Xây dựng hệ thống nuôi cấy rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất artemisinin ở cây thanh hao (artemisia annua linn)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




PHẠM THẾ ANH





XÂY DỰNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TÓC VÀ ỨNG
DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
ARTEMISININ Ở CÂY THANH HAO (ARTEMISIA
ANNUA. LINN)



Chuyên ngành: Sinh lý Thực vật
Mã số: 6042302





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. TRẦN VĂN MINH
2. TS. NGUYỄN THỊ THANH





TP. Hồ Chí Minh – 2010
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Ba, má – Người đã sinh thành, dạy dỗ, yêu thương, chăm sóc và lo lắng cho
tôi; cùng mọi thành viên trong gia đình đã chia sẽ, động viên tôi trong học tập
và trong cuộc sống.
Thầy PGS.TS. Trần Văn Minh, Cô TS. Nguyễn Thị Thanh đã trực tiếp
hướng dẫn, tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện
luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến cố GS. TS. Mai Trần Ngọc Tiếng,
PGS. TS. Bùi Trang Việt, PGS.TS. Võ Thị Bạch Mai, TS. Nguyễn Du Sanh.
Các quý Thầy, Cô đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt thời
gian học tại trường.
Cảm ơn các quý thầy cô, các anh chị, các bạn, các em ở Bộ môn sinh lý
thực vật - trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM đã giúp đỡ tôi trong
thời gian làm luận văn tại Bộ môn.
Cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp Hồ Chí Minh,
Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực
hiện đề tài này.
Cảm ơn tập thể lớp cao học SLTVK17, cảm ơn các anh, chị, các bạn đã

giúp đỡ tôi trong ba năm học vừa qua.
Cảm ơn cô Bùi Thị Tường Thu, bạn Lê Thị Hiền, bạn Trần Trọng Tuấn,
cùng các anh chị, các bạn Phòng Công nghệ phôi soma - Viện Sinh học Nhiệt
đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.
Cảm ơn các đồng nghiệp và bạn bè đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, chia sẽ và
động viên trong suốt thời gian làm luận văn cũng như trong công việc và cuộc
sống.


Phạm Thế Anh
i Mục
lục


Phạm Thế Anh SLTVK17
MỤC LỤC
Mục lục i
Danh mục chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục biểu đồ viii
Danh mục hình ix
Danh mục ảnh x
Lời mở đầu 1
1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Thanh hao Artemisia annua L và bệnh sốt rét 3
1.1.1. Cây Thanh hao Artemisia annua 3
1.1.1.1. Hệ thống phân loại. 3
1.1.1.2. Đặc điểm phân bố 3
1.1.1.3. Đặc điểm sinh thái 4
1.1.1.3.1. Điều kiện sống 4

1.1.1.3.2. Vòng đời 4
1.1.1.4. Thành phần hóa học 5
1.1.2. Tổng quan về bệnh sốt rét và liệu pháp chữa trị 6
1.1.2.1. Sơ lược về bệnh sốt rét 6
1.1.2.2. Artemisinin công cụ chữa bệnh sốt rét hiện nay 7
1.2. Sinh tổng hợp artemisinin 8
1.3. Tổng quan về chuyển gen tạo rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản
xuất hợp chất thứ cấp. 11
1.3.1. Agrobacterium rhizogenes chuyển gen tạo rễ tóc 11
ii
Mục lục


Phạm Thế Anh SLTVK17
1.3.1.1. Giới thiệu 11
1.3.1.2. Nguồn gốc và quy trình chuyển gen tạo rễ 12
1.3.1.3. Dùng PCR để đánh giá kết quả chuyển gen vào thực vật 17
1.3.2. Nuôi cấy rễ chuyển gen và ứng dụng trong công nghệ nghiên cứu
sản xuất các hợp chất thứ cấp 19
1.3.3. Các nguyên lý cơ bản nhằm làm gia tăng quá trình sản xuất các
hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ chuyển gen 19
1.3.3.1. Chọn lọc dòng rễ có năng suất cao 20
1.3.3.2. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy 21
1.3.3.3. Elicitor 21
1.3.3.4. Nuôi cấy hai giai đoạn 22
1.3.3.5. Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ chuyển
gen và sản xuất hợp chất thứ cấp. 23
1.3.3.5.1. Khái niệm bioreactor 23
1.3.3.5.2. Khó khăn và thuận lợi của nuôi cấy bằng hệ thống
bioreactor 24

1.3.3.5.3. Phân loại bioreactor 25
1.3.3.5.4. Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ
chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp. 26
1.4. Sắc ký lỏng cao áp HPLC 27
1.4.1. Nguyên tắc 27
1.4.2. Thiết bị 28
iii
Mục lục


Phạm Thế Anh SLTVK17
2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 29
2.1.1. Nguồn mẫu ban đầu 29
2.1.2. Môi trường nuôi cấy 29
2.1.3. Dụng cụ thiết bị 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP 29
2.2.1. Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao 29
2.2.1.1. Gieo hạt in vitro 29
2.2.1.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 29
2.2.1.3. Kiểm tra kết quả chuyển gen 31
2.2.1.3.1. Tách chiết DNA thực vật 31
2.2.1.3.2. Tách chiết plasmid DNA của Agrobacterium rhizogenes
ATCC 11325 31
2.2.1.3.3. Phân tích PCR kiểm tra quá trình chuyển gen 32
2.2.1.4. Phân tích CĐHSTTV của rễ chuyển gen bằng phương pháp
sinh trắc nghiệm 33
2.2.1.5. Định tính artemisinin trong rễ tóc bằng phương pháp TLC 36
2.2.1.5.1. Nguyên tắc 36
2.2.1.5.2. Cách tiến hành 37

2.2.2. Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng lắc 38
2.2.2.1. Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy lên sự tăng
trưởng và tích lũy artemisinin của rễ tóc 39
2.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ đạm nitrat đến khả năng tích tụ
artemisinin 39
2.2.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH
4
+
/NO
3
đến tích tụ artemisinin 40
iv
Mục lục


Phạm Thế Anh SLTVK17
2.2.2.4. Ảnh hưởng của photphat vô cơ đến khả năng tích tụ
artemisinin 40
2.2.2.5. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tích tụ artemisinin 40
2.2.2.6. Ảnh hưởng của GA
3
đến khả năng tích tụ artemisinin 41
2.2.2.7. Môi trường cải tiến 41
2.2.3. Nuôi cấy rễ tóc Thanh hao trong bioreactor ngập chìm tạm thời 41
2.2.3.1. Động thái tăng trưởng của rễ trong bioreactor ngập chìm tạm
thời 42
2.2.3.2. Biến động pH của môi trường nuôi cấy đến tích tụ artemisinin 42
2.2.3.3. Biến động của chu kỳ chiếu sáng đến tích tụ artemisinin 42
2.2.3.4. Biến động của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin 42
2.2.3.5. Ảnh hưởng của điều kiện tổng hợp 43

2.2.3.5.1. Chu kỳ ngập chìm trong nuôi cấy bioreactor 43
2.2.3.5.2. Ảnh hưởng của YE và chitosan đến sự tích tụ artemisinin 43
2.2.4. Định lượng artemisinin bằng phương pháp HPLC với bộ phản ứng
sau cột và đầu dò UV 43
2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu 43
2.2.4.2. Định lượng artemisinin 44
2.3. XỬ LÝ THỐNG KÊ 45


3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao 46
3.1.1. Gieo hạt in vitro 46
3.1.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 47
v
Mục lục


Phạm Thế Anh SLTVK17
3.1.3. Kiểm tra kết quả chuyển gen 50
3.1.4. Đo hoạt tính CĐHSTTV 52
3.1.5. Định tính artemisinin 54
3.2. Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng 55
3.3. Nuôi cấy rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm thời 62
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN 71
4.2. ĐỀ NGHỊ 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO 73
PHỤ LỤC

vi Danh mục

viết tắt


Phạm Thế Anh SLTVK17
DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

ABA : Abscisic acid
BA : 6-benzyladenine
B5 : Môi trường Gamborg và Eveleigh (1968)
CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
GA
3
: Gibberellic acid
HPLC : High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng
cao áp)
LB : Môi trường Luria Bertani
LV : Môi trường Litvay (1985)
NAA : a-naphthaleneacetic acid
MJ : Methyl Jasmonate
MS : Môi trường Murashige và Skoog (1962)
PCR : Polymerase Chain Reaction
SA : Acid Salisilic
TLC : Thin layer chromatography (Sắc ký bản mỏng)
YE : Yeast extract (Dịch chiết nấm men)
ZEA : Zeatin
WHO : World Health Organization

viii Danh mục biểu đồ

Phạm Thế Anh SLTVK17
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong gieo hạt in vitro 46
Biểu đồ 3.2. Hoạt tính Auxin, ABA, Cytokinin và Giberelin tổng ở rễ đối
chứng và rễ tóc chuyển gen 52
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của môi trường đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 56
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của đạm nitrate đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 57
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH
4
+
/NO
3
đến khả năng tích tụ artemisinin
(nuôi cấy lỏng) 58
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của photphat

đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 59
Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của BA

đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 60
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của GA
3


đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 61
Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của môi trường cải tiến

đến tích tụ artemisinin (nuôi
cấy lỏng) 62

Biểu đồ 3.10. Động thái tăng trưởng của rễ tóc nuôi trong bioreactor ngập chìm
tạm thời 63
Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tích tụ artemisinin (nuôi cấy
trong bioreactor) 65
Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến tích tụ artemisinin (nuôi
cấy trong bioreactor) 66
Biểu đồ 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy trong
bioreactor) 67
Biểu đồ 3.14. Ảnh hưởng của môi trường cải tiến đến tích tụ artemisinin (nuôi
cấy trong bioreactor) 68
Biểu đồ 3.15. Ảnh hưởng của chu kỳ ngập chìm đến tích tụ artemisinin (nuôi
cấy trong bioreactor) 69
Biểu đồ 3.16. Ảnh hưởng của YE và Chitosan đến tích tụ artemisinin 71
vii Danh mục bảng


Phạm Thế Anh SLTVK17
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 32
Bảng 2.2. Bảng bố trí các loại môi trường nuôi cấy thí nghiệm 38
Bảng 2.3. Bảng bố trí các hàm lượng đạm nitrat nuôi cấy thí nghiệm 39
Bảng 2.4. Bảng bố trí các tỷ lệ NH
4
+
/NO
3
nuôi cấy thí nghiệm 39
Bảng 2.5. Bảng bố trí các hàm lượng KH
2

PO
4
nuôi cấy thí nghiệm 40
Bảng 2.6. Bảng bố trí các hàm lượng BA nuôi cấy thí nghiệm 40
Bảng 2.7. Bảng bố trí các hàm lượng GA
3
nuôi cấy thí nghiệm 41
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong gieo hạt in vitro 46
Bảng 3.2. Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tổng cộng ở rễ tóc
chuyển gen và rễ đối chứng 52
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khoáng đến tích tụ
artemisinin 55
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của đạm nitrat đến tích tụ artemisinin 56
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH
4
+
/NO
3
đến tích tụ artemisinin 57
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của photphat đến tích tụ artemisinin 58
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BA đến tích tụ artemisinin 59
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của GA
3
đến tích tụ artemisinin 60
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường cải tiến đến tích tụ artemisinin 61
Bảng 3.10. Động thái sinh trưởng của rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm
thời 62
Bảng 3.11. Biến động của pH môi trường nuôi cấy đến tích tụ artemisinin 64
Bảng 3.12. Biến động của chu kỳ chiếu sáng đến tích tụ artemisinin 65
Bảng 3.13. Biến động của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin 66

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của điều kiện tổng hợp 67
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của chu kỳ ngập chìm đến tích tụ artemisinin 68
Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của YE và Chitosan đến khả năng tích tụ artemisinin
trong bioreactor 70
ix Danh mục hình và ảnh


Phạm Thế Anh SLTVK17
DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Artemisia annua và cấu trúc hóa học của artemisin 3
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp artemisinin 9
Hình 1.3. Quá trình xâm nhiễm của Agrobacterium 13
Hình 1.4. Cấu trúc Ri-plasmid của A. Rhizogenes 15
Hình 1.5. Sơ đồ cảm ứng ra rễ của Agrobacterium 16
Hình 1.6. Quá trình PCR 17
Hình 1.7. Các bước ứng dụng trong việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ rễ tóc
chuyển gen 20










x Danh mục hình và ảnh

Phạm Thế Anh SLTVK17
DANH MỤC ẢNH

Trang
Ảnh 1. Hệ thống máy HPLC (Waters, Mỹ) 28
Ảnh 3.1. Gieo hạt in vitro 47
Ảnh 3.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 48
Ảnh 3.3. Hình thành rễ thứ cấp từ rễ bất định ban đầu 48
Ảnh 3.4. Quá trình hình thành rễ tóc từ mẫu mô lá được chuyển gen 49
Ảnh 3.5. Kết quả phân tích PCR kiểm tra gen rolA trên rễ tóc chuyển
gen 50
Ảnh 3.6. Kết quả phân tích PCR kiểm tra gen rolB trên rễ tóc chuyển
gen 51
Ảnh 3.7. Kết quả phân tích PCR kiểm tra gen rol trên rễ tóc chuyển gen 51
Ảnh 3.8. Rễ tóc tăng trưởng trên môi trường thạch MS không bổ sung
CĐHSTTV 53
Ảnh 3.9. Phát hiện artemisinin bằng TLC 54
Ảnh 3.10. Tăng trưởng rễ tóc trên môi trường B5, MS và LV 55
Ảnh 3.11. Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường MS và môi trường cải tiến MSI 61
Ảnh 3.12. Động thái tăng trưởng của rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm
thời 63
Ảnh 3.13. Sinh trưởng của rễ tóc trên môi trường MS, MSI và MSII 67
Ảnh 3.14. Chu kỳ nổi và ngập môi trường 69
1 Lời mở
dầu


Phạm Thế Anh SLTVK17

LỜI MỞ ĐẦU
Sốt rét, một trong những căn bệnh phổ biến nhất ở các nước nhiệt đới, gây
ảnh hưởng đến 500 triệu người hàng năm và làm chết hơn một triệu người
(WHO, 2004). Chính việc kháng lại thuốc quinoline của ký sinh trùng
Plasmodium falciparum đã làm cho căn bệnh sốt rét ngày càng trở nên khó
kiểm soát (Balint, 2001). Tuy nhiên, ngay nay artemisinin – được chiết xuất từ
Artemisia annua L. – đã trở nên phổ biến được xem như phương thức chữa sốt
rét hữu hiệu và an toàn. Những nghiên cứu về cấu trúc phân tử cho thấy
artemisinin là một sesquiterpene lactone, bên trong có cầu nối endoperoxide.
Artemisinin và các dẫn xuất có khả năng chống lại các dòng Plasmodium
falciparum kháng đa thuốc, chủ yếu là ở vùng Đông Nam Châu Á và gần đây là
ở Châu Phi (Meshnick và cs., 1996).
Nguồn artemisinin hiện nay có được là từ việc thu nhận cây Thanh hao
ngoài tự nhiên. Sản lượng artemisinin tùy thuộc từng mùa và tùy vào từng loại
cá thể. Ngoài ra, côn trùng, nấm mốc, vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến hàm
lượng và hoạt tính của artemisinin. Sự tổng hợp artemisinin ngoài cơ thể cũng
đã được xem xét nhưng không hiệu quả do quá phức tạp, hàm lượng lại thấp do
đó không đem lại hiệu quả kinh tế cao. Để giải quyết các vấn đề này, việc thu
nhận artemisinin thông qua nuôi cấy mô thực vật đã được xem như giải pháp
thay thế đầy hứa hẹn. Sự tổng hợp artemisinin in vitro đã được tìm thấy trong
mô sẹo, tế bào dịch huyền phù và nuôi cấy rễ chuyển gen.
Nuôi cấy rễ tóc chuyển gen là một hướng mới trong hệ thống nuôi cấy mô
tế bào thực vật, chúng thể hiện nhiều ứng dụng hứa hẹn trong tương lai hơn
phương pháp nuôi cây tế bào và mô sẹo truyền thống. Điều này được thể hiện
qua tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng tổng hợp các chất thứ cấp và có tính
bền vững cao về mặt di truyền và sinh hoá. Agrobacterium chuyển gen tạo rễ
tóc ở A. anua sản xuất artemisinin và gia tăng sinh khối hơn không chuyển gen
nhiều, điều này đã làm cho chúng trở thành một hệ thống tốt để ngiên cứu sản
xuất các hợp chất thứ cấp.
2 Lời mở

dầu


Phạm Thế Anh SLTVK17
Nhằm mục tiêu giải quyết phần nào tình trạng thiếu thuốc chữa trị sốt rét
hiện nay,chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng hệ thống nuôi
cấy rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất artemisinin ở cây Thanh
hao (Artemisia annua. Linn)”
Đề tài gồm những nội dung chính sau:
ü Thiết lập qui trình chuyển gen tạo rễ tóc ở cây Thanh hao
ü Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng
ü Nuôi cấy rễ tóc trên bioreactor ngập chìm tạm thời
ü Tách chiết hợp chất thứ cấp và sử dụng phương pháp TLC
và HPLC để định tính và định lượng hàm lượng artemisinin
trong rễ tóc.
Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về
Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện sinh học Nhiệt đới.


3 Chương 1. Tổng
quan


Phạm Thế Anh SLTVK17
1.1. Tổng quan về cây Thanh hao Artemisia annua L và bệnh sốt rét
1.1.1. Cây Thanh hao Artemisia annua
1.1.1.1. Hệ thống phân loại
Theo Mabberley (1997), hệ thống phân loại của cây Thanh hao như sau:
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae
Chi: Artemisia
Tên khoa học: Artemisia annua Linn
Tên tiếng Anh: (Sweet/annual) Wormwood, sweet Annie (E)
Tên thông thường: Thanh hao hoa vàng, Thanh cao, Thảo cao, Ngải si, Ngải
hôi, Ngải đắng

Hình 1.1. Artemisia annua và cấu trúc hóa học của artemisinin
1.1.1.2. Đặc điểm phân bố
Cây Thanh hao hoa vàng (Artemisisa annua) bắt nguồn từ châu Á (Trung
Quốc, Việt Nam), mọc tốt ở khí hậu ôn đới hay cao nguyên. Có thể tìm thấy
4 Chương 1. Tổng
quan


Phạm Thế Anh SLTVK17
chúng ở các cánh đồng, nông trại, bờ rừng, dọc đường, trên bùn gần bờ sông,
rạch Hiện nay, Thanh hao là một loại cây rất phổ thông, phân bố ở vùng ôn
đới ẩm, cận nhiệt đới và nhiệt đới Bắc bán cầu, gồm một số nước Đông Âu,
Bắc Mỹ, Tây Nam Á và Đông Á. Ở châu Á, thường gặp cây ở phía nam Liên
Xô cũ, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và Việt Nam…
Ở Việt Nam, theo kết quả điều tra của Viện dược liệu từ năm 1986 – 1990,
đã phát hiện Thanh hao hoa vàng mọc tự nhiên ở 4 tỉnh. Trong 15 loài thuộc
chi Artemisia ở Việt Nam, có 4 loài rất giống nhau về hình thái là: Artemisia
apiaceae, A. capillaris, A. campetris và A. annua; trong đó chỉ có A. annua có
artemisinin.
1.1.1.3. Đặc điểm sinh thái
1.1.1.3.1. Điều kiện sống

Ø Khí hậu: Thanh hao có biên độ sinh thái rộng, sinh trưởng được ở các
vùng ôn đới ẩm và cả ở vùng nhiệt đới gió mùa nóng ẩm Việt Nam. Tuy nhiên,
vùng phân bố tự nhiên của Thanh hao hoa vàng ở miền Bắc Việt Nam bị ảnh
hưởng nhiều bởi gió mùa đông bắc từ cuối thu đến xuân.
Ø Ánh sáng: Thanh hao hoa vàng là loại cây ưa sáng và ẩm. Trong tự
nhiên, có thể thấy cây hơi chịu bóng khi mọc lẫn với một số cây cỏ và cây bụi ở
vùng đồi và chân núi đá vôi. Theo “Trung dược thông báo” tập 11, số 7, 1986
chế độ chiếu sáng ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng artemisinin trong lá; độ
che bóng càng cao thì hàm lượng hoạt chất này càng giảm.
Ø Yêu cầu đất: phạm vi thích ứng rộng, đất giàu dinh dưỡng, thoát nước,
tưới tiêu thuận tiện, pH đất = 5,0 – 6,5.
1.1.1.3.2. Vòng đời
Hàng năm, từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3, khi nhiệt độ không khí ấm dần
lên (16 – 18
o
C), hạt Thanh hao trong tự nhiên bắt đầu nẩy mầm. Trong thời
gian từ khoảng 2 – 2,5 tháng đầu, cây con sinh trưởng chậm; trung bình chỉ cao
8 – 10,2 cm/tháng. Lúc này, cây chưa có hoạt chất.
Khi cây được 3,5 – 4 tháng tuổi là thời kỳ sinh trưởng mạnh, bắt đầu phân
cành và có chiều cao đạt trên 1 m, tăng trung bình 15,3 – 17,7 cm/tháng; hàm
5 Chương 1. Tổng
quan


Phạm Thế Anh SLTVK17
lượng hoạt chất trong lá tăng rất nhanh, cho đến khi bắt đầu có hoa được xem là
cực điểm.
Đến cuối tháng 7 hoặc đầu tháng 8 cây sinh trưởng chậm lại; số lá xanh trên
cây giảm đi, do các lá phía gốc già và rụng.
Hoa Thanh hao hoa vàng nở từ dưới lên trên và từ ngoài vào trong. Quả già

và chín từ giữa tháng 10 đến tháng 11.
Vào giữa tháng 11, cây vàng úa và tàn lụi, hạt giống được phát tán ra xung
quanh. Hạt Thanh hao hoa vàng tồn tại trên mặt đất qua mùa đông lạnh từ 3 –
3,5 tháng. Tuy nhiên, khả năng nẩy mầm của hạt giảm nhanh theo thời gian bảo
quản.
1.1.1.4. Thành phần hoá học
Phần trên mặt đất của Thanh hao hoa vàng chứa artemisinin (thành phần
chính), acid artemisinic, quinghaosu I (artennuin A), quinghaosu II (artennuin
B), quinghaosu III (desoxyartemisinin ), quinghaosu IV, quinghaosu V
(artennuin E), artemisininlacton (artennuin F), artemisiten
(dehydroartemisinin), artemisinic acid methyl ester, artennuin C, artemisinin G,
artemisino, 11 R – (-) – dihydroartenuin epoxyartemisinic,
dihydroepideoxyartennuin B, epideoxyartennuin B. Ngoài ra, còn có 1,1% tinh
dầu gồm 47 thành phần, trong đó artemisiaceton (52,5%), 1 – 8 cineol
(11,66%) và camphor (10,9%).
Cây còn chứa lipid, flavonoid, coumarin, polyacetylen, tinh dầu serol.
Ø Các lipid gồm : nonacosanol, 2 – methyltricosan – 8 – on – 23 – ol,
hentriacontanyl – tricontanoat và 2, 29 – dimethyltriacontan.
Ø Các hợp chất flavonoid gồm quercetagetin – 3 – methylether;
quercetagetin –6,7 – tetramethylether; quercetagetin –6,7 – 4’ – trimethyl ether;
3,5 – dihydroxy –3’,4’ – 6,7 – tetramethoxyflavon; 3,3’,5’ – dioxyflavon;
kaempferol; quercetin; 6 - methoxy kaempferol, artemetin; casticin;
chrysopletin.
Ø Các dẫn chất polyacetylen là anuadiepoxyd và ponticaepoxyd.
Ø Tinh dầu cây Thanh hao hoa vàng Việt Nam chứa a - pinen, camphen,
sabinen, b - pinen, b - myrcen 4,38%, p. cymen, 1 – 8 cineol 15,44%,
6 Chương 1. Tổng
quan

Phạm Thế Anh SLTVK17
artemisiaceton, linalol, limonen oxyd, camphor 23,75%, artemisialcol, 4 –
terpineol, 2 – methylen – 5 – isopropenylcyclohexanol, geranyl acetat, b -
cubeben, a - cubebon - b - caryophylen 6,29%, b - farnesen, D - cadinen
(Nguyễn Xuân Dũng và cs, 1990).
Theo Harman J. Woerdenbag và cộng sự (1994), lá thanh hao hoa vàng cho
các hàm lượng cao nhất về artemisinin (0,86%), acid artemisinic (0,16%) và
artennuin B (0,08%) vào thời điểm cây được 5 tháng tuổi. Sau đó, hàm lượng
các chất này đều giảm đi. Tinh dầu đạt hàm lượng tối đa (1%) trước khi cây ra
hoa. Lúc này, tinh dầu chứa monoterpen 55% và sesquiterpen 45%.
1.1.2. Tổng quan Bệnh sốt rét và liệu pháp chữa trị
1.1.2.1. Sơ lược về bệnh sốt rét
Bệnh sốt rét đã trở thành vấn đề toàn cầu, là căn bệnh thường thấy ở 105
quốc gia, phổ biến ở nhiều vùng thuộc châu Á, châu Phi, Trung Mỹ và Nam
Mỹ. Hàng năm, có 300 – 500 triệu người trên khắp thế giới bị nhiễm bệnh và
hơn một triệu người chết vì căn bệnh này. Tình trạng mắc bệnh và tử vong, đặc
biệt là ở trẻ em và thai phụ do sốt rét đang ở báo động mạnh. Du khách và dân
nhập cư mang bệnh sốt rét là một trong những nguyên nhân khiến bệnh sốt rét
lan truyền khắp thế giới.
Mỗi ngày tại châu Phi có đến 3.000 trẻ em tử vong vì sốt rét (thống kê năm
2003), nghĩa là cứ mỗi 30 giây lại có một em chết vì căn bệnh này. Hai loại
muỗi A. gambiae và A. funesus được xem là “vô địch” trong lĩnh vực truyền
bệnh cho người tại đây. Bệnh gây thiệt hại khoảng 12 tỷ USD / năm cho châu
Phi, chiếm đến 40% ngân sách phục vụ sức khỏe cộng đồng.
Việt Nam cũng nằm trong khu vực sốt rét nặng của thế giới. Khoảng 60
năm trước, mỗi năm nước ta có gần 1 triệu người mắc bệnh, chiếm 5% dân số
(Morin, 1926), tỉ lệ tử vong đến 20%. Chương trình thanh toán sốt rét được tiến
hành từ năm 1960 nhưng hiện vẫn có khoảng 45 triệu dân ta sống trong vùng
lưu hành sốt rét. Các vùng này chiếm 3/4 diện tích cả nước gồm vùng rừng núi
phía Bắc, ven dọc Trường Sơn, cao nguyên miền Trung, khu vực Đông Nam,

Tây Nam và miền duyên hải.
7 Chương 1. Tổng
quan


Phạm Thế Anh SLTVK17
Liệu pháp chữa trị và sự kiểm soát sốt rét đang trở nên khó khăn hơn do
chiều hướng kháng thuốc của ký sinh trùng và chiều hướng kháng thuốc diệt
côn trùng của muỗi đang gia tăng. Mặc dù vậy, chỉ có 4 trong số khoảng 1.400
loại thuốc mới, được phát triển trong giai đoạn từ 1975 đến 1999 là để chống
sốt rét. Vì thế, hiện nay sốt rét vẫn là một căn bệnh khó tiêu diệt. Các nhà khoa
học vẫn không ngừng nghiên cứu nhằm tìm ra một loại thuốc mới điều trị sốt
rét hiệu quả hơn.
Theo báo cáo của Viện Y học IOM, bệnh sốt rét đang tái phát ở mức độ
cao, từ đó nhấn mạnh đến việc cần thiết phải bổ sung nguồn thuốc cấp bách với
giá thành rẻ hơn nhưng có thể thay thế các thuốc trị sốt rét cũ đã bị đề kháng.
1.1.2.2. Artemisinin công cụ chữa trị sốt rét hiện nay
Thuốc trị ký sinh trùng sốt rét tốt và hiệu nghiệm nhất hiện nay là
artemisinin lấy từ cây Thanh hao (quinghao) mà Trung Quốc đã tìm ra đầu thập
niên 1970, áp dụng thành công trong các thử nghiệm lâm sàng và hiện được
dùng rộng rãi. Artemisinin có tác dụng diệt nhanh chóng các ký sinh trùng lưu
thông trong máu và khi dùng chung với các thuốc chống sốt rét khác cho kết
quả rất tốt, làm giảm nhiều xác suất tái xuất hiện của các ký sinh trùng kháng
thuốc.
Tại Việt Nam, hai danh y Tuệ Tĩnh và Hải Thượng Lãn Ông cũng đã dùng
Thanh hao hoa vàng trị được bệnh sốt rét, đổ mồ hôi trộm. Từ năm 1984, Việt
Nam cũng đã dùng Thanh hao để trích ra các hợp chất arthemeter, artemisinin
và artesunate, nghiên cứu trị sốt rét thành công trong thử nghiệm và thực tiễn
trên bệnh nhân sốt rét. Trong chiến tranh, dù không phổ biến, Thanh hao cũng
đã được dùng để trị sốt rét.

Năm 1979, Trung Quốc đã tiến hành một cuộc thử nghiệm lâm sàng dùng
artemisinin trên 2.099 bệnh nhân sốt rét. Một kết quả không tưởng là tất cả đều
hết bệnh. Ngoài ra, artemisinin dùng trên 143 bệnh nhân sốt rét với ký sinh
trùng đã nhờn thuốc chloroquine và 141 bệnh sốt rét màng não cũng cho kết
quả khả quan. Nhiều thử nghiệm lâm sàng tiếp theo ở Trung Quốc, Đông Nam
Á đều cho các kết quả tương tự.
Ở Việt Nam, trong một thử nghiệm năm 1993 trên 638 bệnh nhân, dùng
8 Chương 1. Tổng
quan


Phạm Thế Anh SLTVK17
thuốc uống artemisinin cho thấy: trong vòng 24 tiếng, 98% ký sinh trùng sốt rét
biến mất. Nhóm bệnh nhân dùng thuốc trong 5 ngày chỉ có 10% là ký sinh
trùng xuất hiện lại. Artemisinin chống được cả P.falciparum và P.vivax. Trong
một thử nghiệm khác năm 1999, kết quả tốt nhất là dùng artemisinin và sau đó
dùng quinine trong 3 - 5 ngày sau.
Artemisinin là hoạt chất chính của cây Thanh hao hoa vàng. Khi cây ra nụ,
lá Thanh hao được thu hoạch có màu vàng nâu hoặc nâu sẫm, giòn dễ vụn nát,
mùi thơm hắc đặc biệt, vị đắng. Đây là lúc lá có hàm lượng artemisinin cao
nhất, 1,6% trong lá khô ( lá xanh chỉ có 0,6% artemisinin). Lá Thanh hao được
tán nhuyễn, xay thành bột để chiết xuất hoạt chất artemisinin.
Ngày nay, artemisinin được coi là phòng tuyến hữu hiệu cuối cùng trong
kho vũ khí chống ký sinh trùng sốt rét
1.2. Sinh tổng hợp artemisinin
Wang và cộng sự (2004) nghiên cứu về sự ảnh hưởng của gen fpf1
(flowering promoting factor1) ở thời điểm Thanh hao ra hoa, mối liên hệ giữa
việc nở hoa và quá trình tổng hợp artemisinin nhận thấy sự ra hoa không là yếu
tố cần thiết cho sự gia tăng hàm lượng artemisinin; thời điểm thu hoạch tốt nhất
là lúc cây ở cuối giai đoạn sinh trưởng và có sự tạo chồi.

Artemisinin là một endoperoxide sesquiterpene lactone thuộc nhóm
isoprenoid. Một trong những con đường sinh tổng hợp quan trọng nhất ở thực
vật là con đường isoprenoid. Terpenoid được tạo nên bởi isopentenyl
diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP). Ở thực vật cấp cao
hơn có hai con đường sinh tổng hợp độc lập nhau dẫn đến việc hình thành IPP:
con đường mevalonate trong cytosol và con đường mevalonate trong thể hạt
(Liu và cs., 2005).

9 Chương 1. Tổng
quan


Phạm Thế Anh SLTVK17

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp artemisinin (Liu và cs., 2005; Bertea và
cs., 2005).
CMK: 4-(Cytidine 5
’
-diphospho)-2-Cmethyl- D-erythritol kinase
CMS: 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyl transferase
10 Chương 1. Tổng
quan


Phạm Thế Anh SLTVK17
DXR: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase
DXS: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase
FPPS: farnesyl diphosphate synthetase
GPPS: geranyl diphosphate synthase
HMGR: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A(HMGCoA)

reductase
HMGS: HMG-CoA synthase; IDS isopentenyl diphosphate synthase
MCS: 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase
MDD: mevalonate diphosphate decarboxylase
MK: mevalonate kinase
MPK: mevalonate-5-phosphate kinase
SES: sesquiterpene synthase
Mới đây, hai gen mã hóa cho deoxy–D-xylulose-5-phosphate synthase
(DXPS) và deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXPR) được
tách từ rễ cây Thanh hao chuyển gen đã chứng minh được rằng con đường sinh
tổng hợp terpenoid diễn ra trong thể hạt (Krushkal và cs. 2003; Souret và cs.
2002). Do đó, con đường mevalonate không phải là con đường duy nhất để
tổng hợp artemisinin trong cây Thanh hao. Akhila và cộng sự (1987) đề nghị
con đường sinh tổng hợp artemisinin hoàn chỉnh bắt đầu từ mevalonic acid và
IPP. Tiếp theo là sự tổng hợp farnesyl pyrophosphate (FPP), germacrane
skeleton, dihydrocostunolide, cadinanolide, arteannuin B, và artemisinin. Hàm
lượng của artemisinic acid gấp 8 – 10 lần so với artemisinin ở cây Thanh hao.
Vì thế, có giả thuyết cho rằng acid artemisinic là tiền chất cho sự sinh tổng hợp
artemisinin B và artemisinin. Sangwan và cộng sự (1993) cho rằng có sự biến
đổi acid artemisinic thành artemisinin B và artemisinin cả ở cây tự nhiên và
trong tế bào nuôi cấy.
Bertea và cộng sự (2005) đã nhận biết được chất trung gian và các enzyme
liên quan đến sự tổng hợp artemisinin ở Thanh hao. Một số enzyme liên quan
đến sự tổng hợp artemisinin như 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A
reductase (HMGR), farnesyl diphosphate synthase (FPPS), and sesquiterpene
synthase (SES).
11 Chương 1. Tổng
quan

Phạm Thế Anh SLTVK17
1.3. Tổng quan về chuyển gen tạo rễ và ứng dụng trong nghiên cứu sản
xuất hợp chất thứ cấp
1.3.1. Agrobacterium rhizogenes chuyển gen tạo rễ tóc
1.3.1.1. Giới thiệu
Từ ngàn xưa, loài người đã phụ thuộc rất nhiều vào thực vật như nguồn
cung cấp các protein, carbohydrat và chất béo (Rao và Ravishankar, 2002).
Ngày nay số lượng và chủng loại các hóa chất do thực vật sản xuất (sử dụng
trong dược phẩm, thực phẩm, phụ gia, mỹ phẩm và thuốc trừ sâu sinh học)
không ngừng được mở rộng. Hơn 25% các thuốc uống sử dụng trong các nước
công nghiệp hoá có nguồn gốc trực tiếp hay gián tiếp từ thực vật, chỉ riêng việc
bán các sản phẩm này hàng năm nước Mỹ đã thu hơn 30 tỷ USD vào năm
2002. Chính nhu cầu cao này đã dẫn tới những nỗ lực để tìm ra các con đường
mới để sản xuất hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ thực vật.
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật mà trong đó các tế bào, mô, cơ quan thực
vật được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, hoàn toàn không phụ thuộc vào yếu
tố khí hậu và địa lý, đòi hỏi có nhiều điều chỉnh trong quá trình nuôi cấy cho
sản xuất các hợp chất biến dưỡng quan trọng. Kỹ thuật này đã được ứng dụng
rộng rãi và đạt được nhiều thành tựu. Khai thác rễ tóc chuyển gen (còn gọi lông
rễ, giống với bệnh ra rễ ở thực vật trong tự nhiên do vi khuẩn gây ra, nguyên
nhân của sự sản xuất ồ ạt rễ bất định với phần lớn là rễ tóc) có mối quan hệ với
cách tiếp cận mới trong công nghệ sinh học thực vật, nhận được nhiều quan
tâm trong những năm gần đây. Tuy cơ chế di truyền chuyển gen gián tiếp của
Agrobacterium đã được biết tới hơn 30 năm nay, song tiềm năng của kỹ thuật
nuôi cấy rễ chuyển gen hầu như không được chú trọng. Tuy nhiên, giữa những
năm 1980, tín hiệu về tiềm năng sinh tổng hợp của lông rễ đã được theo dõi
thông qua một số ít các nhà nghiên cứu, điển hình là sự sản xuất các alkaloid
(Mano và cs., 1986; Payne và cs., 1987). Trong suốt những năm 1990, những
nghiên cứu về vấn đề này gia tăng đáng kể, và hơn 400 bài báo về rễ tóc
chuyển gen đã được công bố. Các nghiên cứu đã nêu rõ một số thuận lợi trong

việc nuôi cấy rễ tóc chuyển gen, bao gồm mối liên quan giữ tốc độ phát triển
nhanh (trong môi trường không có CĐHSTTV), sự bền vững về mặt di truyền
12 Chương 1. Tổng
quan


Phạm Thế Anh SLTVK17
và sinh hoá học, khả năng sinh tổng hợp chất chuyển hoá tới sự phát sinh cơ
quan (Shanks và Morgan, 1999; Sevon và Okman-Caldentey, 2002). Thêm vào
đó, gần đây sự phát triển hệ thống bioreactor mở ra nhiều triển vọng trong việc
nuôi cấy rễ chuyển gen ở qui mô công nghiệp (Guillon và cs., 2006). Hơn nữa,
những quan tâm về hệ thống nuôi trồng rễ chuyển gen đến từ các công ty tư
nhân (ROOTec bioactives GmbH, Basel, Thụy Sĩ), có thể dễ dàng chuyển giao
kiến thức từ các phòng thí nghiệm nghiên cứu sang công nghiệp dược phẩm .
Các báo cáo tổng kết gần đây phát triển các nghiên cứu về rễ chuyển gen,
bao gồm các phương pháp chuyển gen từ thực vật, sản xuất các hợp chất có
hoạt tính sinh học và gia tăng hàm lượng các chất thứ cấp mong muốn. Ngoài
ra còn đề cập đến các kiểu bioreactor cho nuôi cấy rễ tóc chuyển gen và quy
trình nuôi cấy qui mô lớn.
1.3.1.2. Nguồn gốc và quy trình chuyển gen tạo rễ tóc
Agrobacterium rhizogenes là một loài rất gần với Agrobacterium
tumefaciens. Chúng gây ra bệnh trên tầng lông hút của rễ cây song tử diệp. A.
rhizogenes cũng có một plasmid có khả năng tạo rễ, được gọi là “Ri plasmid”.
Phần T-DNA của Ri plasmid sẽ được chuyển vào nhân tế bào thực vật, khi sự
chuyển nạp gen xảy ra, giống như sự chuyển nạp gen của Ti plasmid T-DNA.
Rễ nhánh bất định, có khối u sần sùi được tạo ra ở vùng bị nhiễm. Người ta
hiện biết tương đối ít về T-DNA của Ri plasmid. Trong nhiều dòng A.
rhizogenes, sản xuất opine agropine, T-DNA được tách ra thành 2 phần: TL và
TR. Các gen tổng hợp agropine và auxin định vị trên đoạn sau cùng. Điều này
khác với octopine Ti plasmid, chúng có gen tổng hợp auxin trên đoạn TL. Điều

khá thú vị là, các T-DNA của Ri sản xuất những opine như: cucumopine và
mannopine đều không có gen auxin, nhưng lại cho ra kiểu hình “hairy root”
giống như trường hợp Ti plasmid. Trong trường hợp Ri plasmid, dường như
auxin được sản xuất bởi thực vật, và các gen tổng hợp auxin có vai trò tổng hợp
auxin phụ trợ khi cần. Tính chất đặc biệt của Ri plasmid được khai thác nhiều
trong công nghệ di truyền (Bùi Chí bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) .
13 Chương 1. Tổng
quan


Phạm Thế Anh SLTVK17


Cuối thế kỷ trước, hai bệnh thực vật, bệnh ghẻ khối u (crown gall) và bệnh
rễ tóc hay lông rễ (hairy root) là nguyên nhân chính gây ra nạn mất mùa ở các
vườn nho, mận, táo và đào. Một số nhà nghiên cứu bắt đầu làm sáng tỏ bản
chất tự nhiên cơ chế xâm nhiễm của chúng. Một vài năm sau đó, cơ chế phân tử
cơ bản của những bệnh này được giải thích dựa trên khả năng kỹ thuật di
truyền tự nhiên của vi khuẩn đất gây bệnh thực vật thuộc giống Agrobaterium
(họ Rhizobiaceae) (Chilton và cs., 1977, 1980). Khi nhiều loài thực vật khác
nhau (chủ yếu là loài hạt kín và loài hai lá mầm) bị tổn thương, chúng sản xuất
ra các loại phenolic đơn, như là acetosyringone cảm ứng định vị plasmid vir
gene (virulence) của Agrobacterium, chịu trách nhiệm cho việc chuyển đoạn T-
DNA của Ti-plasmid (Ti: cảm ứng khối u) đối với Agrobacterium tumefaciens
và Ri-plasmid (Ri: cảm ứng ra rễ) trong trường hợp Agrobaterium rhizogenes ở
tế bào thực vật (Nilsson và Olsson, 1997). Các gen của đoạn DNA chuyển vào
làm trung gian hình thành những kiểu hình mới như khối u và lông rễ, tiết ra
Hình 1.3.
Quá trình xâm nhiễm của Agrobacterium. Các bước cần thiết xuất
hiện bên trong vi khuẩn (truyền tín hiệu hóa học, cảm ứng gen vir, và chế

biến T-DNA) và trong tế bào thực vật (vi khuẩn xâm nhiễm, chuyển T-DNA,
xâm nhập nhân tế bào, và gắn chèn T-DNA) được in đậm, cùng với các gen
và protein làm trung gian giữa các bước (theo Gelvin, 2000).