát triển gen chức năng dioxin dioxygenaza trong hỗn
hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 cũng đã được công bố trong bài
báo này.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
16
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
2.1 Nguyên liệu
 Hỗn hợp chủng SETDN20 được phân lập bằng phương pháp làm giàu nhiều lần từ

lô đất xử lý tẩy dộc bằng phân hủy sinh học DNT100T ở sân bay Đà Nẵng. Hỗn
hợp chủng nay được nuôi ở điều kiện kị khí không sử dụng hỗn hợp khí Nito,
Cacbonic và Hidro trong tủ nuôi cấy kị khí chuyên dụng
Sử dụng cặp mồi 907R, 341F kẹp GC.
 Cặp mồi nhân gene mã hóa enzyme phân hủy dioxin
DR (5'-TGYASNTAYCAYGGVTGG-3')
DF (5'-TBVGGNCCVYKNGGVTGG-3')
Cặp mồi trên đã được xử dụng để nhân gen mã hóa cho enzyme dioxin
dioxigenaza(khoảng hơn 700bp) của hỗn hợp chủng SETDN20 nuôi trong điều
kiện kị khí không bắt buộc.
 Xác định trình tự gene bằng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant
Gientic Analyzez. Trình tự nucleotit được xử lý bằng phần mềm Avan Data
Collection v1.0 và ADN Sequencing Analysis.
2.2. Phương pháp
a. Phương pháp phân lập vi khuẩn
Phân lập chủng vi khuẩn theo phương pháp làm giàu. Mẫu đất ban đầu chưa xử lý
tẩy độc(mẫu đối chứng) và mẫu đang xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học được
làm giàu trên môi trường xử lý có bổ sung dịch chiết đất(tách từ đất nhiễm độc hóa
học) làm nguồn cacbon và năng lượng duy nhất.
Quá trình làm giàu được tiến hành 3 lần, thể tích bình nuôi cấy kị khí là 125 ml,
nuôi ở điều kiện tĩnh, trong bong tối ở 30ºC. Nguồn cacbon sử dụng cho nghiên cứu
này là dịch chiết đất vì nó chủ yếu chứa đồng phân 2, 3, 7, 8- TCDD là đồng phân độc
nhất với hệ số độc là 1, các đồng phân dioxin, furan chứa clo khác đã phân tích được.
b. Nghiên cứu hình thái tế bào vi khuẩn
Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi điện tử quét JSML 5410
c. Tách chiết AND tổng số
 Dung dịch đệm tách gồm: TrisHCl (pH = 8.0) 100 mM; EDTA (pH = 8.0) 100
mM; Natriphosphate (pH = 8.0) 100 mM; NaCl 1,5 M; CTAB 1%.
 Trộn 15ml dung dịch đệm tách với 15g đất.
 Lắc đều trong 15 phút trên máy lắc với tốc độ 200 rpm.

 Mẫu cho shock nhiệt 3 lần trong nito lỏng và bể nhiệt 65ºC.
17
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
 Bổ sung 100µl proteinase K vào ống mẫu và ủ ở 37ºC trong nửa giờ.
 Bổ sung 1,5 ml SDS 20% vào tất cả các mẫu, lắc đều và ủ ở 65ºC trong 2 giờ. Ly
tâm 6000 rpm trong 10 phút thu dịch bên trên. Phần tủa còn lại, bổ sung tiếp 4,5 ml
đệm tách và 0,5 ml SDS 20 %, tiếp tục ủ ở 65ºC thêm 10 phút.
 Lặp lại quá trình ly tâm như trên để thu dịch.
 Phần dung dịch chứa DNA thu được sau hai lần ly tâm đó được làm sạch với
chloroform / isoamyl alcohol (24 : 1).
 Kết tủa DNA bằng isopropanol, rửa sạch bằng ethanol 70 % và hòa tan trở lại bằng
100 µl dung dịch TE 10 mM.
 Thu nhận được dung dịch DNA rồi tiếp tục làm sạch bằng phenol, đem kết tủa và
hòa tan trở lại bằng 50 µl dung dịch TE 10 mM.
d. PCR và nhân dòng đọc trình tự
 Nhân đoạn gen 16S ARN ribosom có độ dài khoảng 550bp bằng kỹ thuật PCR sử
dụng cặp mồi 907R, 341F kẹp GC với nhiệt độ gắn mồi là 65ºC.
 Nhân đoạn gen mã hóa cho enzyme dioxin – dioxygenaza có độ dài khoảng 700 bp
bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi DF, DR với thể tích là 25 µl, thành phần phản
ứng gồm 2,5 µl PCR buffer 10x, 4 mM MgCl2, 0,25 mM hỗn hợp dNTPs, 20 pM
mỗi loại mồi DF và DR, 1 đơn vị Taq AND polymeraza, nhiệt độ gắn mồi là 50ºC.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza nồng độ 0,8 %, sau đó gắn trực tiếp
vào vector PCR
R
2.1 nhờ biến nạp vào chủng E.coli INV F' và chọn lọc trên môi
trường LB đặc có chứa 100 mg/l ampixillin, nuôi cấy ở 37ºC qua đêm.
e. Phương pháp điện di gel gradient biến tính (DGGE) để xác định mứa độ đa dạng của
vi sinh vật trong tập đoàn
Sau khi thu được PCR đảm bảo chất lượng, tiếp tục sử dụng phương pháp điện di
gel biến tính, nồng độ của gel là 6 % với dải biến tính từ 20 – 70 % để nghiên cứu sự

đa dạng của vi sinh vật.
3. KẾT QUẢ
3.1. Sự phát triển và hình thái tế bào của hỗn hợp vi khuẩn kị khí không bắt buộc
SEDTDN20
18
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ

Hình 1. Sự phát triển (A) và hình thái tế bào (B) của hổn hợp vi khuẩn SETDN20.
Nghiên cứu hỗn hợp chủng vi khuẩn này chỉ sử dụng phương pháp nuôi cấy kị khí
không có sự hỗ trợ của phòng nuôi cấy kị khí và các loại khí cần thiết. SETDN20 đã
được làm giàu 3 lần. Các chủng sạch không thể tách ra khỏi hỗn hợp nên nghiên cứu cả
hỗn hợp chủng của SETDN20. Nhìn vào hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét
ở hình 1 ta có thể thấy, có ít nhất hai loài vi khuẩn trong đó tồn tại một loại vi khuẩn
chiếm ưu thế hình thái giống như đại diện của Sarcina.
3.2. Khả năng sử dụng dioxin và furan trong dịch nuôi cấy của mẫu có SETDN20
Độ tồn lưu của dioxin và furan trong dịch nuôi cấy của mẫu có SETDN20 và mẫu
đối chứng (không có vi sinh vật) được trình bày ở bảng 1.
Tên đồng phân
Nồng độ độc tương đương (pg TEQ/I ml)
Đối chứng không có VSV Hỗn hợp vi khuẩn kị
khí SETDN20
PCDDs
19
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
2,3,7,8-TCDD 4272,774 3506,466
1,2,3,7,8 PeCDD 13,876 11,467
1,2,3,4,7,8 HxCDD 0,22 0,177
1,2,3,6,7,8 HxCDD 0,956 0,834
1,2,3,7,8,9 HxCDD 0,566 0,495
1,2,3,4,6,7,8 HpCDD 0,356 0,307

1,2,3,4,6,7,8,9 OCDD 0,89 0,737
PCDFs
2,3,7,8 TCDF 8,433 7,313
1,2,3,7,8 PeCDF 0,040 0,037
2,3,4,7,8 PeCDF 0,923 0,744
1,2,3,4,7,8 HxCDF 0,098 0,082
1,2,3,6,7,8 HxCDF 0,036 0
1,2,3,7,8,9 HxCDF 0 0
2,3,4,6,7,8 HxCDF 0,031 0,038
1,2,3,4,6,7,8 HpCDF 0,038 0,031
1,2,3,4,7,8,9 HpCDD 0 0
1,2,3,4,6,7,8,9 OCDF 0,002 0,001
Tổng số độc 4299,243 3528,742
Phần trăm phân hủy 0 17,9%

Bảng 1.Khả năng sử dụng các đồng phân PCCDs và PCDFs của hỗn hợp vi khuẩn
SETDN20
Hỗn hợp chủng SETDN20 sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường xử lý có bổ sung
dịch chiết đất đã loại bỏ 17,9% tổng độ độc, trong đó 2,3,7,8-TCCD giảm từ 4299,243
pg TEQ/ml xuống còn 3528,742pg TEQ/ml.
So với một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy dioxin hiếu khí như
Streptomyces danangiensis XKDN19 có khả năng phân hủy 85,97% lượng 2,3,7,8-
TCDD sau 14 ngày với hàm lượng ban đầu 333pg/ml thì khả năng phân hủy của hỗn
hợp chủng SETDN20 thấp hơn nhiều.Tuy nhiên do dioxin hòa tan trong nước rất thấp,
nó tích tụ nhiều trong các trầm tích thiếu oxy, vì vậy phân hủy dioxin ở điều kiện
20
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
không phải hiếu khí cũng rất có ý nghĩa.
Các kết quả nghiên cứu khả năng xử dụng dioxin cho thấy, SETDN20 thuộc vi
sinh vật sử dụng nguồn chất độc này như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. Như

vậy, hỗn hợp chủng SETDN20 có khả năng sử dụng dioxin và chủ yếu là đồng phân
2,3,7,8-TCCD thực sự có ý nghĩa trong nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ tẩy
độc dioxin. Vì vậy, hỗn hợp chủng này đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng và
gien chức năng dioxin dioxygenaza.
3.3. Sự đa dạng của vi sinh vật trong hỗn hợp chủng SETDN20
Sau khi thu nhận được AND tổng số của hỗn hợp chủng SETDN20 đủ cả về số
lượng và chất lượng được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. Sản phẩm AND
thu được làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S ARN Ribosom có độ dài
khoảng 550 bp bằng kỹ thuật PCR như đã mô tả trong phần phương pháp và sản phẩm
PCR được điện di kiểm tra trên gel biến tính DGGE để nghiên cứu sự đa dạng của hỗn
hợp chủng. Kết quả trên gel cho ta thấy, có 3 băng khác nhau trong hỗn hợp chủng thể
hiện ở hình 2 (giếng số 7).
Hình 2. Ảnh điện di trên gel gradient biến tính (Denature gradient gel electrophoresis -
DGGE) mẫu hỗn hợp chủng SETDN20 giếng số 7 (các giếng 1-6 là kết quả của mẫu
khác)
Như vậy quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét chúng ta chỉ nhìn thấy có hai loài,
còn dung phương pháp điện di gel gradient biến tính cho ta thấy rõ hơn về sự có mặt
các loài trong hỗn hợp chủng, gồm có 3 băng có thể tương ứng với ba loài khác nhau.
Cần có các nghiên cứu về xác định trình tự nucleotit để biết tên và vị trí phân loại của
21
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
các băng trên. Trong hỗn hợp chủng kị khí không hoàn toàn này có khả năng sử dụng
dioxin, vậy vai trò của cả hỗn hợp này nhue thế nào? Trước tiên chúng tôi nghiên cứu
gen mã hóa cho enzyme dioxin dioxygenaza của hỗn hợp SETDN20 bằng cặp mồi
DR, DF.
a.Nhân dòng và xác định trình tự gen dioxin dioxygenaza của SETDN20
Như trong phần phân lập mẫu và nghiên cứu sự đa dạng đã đề cập, SETDN20 có
thể là hỗn hợp gồm 3 chủng mà cho đến nay chúng tôi vẫn chưa thể tinh sạch thành
chủng đơn được. Nhưng hỗn hợp 3 chủng này lại có khả năng phân hủy dịch chiết từ
đất nhiếm dioxin (chủ yếu là thành phần 2, 3, 7, 8- TCDD), vì vậy chúng tôi tiến hành

xác định gen mã hóa cho enzyme dioxin dioxygenaza trong hỗn hợp chủng SETDN20.
ADN tổng số của hỗn hợp chủng SETDN20 sau khi tách chiết và làm sạch được dung
làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gen mã hóa dioxin dioxygenaza với cặp mồi DF và
DR như đã nêu ở trên phần phương pháp.
Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR của gien mã hóa cho enzim dioxin deogienaza ở
SETDN20 MK. Marker phân tử 1kb; giếng 1. sản phẩm PCR lần 1; giếng 2. sản phẩm
PCR lần 2.
Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng hơn 700 bp và khá đặc hiệu (hình
3,giếng 1, 2). Sau đó, sản phẩm PCR này được gắn vào vector PCR 2.1 và biến nạp vào
tế bào E.coli INV F’. Sản phẩm này được kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI. Kết
quả đã chỉ ra rằng, một băng ADN có kích thước khoảng 700 bp đã được phát hiện. Để
khẳng định rõ hơn điều này AND plasmit có mang đoạn gen 16S ARN Ribosom có
kích thước khoảng 700 bp (sản phẩm PCR) đã được sử dụng làm khuôn và chạy lại
PCR ở cùng điều kiện phản ứng như lần đầu. Kết quả vẫn chỉ được một đoạn ADN
(sản phẩm PCR) có kích thước như ban đầu khoảng 700 bp (hình 3, giếng 2).
22
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
ADN plasmit có mang sản phẩm PCR như mong muốn đã được tách và làm sạch
lượng lớn phục vụ cho đọc trình tự. Trình tự gen dioxin dioxygenaza của SETDN20
được xác định tren máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyse,
sử dụng bô Kit Bibdye Terminator V3.1 Cycle Sequencing. Kết quả đã nhận được một
đoạn trình tự nucleotit khoảng hơn 700 bp rõ ràng. Trình tự đoạn gen này đã được đưa
vào khung đọc mở (ORE) để dịch mã ra trình tự axit amin. Trình tự axit amin này đã
được so sánh với các trình tự axit amin trong ngân hàng Protein thế giới EMBL. Kết
quả cho thấy enzyme phenylpropionate dioxygenaza (99%). Điều đó chứng tỏ, trong
hỗn hợp vi khuẩn SEDTN20 đã có mang nhóm gen mã hóa cho các enzyme dioxin
dioxygenaza mà chúng tôi rất quan tâm trong công nghệ tẩy độc dioxin.
4. KẾT LUẬN
1. Hỗn hợp chủng SETDN20 có thể bao gồm 3 loài khác nhau và có khả năng phát
triển thêm nguồn chiết dịch đất với hàm lượng cao trong điều kiện kị khí bắt buộc.

2. Sau hai tháng nuôi tĩnh ở nhiệt độ 30ºC, hỗn hợp chủng SETDN20 đã loại bỏ 17,9%
tổng độ độc trong đó có 2, 3, 7, 8-TCDD.
3. Trong hỗn hợp chủng SETDN20 chứa gen mã hóa enzyme dioxin dioxygenaza.
Enzym này có độ tương đồng cao với nhóm enzyme phenylpropionate dioxygenaza
(99%). Ở điều kiện kị khí không bắt buộc, gen mã hóa cho các enzyme dioxygenaza
tham gia vào quá trình cắt vòng thơm vẫn có mặt.
23
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ

Ứng dụng 2
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ SỰ ĐA DẠNG CỦA TẬP ĐOÀN VI KHUẨN KHỬ
SUNFATE TRONG MẪU BÙN HỒ KHU VỰC NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ
DIOXIN TẠI SÂN BAY ĐÀ NẴNG BẰNG KĨ THUẬT PCR-DGGE
TÓM TẮT
Chiến tranh việt nam đã đi qua hơn 30 năm, tuy nhiên hậu quả của nó vẫn còn ảnh
hưởng đén xã hội và môi trường của nước ta như ô nhiểm chất diệt cỏ có chưa dioxin
tại các căn cứ quân sự cũ trước đây của quân đội mỹ đã sử dụng. Hiện nay không chỉ
đất mà cả bùn hồ trong khu vực bãi rửa máy bay và kho chứa tại căn cứ quân sự cũ của
mỹ ở sân bay Đà Nẵng vẫn bị ô nhiểm các chất diệt cỏ chứa dioxin. Phương án khử
độc đất nhiễm đã và đang được triển khai, trog đó khử độc bằng công nghệ sinh học đã
thu được kết quả khả quan. Vi sinh vật kị khí trong đó có vi khuẩn khử sunfate đóng
vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hóa vật chất và khử loại chlor tại các mẫu
trầm tích. Một trong những yêu cầu để công nghệ thành công là đánh giá tập đoàn vi
sinh vật trong các mẫu ô nhiểm cần khử độc. Các phương pháp dựa trên nuôi cấy
thường chỉ xác định được một phần nhỏ tập đoàn vi khuẩn thường tồn tại ngoài tự
nhiên. Hiện nay để đánh giá chính xác mức độ đa dạng VSV , nhiều kĩ thuật sinh học
phân tử dựa trên phân tích gen mã hóa 16S-rARN như kĩ thuật PCR kết hợp DGGE
đang được ứng dụng rộng rãi nghiên cứu sinh thái học. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật
PCR lồng kết hợp với DGGE đã được sử dụng để đánh giá tập đoàn vi khuẩn khử
sunfate và đánh giá sự đa dạng của tập đoàn vi khuẩn này trong mẫu bùn hồ khu vực

nhiểm chất diệt có chưa dioxin tại sân bay Đà Nẵng.
24
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: Th.S PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ
1. MỞ ĐẦU
Trong khoảng 10 năm từ 1961 đến 1971 quân đội Mỹ đã rải khoảng 80 triệu lit
các chất diệt cỏ có chứa dioxin xuống nhiều vùng ở miền Trung và miền Nam Việt
Nam.Căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở sân bay Đà Nẵng là một trong các điểm nóng hiện
nay vẫn bị ô nhiễm nặng các chất diệt cỏ chứa dioxin. Một kết quả phân tích gần đây
cho thấy không những đất mà cả bùn hồ tiếp nhận nước chảy từ bãi nhiễm đã chứa
dioxin ở các nồng độ khác nhau. Vi khuẩn kị khí tùy tiện và vi khuẩn kị khí bắt buộc
trong đó có vi khuẩn khử sunfate (KFS) đóng vai trò rất quan trọng trong phân hủy tự
nhiên hoặc làm sạch bằng phân hủy sinh học trầm tích bị ô nhiễm.
Tuy nhiên, phân lập vi khuẩn KSF từ các mẫu môi trường đôi khi không dễ dàng.
Hiện nay , các phương pháp dựa trên nuôi cấy thường chỉ xác định được một phần nhỏ
tập đoàn vi khuẩn ngoài tự nhiên. Các phương pháp không phụ thuộc nuôi cấy khác
nhau trong đó có PCR kết hợp với điện di trên gel chứa dải nồng độ biế tính thích hợp
(PCR-DGGE) đã được sử dụng rộng rã trong nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Trong
nghiên cứu này kỹ thuật PCR-DGGE đã sử dụng để đánh giá sợ bộ vi khuẩn KSF trong
mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Mẫu bùn hồ
Mười ba mẫu bùn được lấy từ ba hồ A, B, C. Hai mẫu B1 và B2 được lấy ở hồ B
và mẫu C1 được lấy ở hồ C ở thời điểm 3/2007. Đây là 2 hồ không nhận trực tiếp
nguồn nước chảy từ các bãi nhiểm nặng chất diệt cỏ chưa dioxin ở khu vực sân bay Đà
Nẵng. Hồ A là hồ tiếp nhận trực tiếp nguồn nước từ khu vực bãi nhiểm. Năm mẫu bùn
A1-A5 ở hồ A được lấy ở thời điểm 1/2007 và năm mẫu A6-A10 được lấy ở thời điểm
3/2007. Nồng độ dioxin trong một số mẫu lấy ở hồ B và C không cao, tuy nhiên ở hồ A
khoảng 10.000ppt.
2.2 Xác định tập đoàn vi khuẩn KSF bằng kĩ thuật PCR-DGGE
a, Tách chiết và làm sạch DNA

1)Dung dịch đệm tách gồm: TrisHCl (pH = 8.0) 100 mM; EDTA (pH = 8.0) 100 mM;
Natriphosphate (pH = 8.0) 100 mM; NaCl 1,5 M; CTAB 1%.
2)Trộn 15ml dung dịch đệm tách với 15g đất.
3)Lắc đều trong 15 phút trên máy lắc với tốc độ 200 rpm.
4)Mẫu cho shock nhiệt 3 lần trong nito lỏng và bể nhiệt 65ºC.
5)Bổ sung 100µl proteinase K vào ống mẫu và ủ ở 37ºC trong nửa giờ.
25