Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của các hợp chất thứ cấp từ cây bìm Eberhardt (Ipomoea Eberhardtii)

Trang 1
MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học - thực phẩm trong việc tách chiết và khảo sát thành
phần hóa học và đặc tính sinh học của các loại cây có nhiếu ứng dụng trong thiên
nhiên hiện nay đang được quan tâm rất nhiều trên thế giới cũng như tại Việt
Nam. Nhằm tìm kiếm các đặc tính sinh học để ứng dụng vào các lĩnh vực trong
thực tiễn.
Cây Bìm bìm Eberhardt (Ipomoea Eberhardtii) là một loại cây có khả
năng phát triển rất mạnh mẽ, là loài cây leo nguy hiểm này có nguồn gốc ở vùng
khí hậu nhiệt đới. Loài cây này phát triển rất nhanh, xanh tốt quanh năm và có
hiệu suất quang hợp cao. Đây là loài thực vật xâm lấn nguy hiểm cần phải loại
trừ. Tuy nhiên loại cây này cũng có thể tiết ra các chất có khả năng kháng một số
loại vi khuẩn, chống lại sự phát triển của cỏ dại và các chất kháng oxy hóa có
nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa. Tuy nhiên, trên
thực tế có rất ít nghiên cứu về cây này để có thể làm rõ vấn đề trên. Hiện nay trên
thế giới chưa có một nghiên cứu nào sâu xa về loài cây này. Các nhà khoa học
Việt Nam cũng chỉ mới bước đầu tìm hiểu, nghiên cứu về nó.
Xuất phát từ yêu cầu trên, nên tôi chọn đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ
thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của
các hợp chất thứ cấp từ cây bìm Eberhardt (Ipomoea Eberhardtii)” để có thể
góp một phần nào đó giải quyết các vấn đề ở trên.
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 2
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Mục đích cơ sở nghiên cứu đề tài
Cây bìm bôi có hai loại là Lang bìm bìm Hoa trắng (Ipomoea
eberhardtii) và Merremia boisiana var. Boisiana. Loài mọc và gây hại mạnh ở
Việt Nam, sát thủ kiều mộc được xác định là Ipomoea eberhardtii. Loài cây này
phát triển rất nhanh, xanh tốt quanh năm và có hiệu suất quang hợp cao. Đây là
loài thực vật xâm lấn nguy hiểm cần phải loại trừ. Khác với cây bìm bìm mà
Đông y dùng làm thuốc chữa phù thũng, dây bìm bìm ở bán đảo Sơn Trà có hoa

màu trắng, lá to, dày, thân có độc… Không những "cát cứ" ở bán đảo Sơn Trà,
dây bìm bìm còn chọn đèo Hải Vân, các khu rừng ở xã Hòa Phú, Hòa Bắc
(H.Hòa Vang, TP Đà Nẵng) làm nơi "đóng quân”. Hàng nghìn ha rừng ở Đà
Nẵng đang bị loài này tàn phá [13].
Tuy nhiên để có nhiều hiệu quả trong việc sử dụng loài cây này cần phải
khảo sát tốt đặc tính sinh học của cây bìm bôi để có hiệu quả tốt trong việc xử lý
cũng như ứng dụng của chúng. Do vậy cần phải nghiên cứu đặc tính sinh hoc của
cây lang bìm bìm Ipomoea eberhardtii nhằm một số mục dích như sau:
- Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết các phần của cây bìm
bìm (lá, thân).
- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm từ dịch chiết lá và thân.
1.2. Giới thiệu về cây Bìm Bìm
Tên Khoa học: Merremia eberhardtii (Gagnep.) N. T. Nhan, 1990
Tên tiếng Anh: Ipomoea eber-hardtii
Tên tiếng Việt: Bìm bìm eberhardt, Sát thủ dây leo, Sát thủ kiều mộc
Tên khác: Ipomoea eber-hardtii Gagnep. 1914 (FGI, 4: 268; CCVN, 2:
997).
Tên thường gọi: cây Lang rừng hoặc cây Lá bạc [13] [18].
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 3
Hình 1.1. Lang bìm bìm Hoa trắng Hình 1.2. Lang bìm bìm Hoa vàng[15]
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Là loài cây dây leo dài 15-20m, hoa bắt nguồn từ các chồi nách phát triển
thành các chùm nối với phần thân, thân gần giống thân gỗ, hoa màu trắng có lông
tơ. Lá xanh pha màu bạc ánh kim, giống lá khoai lang nên có người gọi là cây
Lang rừng hoặc cây Lá bạc, là loài dây leo gỗ rất to với đường kính thân có thể
đến 8cm, leo cao khoảng 10m và có hoa hình phễu hay hình chuông màu vàng
[16][19].
Lá:
Lá hình chuông hoặc hình trứng rộng rãi, 10-15 cm, gần giống hình trái tim,

hướng về đỉnh thành một mũi nhọn, phía trên co một lớp lông màu bạc ánh kim
mềm, dưới có các đường vân lá nhỏ, đáy thùy, chặt chẽ, xoang cấp tính, hệ gân lá
cơ bản có 7 đường, hệ gân ngang to, xếp song song, cuống dài 5cm, lá mỏng và
xếp dày dọc theo chiều dài của thân.
Chùm hoa:
Cụm hoa ở nách, phát triển theo chùm, đài hoa và cuống mạnh mẽ, dài 12-
15cm, màu vàng nhạt có lông tơ.
Hoa:
Hoa hình chuông rộng, có thể dài đến 18mm, rộng 12-15mm, có lông tơ bên
ngoài, màu vàng nâu, đỉnh có đầu nhọn, bên trong hơi nhỏ hơn, tràng hoa hình
chuông, màu trắng, dài 6cm, rộng 4-5cm, ngoài có lông rất mịn, thùy chi nằm kín
bên trong, các nhị có lông mao ở tràng hoa, sợi dài 7mm, trên có nhiều nhánh và
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 4
bên dưới có nhiều điểm gắn, có thể co giãn và dài hơn 5mm, bao phấn hình elip,
nhụy hoa có bề mặt nhẵn không có lông, bầu nhụy tù, 2 tế bào, bầu nhụy không
suy giảm, bầu nhụy dạng chỉ, các đầu núm nhụy dài 2cm [18][19].
Loài cây này phát triển rất nhanh, xanh tốt quanh năm và có hiệu suất quang
hợp cao. "Dây lang rừng" phát triển nhanh là vì chúng có thể phát tán bằng hạt,
chồi, thân hoặc rễ. Dây bò đến đâu, rễ bén đến đó và phát triển thành gốc mới.
Thân dây có đường kính 15-20 cm thậm chí to hơn tuỳ theo vùng đất chúng bám
trụ. Loại lang này là thức ăn ưa thích của heo, bò và thỏ nhưng chúng bò trên
những tán cây cao hàng chục mét nên rất khó khăn trong việc hái lượm để sử
dụng [13].
1.2.2. Nguồn gốc và phân bố
Loài cây leo nguy hiểm này có nguồn gốc ở vùng khí hậu nhiệt đới đảo Hải
Nam và khu Tự trị dân tộc Choang (Quảng Tây), Vân Nam (Trung Quốc), ở độ
cao từ 100 đến 1500m so với mặt nước biển [17] [19].
Hình 1.3. Tình hình phân bố tại Việt Nam
Bìm bôi phát tán rất nhanh bằng hạt, chồi, rễ và thân. Chim, thú gặm nhấm

ăn rồi thải hạt đi khắp nơi giúp cây phát tán rộng hơn. Chúng leo đè lên các cánh
rừng Thông, Keo lá tràm hay bất cứ cây thân gỗ nào để "chiếm đoạt" ánh sáng.
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 5
Do tán lá rộng và dày đặc nên đã che kín không gian, khiến thảm thực vật bên
dưới bị chết sau một thời gian thiếu ánh sáng. Lớp thực vật chết tạo nên lớp lá
khô rất dễ gây cháy rừng. Một số vụ cháy rừng thông ở vùng rừng cấm Hải Vân
trong những năm qua đều có liên quan đến loài Bìm bôi.
Cây Bìm bôi xâm nhập vào nước ta khoảng mấy chục năm trước đây, mọc ở
dưới chân đèo Hải Vân. Đến nay các nhà khoa học đã phát hiện ở Việt Nam chi
Bìm bìm có tới 17 loài và 3 thứ.
Loài Bìm bôi đã thấy xuất hiện ở Sa Pa (Lào Cai), Lạng Sơn, Quảng Ninh,
Vườn quốc gia Bạch Mã, Nam Đông (Thừa Thiên- Huế), các đai cao của khu bảo
tồn thiên nhiên Sơn Trà và Bà Nà (Đà Nẵng) Theo Chi cục Kiểm lâm Đà Nẵng,
hiện có khoảng 15.000ha/55.000ha rừng ở đây đã bị loại dây leo này che phủ,
trong đó rừng Sơn Trà 5.000 ha và rừng Hải Vân 10.000ha. Đó là chưa kể các
khu rừng ở Hoà Phú, Hoà Ninh, Hoà Bắc (huyện Hoà Vang) cũng đã phát hiện
sự có mặt của cây này [17].
1.2.3. Hiện trạng phát triển và ảnh hưởng của cây Bìm Bôi
Khi những vạt hoa trắng nở rộ trên những mảng lá xanh pha màu bạc ánh
kim, trải dài trên những tán thông Caribê ở phía nam đèo Hải Vân, cũng chính là
lúc ngành kiểm lâm Đà Nẵng hốt hoảng vì sự xâm thực táo bạo của loài dây leo
lạ này.
Theo Ông Trần Huy Độ, Trưởng ban Quản lý rừng đặc dụng Nam Hải Vân
cho biết, từ năm 1999 dây lạ (người dân thường gọi là "dây lang rừng" hay lá
bợt) bắt đầu phát triển mạnh. Từ các khe, suối, bìa rừng, loài cây này xông lên,
leo đè luôn cánh rừng thông, rừng keo lá tràm và lan toả với tốc độ nhanh.
Những tán lá rộng và dày đặc đã che kín không gian của các loại cây khác làm
rừng và cả thảm thực vật bên dưới chết dần vì thiếu ánh sáng. Thân dây có đường
kính 15-20 cm thậm chí to hơn tuỳ theo vùng đất chúng bám trụ [14] [17].

Trước tình hình như vậy, Ban quản lý rừng đặc dụng Nam Hải Vân đã làm
tờ trình gửi Chi cục Kiểm lâm, Sở Thuỷ sản nông lâm thành phố. Các cơ quan
chức năng đã vào cuộc, cán bộ kỹ thuật của Sở cũng đã lấy mẫu nghiên cứu,
nhưng vẫn chưa chính thức khẳng định loại cây gì, xuất xứ ở đâu và du nhập vào
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 6
Việt Nam từ khi nào. Chính vì thế mà không tìm được một loại hoá chất hoặc vi
sinh gì để tiệt trừ sự xâm thực của loại cây này.
Trong 2 năm 2000-2001, UBND thành phố đã trích kinh phí để tận diệt dây
lạ bằng biện pháp thủ công: rứt dây, đào gốc, băm vụn thân, lá và phơi khô để
đốt. Tuy nhiên với khoản tiền 300.000 đồng cho 1 ha là quá lớn khi diện tích xâm
thực đã lên đến hơn 1.000 ha trên tổng số hơn 5.000 ha rừng trồng. Sau khi diệt
được 40 ha, hết kinh phí, ngành kiểm lâm và các hộ nông dân trồng rừng đành
khoanh tay nhìn sự tái lấn chiếm của "dây lang rừng" và sự chết dần của những
cánh rừng trồng [17].
Hình 1.4. Bìm hoa trắng (Merremia eberhardtii) xâm hại tại Bán đảo Sơn Trà
Theo Kỹ sư Hồ Ngọc Lượng, Phó ban Quản lý rừng đặc dụng Nam Hải
Vân, một trong những "chuyên gia" đối đầu với giống dây leo lạ từ nhiều năm
nay cho biết: "Không những rừng Nam Hải Vân mà hiện nay "lang rừng" đã phát
tán sang khu bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà và bắt đầu "tấn công" rừng Bà Nà (các
vùng rừng liền kề). Vấn nạn này đã thành nguy cơ cần báo động khẩn thiết [14].
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 7
Hình 1.5. Cây bìm bìm phát triển mạnh vùng đèo Hải Vân
Theo nhận định chung của giới chuyên môn thì ngoài việc "cướp" ánh sáng,
loài thực vật này còn tiềm ẩn nguy cơ cháy rừng do khả năng tích luỹ khối lượng
vật liệu cháy lớn (lá khô, cành khô, bản lá to và nhiều). Thậm chí khả năng bắt
lửa rất nhanh kể cả lá, nhánh còn xanh. Ông Nguyễn Mạnh Tiến, Trưởng phòng
Quản lý Bảo vệ rừng Chi cục Kiểm lâm Đà Nẵng, cho biết: "Từ đầu năm tới nay,
đã có 9 vụ cháy rừng, trong đó phần lớn các vụ cháy xảy ra nơi có bìm bìm. Mới

đây, ngày 11/7, vụ cháy 0,5 ha rừng tại khu bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà có
nguyên nhân từ dây bìm bìm"
Theo Danh sách 100 loài xâm lấn nguy hiểm nhất toàn cầu, loài này hiện
chưa được đưa vào nhưng với vấn nạn hiện nay ở Việt Nam nói riêng và một số
nước nhiệt đới trong khu vực, có thể trong tương lai gần, nếu không có biện pháp
hạn chế sự phát tán, lây lan của nó thì rõ ràng đó là một vấn nạn lớn, đặc biệt là
với những khu rừng thứ sinh, đang trong giai đoạn phục hồi và gần khu vực có
đường giao thông. Hạt của loài này tồn tại lâu trong cát sỏi, vật liệu xây dựng và
do đó, việc mở đường giao thông ở khu vực hiện nay là nguy cơ lớn nhất làm lây
lan mối nguy hiểm tới các khu vực khác [17].
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 8
1.2.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
Merremia boisiana (Gagnep.) Oostr là một loài nước ngoài mới được phát
hiện tại Quảng Châu đe dọa môi trường sống của thảm thực vật rừng. Kết quả
cho thấy rằng Merremia boisiana phân phối duy nhất trong núi Taihezhang tại
Quảng Châu, nhưng tác hại của nó nghiêm trọng hơn so với Mikania micrantha.
40 000 cây trong 20 ha rừng bị chết vì hiệu ứng tác hại của biến thể của
Merremia boisiana. Sau 1 tháng mỗi nồng độ chất chiết xuất từ dung dịch
nước của Merremia boisiana có thể hạn chế nảy mầm của hạt giống Brassica
parachunensis, sự tập trung lớn nhất, kiềm chế được. Chúng ức chế mạnh hơn so
với các loài ngoại lai xâm nhập vào hạt giống nảy mầm tập trung. [15]
Merremia boisiana (Gagn.) v.Ooststr, một cây leo thân gỗ xâm nhập vùng
đất thấp rừng môi trường sống, là một thành viên của họ Convolvulaceae thường
được gọi là Jinzhongteng. Dựa vào các phân tích về đặc điểm sinh thái và sinh
học của M.boisiana, bài viết này đã đề xuất rằng loài này là một mối nguy
hiểm sinh thái thực vật xâm lấn điển hình, và các biện pháp phòng ngừa toàn
diện nên được đặt có hiệu lực ngay lập tức. [15].
Nghiên cứu gần đây chứng minh rằng Merremia boisiana loại cây leo có
một rộng khả năng thích ứng sinh thái tốt, một trong những cơ chế cuộc xâm

lược của các loài xâm lấn. Ở Trung Quốc, M. boisiana đã phân phối ở Vân Nam,
Quảng Tây và Quảng Đông, nhưng phân phối của mình ở tỉnh Phúc Kiến đã
không được xác nhận. Thành phố Quảng Châu và vùng phụ cận trở thành một
khu vực phân phối mới của M. boisiana do của nó phía Bắc xâm nhập từ Hải
Nam dưới sự nóng lên toàn cầu. Chúng lây lan là một thảm họa có nguồn gốc từ
các hệ sinh thái nội tại được bị phá hủy bởi các nhiễu loạn, gây bitat ha trở nên
tồi tệ hơn, bị hỏng. Giảm đa dạng sinh học cộng đồng và nhóm đa dạng chức
năng tăng cường khả năng xâm lấn của các cộng đồng kỳ lạ và cung cấp cơ hội
cho các loài xâm lấn. Bảo vệ hệ sinh thái tự nhiên từ sự xáo trộn, và xây dựng lại
một thứ tối ưu hóa hệ sinh thái bị phá hủy sẽ là chiến lược cần thiết [15].
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 9
Loài cây xâm lấn này được phát hiện tại Việt Nam vào năm 1999 và đến
nay chưa có nghiên cứu nào về đặc tính sinh học cũng như tác hại của cây bìm
bôi M. boisiana.
Ngày 14/4/2012, được sự cho phép của UBND thành phố Đà Đẵng, Giáo sư
Steve Adkins thuộc trường Đại học Queenland - Canada cùng các chuyên gia của
Viện Sinh học nhiệt đới và Trường Đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí
Minh đã tiến hành khảo sát, thu mẫu các dây lang bìm bìm đang xâm hại trên địa
bàn thành phố Đà Nẵng [14].
Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã đưa đoàn đi kiểm tra và khảo sát
thực địa tại Bán đảo Sơn Trà, rừng đặc dụng Nam Hải Vân và khu Bảo tồn thiên
nhiên Bà Nà Núi Chúa. Ước tính hiện nay Đà Nẵng có gần 2000 ha rừng bị dây
lang bìm bìm xâm hại chủ yếu là rừng đặc dụng, trong đó có 02 loài chính đó là
Bìm bìm hoa vàng và bìm bìm hoa trắng. Đoàn chuyên gia đã thu thập mẫu, khảo
sát điều kiện lập địa và có báo cáo sơ bộ ban đầu với UBND thành phố, sẽ gửi
báo cáo kỹ thuật cùng với các ý kiến đề xuất để làm cơ sở cho các công tác
nghiên cứu trong thời gian đến [14].
1.3. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên.
1.3.1. Alcaloid

Là những hợp chất thiên nhiên với nhiều dạng cấu trúc khác nhau và có
hoạt tính sinh học rõ rệt. Đa số alcaloid hiện diện trong loài cây hạt kín, cây có
hoa nhưng cũng tìm thấy trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật và
thực vật hạ đẳng. Đa số alcaloid không màu, ở dạng kết tính rắn, có nhiệt độ
nóng chảy hoặc nhiệt độ phân hủy xác định. Vài alcaloid ở dạng keo, vô định
hình và alcaloid ở dạng lỏng (nicotin, coniin) hoặc có màu (berberin màu vàng;
betanidin màu đỏ) [7].
Các alcaloid ở dạng bazơ tự do thường hoà tan được trong dung môi hữu
cơ, tuy nhiên các alcaloid ở dạng bazo tứ cấp thì chỉ hòa tan trong nước. Muối
của đa số alkaloid thì hòa tan trong nước. Độ hòa tan của alkaloid và các muối
của chúng giữ vai trò quan trọng trong kỷ nghệ dược phẩm; trong việc trích ly
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 10
chúng ra khỏi cây cỏ và trong việc bào chế alcaloid thành các dạng thuốc phù
hợp.
Đa số alcaloid có tính kiềm, điều này khiến cho alcaloid cực kỳ nhạy cảm,
dễ bị thủy phân khi gặp ánh sáng hoăc nhiệt độ.
Nhiều alcaloid đã được sử dụng để làm thuốc trị bệnh. Alcalid có tác dụng
kích thích thần kinh như: strychnine, cafein, lobelin…có khả năng diệt ký sinh
trùng và các nguyên sinh động vật như: emetin, quinin, conessin, berberin. Các
alcaloid có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương nên được dùng làm thuốc
giảm đau trong khi giải phẩu hoặc khi bị bệnh ung thư giai đoạn cuối: morphin
và các dẫn xuất của morphin như: heroin, codein (tuy nhiên các hợp chất này có
thể gây ra tình trạng uể oải, buồn ngủ, khó thở và nghiện thuốc). Có alcaloid
được bào chế làm thuốc để giảm hệ thần kinh giao cảm: reserpin, propanolol [7].
1.3.2. Flavonoid
Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất
nhiều rau, quả, hoa…Phần lớn có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy,
một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì
về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn [7].

Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glicosid. Các đường thường
gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhamnose; L-Arabinose…
Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp;
flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Các glicisid flavonol như:
rutin, querciitrin, daempherol. Kaempherol rất thường xuyên hiện diện.
Antocyanidine dạng glicosid thí dụ như: pelargonidin; cyanidin; delphinidin…tạo
màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái.
Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu. Flavone có màu vàng
nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng
đến cam-đỏ. Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine;
catechin kết tinh không màu. Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dương tạo màu
cho nhiều loại hoa và trái. Quercetin ở môi trường kiềm thì có tác dụng kháng
khuẩn kém nhưng ở môi trường acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 11
vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng Salmonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực
vật [7].
Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid như rotenon (trích từ dây thuốc cá
Derris elliptica Benth, họ Đậu) có tính độc đối với cá và côn trùng nhưng không
độc với các động vật hữu nhũ. Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng
như hợp chất pyrethrin (trích từ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium,
họ Cúc).
1.3.3. Tinh dầu
Nói chung, tinh dầu trích ly từ thực vật có cấu trúc terpenoid. Từ 2000 năm
trước người ta đã biết sử dụng turpentine để trị ho. Mentol là alcol terpen trích từ
tinh dầu bạc hà có khả năng gây tê cục bộ, nên góp phần vào đặc tính trị ho của
nó. Các gia vị như: hồ tiêu, gừng, nhục đậu khấu, đinh hương…bên cạnh mùi vị
làm chúng có giá trị trong ngành ăn uống, chúng còn có tác dụng kháng khuẩn.
Nhiều tinh dầu có khả năng kháng khuẩn mạnh như: tinh dầu rau ngỗ Enhydra
fluctuans; tinh dầu hồi Illicium verum; tinh dầu quế Cinhamomum; tinh dầu long

não Cinnamonium campho; tinh dầu gừng Zingiber officinalist; tinh dầu nghệ
Curcuma longa…[7].
1.3.4. Saponin
Là một loại glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất
đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của
dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết. Saponin
thường ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng
chảy thường cao từ 200
0
C trở lên và có thể trên 300
0
C. Saponin có thể bị tủa bởi
acetat chì, hydroxid barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để
cô lập saponin. Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất
hormone steroid có hoạt tính cao. Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm,
kháng khuẩn [7].
1.3. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis
1.3.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 12
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ
cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến
những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần
khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis"
ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu
hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong
y học, chăn nuôi, thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005) [4] [9].
1.3.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
Đặc điểm phân loại [4] [9]:

Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis

Hình 1.6. Vi khuẩn Bacillus subtilis [9].
 Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường
đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng
sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa
sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis [9].
1.3.3. Đặc điểm hình thái
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 13
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 -
0,8m x 1,5 – 3m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di
động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm
giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8m. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự
nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại,
tia phóng xạ [9].
1.3.4. Đặc điểm nuôi cấy
 Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37
0
C
 Nhu cầu O
2
: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng
phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.

 Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.
 Môi trường
Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có
tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.
Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn
sóng.
Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin.
Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo
màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều [4] [9].
1.4. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH
1.4.1. Khái niệm về gốc tự do
Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự
sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung
cấp cho mọi hoạt động sống của con người [2].
Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng
oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy
tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 14
gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng
oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) [2].
Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O
2
•–
), đây là gốc tự
do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde (O
2
•–

) nhiều gốc tự do và các
phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl (HO
●
),
hydroperoxyl (HOO
●
), peroxyl (ROO
●
), alkoxyl (RO
●
), lipoperoxyde (LOO
•
),
H
2
O
2
.
Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng
phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA,… gây rối loạn các quá
trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn
công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với
những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây
chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể. Gốc tự do được tạo ra bằng
nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể
xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời,
thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxy.
Hiện nay ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ
cấp từ thực vật như là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy
hóa có hại tồn tại sẵn có trong cơ thể. Trong đời sống các sinh vật kỵ khí và hiếu

khí đều thiết lập một sự cân bằng tinh tế giữa ích lợi và nguy cơ trong việc sử
dụng oxy để đạt năng lượng. Trong quá trình hô hấp chúng đã tạo ra các hợp chất
trung gian là các gốc tự do: anion superoxide (O
2
), hydroxyl (OH), chất oxy hóa
nh H
2
O
2
có hoạt tính phản ứng rất lớn, mà từ các chất này cũng như các sản
phẩm phản ứng của chúng là nguyên nhân phá hủy các phân tử sinh học như
DNA, lipid, protein…
Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzyme nhằm
điều hòa các loại phân tử oxy hoạt tính cao này như superoxide dismutase,
catalae, glutathione peroxidase là các enzyme điều hòa nhằm duy trì sự an toàn
trong giới hạn cho phép của anion superoxide, H
2
O
2
và các hydroperoxide hữu
cơ tương ứng, chúng được xem là các enzyme khử độc chính trong cơ thể. Đôi
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 15
khi hệ thống bảo vệ trên bị quá tải, không khí bị ô nhiễm, khói thuốc lá, bức xạ tử
ngoại…các loại oxy hoạt tính cao này vượt quá giới hạn cho phép sẽ là nguồn
gây bệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa cho sinh vật. Các chất chống oxy hóa
từ thực vật đã góp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo vệ của cơ thể, ngăn chặn oxy
hóa không mong muốn như các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…và các hợp
chất trao đổi chất thứ cấp từ thực vật đã và đang được quan tâm nghiên cứu [2]
[11].

1.4.2. Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể
Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu được kiểm
soát, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần
cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm
trùng, tăng cường miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co
bóp cơ thịt [2] [11].
1.4.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người
mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày.
Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như:
ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm
trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế
bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết.
Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên
mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp
các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở
DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn
nheo, cơ khớp cứng nhắc [2] [11].
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau đây:
Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và
tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ
nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy yếu
kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được.
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 16
Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây
tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào.
Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây
ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty
lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc,

khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng.
Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60
bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer,
Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân,
xơ gan [2] [11].
Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động
(ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể
như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-
Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động
và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản
của cân bằng nội mô (homeostasis). Do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động từ
bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng
các dạng oxy hoạt động. Trạng thái sinh lý này gọi là stress oxy hóa (oxiizdative
stress). Hay nói cách khác, stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất
chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hóa.
Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng
ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã
tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy
hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn
thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có
những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại
những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta
cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ
thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu [2] [11].
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 17
PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Vật liệu:
Thân cây lá bạc (bìm Merremia eberhardtii)

Nguồn gốc lấy mẫu:
Mẫu cây bìm Merremia eberhardtii tươi được tách trực tiếp từ cây
trên núi, mẫu thường được lấy buổi sáng và được xử lý sau khi được đưa tới
phòng thí nghiệm và được lấy từ 2 nguồn:
- Tại khu vực rừng phía nam chân đèo Hải Vân thuộc địa phận xã
Hòa Hiệp Bắc, quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng.
- Khu vực bán đảo Sơn Trà (P.Thọ Quang, Q.Sơn Trà, Đà Nẵng)
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất
- Hóa chất pha dung dịch đệm, môi trường, dung môi và các loại hóa chất
khác. Một số hóa chất điển hình:
- Dung môi chiết tách:
+ Cồn
+ HCl của Trung Quốc
+ Etyl acetat của Trung Quốc
- Hóa chất pha dung dịch đệm:
+ NaCl
+ KCl
+ KH
2
PO
4
+ NaH
2
PO
4
+ Na
2
HPO
4

.7H
2
O
+ Dung dịch NaOH 2M
+ Dung dịch HCl 0,5 N
+ Cồn tuyệt đối Methanol và Ethanol.
- Natri tiosulfat Na
2
S
2
O
3
- Tween 80
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 18
- NH
4
SCN
- Chủng vi sinh vật: Vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacillus cereus sử dụng
giống bảo quản tại phòng thí nghiệm của bộ môn công nghệ sinh học, đại học
bách khoa Đà Nẵng.
2.1.2.2. Thiết bị và dụng cụ
- Các dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, lọ penicilline, chai thủy tinh
500ml, bình tam giác, bể nuôi, que cấy trang, que cấy vòng, đèn cồn, đầu típ,
micropipet, pipet Pasteur, ống eppendof… tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh
học Khoa hóa Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng.
- Thiết bị, máy móc thuộc phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng như:
- Tủ sấy hút chân không
- Máy li tâm: Model Rotanta 460 hightech

- Lò vi sóng: Model Sharp R-399VN(S)
- Máy nuôi lắc: Model Grant GLS400
- Tủ cấy - Bếp điện
- Cân kỹ thuật - Nồi hấp vô trùng
- Cân phân tích - Tủ ấm
- Máy đo pH - Cân phân tích
- Máy đo màu - Tủ lạnh
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp hoá lý
2.2.1.1. Phương pháp chiết các chất tan
 Quy trình ly trích mẫu cho quá trình nghiên cứu:
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 19
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tách chiết
2.2.2. Phương pháp vi sinh
2.2.2.1. Phương pháp pha loãng thập phân
Phương pháp này nhằm giảm số tế bào vi sinh vật sao cho phù hợp với quá
trình nghiên cứu.
Chuẩn bị một số môi trường lỏng vô khuẩn. Dùng pipet đưa vật phẩm
nghiên cứu vào ống nghiệm thứ nhất, đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyền từ ống
nghiệm thứ nhất sang ống nghiệm thứ 2, rồi từ ống thứ 2 sang ống thứ 3, ống thứ
3 sang ống thứ 4,… Nhờ trình tự pha loãng mà số tế bào càng về cuối càng giảm
dần, tương ứng với độ pha loãng là 10
-1
÷10
-5
(hình 2.1). Sau khi pha loãng mẫu
được gieo cấy trên môi trường thạch đã đổ đĩa để tách từng khuẩn lạc một riêng
biệt [4].

SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Lọc
Lập lại quy trình 3 lần
Lắc ở nhiệt độ phòng 30 phút
Cho vào 30ml cồn 70
0
Nghiền (cối chày)
Cân 20g lá hoặc thân cây Bìm Bôi
Thu dịch chiết
Lọc
Đun sôi trong 1 giờ
Cho vào 200 ml nước cât
Bảo quản ở chai màu đen
và tiến hành các thí nghiệm
Thu dịch, bảo quản và tiến
hành các thí nghiệm
Lọc sạch lần cuối
Trang 20


Hình 2.2: Sơ đồ pha loãng vật phẩm nghiên cứu
2.2.2.2. Phương pháp đo độ đục của huyền phù vi khuẩn
- Đo bằng quang phổ kế
Dùng chùm tia sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa vi sinh vật
muốn đo, vi sinh vật làm phân tán bớt chùm tia sáng nhiều hoặc ít tuỳ thuộc vào
số lượng của chúng trong dịch huyền phù, độ đục của huyền phù với mật độ tế
bào. Từ đó, biết được mật độ vi sinh vật trong huyền phù. Quá trình đo được thực
hiện trên máy so màu tại bước sóng 625 nm [4] [9].
- Sử dụng dãy ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống Mc Faland) [4][9].
Dãy ống nghiệm chứa BaSO

4
ở các độ pha loãng khác nhau tương ứng với
độ pha loãng có bảng đối chiếu nồng độ vi khuẩn tương ứng. Đối chiếu độ đục
ống nghiệm với dãy ống Mc Faland sau đó đối chứng bảng ta sẽ biết nồng độ vi
khuẩn tương ứng. Dãy ống Mc Faland được pha như sau: Lấy 10 ống nghiệm
sạch, cho dung dịch BaCl
2
1% vào mỗi ống theo thứ tự từ 1 đến 10 (ống 1: 0,1ml;
ống 2: 0,2ml; cho đến ống thứ 10 là 1ml). Sau đó cho vào mỗi ống lượng vừa đủ
10ml dung dịch H
2
S0
4
1%, hàn kín miệng ống lại. Độ đục của mỗi ống tương ứng
với mật độ tế bào vi sinh vật theo dãy Mc Faland được cho ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Dãy ống chuẩn Mc faland xác định mật độ tế bào theo độ đục
STT Số vi khuẩn /ml (10
6
) STT Số vi khuẩn /ml (10
6
)
1 300 6 1800
2 600 7 2100
3 900 8 2400
4 1200 9 2700
5 1500 10 3000
2.2.2.3. Phương pháp khuếch tán đĩa
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 21
Cho chất cần nghiên cứu khuếch tán vào môi trường thạch có chứa vi sinh

vật kiểm định tạo ra các vòng ức chế vi sinh vật kiểm định. Khi có tạo vòng vô
khuẩn là chất đó có tính kháng khuẩn, tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tuỳ thuộc
vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ. Trong nội dung của nghiên cứu này
chúng tôi sử dụng phương pháp đục lỗ thạch [4] [9].
Cấy vi sinh vật kiểm định vào đĩa thạch Petri đã vô trùng. Đục lỗ thạch
bằng nút cao su, cho dịch chiết kháng khuẩn đã được pha loãng với một nồng độ
nhất định vào lỗ đục đó. Nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm và sau đó lấy ra
đo vòng vô khuẩn xung quanh lỗ đục.
2.2.2.4. Phương pháp pha loãng để xác định MIC
Nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn MIC (Minimum Inhibitory
Concentration)
Mục đích:
Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của
kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi
trường nuôi cấy (phương pháp định lượng) [10].
Nguyên lý :
Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một
nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng mắt
thường đã có thể xác định được điều này [10].
Đây là phương pháp để xác định lượng chất kháng khuẩn tối thiểu có khả
năng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật. Pha loãng chất cần nghiên cứu theo phương
pháp pha loãng gấp đôi, cho vào môi trường thạch đã được vô trùng, đổ vào đĩa
petri và cấy vi sinh vật kiểm định, nuôi trong tủ ấm ở 37
0
C sau 20÷24 giờ đọc kết
quả. Nồng độ nhỏ nhất mà tiêu diệt 90- 99% lượng vi sinh vật kiểm định trong
mẫu gọi là MIC [10].
2.2.2.5. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp pha loãng
Phương pháp này cho phép đếm được số tế bào sống có trong 1ml dung
dịch. Dùng dung dịch cần đếm vi khuẩn pha loãng ở các độ liên tiếp nhau, theo

cơ số 10, thường lấy vi khuẩn đã pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp thích hợp với
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 22
từng loại vi khuẩn. Đảm bảo có thể đếm được khuẩn lạc, ít nhất là hai ống có thể
nhìn thấy khuẩn lạc. Ở độ pha loãng cuối cùng lấy 0,1 ml dịch vi khuẩn cấy lên 2
đĩa môi trường, dùng que trang để dàn đều dịch trên bề mặt thạch. Sau đó nuôi ở
370C trong 24 giờ [10].
Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Chọn độ pha loãng có số khuẩn lạc từ
30 đến 300 khuẩn lạc trên 1 đĩa để đưa vào tính toán. Sau khi có số khuẩn lạc ta
tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng
Di theo công thức (2.1).
Mi (CFU/ml) = (2.1)
Trong đó : Ai là số khuẩn lạc trung bình /đĩa.
Di là độ pha loãng.
V là thể tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml).
Mi là mật độ tế bào vi sinh vật trong đĩa i.
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở
các nồng độ pha loãng khác nhau.
Đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng cách so sánh lượng vi khuẩn nuôi
trong môi trường có chứa chất cần nghiên cứu (CFU chất nghiên cứu) với lượng
vi khuẩn nuôi trong môi trường có nước cất vô trùng đối chứng (CFU đối chứng)
theo công thức (2.2).
% vi khuẩn chết = ×100% (2.2)
2.2.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của dịch chiết từ thân cây Bìm Bìm
- Các dịch chiết thu được tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn với vi khuẩn
B.subtilis [10].
- Môi trường được sử dụng ở đây là TSA, BHI.
- Dùng phương pháp vòng kháng khuẩn để kiểm tra phân đoạn nào có khả
năng kháng khuẩn.
Tiến hành:

- Môi trường TSA dùng để đổ đĩa petri với độ dày 2/3 đĩa, để 72 giờ cho
đĩa khô hoàn toàn.
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 23
- Hòa tan 0,4g mẫu bằng 5 ml dung môi DMSO (lúc này nồng độ mẫu là
0,02 g/ml) đun nhẹ trên ngọn đèn cồn.
- Cắt 1/3 đầu ống tipe, sấy khử trùng.
- Dùng đầu tipe đã được khử trùng đục lỗ đĩa, mỗi đĩa đục 5 lỗ với khoảng
cách đều nhau.
- Cấy vi khuẩn vào môi trường BHI, chuẩn độ đục của huyền dịch vi khuẩn
tương đương với độ đục của ống Mc Farland 0,5 bằng cách thêm nước muối
sinh lý 0,9%. Lúc này nồng độ vi khuẩn sẽ tương đương 10
8
. Pha loãng nồng
độ vi khuẩn xuống còn 10
7
, 10
6
bằng môi trường BHI.
- Dùng tâm bông vô trùng chấm nhẹ vào huyền dịch vi khuẩn, sau đó ray
đều tâm bông này lên đĩa petri có sẵn các lỗ sao cho vi khuẩn có thể được trãi
đều mặt đĩa.
- Dùng micropipette hút 100µl mỗi phân đoạn mẫu lần lượt cho vào mỗi lỗ.
Quan sát : Sau 24 giờ, nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng
tỏ phân đoạn đó có kháng khuẩn. Ta sử dụng phân đoạn này tiếp tục thử nghiệm
xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC).
Thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn:
Pha loãng dịch kháng khuẩn ở nồng độ 0,02 g/ml xuống 0,002 g/ml
(2000µg/ml). Chuẩn bị 3 nhóm ống nghiệm tương ứng dịch chiết từ các mẫu
thân, lá [4] [10].

Chuẩn bị 3 ống nghiệm để làm đối chứng, mỗi ống chứa 1 ml môi trường
BHI.
Cho Bacillus subtilis lần lượt vào từng ống.
- Ủ tất cả các ống nghiệm trong tủ ấm 37ºC/24 giờ.
- Quan sát sự thay đổi độ đục của môi trường, sự tạo thành cặn ở đáy và sự
tạo váng ở bề mặt ống nghiệm.
2.2.4. Phương pháp điện hoá
Sử dụng pH meter đo pH dung dịch
Để đo pH dung dịch, người ta sử dụng các loại điện cực chỉ thị khác nhau
như: điện cực hidro, điện cực qiuhydon, điện cực thủy tinh. Khi nhúng điện cực
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 24
vào dung dịch, quá trình trao đổi ion H
+
giữa điện cực và dung dịch xuất hiện cân
bằng: H
+
(dung dịch)  H
+
(thủy tinh)
Do sự chênh lệch hoạt độ ion H
+
bề mặt thủy tinh xuất hiện điện thế E
m
.
Vậy thế điện cực của màng E
m
đặc trưng cho pH dung dịch nghiên cứu [5].
2.2.5. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH
2.2.5.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH

- Là gốc tự do bền do có hiệu ứng liên hợp trong phân tử [2].
- Độ hấp thụ cực đại tại 517nm do gốc tự do trên Nitơ và cho màu tím trong
Methanol.
- Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa :
DPPH ˉ + AH  DPPH-H + A˙
- Kết quả được đánh giá thông qua giá trị IC
50
(inhibitory concentration)
là nồng độ chất oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong
khoảng thời gian xác định.
- Mẫu Vitamin C được dùng để so sánh thông giá trị IC
50
.
2.2.5.2. Phương pháp thyocyanate xác định hoạt độ chống oxy hóa.
Nguyên tắc: Trong môi trường axit các chất hydroperoxit sẽ oxy hóa Fe
2+
thành Fe
3+
. Lượng Fe
3+
tạo thành sẽ tạo phức màu đỏ máu với amonium
thyocyanate. Với mẫu có chất chống oxy hóa thì lượng Fe
3+
tạo thành sẽ ít hơn
mẫu trắng. Hoạt độ kháng oxy hóa được hiển thị bằng phần trăm (%) Fe
2+
bị ức
chế tạo thành Fe
3+
[2] [11] [12].

Khi cho vào hỗn hợp chứa các hợp chất peroxit thì Fe
2+
bị oxy hóa thành
Fe
3+
Fe
2+
- e + H
+
= Fe
3+
Fe
3+
+ SCN
-
= Fe(SCN)
3
(có màu đỏ máu)
Công thức tính phần trăm ức chế oxy hóa

%100.
Ao
AtAo
Hd
−
=
(2.3)
Trong đó: Hd: phần trăm ức chế oxy hóa.
A
0

: mật độ quang của mẫu trắng.
A
t
: mật độ quang của mẫu thử.
2.2.6. Phương pháp vật lý
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long
Trang 25
Xác định độ ẩm của các nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến khối lượng
không đổi [5].
Tiến hành xác định:
- Nguyên liệu được rửa sạch và sấy ở 25 ÷ 40
0
C để đưa về trạng thái ban
đầu.
- Rửa sạch cốc cân và sấy cốc cân trong 2 giờ ở 105
0
C.
- Đưa cốc cân vào bình hút ẩm, để nguội,
- Cân khối lượng cốc trên cân phân tích, m
0
(g).
- Cân cốc cân và nguyên liệu, m
1
(g).
- Cho nguyên liệu vào cốc và đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 40 ÷ 60
0
Ctrong thời
gian 3 giờ, sau đó đưa vào bình hút ẩm, để nguội, đem cân và đặt tiếp vào tủ sấy,
rồi lại đem cân (mỗi lần cân cách nhau 30 phút) đến khi kết quả giữa 2 lần cân
cuối cùng có sai số 0,01g là coi như khối lượng không đổi, ta được m

2
(g) [5].
- Độ ẩm nguyên liệu được tính theo công thức sau:
%100.
01
21
mm
mm
W
−
−
=
(2-4)
Trong đó: m
0
: khối lượng cốc không có nguyên liệu, g.
m
1
: khối lượng của cốc và nguyên liệu trước khi sấy, g.
m
2
: khối lượng của cốc và nguyên liệu sau khi sấy, g.
PHẦN III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long