Khảo sát thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của rễ củ cây sắn dây (pueraria thomsonii benth )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ
MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ
NHIÊN
PHẠM THỊ CẨM
NHUNG
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CỦ CÂY SẮN DÂY PUERARIA
THOMSONII BENTH.
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm (hướng Hóa Sinh) Mã số:
60 42 30
Hướng dẫn khoa học: TS. VÕ VĂN
LẸO
Thành phố Hồ Chí Minh – 2011
LỜI CẢM
ƠN
Khoảng thời gian làm khoá luận là khoảng thời gian khó
quên
nhất trong đời tôi. Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến
tất
cả những người đã giúp đỡ tôi trong thời gian vừa
qua.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Võ Văn
Lẹo,
thầy đã trực tiếp hướng dẫn, kiên nhẫn truyền đạt những
kiến
thức quí báu, tận tình giúp đỡ em hoàn thành khoá luận
này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị công
nhân

viên trong Bộ môn Dược liệu và các thầy cô trong Bộ
môn
Hóa sinh trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình chỉ
bảo
và tạo mọi điều kiện giúp đỡ để em có thể hoàn thành
khoá
luận một cách tốt
nhất.
Con xin cảm ơn cha mẹ đã luôn bên cạnh quan tâm chăm
sóc,
động viên và tạo điều kiện tốt nhất cả về tinh thần và vật
chất.
Đồng thời, cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành tới
những
người bạn đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi
hoàn
thành khóa luận
này.
Trân
trọng
Phạm Thị Cẩm
Nhung
MỤC
LỤC
MỤC LỤC
i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
iii
DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ
ĐỒ

iv
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ
v
MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1 Tổng quan về thực vật
học

3
1.1.1. Giới thiệu về họ Đậu (Fabacecae)
3
1.1.2. Giới thiệu về cây Sắn dây Pueraria thomsonii. Benth


4
1.2. Tổng quan về hóa
học

6
Thành phần hoá học của Sắn
dây

6
1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý và công dụng
9
1.3.1. Tác dụng dược lý
9

1.3.2. Sắn dây trong Đông y cổ truyền
11
1.3.3. Sắn dây trong dược học hiện đại
12
1.4. Các phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa
14
1.4.1. Phương pháp FRAP
14
1.4.2. Phương pháp đo MDA
15
1.4.3. Phương pháp sàng lọc khả năng loại gốc tự do DPPH
(1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl)
16
1.4.4. Phương pháp xác định khả năng bất hoạt enzyme xanthin oxidase


18
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
19
2.1. Nguyên liệu
19
2.2. Dung môi, hoá chất
19
2.3. Dụng cụ, thiết bị
19
2.4. Phương pháp nghiên cứu
20
2.4.1. Khảo sát thực vật
học

20
2.4.2. Thử tinh khiết
21
i
2.4.3. Khảo sát thành phần hoá học
22
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu về tác dụng chống oxy hoá
28
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
28
3.1. Khảo sát về thực vật
học

28
3.1.1. Đặc điểm hình thái dược liệu
28
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu rễ
29
3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu
31
3.2. Thử tinh khiết
32
3.2.1. Xác định độ
ẩm

32
3.2.2. Xác định độ tro
32
3.3. Nghiên cứu thành phần hoá

học

33
3.3.1. Định tính sơ bộ thành phần hoá học
33
3.3.2. Chiết xuất bằng ngấm kiệt với cồn 96%.
34
3.3.3. Phân tách các phân đoạn và phân lập các
chất

36
3.3.4. Kiểm tra các chất phân lập được từ các cao chiết
42
3.3.5. Xác định cấu trúc hóa học của P6
48
3.4. Thử tác dụng chống oxy hoá in vitro trên mô hình DPPH
52
3.4.1. Chiết xuất cao dược liệu cho thử nghiệm in vitro
52
3.4.2. Kết quả thử tác dụng chống oxy hoá của các cao chiết, các phân
đoạn
chiết và các chất phân lập được
52
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
55
Kết
luận

55
Đề nghị

56
TÀI LIỆU THAM KHẢO
57
i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
dd: dung
dịch
DCM:
Dichloromethane
DE: Diethyl
Ether
EA: Ethyl
Acetate
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng cao
áp).
Me:
Methanol
MS: Mass Spectometry (Phương pháp khối
phổ).
NMR: Nuclear Magnetic Resonance (Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân)
.
SKLM: Sắc kí lớp
mỏng
Pđ: phân
đoạn
5
DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ
ĐỒ
Hình 1.1 Cây
sắn

dây (Pueraria thomsonii Benth.)
4
Hình 1.2. Lá Sắn
dây

5
Hình 1.3 Lá kèm 2 của Sắn dây
5
Hình 1.4 Một số chế phẩm có chứa Sắn dây trên thị
trường.

13
Hình 1.5 Phản ứng FRAP
14
Hình 1.6 Phản ứng tạo sản phẩm MDA - TBA
15
Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc DPPH
17
Hình 3. 1. Rễ củ Sắn dây
29
Hình 3.2 Rễ củ
30
Hình 3.3 Libe-gỗ cấp
3

30
Hình 3. 4 Cụm sợi libe
30
Hình 3. 5 Gỗ cấp 2
30

Hình 3.6 Bột dược liệu
31
Hình 3.7 Các cấu tử trong bột rễ củ Sắn
dây

31
Hình 3. 8. Kiểm tra cao cồn bằng
SKLM.

35
Hình 3. 9. Kiểm tra kết quả phân bố lỏng - lỏng.
38
Hình 3. 10 Kiểm tra các phân đoạn từ cao DE. Hệ CHCl
3
: MeOH : H
2
O (7:3:1)
.

40
Hình 3. 11 Kiểm tra các phân đoạn từ cao EA. Hệ CHCl
3
: MeOH : H
2
O (7:3:1)
.

42
Hình 3. 12 Sắc đồ kiểm tra các chất phân lập. Hệ CHCl
3

: MeOH : H
2
O
(7:3:1)



43
Hình 3. 13 Sắc đồ kiểm tra các chất phân lập. Hệ EA : MeOH (85 : 15)


43
Hình 3. 14 Phổ UV của P1
44
Hình 3. 15 Phổ UV của P2
44
Hình 3. 16 Phổ UV của P3
45
Hình 3. 17 Phổ UV của P4
45
Hình 3. 18 Phổ UV của P5
46
Hình 3. 19 Sắc kí đồ tinh chế P5 qua cột rây phân
tử.

47
Hình 3. 20 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của P6
48
Hình 3. 21 Phổ UV của daidzein [27]
48

Hình 3. 22 Phổ UV của P6
48
Hình 3. 23 Cấu trúc của P6 (= Daidzein)
51
Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại của Sắn
dây

4
Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết rễ củ Sắn dây bằng ngấm kiệt với cồn 96%
34
Sơ đồ 3.2. Tách các phân đoạn bằng chiết phân bố lỏng - lỏng
37
Sơ đồ 3.3 Phân lập các chất từ cao diethyl ether.
39
Sơ đồ 3.4 Phân lập các chất từ cao ethyl acetat.
41
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
ĐỒ
Bảng 3. 1. Kết quả xác định độ ẩm của rễ củ Sắn dây.
32
Bảng 3. 2 Kết quả xác định độ tro của bột rễ củ Sắn dây
32
Bảng 3. 3. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hoá học rễ củ Sắn
dây.



33
Bảng 3. 4 So sánh λ
max

của P1, P2, P3, P4 và P5
43
Bảng 3. 5 Bảng so sánh λ
max
của P6 với λ
max
của daidzein
49
Bảng 3. 6 So sánh số khối của P6 với daidzein
49
Bảng 3. 7 Dữ liệu phổ
13
C-NMR của P6 so sánh với daidzein trong tài liệu [31]

51
Bảng 3.8 Hàm lượng các cao chiết (%) với các hệ dung môi khác nhau
52
Bảng 3. 9 Độ hấp thu của các cao chiết tại λ = 517nm trên mô hình
DPPH

53
Bảng 3. 10 Độ hấp thu của các chất phân lập tại λ = 517nm trên mô hình
DPPH.


53
Biểu đồ 3.1 Kết quả hoạt tính chống oxy hoá các phân đoạn trên mô hình
DPPH

54
MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, việc phòng và chữa các bệnh do sự tác động của các gốc tự do như một
số
bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường và một số chứng bệnh của phụ nữ tiền mãn
kinh
đang ngày càng trở nên cấp thiết trong công tác chăm sóc sức khoẻ ở nhiều quốc
gia
trên thế giới [40] và việc tìm ra các chất chống oxy hoá có nguồn gốc tự nhiên để
làm
thuốc chữa các bệnh trên là một nhu cầu thực tế của xã
hội.
Ở phương Đông, Sắn dây (Pueraria thomsonii Benth.) là một loại thảo dược phổ
biến
được dùng lâu đời ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam. Các
nghiên
cứu
cho thấy thành phần hóa học của rễ bao gồm chủ yếu là các isoflavon,
saponin và
tinh
bột. Trong y học cổ truyền, Sắn dây được dùng để chữa bệnh cảm
sốt, sởi mọc
không
đều, viêm ruột, kiết lỵ kèm sốt và khát nước. Bột Sắn dây được
dùng như một
thứ
nước giải khát thông thường, pha nước uống giải nhiệt, làm mát
cơ thể trong mùa
hè.

Trong y học hiện đại, Sắn dây được dùng để chữa các cơn đau
thắt ngực trong
bệnh
mạch vành, một công dụng nữa cũng đáng quan tâm là dùng để
chữa chứng
nghiện
rượu. Riêng isoflavon là thành phần đang được quan tâm để chữa
ung thư và các
rối
loạn của phụ nữ trong giai đoạn tiền mãn kinh. Các tác dụng này
ít nhiều có liên
quan
đến tác dụng chống oxy hoá. Tuy vậy hiện có rất ít công trình
nghiên cứu trên
Sắn
dây về lĩnh vực này ở Việt Nam. Do đó, chúng tôi tiến hành
đề tài“Khảo sát
thành
phần hoá học và tác dụng chống oxy hoá của rễ củ cây Sắn
dây Pueraria
thomsonii
Benth.” nhằm khảo sát thành phần hoá học của rễ và sàng
lọc tác dụng chống
oxy
hoá của các phân đoạn, chất phân lập được trên mô hình
chống oxy hoá in vitro,
để
bước đầu chứng minh tác dụng cây thuốc và làm cơ sở
cho các nghiên cứu tiếp
theo

với các mục tiêu cụ thể như
sau:
- Từ rễ củ Sắn dây được trồng ở Việt Nam, khảo sát phương pháp chiết xuất
cao
toàn phần và tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác
nhau.
- Từ các phân đoạn đơn giản tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc của hợp
chất
chính có trong các phân đoạn
này.
8
Khao sat tinh ch6ng oxy hoa cua cac cao chi6t tlr cac dung moi c6
eli)
phan
qrc
khac nhau,
CUa
cac phan
dOI_lll
thu
dUQ'C
tlr phan b6 J6ng-J6ng va
CUa
cac ch
t
phan
lp
dugc tren mo hinh ch6ng oxy hoa in vitro (mo hinh
DPPH).
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về thực vật học
1.1.1. Giới thiệu về họ Đậu
(Fabacecae)
1.1.1.1. Đặc điểm thực
vật
Họ Đậu là một họ lớn, phân bố hầu như khắp nơi trên thế giới. Cây thảo, lá
kép
lông chim lẻ, luôn luôn có lá kèm. Cụm hoa chùm hay chuỳ. Hoa đối xứng 2
bên,
cánh hoa cờ (cánh lớn và trùm lên 2 cánh bên), tràng tiền khai lợp úp. Nhị 10, tất
cả
đều dính nhau thành ống, 9 dính nhau còn chiếc thứ 10 tự do. Noãn cong hình
móng
ngựa và có chân ngắn.
[13]
Quả đậu nhưng đôi khi không mở mà phân đốt, đứt khúc thành từng đoạn có 1 hạt
ở
bên trong
[14]
Trên thế giới có 500 chi, 20.000 loài, phân bố toàn
cầu
Ở Việt Nam có 90 chi, trên 450
loài.
1.1.1.2. Chi Pueraria
DC.
Pueraria DC. là chi nhỏ, gồm các loài là dây leo quấn, phân bố chủ yếu ở
vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á (16 loài); Việt Nam có 5 loài. Một số loài có
rễ
củ, nhiều tinh bột được dùng làm thực phẩm hay làm thuốc; vài loài khác có

tác
dụng phủ đất, lấy lá làm thức ăn cho gia súc. Cá biệt có loài P. tuberosa (Roxb.
Ex
Willd) DC mọc ở Nêpan, Pakistan và Ấn Độ, rễ củ có độc, thường dùng để
thuốc
cá.[10]
1.1.2. Giới thiệu về cây Sắn dây Pueraria thomsonii.
Benth
1.1.2.1. Tên
gọi
Tên khoa học: Pueraria thomsonii Benth; Pueraria lobata (Willd.) Ohwi.;
Pueraria
trilobata Backer.; Pueraria hirsuta
Schneid.
Tên khác: Cát căn, Bạch cát, Khau cát (Tày), Bẳn mắm kèo
(Thái).
Tên nước ngoài: Kudzu bean, Kudzu vine (Anh), Koudzou
(Pháp)
Hình 1.1 Cây
sắn
dây
(Pueraria thomsonii
Ben
t
h.)
1.1.2.2. Vị trí phân
loại
Lớp Ngọc Lan
(Magnoliopsida)
↓

Phân lớp Hoa hồng
(Rosidae)
↓
Bộ Đậu
(Fabales)
↓
Họ Đậu
(Fabacecae)
↓
Chi Pueraria
DC
↓
Loài Pueraria thomsonii Benth
[10]
Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại của Sắn
dây
1.1.2.3. Mô tả thực
vật
Dạng sống: dây leo dài, khỏe, có khi bò lan mặt đất; thân non màu xanh, mềm,
có
nhiều lông mịn màu vàng nâu; thân già màu xám, cứng, có nhiều nốt
sần.
Lá mọc cách, kép lông chim lẻ có 3 lá chét, cuống lá màu xanh, có nhiều lông,
mặt
bụng có rãnh ở giữa, dài 10-13 cm, phù ở
đáy.
Hình 1.2. Lá Sắn
dây
Hình 1.3 Lá kèm 2
của

Sắn
dâ
y
Lá kèm 2, hình bầu dục đầu nhọn mũi mác, dài 9-11 mm, rộng 0,5-1 mm,
nhiều
lông.
Rễ củ lớn, màu xám, vỏ ngoài có nhiều đường vân tròn quanh củ, bần dày, một
số
chỗ bong ra, củ cắt ngang màu trắng, nhiều sợi, có vài vòng
nâu.[10]
1.1.2.4. Phân bố sinh
thái
Pueraria DC. là chi nhỏ, gồm các loài là dây leo quấn, phân bố chủ yếu ở các
vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á (16 loài); Việt Nam có 5 loài, trồng từ vùng
núi
đến đồng bằng. Cây ưa sáng, biên độ sinh thái rộng, sinh trưởng phát triển tốt
trên
nhiều vùng đất và tiểu khí hậu khác
nhau.
Mùa hoa: tháng 9 – 10, mùa quả: tháng 11 –
12.
1.1.2.5. Bộ phận dùng và cách chế
biến
Rễ củ (Radix Puerariae) thường gọi là Cát căn, được thu hái từ cuối tháng 10
đến
tháng 3 - 4 năm sau, đem rửa sạch đất cát, thái mỏng, phơi sấy khô. Trong y học
cổ
truyền, người ta còn đem xông sinh (lưu huỳnh) để tẩy trắng, cho vào bao bì
phù

hợp, bảo quản nơi thoáng mát và thường xuyên kiểm tra mối mọt.
[3]
1.2. Tổng quan về hóa học
Thành phần hoá học của Sắn
dây
- Trong rễ củ sắn dây tươi có 12% tinh bột (nếu khô củ có đến 40% tinh
bột),
saponosid và isoflavon (puerarin, daidzin, daidzein…), puerosid A, puerosid
B,
nhóm olean tritrerpen. Trong dây và lá khô có chứa: protein 16,3%; lipid
1,8%;
glucid 31,1%; cellulose 31,3%; các axít amin (asparaginic, glutamic, adenin,
prolin,
leucin…).[4]
- Cấu trúc của một số Isoflavonoid trong rễ củ Sắn dây
[20]
Daidzein
Daidzin
Formononetin
Genistein
Genistin
Genistein 8 – C –
glucose
Puerarin
PG-1
PG-3
Neopuerarin
Neopuerarin
A
Neopuerarin

B
Glc
a
: β –glucopyranose Glc
c
: α
–glucofuranose
Glc
b
: α –glucopyranose Glc
d
: β
–glucofuranose
- Dữ liệu phổ NMR của một số hợp chất trong rễ củ Sắn
dây:
+ Daidzein: APCI – MS (M + H)
+
: 255,137.
1
H-NMR (DMSO), δ: 6.83 (2H,
d,
J=8Hz, H-3’), 6.88 (1H, d, J = 2Hz, H-8), 6.97 (1H, dd, J = 9, 2Hz, H-6), 7.37
(2H,
d, J = 8Hz, H-2’), 7.94 (1H, d, J = 9Hz, H-5), 8.25 (1H, s, H-2).
13
C-NMR:
153.0
(C-2), 123.7 (C-3), 175.0 (C-4), 127.5 (C-5), 115.1 (C-6), 162.7 (C-7), 102.3
(C-8),
157.4 (C-9), 116.9 (C-10), 122.8 (C-1’), 130.3 (C-2’), 115.3 (C-3’), 157.6

(C-4’),
115.3 (C-5’), 130.3 (C-6’).
[31]
+ Daidzin: APCI – MS (M+H)
+
: 417,255,
1
H-NMR (DMSO), δ: 6.82 (2H, d,
J
=8Hz, H-3’), 7.15 (1H, dd, J = 8, 2Hz, H6), 7.23 (1H, d, J = 2Hz, H-8), 7.42 (2H,
d,
J = 8Hz, H-2’), 8.06 (1H, d, J = 8Hz, H-5), 8.38 (1H, s, H-2).
13
C-NMR: 153.5
(C-
2), 123.9 (C-3), 174.9 (C-4), 127.2 (C-5), 115.8 (C-6), 161.6 (C-7), 103.6
(C-8),
157.3 (C-9), 118.7 (C-10), 122.6 (C-1’), 130.3 (C-2’), 115.1 (C-3’), 157.2
(C-4’),
115.1 (C-5’), 130.3 (C-6’). Glc: 100.2 (C-1), 73.3 (C-2), 76.5 (C-3), 69.7
(C-4),
77.4 (C-5), 60.7 (C-6).
[31]
+ Genistein: APCI-MS (M+H)
+
: 271,53.
1
H-NMR (DMSO), δ: 6.23 (1H, d, J
=
2Hz, H-8). 6.38 (1H, d, J = 2Hz, H-6), 6.82 (2H, d, J = 8Hz, H-3’), 7.48 (2H, d, J

=
8Hz, H-2’), 8.28 (1H, s, H-2).
13
C-NMR: 153.7 (C-2), 122.3 (C-3), 180.0
(C-4),
162.0 (C-5), 99.0 (C-6), 164.3 (C-7), 93.6 (C-8), 157.4 (C-9), 104.4 (C-10),
121.1
(C-1’), 130.0 (C-2’), 115.2 (C-3’), 157.4 (C-4’), 115.2 (C-5’), 130.0 (C-6’).
[31]
+ Puerarin: APCI – MS (M+H)
+
: 417,297.
1
H-NMR (DMSO) δ: 4.90 (1H, d, J
=
9Hz, glc H-1). 6.85 (2H, d, J = 8Hz, H-3’), 7.03 (1H, d, J = 9Hz, H-6), 7.40 (2H,
d,
J = 8Hz, H-2’), 8.06 (1H, d, J = 8Hz, H-5), 8.20 (1H, s, H-2).
13
C-NMR: 154.4
(C-
2), 125.5 (C-3), 178.2 (C-4), 128.1 (C-5), 116.2 (C-6), 163.1 (C-7), 113.1
(C-8),
154.5 (C-9), 118.4 (C-10), 124.2 (C-1’), 131.4 (C-2’), 116.2 (C-3’), 158.6
(C-4’),
116.2 (C-5’), 131.4 (C-6’), Glc: 75.6 (C-1), 72.9 (C-2), 80.0 (C-3), 71.7 (C-4),
82.7
(C-5), 62.7 (C-6).
[31]
1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý và công dụng

1.3.1. Tác dụng dược
lý
1.3.1.1. Tác dụng đối với tim
mạch
Thử nghiệm trên chó, flavon toàn phần của Sắn dây tiêm thẳng vào động mạch
vành
với liều 1mg/kg dẫn đến lưu lượng mạch vành tăng trung bình 24 ± 5% và
sức
kháng mạch vành giảm 19 ± 3%, nếu tăng liều 2 mg/kg thì lưu lượng mạch
vành
tăng 53 ± 6% và sức kháng giảm 34 ± 7%; tác dụng trên kéo dài trong vòng 3
phút.
Còn bằng đường tiêm tĩnh mạch phải dùng liều flavon toàn phần cao hơn:
20
mg/kg, 30 mg/kg thì lưu lượng mạch vành tăng 15 ± 4%, 44,9% và sức kháng
mạch
vành giảm 13,4%, 28 ±
6%.
Puerarin trên chó thí nghiệm tiêm tĩnh mạch với liều 20 mg/kg có tác dụng hạn
chế
phạm vi nhồi máu cơ tim thực nghiệm. Trên lâm sàng ở những bệnh nhân nhồi
máu
cơ tim cấp tính, puerarin trên tĩnh mạch với liều 4 – 5 mg/kg sau đó 4 giờ tiếp
tục
tiêm truyền tĩnh mạch puerarin với liều 4 – 5 mg/kg, kết quả các chỉ số tiêu
hao
oxygen của cơ tim, men phosphocreatine – kinase, ∑ST tăng cao, ∑Q bệnh lý
và
phạm vi nhồi máu cơ tim đều giảm so với lô đối chứng. Những kết quả trên là cơ
sở

khoa học cho việc giải thích tác dụng điều trị bệnh mạch vành của Sắn dây trên
lâm
sàng.[11]
1.3.1.2. Tác dụng hạ huyết
áp
Cao Sắn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác
dụng
kích thích tim của isoprenalin, ngoài ra còn làm giảm nhịp tim và gây hạ huyết
áp.
Trên mạc treo ruột chuột nhắt trắng nhỏ dung dịch puerarin 0,5% có tác dụng
đối
kháng với những hiện tượng do andrenalin gây nên như gây co bóp các vi
động
mạch, lưu lượng tuần hoàn
giảm.[11]
1.3.1.3. Tác dụng chống loạn nhịp
tim
Puerarin, daidzein và dạng chiết cồn từ Sắn dây, trên chuột cống trắng và chuột
nhắt
trắng với những mô hình gây loạn nhịp tim bằng aconitin, bari clorid, calci
clorid,
chloroform và thắt động mạch vành trái trước đều có tác dụng đối kháng rõ rệt
với
loạn nhịp tim do các tác nhân trên gây nên. So sánh tác dụng của 3 dạng thuốc
trên
thấy rằng daidzein có tác dụng kháng loạn nhịp tim tương đối mạnh, đối với
các
loạn nhịp tim trên đều có tác dụng rõ rệt, dạng chiết cồn có tác dụng giống
với
daidzein, điều đó chứng tỏ daidzein là thành phần chủ yếu có tác dụng chống

loạn
nhịp tim. Còn puerarin với liều lượng tương đương có tác dụng đối kháng rõ rệt
với
loạn nhịp tim do aconitin, bari clorid gây nên, giảm nhẹ mức độ loạn nhịp do
thiếu
máu cơ tim, còn tác dụng đối kháng với rung thất thì không bằng daidzein.
Những
kết quả trên chứng minh việc dùng Sắn dây để phòng ngừa và điều trị rối loạn
nhịp
tim, đặc biệt là trong trường hợp thiếu máu cơ tim là có cơ sở khoa
học.[11]
1.3.1.4. Tác dụng chống ung
thư
Dạng chiết cồn từ Sắn dây với liều 10g/kg trên động vật thí nghiệm có tác dụng
ức
chế nhất định với sự phát triển của tế bào sarcom 180, u báng Ehrlich và tế bào
ung
thư phổi Lewis. Daidzein với nồng độ 14 µm/ml có tác dụng ức chế sự tăng
trưởng
của tế bào
HL.60.[11]
1.3.1.5. Tác dụng
phytoestrogen
Một số thành phần có trong Sắn dây như daidzein và genistein hiện được biết
đến
như các phytoestrogen. Phytoestrogen được sử dụng trong liệu pháp hormon
thay
thế, dùng cho phụ nữ tiền mãn kinh để hạn chế các rối loạn do thiếu estrogen gây
ra.
Tác động này là do chúng có cấu trúc tương tự như estrogen nên có thể gắn vào

thụ
thể estrogen [5]
[28].
Ngoài ra, cho đến nay nhiều nghiên cứu dịch tễ học trên phụ nữ châu Á và phụ
nữ
Âu Mỹ cho thấy các chế độ ăn giàu phytoestrogen đã cải thiện các triệu chứng
thiếu
hụt estrogen ở phụ nữ mãn kinh và có thể dự phòng ung thư vú, loãng xương
và
bệnh lý tim mạch. Tuy nhiên các chất này thể hiện tác dụng sinh học thông qua
các
cơ chế cực kỳ phức tạp. Tác dụng của chúng trên tế bào phụ thuộc vào lượng
thụ
thể α và β của estrogen. Mối liên quan giữa chế độ ăn giàu phytoestrogen và
tần
suất thấp mắc phải ung thư vú và ung thư niêm mạc tử cung đã được khảo sát rất
kỹ
lưỡng và đã được khẳng định trên quần thể phụ nữ sinh sống ở Đông Á (Nhật
Bản,
Đài Loan) và Hawaii. [16],
[39]
1.3.2. Sắn dây trong Đông y cổ
truyền
- Tính vị, công
năng:

Sắn dây có vị ngọt, cay, tính bình, quy vào các kinh tỳ,
vị.

Có tác dụng giải độc, thải nhiệt, sinh tân chỉ khát, thoái chẩn, thăng dương, chỉ

tả.
- Một số bài thuốc có chứa Sắn dây
[11]:

Chữa nghiện rượu: hoa Sắn dây là vị thuốc giải rượu rất có hiệu quả.
Ngày
dùng 12-16gr, sắc uống. Nếu giải độc rượu nên dùng khoảng 30-40gr,
sắc
đậm đặc, cho bệnh nhân uống sẽ làm cơ thể nôn ra hết, dần dần tỉnh
lại.

Bài thuốc Cát hoa thang: Sắn dây 12-16gr, Hoa hòe 12-16gr, nấu với 1
lít
nước, sắc còn 700ml, dùng uống giải khát, giải khí độc do thử thấp (khí
nóng
và ẩm) gây ra, phòng ngừa các bệnh ngoài da khi thời tiết oi bức (rôm
sảy,
mụn nhọt, ghẻ ngứa…), dùng giải độc rượu và rất tốt cho người bị đại tiện
ra
máu, cao huyết áp, đái tháo
đường.

Dùng trị sởi đậu: Cát căn 10g, thăng ma, cam thảo, ngưu bàng tử, mỗi
vị
10g. Sắc uống, ngày một
thang.

Chữa cảm mạo sốt cao: Củ sắn dây 8 g, Ma hoàng 5 g, Quế chi 4 g, Đại táo
5
g,

Thược dược 4 g, Sinh khương 5 g, Cam thảo 4 g, nước 600 ml, sắc
còn
200 ml, chia 3 lần uống trong
ngày.

Chảy máu mũi, tâm thần phiền muộn: Củ sắn dây tươi giã nát, vắt lấy
nước
cốt, uống mỗi lần một chén
con.

Chữa rắn cắn: giã lá sắn dây tươi vắt lấy nước uống, bã đắp lên nơi rắn
cắn.

Vết thương chảy nhiều máu: Dùng lá sắn dây tươi giã nát, đắp vào
vết
thương.

Bột rắc những nơi mồ hôi ẩm ngứa: Bột sắn dây 5 g, Thiên hoa phấn 5
g,
Hòa thạch 20 g, trộn đều, tán nhỏ, rắc những nơi ẩm
ngứa.

Chữa trẻ sốt: Củ sắn dây 20 g, thêm 200 ml nước sắc còn 100 ml, cho
trẻ
uống trong
ngày.

Bột Sắn dây pha nước uống có đường giúp giải nhiệt, làm mát cơ
thể.[12]
1.3.3. Sắn dây trong dược học hiện

đại
- Ở Trung Quốc dùng sắn dây chữa bệnh mạch vành, đau thắt ngực, cao huyết
áp,
tai điếc đột
ngột.
- Tuy nhiên, hiện trên thị trường có rất ít các sản phẩm chế biến từ sắn dây.
Nhằm
tạo ra sản phẩm chức năng mới có chất lượng tốt, các tác giả Hoàng Ngọc Tú
và
Huỳnh Thị Minh Trang (Sinh viên Trường đại học công nghệ Sài Gòn) đã
tiến
hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất rượu chức năng từ sắn dây”.
Trong
quá trình lên men rượu, các tác giả cũng đã tiến hành nghiên cứu tạo ra
sản
phẩm đường isomalto - oligosaccharid (IMO). Kết quả phân tích cho thấy
sản
phẩm rượu sắn dây có chứa puerarin, đường IMO có khả năng chống oxy hóa
rất
tốt. Sản phẩm rượu vang sắn dây sau khi tàng trữ và lên men phụ trong 15
ngày
có độ cồn là 12%, màu vàng rơm, trong, có mùi vị đặc trưng của Sắn dây.
Việc
đánh giá cảm quan theo tiêu chuẩn TCVN 3215-79 cho thấy sản phẩm đạt
loại
khá.[6]
- Một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường có chứa các thành phần
được
chiết xuất từ rễ củ Sắn
dây:

+ JuveCare: Là một loại thực phẩm chức năng được nhập khẩu từ nước
ngoài.
Sản phẩm cung cấp hỗn hợp các chiết xuất bổ sung nội tiết tố nữ, cung
cấp
năng lượng…Thành phần gồm: Jujube Dates (Đại Táo), hỗn hợp
Proprietary
Blend với các acid amin, Lá Ginkgo Biloba, Isoflavones (từ rễ cây Kudzu:
củ
sắn dây ).
[42]
+ Ỷ Lan: là một loại thực phẩm chức năng được sản xuất từ các nguyên
liệu
thiên nhiên có tác dụng bổ sung, cân bằng nội tiết tố cho nữ giới… Thành
phần
gồm: Delta - immun, cao Hà thủ ô đỏ, cao mầm Cải củ, cao Cát căn, cao lá
Dâu
non, cao lá Sen bánh tẻ, cao Broccoli, Isoflavonoid, Pregnenolone, DHEA
[43]
+ Metabosol: là một loại thực phẩm chức năng gồm các loại thảo dược, có
thể
dùng chung với thuốc tây điều trị đái tháo đường típ1 và đái tháo đường típ
2.
Thành phần: alpha liopic acid, Lycium fruit (kỷ tử), Morinda citrifolia
(Nhàu),
Dioscorea (hoài sơn), Cinnamon (Quế chi), Cornus (Sơn thù), Pueraria
(Cát
căn), Phelledendron amurerense (Hoàng bá)
[44].
Hình 1.4 Một
số chế

phẩm
có chứa
Sắn dây trên thị
trườ
n
g.
1.4. Các phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa
1.4.1. Phương pháp
FRAP
Phương pháp này được thực hiện theo Benzie và Strain (1996) [15], [8],
[21]
Nguyên
tắc:
Phương pháp này dùng để đo năng lực khử trong huyết tương nhưng cũng được
sử
dụng để phân tích các chất chống oxy hoá trong thực vật. Phương pháp này dựa
vào
sự khử phức Fe (III) –TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazin) thành phức Fe (II)
–TPTZ
bền hơn bằng một chất khử (chất chống oxy hoá) ở pH thấp. Fe (II) – TPTZ có
màu
xanh dương đậm và có thể đo mật độ quang (A) ở bước sóng λ = 593 nm (Hình
1.5)
N
N N
N
N N
F
e
(

III
)
N N
N
N N
N
+Chất
ti
chố
i
ng
o
t

xy hóa
N
e
N N
N
N
N
N
N
N N
F
e
(
II
)
N

N
[
F
e
(
III
)(T
P
TZ)
2
]
3+
[
F
e
(
II
)(T
P
TZ)
2
]

2
+
Hình 1.5 Phản
ứng
FRA
P
Thuốc thử

FRAP:
 Đệm acetat: 300 mM
(pH=3,6)
 10 Mm 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ), pha trong 40 mM
HCl
 20 mM FeCl
3
.6H
2
O trong nước
cất
Tỷ lệ các thành phần trong thuốc thử FRAP theo thứ tự trên là 10:1:1 (v/v).
Dung
dịch được yêu cầu pha mới trong
ngày.
+
an
o
x
d
a
n
Tiến
hành:
1,5 ml thuốc thử được trộn với 50 l mẫu. Hỗn hợp này được mang đi ủ
trong

thời
gian 1,5 giờ ở 37
O

C và được đo ở bước sóng 593 nm. Đường chuẩn là
dung
dịch
FeSO
4
.7H
2
O được pha thành các nồng độ 1000, 750, 500, 250 và 100 mM
rồi
cho
phản ứng với thuốc thử FRAP. Vitamin C được sử dụng như chất đối
chứng.
Kết
quả được thể hiện qua đơn vị đo mol FeII/L. Kết quả đo được lặp lại trên
3
mẫu
thử và lấy giá trị trung
bình.
1.4.2. Phương pháp đo
MDA
Phương pháp này được thực hiện theo Bagaladorov và cộng sự (1987).
[7]
Nguyên
tắc:
Peroxy hoá lipid là một cơ chế thường gặp của những tế bào bị tổn thương
trong
thực vật và động vật, nó được coi như là chất chỉ thị của quá trình stress oxy
hoá
trong tế bào và mô. Việc đo MDA (malonyldialdehyd), một sản phẩm của quá
trình

peroxy hoá lipid, là một phương pháp thuận tiện và nhạy cho việc đánh giá nồng
độ
lipid peroxid trong nhiều mẫu khác nhau bao gồm thuốc, thực phẩm và mô sinh
học
từ người và động vật. [19], [32],
[36].
Phương pháp đo MDA dựa vào phản ứng với acid thiobarbituric. MDA phản
ứng
với acid thiobarbituric (TBA) ở 90
O
C trong môi trường acid tạo phức
MDA-TBA
có màu hồng, gồm 2 mol TBA kết hợp với một mol MDA. Phức màu được hoà
tan
trong dung môi hữu cơ như butanol rồi đo phổ hấp thu UV ở bước sóng 532
nm
(Hình
1.6).
O
OHC-CH2-CHO
O
H H
H
H
N
N
O
H
-2H
2

O
N
O
CH=CH-HC H
N
S N
O
H
H
HO N
S
H
S N
O
H
H
HO N
S
H
TBA
MDA TBA
Phuc
MDA
-TB
A
Hình 1.6 Phản
ứng
tạo
sản
phẩm MDA -

T
B
A
Thuốc
thử:
Tween 80 (1%), FeSO4 (10-3 M), acid ascorbic (10-2 M), acid trichloracetic
(30%),
acid thiobarbituric
(0,25%).
Tiến
hành:
Một hỗn hợp dung dịch gồm 2ml tween 80 (1%); 0,2 ml FeSO
4
(10 - 3 M); 0,2
ml
acid ascorbic (10 - 2 M) và 0,2 ml mẫu được trộn đều, sau đó mang đi ủ ở 40
O
C
trong tối trong thời gian 48 giờ. Kết thúc phản ứng peroxy hóa lipid bằng cách
thêm
1,3 ml acid trichloracetic (30%). Hỗn hợp này cũng được trộn đều và được ủ
trong
thời gian 1giờ. Sau đó dung dịch này được mang đi ly tâm ở tốc độ 600
vòng/phút
trong thời gian 10 phút. Lấy 2 ml dịch ly tâm, cho vào 1 ống nghiệm, thêm vào 2
ml
acid thiobarbituric (0,25%), đặt vào nước sôi khoảng 15 phút, để nguội, đo độ
hấp
thu ở bước sóng 532 nm. Kết quả đo được lặp lại trên 3 mẫu thử và lấy giá trị
trung

bình.
Tính kết
quả:
Phần trăm ức chế sự peroxy hóa lipid được tính theo công
thức:
% ức chế = [(X-Y)/X] 
100
Trong đó, X : độ hấp thu của mẫu chứng (không có mẫu
thử)
Y : độ hấp thu của dung dịch phản ứng có mẫu thử
nghiệm.
1.4.3. Phương pháp sàng lọc khả năng loại gốc tự do DPPH
(1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl)
Phương pháp này được thực hiện theo Von Gadow, Joubert và Hansmann
(1997)
[38].
Nguyên
tắc:
Phương pháp thử DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một phương
pháp
thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự do. Phương
pháp
này được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định. Do đó phương
pháp
này được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hoá. DPPH là một gốc
tự
do có bước sóng hấp thu cực đại ở 517 nm và có màu tím. Các chất có khả
năng
chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ

hấp
thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển
từ
tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy
hóa
được minh họa trong hình 1.7
[16].
N
N
.
O
2
N
N
.
N
O
2
+ AH
O
2
N
NH
N
O
2
+
A

.

N
O
2
N
O
2
DPPH
Chât
c
hông
oxy
hóa
D
PP
H-H
Hình 1.7 Phản
ứng
trung hòa
gốc
DPPH
Thuốc thử: dung dịch DPPH (6.10
-5
M trong
methanol)
Tiến
hành:
Mẫu thử (50 l) được trộn với 2 ml dung dịch DPPH (6.10-5 M
trong
methanol).
Hỗn hợp phản ứng được để trong tối 16 phút, sau đó đo sự giảm độ

hấp
thu ở bước sóng 517 nm. Kết quả đo được lặp lại trên 3 mẫu thử và lấy giá trị
trung
bình.
Tính kết
quả:
(%) ức chế gốc DPPH của các mẫu thử được tính theo công
thức:
% ức chế DPPH = [(Ac - At)/Ac]


100
Trong đó, Ac: độ hấp thu của mẫu chứng (không có mẫu
thử)
At: độ hấp thu của mẫu thử nghiệm ở t = 16
phút.
1.4.4. Phương pháp xác định khả năng bất hoạt enzyme xanthin
oxidase
Phương pháp được thực hiện theo Noro và cộng sự (1983) [29],
[33]
Nguyên
tắc:
Xanthin oxidase là một enzyme tiền oxy hóa xúc tác phản ứng oxy hóa xanthin
tạo
acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O
2
 Phương pháp thử xanthin
oxidase
sử
dụng phổ UV-Vis khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthin oxidase của

các
mẫu thử thông qua mật độ quang của sản phẩm acid uric hình thành. Acid uric
có
bước sóng hấp thu cực đại ở 290 nm. Chất có khả năng chống enzyme
xanthin
oxidase càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó mật độ quang
của
acid uric sẽ
giảm.
Thuốc thử: Đệm phosphat 70 mM (pH=7,5); xanthin oxidase 0,08 U/ml; HCl
1N.
Tiến
hành:
Một hỗn hợp gồm 300 l dung dịch mẫu, 1500 l đệm phosphat 70 mM và
100

l xanthin oxidase 0,08 U/ml được đem đi ủ trong 15 phút ở 25
O
C. Sau đó
thêm

vào
900 dung dịch xanthin và tiếp tục ủ trong 30 phút. Cuối cùng phản ứng được
kết
thúc bằng HCl 1N và được đo mật độ quang ở bước sóng 290
nm.
Tính kết
quả:
Khả năng ức chế enzyme xanthin oxidase được tính theo công
thức:

I (%) = [(Ac-As)/Ac] 
100
Trong đó, Ac: Giá trị mật độ quang của mẫu chứng (không có mẫu
thử)
As: Giá trị mật độ quang của mẫu thử
nghiệm