Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho tạo giống mía (saccharum SSP ) chuyển gen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI



BÙI NGỌC TRANG




NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH PHỤC VỤ
CHO TẠO GIỐNG MÍA (SACCHARUM SSP.) CHUYỂN GEN



LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP



Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT
Mã số : 60.62.01



Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS LÊ HUY HÀM



HÀ NỘI - 2008
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
i

Lời cam ñoan


Tôi xin cam ñoan rằng số liệu kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa sử dụng ñể bảo vệ trong một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong luận văn này ñã ñược cảm
ơn, mọi thông tin trích trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, tháng 09 năm 2008
Tác giả


Bùi Ngọc Trang










Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ii

Lời cảm ơn

ðể hoàn thành luận văn, tôi nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ của
mọi người.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến các Thầy giáo, Cô giáo
khoa Nông học, khoa Sau ðại học,bộ môn Công nghệ Sinh học, trường ðại
Học Nông Nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm
luận văn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính trọng sâu sắc nhất tới Thầy giáo -
PGS.TS. Lê Huy Hàm, người ñã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp ñỡ
tôi thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Lý Thu cùng tập thể cán bộ công
nhân viên Viện Di truyền Nông nghiệp ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè ñồng nghiệp ñã ñộng viên giúp ñỡ
tôi hoàn thành khoá học!

Hà Nội, tháng 09 năm 2008
Tác giả


Bùi Ngọc Trang

Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip
iii


MC LC
Li cam ủoan i

Li cm n ii

Mc lc iii

Bng kớ hiu cỏc ch vit tt vi

Danh mc bng vii

Danh mc biu ủ ix

Danh mc hỡnh x

1. Mở đầu 1

1.1 đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 3

1.2.1 Mục đích 3

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 3

1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.3.1 ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 ý nghĩa thực tiễn 3

2. Tổng quan tài liệu 4

2.1 Một số nét về cây mía (Saccharum Ssp.) 4

2.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học 4

2.1.2 Phân bố và yêu cầu sinh thái 5

2.1.3 Giá trị cây mía 6

2.2 Cơ sở khoa học của xây dựng hệ thống tái sinh 7

2.2.1 Cơ sở khoa học 7

2.2.2 Vai trò của hệ thống tái sinh và một số hệ thống nuôi cấy sử dụng cho
biến nạp gen 8

2.3 Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật 11

2.3.1 Khái niệm về chuyển gen 11

Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip
iv


2.3.2 Các phơng pháp chuyển gen 11

2.3.3 Vai trò của gen chỉ thị trong kỹ thuật chuyển gen 14

2.4 Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen vào cây mía 15

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19

3. nội dung, vật liệu và Phơng pháp nghiên cứu 22

3.1 Nội dung nghiên cứu 22

3.2.1 Vật liệu thực vật 22

3.2.2 Vật liệu di truyền 24

3.3 Phơng pháp nghiên cứu 25

3.3.1 Môi trờng nuôi cấy 25

3.3.2 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 25

3.3.3 Bố trí thí nghiệm 25

3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi 33

3.3.5 Xử lý số liệu 34

4. Kết quả và thảo luận 35

4.1 Đánh giá khả năng tái sinh cây thông qua mô sẹo của 4 giống mía nhập nội 35

4.1.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng tạo mô sẹo từ lá non của 4 giống mía 35

4.1.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng tái sinh của 4 giống mía 38

4.2 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh 40

4.2.1 Giai đoạn khởi tạo và nhân mô sẹo 40

4.2.2 Giai đoạn tái sinh, nhân chồi và ra rễ 50

4.2. 3 Giai đoạn vờn ơm 62

4.3 Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị GUS vào mô sẹo của cây mía thông qua
Agrobacterium tumefaciens 64

4.3.1 Thí nghiệm 13. Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho thí nghiệm
chuyển gen vào mô sẹo mía 65

Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip
v


4.3.2 Thí nghiệm 14. Nghiên cứu ảnh hởng của mật độ vi khuẩn đến mức độ
biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo mía 66

4.3.3 Thí nghiệm 15. Nghiên cứu ảnh hởng của AS tới khả năng biểu hiện
tạm thời của gen gus ở mô sẹo mía 67

4.3.4 Thí nghiệm 16. Nghiên cứu ảnh hởng của thời gian lây nhiễm tới khả
năng biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo mía 69

5. Kết luận và đề nghị 72

5.1 Kết luận 72

5.2 Đề nghị 73
tàI LIệU THAM KHảO 76
pHụ LụC 82













Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip
vi


Bảng kí hiệu các chữ viết tắt

Đ/C : Đối chứng
ĐTST : Điều tiết sinh trởng
2,4-D : 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid
ADN : Acid deoxy ribo nucleic
AS : Acetosyringone

BAP : 6-Benzylaminopurine
CS. : Cộng sự
CV : Correlation of Variants
gus : -glucuronidase
IAA : Indole-3-acetic acid
Ki : Kinetin (6-Furfurylaminopurine)
LSD : Least Significant Difference
MS : Murashige và Skoog, 1962
N6 : Chu và cộng sự, 1975
OD
600
: Mật độ vi khuẩn đo ở bớc sóng 600 nm
PCR : Polymerase Chain Reaction
QĐ : Quế đờng
ROC : Republic of China
T-DNA : Transfered-DNA
TDZ : Thidiazuron
VIR : virulence
X-Gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronic acid
-NAA : -Naphtalenacetic acid
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vii


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía 27

Bảng 2. ảnh hưởng phối hợp của auxin và cytokinin tới khả năng tạo mô
sẹo từ lá non mía 27

Bảng 3. ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 28

Bảng 4. ảnh hưởng của cytokinin ñến khả năng nhân nhanh chồi mía 29

Bảng 5. Khả năng tạo mô sẹo từ lá non của 4 giống mía nhập nội 36

Bảng 6. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống giống mía nhập nội 38

Bảng 7. ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo 41

Bảng 8. ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D tới khả năng
tạo mô sẹo 44

Bảng 9. ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trê
n
hai nền môi trường MS và N6 46

Bảng 10. ảnh hưởng của hàm lượng 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trên
nền môi trường N6 48

Bảng 11. ảnh hưởng của Ki và BAP tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo 50

Bảng 12. ảnh hưởng của α-NAA phối hợp Ki tới khả năng tái sinh cây từ mô
sẹo 54

Bảng 13. ảnh hưởng của Ki ñến khả năng nhân nhanh chồi mía 56

Bảng 14. ảnh hưởng phối hợp của auxin và Ki lên khả năng
nhân nhanh chồi mía 58

Bảng 15. ảnh hưởng của α-NAA lên khả năng phát sinh rễ của chồi mía 60

Bảng 16. ảnh hưởng giá thể ñến Tỉ lệ sống của cây mía ngoài vườn ươm 62

Bảng 17. Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumerfaciens thích hợp cho chuyển
gen vào mô sẹo giống ROC 23 65

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
viii


Bảng 18. ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời củ
a
gen gus ở mô sẹo cây mía 66

Bảng 19. ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời
68

của gen gus 68

Bảng 20. ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới tỉ lệ biểu hiện
69

tạm thời của gen gus 69


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ix

DANH MỤC BIỂU ðỒ

Biểu ñồ 1. Khả năng tạo mô sẹo của 4 giống mía 37

Biểu ñồ 2. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống mía 40

Biểu ñồ 3. ảnh hưởng của auxin tới khả năng khởi tạo mô sẹo của cây mía 42

Biểu ñồ 4. ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D 44

tới khả năng tạo mô sẹo cây mía 44

Biểu ñồ 5. Tương quan giữa nồng ñộ 2,4D và khả năng nhân mô sẹo trên
hai nền môi trường MS, N6 47

Biểu ñồ 6. Tương quan giữa nồng ñộ 2,4-D và hệ số nhân mô sẹo của cây mía
49

Biểu ñồ 7. ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 51

Biểu ñồ 8. Tương quan giữa nồng ñộ α-NAA trong tác ñộng tổ hợp với Ki
tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây mía 54

Biểu ñồ 9. Tương quan giữa nồng ñộ Ki và khả năng nhân nhanh chồi mía 57

Biểu ñồ 10. Tương quan giữa nồng ñộ auxin trong tác ñộng tổ hợp với Ki tới
khả năng nhân nhanh chồi mía 58

Biểu ñồ 11. Tương quan giữa nồng α-NAAvà khả năng phát sinh rễ 61

của chồi mía 61


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
x


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cây mía (Saccharum ssp.) 4
Hình 2. Sơ ñồ thể hiện quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào thực vật 8

Hình 3. Vectơ nhị thể pCAMBIA1301 25

Hình 4. Kết quả tạo mô sẹo từ lá non của 4 giống mía nhập nội 37

Hình 5. Tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống mía 39

Hình 6. ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo của cây mía 43

Hình 7. Mô sẹo khởi tạo trên môi trường: (a) (b) 2 mg/l 2,4-D; 45

Hình 8. Mô sẹo ñược nhân trên môi trường 49

Hình 9. Chồi tái sinh từ mô sẹo 52

Hình 10. Chồi mía tái sinh trên các công thức: 55

Hình 11. Chồi mía ñược nhân nhanh trên công thức : 59

Hình 12. Cây con ra rễ trên môi trường: 62

Hình 14. Sơ ñồ hệ thống tái sinh ở giống mía ROC 23 64

Hình 15. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên mô sẹo mía sau khi lây nhiễm
với các chủng vi khuẩn A. Tumefaciens 66

Hình 16. Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các mật ñộ vi khuẩn khác nhau 67

Hình 17. ảnh hưởng của hàm lượng AS tới biểu hiện tạm thời của gen gus 69

Hình 18 . ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới biểu hiện tạm thời của gen gus 70


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
1


1. MỞ ðẦU
1.1 ðẶT VẤN ðỀ
Cây mía (Saccharum ssp.) là một trong những cây công nghiệp có giá
trị kinh tế cao, quan trọng ở các nước nhiệt ñới và á nhiệt ñới, ñược trồng ở
hơn 70 nước trên thế giới. 70% lượng ñường trên thế giới ñược sản xuất từ
cây mía [52]. Tầm quan trọng của mía ngày càng tăng bởi cây mía là nguồn
nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp ñường và các ngành công nghiệp sản
xuất rượu, acid acetic, butanol, giấy, gỗ dán, công nghệ enzyme và thức ăn
chăn nuôi. Những năm gần ñây, mía trở thành một trong những ñối tượng
ñặc biệt ñược quan tâm trong chương trình sản xuất nhiên liệu sinh học.
Ở Việt Nam, mía là nguồn nguyên liệu duy nhất cho ngành công
nghiệp chế biến ñường. Triển vọng phát triển ngành trồng mía ở nước ta là rất

lớn vì chúng ta có những ñiều kiện thuận lợi ñể nâng cao năng suất và sản
lượng mía, ñáp ứng nhu cầu ñường trong nước cũng như xuất khẩu [4]. Hiện
nay, ngành mía ñường nước ta ñã có những bước phát triển vượt bậc kể từ khi
thực hiện chương trình 1 triệu tấn ñường do nghị quyết ðại hội ðảng lần thứ
8 ñề ra. Tuy nhiên, bình quân trên cả nước năng suất mía trong suốt giai ñoạn
1996 - 2005 chỉ tăng 1,5%/năm.

Giai ñoạn 2005-2006 năng suất bình quân
ñạt 55,3 tấn mía/ha, bằng 67% năng suất bình quân của toàn thế giới và
thấp hơn nhiều các nước trong khu vực. Một số dự báo cho biết, với quy mô
sản xuất như hiện nay thì năm 2010 Việt Nam phải nhập khẩu khoảng
500000- 600000 tấn ñường [54]. Tất cả các kết quả trên là hệ quả tất yếu của
việc thiếu nguyên liệu mía. Thực tiễn sản xuất cho thấy, các vùng trồng mía
trong nước còn thiếu giống năng suất tốt, chất lượng cao, hầu hết các giống
mía ñang sản xuất là giống nhập nội. ðể khắc phục tình trạng ñó và ñạt chỉ
tiêu ñịnh hướng tới 2020 mức sản xuất ñường sẽ là 2,1 triệu tấn, ðảng và nhà
nước ta ñã và ñang triển khai nhiều biện pháp nhằm cải tạo giống mía.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
2


Trải qua hàng ngàn năm, bằng phương pháp chọn giống cổ truyền,
người ta ñã ñưa ra hàng vạn giống cây trồng mới có ñặc ñiểm quí giá, phẩm
chất tốt, song vẫn còn nhiều hạn chế như năng suất thấp, khả năng chống chịu
sâu bệnh, ñiều kiện ngoại cảnh kém. Từ những năm 70, với sự ra ñời và ứng
dụng mạnh mẽ của sinh học phân tử ñã ñem lại nhiều thành công trong công
cuộc cải tạo giống cây trồng như: nuôi cấy tế bào trần, biến dị dòng soma,
chuyển gen. Trong ñó, phương pháp chuyển gen là phương pháp hết sức mới
mẻ, hữu hiệu, là một kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng [5], ñặc
biệt với cây mía- cây có mức bội thể cao (2n=36-170), hay có những biến ñổi

về mặt di truyền mà các chương trình nhân giống thông thường khó có thể
thực hiện ñược [55] . Ở Việt Nam, việc phát triển mía chủ yếu ở các vùng có
ñiều kiện tự nhiên khó khăn không tưới (khô hạn), cây thường bị bệnh (nấm,
virus, ñen ngọn ) làm giảm giá trị. Vì vậy, nghiên cứu chuyển gen mang ñặc
tính có giá trị vào cây mía là một hướng ñi mới cần ñược quan tâm. Mía là cây
tái sinh tốt, ñây là tiền ñề quan trọng cho việc xây dựng hệ thống tái sinh cây
hoàn chỉnh làm cở sở cho các nghiên cứu chọn tạo giống mía chuyển gen. Tuy
nhiên, ở nước ta chưa có tác giả nào nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục
vụ cho tạo giống mía bằng phương pháp chuyển gen.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài:
“Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho tạo giống mía
(Saccharum ssp.) chuyển gen"
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
3


1.2 MỤC ðÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI
1.2.1 Mục ñích
Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây mía (Saccharum ssp.) phục
vụ cho tạo giống mía chuyển gen- làm cơ sở cho chọn tạo giống mía năng
suất cao, chất lượng tốt,chống chịu những ñiều kiện bất thuận.
1.2.2 Yêu cầu của ñề tài
- ðánh giá khả năng tạo mô sẹo từ lá non và tái sinh cây của 4 giống
mía nhập nội
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng tới khả năng
hình thành, duy trì và nhân mô sẹo tạo nguyên liệu cho chuyển gen ở cây mía.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng tới khả năng tái
sinh, nhân nhanh, ra rễ của chồi mía in vitro.
- Xác ñịnh loại giá thể thích hợp cho tỉ lệ sống cao của cây mía in vitro
ở giai ñoạn vườn ươm.

- Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị gus vào mô sẹo của cây mía thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
ðề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về vấn ñề hệ thống tái sinh và
chuyển gen cây mía
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen tạo cơ sở cho
việc chuyển các gen mang các ñặc tính có giá trị vào cây mía.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
4


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 MỘT SỐ NÉT VỀ CÂY MÍA (SACCHARUM SSP.)
2.1.1 Phân loại và ñặc ñiểm thực vật học
Theo phân loại thực vật, cây mía thuộc:
Giới: Thực vật (Plantae)
Phân giới: Thực vật có mạch (Tracheobionta)
Liên ngành: Thực vật có hạt (Spermatophyta)
Ngành: Hạt kín (Magnoliophyta)
Lớp: Một lá mầm (Liliopsida)
Phân lớp: Commelinidae
Bộ: Hoà thảo (Poales)
Họ: Hòa thảo (Poaceae)
Chi: Saccharum L.
Hình 1. Cây mía (Saccharum ssp.)

Trong chi Saccharum có 13 loài trong ñó có 5 loài ñặc biệt quan trọng
trong sản xuất và lai tạo giống:
- Loài Nhiệt ñới (Saccharum officinarum L.)
- Loài Trung Quốc (Saccharum sinensis Roxb Emend. Jesw)
- Loài Ấn ðộ (Saccharum barberi Jesw)
- Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.)
- Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround and Jesw)
Cây mía thuộc nhóm thực vật quang hợp C4. Do vậy, nó ñược coi là
một trong những cỗ máy chuyển hóa năng lượng mặt trời hiệu quả và có tiềm
năng sản sinh ra một lượng lớn sinh khối [19].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
5


Cây mía thuộc họ hoà thảo, hoa lưỡng tính, mỗi hoa có 3 nhị ñực, 1 bầu
noãn và 2 ñầu nhị cái. Hạt mía rất bé, kích thước khoảng 1-1,25 mm và nặng
khoảng 0,15-0,25 g.
Lá mía mọc thành 2 hàng so le, ñối nhau hoặc theo ñường vòng trên
thân cây mía.
Thân mía là ñối tượng thu hoạch, nguyên liệu ñể chế biến và là bộ
phận làm giống cho các vụ sau, gồm nhiều lóng và ñốt hợp thành.
Rễ mía thuộc loại rễ chùm. So với những cây hoà thảo ngắn ngày khác,
cây mía có bộ rễ phát triển ñặc biệt mạnh (1 khóm có 500-2000 rễ; Tổng
chiều dài rễ tới 100-500 m) [9]
2.1.2 Phân bố và yêu cầu sinh thái
2.1.2.1. Phân bố
Mía là cây có nguồn gốc nhiệt ñới và á nhiệt ñới nên có cần nóng ấm và
sợ giá rét.
Trên thế giới, cây mía phân bố từ vĩ ñộ 35
o

bắc ñến 35
o
nam, phần lớn
nằm từ vĩ ñộ 30
o
bắc ñến 30
o
nam, tương ñối ít ở vùng xích ñạo, tập trung
nhiều ở gần nam, bắc chí tuyến.
Về ñộ cao, cây mía phân bố từ vùng ñất thấp duyên hải ñến vùng ñồi,
cao nguyên và giới hạn ñộ cao 1000-2000 m ở vùng xích ñạo, giới hạn 700 m
ñộ cao ở vùng chí tuyến.
2.1.2.2. Yêu cầu sinh thái
- Nhiệt ñộ: Mía sinh trưởng ñạt ñến mức ñộ tối ña khi nhiệt ñộ
khoảng 30
o
-34
o
C. Nhìn chung, nhiệt ñộ thích hợp cho cả quá trình sinh
trưởng là từ 24
o
– 30
o
C.
- Ánh sáng: Mía là cây rất nhạy cảm với ánh sáng, cần cường ñộ ánh
sáng mạnh và rất sợ bóng râm. Trong suốt cuộc ñời mình, cây mía cần khoảng
2000 ñến 3000h chiếu sáng, tối thiểu phải có từ 1200h chiếu sáng trở lên.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
6

- Nước: Mía là cây cần nhiều nước nhưng lại sợ úng thuỷ. ðể ñạt
năng suất cao, mía cần một lượng mưa hữu hiệu tối thiểu là 1500mm cho cả
chu kỳ sinh trưởng. Lượng mưa hữu hiệu ñó tương ñương với lượng mưa thực
tế là 2000-2500mm.
- ðất: ðất thích hợp với cây mía là loại ñất có khả năng giữ nước, hút
nước tốt, ñất xốp, thoáng, có khoảng 40% chất rắn, 30% nước và 30% không
khí. ðất ñạt các yêu cầu trên là ñất cát pha, ñất thịt nhẹ, ñất thịt trung bình và
trong ñất còn chất hữu cơ, nhiều mùn. Thành phần cơ giới có 10-15% sét, 25-
35% limông, 40-50% cát. ðộ pH=5,5-7,5.
2.1.3 Giá trị cây mía
Hiện nay, mía là nguyên liệu chủ yếu ñể chế biến ra ñường (chiếm
70%) trên thế giới. Một cân ñường cung cấp năng lượng tương ñương 0,5kg
mỡ; 50-60kg rau quả. ðường cung cấp 10% nhu cầu năng lượng của cộng
ñồng [9]. Bên cạnh ñó, mía còn là cây xoá ñói giảm nghèo cho nông dân
trung du, miền núi, là cây có hiệu quả kinh tế cao nhờ vào ñặc tính thực vật
học, cho nên mía có khả năng chịu hạn khá, có thể trồng trên các vùng ñồi
núi. Nếu ñược chăm bón tốt, nó có thể cho 200-250 tấn sinh khối/ha/năm.
Theo thống kê năm 2006 ở Việt Nam, giá bán 1 tấn mía cây trung bình là
700.000ñ, cao hơn nhiều lần các cây trồng khác. Do ñó, mía ñã trở thành cây
làm giàu cho nhiều gia ñình, nhiều khu vực rộng lớn, nhất là vùng trung du
và nhiều ñồi thấp.
Theo dự báo của một số nhà khoa học về kinh tế, cuối thế kỷ XXI và
các thể kỷ sau, năng lượng hoá thạch sẽ ngày càng cạn kiệt. Và ñể khắc phục
tình trạng này, người ta ñã nghĩ ñến việc sử dụng năng lượng mới từ thực vật.
Trong các cây có thể khai thác, chế biến ra nhiên liệu lỏng, cây mía ñược
nhiều người quan tâm nhất và ñược xếp là cây năng lượng hàng ñầu trong số
các loài thực vật. Từ 1 tấn mía tốt, người ta có thể sản xuất ra 35-50 lit cồn
96
o

– loại cồn thay xăng ñể chạy máy ñốt trong. 1 ha mía có thể sản xuất
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
7


7000-8000 lit cồn làm nhiên liệu [9]. Gần ñây, ở Mỹ ñã cố gắng sản xuất cồn
nhiên liệu ñạt 5,67 tỷ lit/năm [6]
Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì giá trị cây mía ngày càng
ñược nâng cao. Ngoài các giá trị ñã ñược biết ñến ở trên, xenllulozo trong bã
mía ñược ngành giấy và công nghiệp gỗ ép, công nghiệp dệt khai thác. Công
nghiệp hoá chất thông qua các phản ứng khử, oxy hoá, ester hoá ñể sản xuất
sobitol, glixerin, nannitol, axit gluconic Từ bùn lọc có thể sản xuất sáp, chất
béo và phân bón
2.2 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH
2.2.1 Cơ sở khoa học
Việc xây dựng 1 hệ thống tái sinh ở thực vật nói chung và cây mía nói
riêng có thể thực hiện ñược nhờ vào tính toàn năng của tế bào thực vật.
Tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào ñã ñược
biệt hoá (trừ một số loại tế bào ñã biệt hoá sâu như ống mạch, mao dẫn ) có
khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong ñiều kiện phù
hợp sẽ phát triển phôi dẫn ñến việc hình thành cây hoàn chỉnh mới
Trong một cơ thể thực vật bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác
nhau, trong ñó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng khác
nhau. Các mô có cấu trúc chuyên môn nhất ñịnh là nhờ sự phân hoá. Phân hoá
tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên
hoá, ñảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Trong ñiều kiện thích
hợp, các tế bào ñã phân hoá có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân
chia mạnh mẽ. Qúa trình này gọi là quá trình phản phân hoá.

Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá

Sự phân hoá tế bào

Sự phản phân hoá tế bào

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
8



Hình 2. Sơ ñồ thể hiện quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào
thực vật [11].
Sự phân hoá cơ quan cũng như tái sinh cơ thể nguyên vẹn là kết quả của
quá trình tái phân hoá các tế bào và mô nuôi cấy. Về mặt bản chất, các quá trình
trên là sự hoạt hoá của các gen trong tế bào. Trong ñiều kiện tự nhiên, ở những
giai ñoạn phát triển cá thể nhất ñịnh một số gen sẽ ñược hoạt hoá, một số gen
khác sẽ bị ức chế theo ñúng chương trình ñã ñược mã hoá trong phân tử ADN.
Trong nuôi cấy thực vật in vitro, con người có thể ñiều khiển ñược sự
phân hoá và phản phân hoá ñể tái sinh một cây hoàn chỉnh từ mô, tế bào nhờ
việc tạo ra những môi trường thích hợp cho mỗi loại ñối tượng thực vật.
2.2.2 Vai trò của hệ thống tái sinh và một số hệ thống nuôi cấy sử dụng
cho biến nạp gen
Trong quá trình chuyển gen thực vật, việc xây dựng ñược dạng tế bào
ñích có khả năng tiếp nhận gen mới và tái sinh thành cây hoàn chỉnh là hết
sức quan trọng
.

Vì vậy, hệ thống tái sinh là ñiều kiện tiên quyết ñể thực hiện
thành công biến nạp gen.
Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây hoàn chỉnh là tiền ñề
quan trọng cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng nói chung và cây
mía nói riêng.
Một số hệ thống nuôi cấy thường ñược sử dụng:
2.2.2.1 Nuôi cấy phân hoá
ðây là phương pháp dựa trên cơ sở nuôi cấy mô, từ các cơ quan xác
ñịnh có sự phân hoá hình thành nên các cơ quan mới. Bao gồm 1 số phương
pháp như: Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng và chồi bên; Nuôi cấy tạo chồi bất ñịnh
;Nuôi cấy tạo phôi vô tính.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
9


• Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng và chồi bên:
Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng là một phương pháp cấy mô ñược ứng dụng
rộng rãi nhất trong nông nghiệp và nghề làm vườn với các ưu ñiểm:
- Nhân nhanh hàng loạt, ñồng nhất với số lượng lớn cây giống từ một
cây mẹ ban ñầu
- Loại trừ bệnh virus
- Bảo quản quỹ gen in vitro
- Sử dụng trong chuyển gen
Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng là các mô phân
sinh của ñỉnh sinh trưởng nằm ở chóp ñỉnh chồi. Kích thước mẫu nuôi cấy
phụ thuộc vào loài thực vật và mục ñích nghiên cứu.
• Nuôi cấy tạo chồi bất ñịnh
Sự tái sinh chồi bất ñịnh chính là sự phát sinh, phân hoá các cơ quan
nhằm tạo mới các chồi bất ñịnh trên mẫu từ nhiều nguồn khác nhau thông qua
giai ñoạn callus. ðây là dạng nhân giống in vitro có thể sử dụng ñể tái sinh

dòng hoặc nhân nhanh với lượng lớn.
• Nuôi cấy tạo phôi vô tính
Phôi vô tính là các thể nhân giống có cực tính, bắt nguồn từ các tế bào
dinh dưỡng (tế bào soma). Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô tế
bào thực vật, ngoài các ñiều kiện vật lý, hoá học thuận lợi cho sự tạo phôi,
còn phụ thuộc rất lớn vào loài, giống, chủng trong cùng một loài. Việc tạo ra
phôi vô tính ở thực vật ñem lại tiềm năng ứng dụng với mục ñích nhân dòng
số lượng lớn, nuôi cấy tế bào trần, tạo các biến dị soma có lợi
2.2.2.2 Nuôi cấy không phân hoá
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
10


Từ các mô, cơ quan nuôi cấy sẽ tạo nên các khối tế bào vô tổ chức,
không có hình dạng nhất ñịnh gọi là mô sẹo (callus) và ở những môi trường
thích hợp, mô sẹo ñược nuôi cấy ñể nhân khối.
• Nuôi cấy mô sẹo (callus)
Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức ñộ cấu trúc di truyền thấp,
chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến ñộng di truyền
cao. Mô sẹo thu ñược bằng nuôi cấy in vitro các cơ quan của thực vật như
thân, rễ, lá, hoa trong môi trường chứa chất ñiều tiết sinh trưởng nhóm
auxin với ñiều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể ñược duy trì liên tục
trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển ñịnh kì.
• Nuôi cấy tế bào huyền phù
Nuôi cấy tế bào huyền phù là kỹ thuật nuôi cấy tế bào ñơn hoặc cụm
nhỏ tế bào trong môi trường lỏng. Các tế bào này cũng ñược tạo từ mô sẹo
có nguồn gốc từ thân, rễ, lá, hoa, phôi Tuy nhiên, nhược ñiểm của
phương pháp này là thời gian nuôi cấy dài và ảnh hưởng trực tiếp tới khả
năng tái sinh cây.
• Nuôi cấy tế bào trần

Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối
nguyên sinh chất ñược bao bọc bởi màng nguyên sinh khi ñược nuôi cấy trên
môi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối mô sẹo và
tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ứng dụng có ý nghĩa nhất của phương pháp
này là tạo cây soma, tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và
biến nạp gen.
Tuy nhiên, nhằm mục ñích xây dựng một hệ thống nuôi cấy tái sinh cây
phục vụ chuyển gen, cần nghiên cứu ñến khả năng sống sót của tế bào sau khi
chuyển gen trên môi trường chọn lọc. Do vậy, hệ thống nuôi cấy qua mô sẹo
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
11


thích hợp hơn cả với ưu ñiểm : Tỉ lệ tái sinh cây cao; Thời gian nuôi cấy
không quá dài
Tái sinh cây qua con ñường mô sẹo có thể hình thành phôi hay tái sinh
tạo chồi trực tiếp. Tuy nhiên, cây tái sinh từ phôi soma xuất phát từ một tế bào
ñơn, riêng lẻ và phát triển thành một cây hoàn chỉnh nên duy trì ñược tính ñồng
nhất của hệ gen và do vậy hạn chế hiện tượng khảm ở cây chuyển gen [1].

2.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT
2.3.1 Khái niệm về chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết
kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các
gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện
các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen
2.3.2 Các phương pháp chuyển gen
Chuyển gen hữu ích vào cây trồng là một trong những bước tiến nhảy

vọt của công nghệ sinh học hiện nay. Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc rất lớn
vào bản chất cây trồng, ñặc tính di truyền cũng như phương pháp biến nạp.
Mục ñích chính của kỹ thuật chuyển gen là phải ñạt hiệu quả cao, áp dụng
ñược với nhiều ñối tượng cây trồng, từ ñó các nhà nghiên cứu công nghệ gen
ñã xây dựng nhiều giải pháp kỹ thuật chuyển gen khác nhau.
Chuyển gen vào thực vật có thể chia làm 2 nhóm phương pháp chính:
phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp.
2.3.2.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp
• Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
12


ADN ñược chuyển vào tế bào thực vật nhờ cơ chế truyền ñặc trưng của
loài vi khuẩn Agrobacterium làm môi giới. Phương pháp chuyển gen thông
qua Agrobacterium thường ñược áp dụng thành công ở các loại cây 2 lá mầm.
Nhờ áp dụng các kỹ thuật di truyền mà Ti-plasmid của vi khuẩn
Agrobacterium ñã trở thành một vectơ chuyển gen hữu hiệu. Người ta ñã có
thể cắt bỏ những ñoạn gen cần thiết, lắp ráp, bổ sung các cấu trúc và các gen
quan tâm vào các vị trí nằm giữa hai ñoạn biên của T-DNA.
Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium là phương pháp chuyển
gen ñược sử dụng rộng rãi nhất, có nhiều ưu ñiểm hơn hẳn các phương pháp
chyển gen khác như:
- Số bản sao ñược chuyển vào tế bào thực vật rất thấp dẫn tới giảm sự
không biểu hiện của các gen ñã chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững,
hiệu quả chuyển gen cao [37].
- Tránh ñược sự hình thành các cây chuyển gen khảm (hiện tượng
thường gặp ở các phương pháp chuyển gen trực tiếp) [30].
Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn này ñã ñược áp dụng thành
công trên nhiều ñối tượng cây trồng, ñặc biệt trên cây hai lá mầm. Người ta

cũng ñã tìm ra các chủng Agrobacterium mẫn cảm với cây 1 lá mầm, trong ñó
có ngô, lúa và ñã nhận ñược các cây chuyển gen hữu thụ bằng phương pháp
này [35][36][42].
• Chuyển gen nhờ virus
Ngoài vi khuẩn, người ta còn dùng virus làm vectơ chuyển gen cho cây
trồng do virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Bên cạnh ñó,
trong cấu tạo của virus cũng có mặt axit nucleic làm cơ sở cho việc gắn các
gen cần chuyển vào.
Tuy nhiên, việc chuyển gen nhờ virus ít ñược sử dụng do vius không
truyền qua hạt nên việc nhân giống các cây chuyển gen nhờ virus phải tiến
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
13


hành bằng phương pháp vô tính- phương pháp không thể thực hiện ñược cho
tất cả các loại cây. ðây chính là nhược ñiểm lớn nhất của phương pháp
chuyển gen này.
2.3.2.2 Phương pháp chuyển gen trực tiếp
• Phương pháp xung ñiện
Phương pháp này dựa vào hiện tượng phóng ñiện ñể tạo lỗ trên màng tế
bào, ñưa ADN vào tế bào dễ hơn, nhất là khi ADN ñã tiếp giáp với màng tế
bào trong nuôi cấy tế bào trần hoặc mô sẹo. Tuy nhiên phương pháp này chưa
có những kết quả chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa, việc nuôi
cấy tế bào trần ở một số loài cây trồng vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Phương
pháp này chủ yếu dùng trong nghiên cứu biểu hiện tạm thời của các gen.
• Phương pháp vi tiêm
Phương pháp sử dụng loại kim siêu nhỏ và kính hiển vi ñể tiêm ADN
vào những tế bào nhất ñịnh. Kỹ thuật này tạo ñược dòng biến nạp từ tế bào
trần và cây biến nạp khảm từ nuôi cấy hạt phấn của cây cải dầu. Tuy nhiên,
mỗi lần tiêm chỉ ñược một tế bào và thao tác ñòi hỏi rất khéo léo, chính xác.

• Phương pháp vĩ tiêm
Phương pháp này sử dụng kim tiêm có ñường kính lớn hơn ñường kính
tế bào ñể ñưa ADN ngoại lai vào tế bào, các tế bào bị phá vỡ và ADN xâm
nhập vào tế bào bị thương và sau ñó ñược chuyển vào tế bào bên cạnh.
• Phương pháp chuyển gen thông qua ống phấn
ðây là phương pháp chuyển gen dựa trên nguyên tắc là ADN có thể
xâm nhập vào hạt phấn ở giai ñoạn nảy mầm, nhờ ñó ADN có ñiều kiện di
chuyển vào nhân của tế bào hạt phấn hoặc hợp tử qua ống phấn. Kỹ thuật
chuyển gen này ñơn giản nhưng hiệu quả chuyển gen thấp
• Phương pháp sử dụng súng bắn gen
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
14


Chuyển gen bằng súng bắn gen là một trong những kỹ thuật ñua các
gen ngoại lai và tế bào. Kỹ thuật biến nạp này dựa trên nguyên tắc sử dụng
các viên ñạn kim loại (thương dùng hạt vàng hoặc volfram) có kích thước
hiển vi, tỷ trọng cao ñể ñạt gia tốc lớn xuyên qua vỏ và màng tế bào, ñưa lớp
ADN bọc ngoài tiếp cận với bộ mày di truyền của tế bào.
Phương pháp này thường áp dụng với những giống cây trồng mà việc
chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium khó thực hiện ñược hoặc khả
năng tái sinh kém do nó có những ưu ñiểm nổi bật như: Dễ sử dụng; Các
vectơ ñược thiết kế ñơn giản; Cần lượng nhỏ plasmid ADN; Biểu hiện gen
tạm thời có thể quan sát sau vài ngày; Chuyển ADN ngoại lai vào tế bào
nhanh. Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen này ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền, hiệu
quả chuyển gen chưa cao, biểu hiện gen không bền vững.
2.3.3 Vai trò của gen chỉ thị trong kỹ thuật chuyển gen
Gen chỉ thị là gen có trách nhiệm thông báo kết quả của quá trình
chuyển AND ngoại lai vào hệ gen của thực vật.
Thực tế cho thấy, chỉ một Tỉ lệ ít tế bào thực vật ñược biến nạp thành

công nhờ các phương pháp chuyển gen. Do ñó, rất cần có phương pháp nhận
biết những tế bào ñã ñược biến nạp gen ñể tạo cây con mang gen mong muốn
từ các tế bào chưa biến ñổi di truyền [8]. Sử dụng gen chỉ thị ñể nhận biết
những tế bào ñã ñược biến nạp là một trong những phương pháp phổ biến
hiện nay. Các gen như: Chloramphenicol-acetyl transferaza (CAT),β-
glucuronidaza (GUS) ñược dùng làm gen chỉ thị những tế bào ñã biến ñổi
chứa gen ngoại lai ổn ñịnh. Ngoài ra còn có gen LUX của ñom ñóm, gen
vibrio harveyi mã hoá enzym uciferase phát tia sáng, dễ phát hiện nên ñược
sử dụng làm gen chỉ thị.
Ở nước ta, ñã có những thành công nhất ñịnh trong nghiên cứu chuyển
gen vào thực vật. Ví dụ như việc chuyển gen kháng hgromycin, gen GUS và gen