Phân lập, tuyển chọn và tách dòng gen mã hóa enzym xylanase từ nấm mốc

61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
MỤC LỤC
MỤC LỤC 1
LỜI MỞ ĐẦU 3
PHẦN I. TỔNG QUAN 4
1.1. XYLAN

4
1.2. PHỨC HỆ ENZYM PHÂN CẮT XYLAN

5
1.3. KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI XYLANASE

7
1.3.1. Khái niệm về xylanase 7
1.3.2. Phân loại xylanase 8
1.4. CẤU TRÚC CỦA XYLANASE

9
1.5. CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA XYLANASE

11
1.6. NGUỒN THU XYLANASE

13
1.6.1. Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn 13
1.6.2. Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc 14
1.7. ỨNG DỤNG CỦA XYLANASE

17

1.7.1. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 17
1.7.2. Trong sản xuất bánh 17
1.7.3. Trong sản xuất rượu vang 18
1.7.4. Trong sản xuất cồn nhiên liệu 18
1.7.5. Trong chất hoạt động bề mặt 19
1.7.6. Trong tẩy trắng giấy và bột giấy 19
1.8. TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ XYLANASE

20
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21
2.1. VẬT LIỆU

21
2.1.1. Nguồn phân lập 21
2.1.2. Hóa chất 21
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
2.1.3. Thiết bị 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

23
2.2.1. Phương pháp phân lập 23
2.2.2. Xác định hoạt tính xylanase trên môi trường đặc 23
2.2.3. Xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp DNS 23
2.2.4. Phương pháp định tên nấm mốc 25
2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA 25
2.2.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 27
2.2.7. Phương pháp khuếch đại một đoạn DNA bằng phản ứng PCR 27

2.2.8. Phương pháp tinh sạch một đoạn DNA 28
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH
XYLANASE CAO

31
3.2. ĐỘNG HỌC SINH TỔNG HỢP ENZYM XYLANASE CỦA CHỦNG C1
VÀ B7

34
3.3. ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOI HÌNH THÁI

35
3.4. ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

37
3.4.1. Tách chiết DNA tổng số 37
3.4.2. Khuếch đại đoạn ITS1-5,8S-ITS2 bằng phản ứng PCR 38
3.4.3. Giải trình tự đoạn được khuếch đại và phân tích trình tự 40
3.5. THIẾT KẾ ĐOẠN MỒI ĐỂ TÁCH DÒNG GEN MÃ HOÁ XYLANASE
.
45
3.6. KHUẾCH ĐẠI GEN MÃ HOÁ XYLANSE

46
3.7. GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ĐÃ ĐƯỢC KHUẾCH ĐẠI VÀ KIỂM TRA
ĐỘ TƯƠNG ĐỒNG TRÊN NGÂN HÀNG GEN THẾ GIỚI

48
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
PHỤ LỤC 60
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay trên trái đất, mỗi năm thực vật sản sinh ra một lượng sinh khối
khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỷ tấn. Tất cả mọi hoạt động của con người cũng
như các loài động vật đều cần đến thực vật. Chúng là nguồn lương thực để nuôi
sống con người và động vật đồng thời là nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho
các ngành công nghiệp. Để thay đổi tính chất của vật liệu đầu vào cho phù hợp với
sản phẩm mong đợi người ta phải tìm cách thay đổi cấu trúc của thành tế bào thực
vật. Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo khá vững chắc bởi cellulose,
hemicellulose và lignin cho nên để phá hủy một phần hoặc toàn bộ chúng thì người
ta thường sử dụng các hóa chất mạnh như axit mạnh hay kiềm mạnh. Do đó chi phí
để sản xuất các sản phẩm như giấy thường cao và nhất là gây ảnh hưởng nghiêm
trọng đến môi trường sinh thái. Chính vì vậy mà yêu cầu đặt ra là phải thay thế bằng
các phương pháp an toàn hơn đối với môi trường. Và giải pháp cho vấn đề này là
các loại enzym thủy phân các polyme sinh học kể trên.
Một loại enzym hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm là
xylanase. Enzym này có khả năng thủy phân hiệu quả các xylan – là thành phần chủ
yếu của hemicellulose trong thành tế bào thực vật. Xylanase có rất nhiều ứng dụng
trong công nghệ chế biến giấy và bột giấy, công nghệ thực phẩm, công nghiệp sản
xuất thức ăn chăn nuôi, hay ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh hoc (ethanol
sinh học) từ phế thải nông nghiệp.
Tuy được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, nhưng việc sử dụng
xylanase còn hạn chế do hiệu suất sinh tổng hợp của các chủng vi sinh vật tự nhiên
sinh enzym này chưa cao. Thông qua đề tài nghiên cứu "Phân lập, tuyển chọn và
tách dòng gen mã hóa enzym xylanase từ nấm mốc" hy vọng sẽ lựa chọn được gen

mã hóa xylanase có hoạt tính cao, tiếp tục những nghiên cứu để sản xuất được
xylanase có giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu thị trường.
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1. XYLAN
Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose được tìm thấy
trong thành tế bào thực vật là polysaccharide cơ bản thứ hai sau cellulose [1]. Thuật
ngữ hemicellulose được dùng để chỉ những polysaccharide thành tế bào thực vật mà
kết hợp chặt chẽ với cellulose và glucan. Trong thực tế, thành tế bào thực vật là một
vật liệu phức tạp trong đó cellulose (35-50%), hemicellulose (20-30%) - một nhóm
cacbonhydrat trong đó dạng xylan là loại chủ yếu - và lignin (20-30%) liên kết chặt
chẽ với nhau.
Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc acetyl,
4-O-methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo
bởi các gốc xylopyranose. Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu β-1,4-
glycozit. Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bằng các gốc
của axit 4-O-methyl-D-glucuronic [2, 3].
Hình 1. Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae [10]
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
Xylan chiếm khoảng 30% vật liệu của thành tế bào của thực vật sống lâu
năm, từ 15-30% đối với gỗ cứng và 7-10% đối với gỗ mềm.
Với các cây gỗ mềm, các nhóm phụ của xylan chủ yếu là axit 4-O-methyl
glucuronic và arabinose. Chúng liên kết với bộ khung xylan bằng liên kết α-1,3-
glycozit. Hiếm khi thấy các nhóm acetyl trong xylan của gỗ mềm. Tỷ lệ arabinose

so với xylose thường là 0,6 [4].
Hemicellulose trong gỗ cứng có nhóm phụ là axit 4- O-methyl glucuronic,
axit acetic và axit uronic. Bộ khung của xylan gỗ cứng này gồm các gốc β-1,4-D-
xylopyranose, trung bình cứ 10 – 20 gốc xylose thì có một axit 4- O-methyl
glucuronic liên kết với nó theo kiểu α-1,2-glycozit. Xấp xỉ 60-70% các đơn vị
xylose được este hóa với axit acetic ở nhóm hydroxyl của carbon thứ 2 hoặc thứ 3
và trung bình thì cứ mười đơn vị xylose thì có một nhóm axit uronic liên kết với
gốc xylose theo kiểu α-1,2-glycozit [2, 4, 5].
1.2. PHỨC HỆ ENZYM PHÂN CẮT XYLAN
Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzym trong
đó endo-β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiện
nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan
tạo ra các oligosaccharide. Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β-1,4-D-xylan
xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer. Các
nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-
glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase.
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
Hình 2. Vị trí tấn công của các enzym vào xylan của cỏ [2]
Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylo-
oligosaccharide bằng cách loại bỏ thành công xylose từ đầu không khử. Có nhiều
công bố về Bacillus sp [6] và một số nấm [7] sinh tổng hợp β-xylosidase nội bào.
Enzym α-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thủy phân nhóm cuối cùng
không khử α-L-arabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan.
Một lượng lớn các vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và các loài vi khuẩn được
công bố là có khả năng sinh tổng hợp α-arabinosidase. Rhodothermus marinus là
loài chịu nhiệt có sinh enzym lớn nhất với hoạt độ 6,6 U/ml [8].
Enzym α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1) thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic

giữa xylose và D-glucuronic axit hoặc liên kết ete với 4-O-methyl. Sự thủy phân
liên kết α-1,2 bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan. Tương tự
như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ. Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp α-glucuronidase [9].
Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết
của các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vỡ liên kết của xylose
với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6), các gốc chuỗi bên arabinose với
axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p-
coumaroyl esterase). Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì
thuận lợi cho sự loại bỏ lignin. Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự
phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose. Nếu sử dụng cùng với
xylanase và các enzym phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase
có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [2].
1.3. KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI XYLANASE
1.3.1. Khái niệm về xylanase
Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 có:
 Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase
 Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong
xylan.
 Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4-
xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4-
xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β-
xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D-
xylanase

 Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase [10]
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
1.3.2. Phân loại xylanase
Wong và các cộng sự [11] phân loại xylanase thành hai nhóm dựa vào đặc
tính lý hóa của chúng như là khối lượng phân tử và điểm đẳng điện và trên các đặc
tính xúc tác khác nhau của chúng. Endo-xylanase có khối lượng phân tử cao với giá
trị pI thấp thuộc về glycanase họ 10 (trước đây gọi là họ ‘F’), trong khi đó các
endoxylanse khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được phân loại thành
glycanase họ 11 (trước đây là họ G) [12, 13].
Biely và các cộng sự [14] sau khi mở rộng phạm vi nghiên cứu trên sự khác
biệt trong các đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase kết luận rằng endo-xylanase của
họ 10 khác với các thành viên của họ 11 là khả năng có thể tấn công các liên kết
glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử [15]. Trong khi endo-
xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh, endo-
xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế. Theo đó
các endo-xylanase của họ 10 có nhiều các hoạt động xúc tác, cái mà tương ứng với
β-xylosidase. Các endo-xylanase của họ 10 giải phóng các xylopyranosyl ở đầu tận
cùng gắn với một gốc xylopyranosyl thay thế, nhưng chúng cũng thể hiện hoạt độ
aryl-β-D-xylosidase.
Sau khi kiểm tra một nghiên cứu phân tích tác nhân rộng rãi, Sapag và các
cộng sự [12] đã ứng dụng một phương pháp mới mà không liên quan tới phân tích
trình tự trước đó cho việc phân loại xylanase họ 11, để chia xylanase thành 6 nhóm
chính. Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzym của nấm. Các enzym nhóm I và II
thường là các enzym có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ
Ascomyceta và Basidiomyceta. Các enzym nhóm I có giá trị pI bazo trong khi đó
nhóm II có giá trị pI ở phía axit. Các enzym của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi
các nấm yếm khí. Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba

nhóm là A, B và C. Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương.
Nhóm B và C thì chứa các enzym chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương,
những loài thường sống trong dạ cỏ [12].
1.4. CẤU TRÚC CỦA XYLANASE
Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt
các enzym, từ cả vi khuẩn và nấm mốc. Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans
có nét đặc trưng của họ 11 [16,17]. Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp β tạo
thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và
tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [12]. Sự khác nhau trong hoạt
động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau
trong cấu trúc bậc ba của chúng. Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được
sắp xếp từ các mảnh β [18, 19]. Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase
họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh β [20]. Vị trí liên kết
cơ chất của endo-xylanase họ 10 ở khe xúc tác không sâu như với endo-xylanase họ
11. Điều này cùng với tính linh động hình thể lớn hơn của các enzym lớn hơn so với
của những enzym nhỏ hơn có thể giải thích nguyên nhân của tính đặc trưng cơ chất
thấp hơn của endo-xylanse họ 10 [16, 17].
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
Hình 3. Cấu trúc không gian 3 chiều của Xylanase họ 10 từ Bacillus
halodurans [21]
Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp β
cái mà làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác. Vũng lõm này

được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón
cái của tay phải. Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân
tử isoleusin [16, 17].
Hình 4. Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [22]
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vònng xylopyranose ở gần vị trí
xúc tác. Meagher và các cộng sự [23] nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei
có thể liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên
kết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác. Các vị trí cho các gốc
xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi
tryptophan [19, 24].
1.5. CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA XYLANASE
Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động của
xylanase. Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thủy phân xylan. Sự thủy phân nhìn
chung có thể là kết quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm anomeric
của các monomer đường khử của cacbonhydrat. Đề xuất này bao gồm một hoặc hai
trạng thái chuyển tiếp hóa học. Sự dịch chuyển glycosyl thường dẫn đến trong sự
thay thế tính ái nhân ở cacbon bão hòa của trung tâm anomeric và diễn ra với sự
duy trì hoặc nghịch chuyển của cấu hình anomeric. Hầu hết các enzym thủy phân
polysaccharide kiểu như cellulase và xylanase được biết đến với sự thủy phân các
cơ chất của chúng với sự duy trì của cấu hình anomeric của C1. Có sự liên quan của
cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm [2]. Cơ chế dịch
chuyển kép bao gồm các đặc điểm:
 Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất.
 Một nhóm carboxyl của enzym ở trạng thái hoạt động
 Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzym với
cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên kết

này đối lập với đường của cơ chất.
 Các tương tác không phải là cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên [2].
(hình 5)
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
Hình 5. Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase của Bacillus circulans
(1 XNB).
(a) Cấu trúc xylan xoắn là phù hợp với dạng lõm giữa Tyr 65 và Tyr 69. Glu 172
là tác nhân xúc tác axit/bazo và Glu 78 là ái nhân. (b) Glycone liên kết với Glu 78.
Chất trung gian này được giữ lại trong suốt phản ứng chuyển glycosyl. (c) Nước
chiếm chỗ của nucleophile. (d) Sự tách và khuếch tán của glycone (xylobiose) cho
phép sự di chuyển của enzym tới một vị trí mới trên cơ chất. Xylanase của họ 11
biểu lộ một cơ chế endo và ngẫu nhiên hơn trong quá trình phân cắt. Điều này là
bởi vì aglycone được giải phóng ở bước (b) và glycone ở bước (d) [16, 17].
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
Leggio và các cộng sự [20] đề xuất rằng cơ chế xúc tác của xylanase là:
1. Xylanase nhận biết và liên kết với xylan.
2. Gốc xylosyl ở vị trí
-
1 bị làm biến dạng và được thả xuống hướng về phía gốc
xúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên kết cộng
hóa trị enzym-cơ chất trung gian.
3. Chất trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, tiếp theo đó cơ
chế thủy phân glycosyl cổ điển tiếp tục diễn ra và sản phẩm được giải phóng
[20].

1.6. NGUỒN THU XYLANASE
Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật; nhiều loại vi khuẩn
và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase [11,25]. Tuy nhiên, có nhiều
nghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp endo-
xylanase trong quả lê Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả. Cleemput và các
cộng sự [26] đã tinh chế được một loại endo-xylanase với khối lượng phân tử là 55
kDa từ bột mì của cây lúa mì châu Âu. Một số loài động vật thân mềm dưới nước
cũng có khả năng sinh tổng hợp xylanase [27].
1.6.1. Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn
Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzym sử dụng cho các quá
trình công nghiệp trong đó có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó. Một số loài
sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là Bacillus sp.
Bacillus SSP-34 có khả năng sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ 506 U/ml trong
môi trường tối ưu. Trước đó thì Ratto và các cộng sự đã công bố Bacillus circulans
tổng hợp lên xylanase có hoạt độ 400 U/ml. Nó hoạt động tối ưu ở pH 7 và 40%
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
hoạt độ được duy trì ở pH 9,2. Streptomyces cuspidosporus sinh tổng hợp được
xylanase có hoạt độ 49 U/ml trong môi trường xylan. Bacillus sp NCL 87-6-10 tổng
hợp được xylanase với hoạt độ 93 U/ml trong môi trường có cảm ứng zeolit và có
hiệu quả hơn khi sử dụng Tween 80. Một chủng khác là Bacillus circulans AB16
tổng hợp xylanase có hoạt độ 19,28 U/ml khi sinh trưởng trên môi trường rơm gạo.
Streptomyces sp QG-11-3 có khả năng sinh enzym xylanase có hoạt độ 96 U/ml.
Các sinh vật khác sinh tổng hợp xylanase được đưa ra ở bảng 1 [28].
1.6.2. Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc
Các enzym xylanase được sinh tổng hợp từ nấm mốc thường có pH tối ưu
thấp hơn so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn. Giá trị pH tối ưu của
xylanase từ nấm mốc thủy phân xylan thì thường dao động từ pH 3 đến 8 và ổn định

ở pH 5 (bảng 2).
Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với pH tối ưu
của xylanase từ nấm. Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy, để sử dụng
xylanase từ nấm mốc cần phải hạ pH xuống thấp do đó mà xylanase từ nấm mốc ít
được dùng hơn so với vi khuẩn. Tuy nhiên trong nhiều ngành công nghiệp khác,
như công nghiệp sản xuất đồ uống, công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu, thì đây lại
là một ưu thế rất lớn của xylanase nấm mốc vì môi trường cho enzym hoạt động là
môi trường axit. Gomes và các cộng sự đã công bố thu được hoạt độ xylanase là
188,1 U/ml với pH tối ưu 4,5 từ Trichoderma viride. Tương tự với T. viride, T.
reesei cũng được biết đến với khả năng sinh tổng hợp xylanase cao với hoạt độ 960
U/ml. Giống như Trichoderma sp, Schizophillum commune cũng là một trong
những loài tổng hợp xylanase cao với hoạt độ xylanase là 1244 U/ml. Nằm trong
nhóm nấm mùn trắng, một loài nấm phá hủy thành tế bào thực vật có tiềm năng là
Phanerochaete chrysosporium sản xuất xylanase có hoạt độ 15-20 U/ml trong môi
trường nuôi cấy. Aspergillus niger có hoạt độ xylanase là 76,6 U/ml sau 5,5 ngày
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
lên men. Nấm sinh tổng hợp xylanase có một số các hạn chế đó là khi sản xuất
enzym trên môi trường lỏng ở quy mô công nghiệp thì hoạt độ thu được thường
thấp hơn thực tế. Điều này là do khi tiến hành lên men trong môi trường lỏng các
sợi nấm kết lại thành các pellet làm cản trở quả trình tiếp xúc với chất dinh dưỡng
và đặc biệt là các ứng suất xảy ra trong thiết bị lên men làm sinh khối của nấm dễ bị
phá vỡ dẫn đến việc làm giảm lượng enzym thu được [28].
Bảng 1. Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [28]
Vi sinh vật Xylanase (U/ml)
Nấm mốc
Aspergillus awamori VTT-D-75028 12,00
Aspergillus niger KKS 138

Aspergillus niger 250
Fusarium oxysporum VTT-D-80134 3,70
Phanerochate chrysosporium 15-20
Piromyces sp.strain E 2 7,96
Thermomyces lanuginosus 650-780
Trichoderma reesei 960
Vi khuẩn
Bacillus SSP-34 506
Bacillus circulans 400
Bacillus stearothermophilus StrainT6 2,33
Bacillus sp. 120
Bacillus sp. strain NCL 87-6-10 93
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
Bacillus circulans AB 16 19,28
Streptomyces sp. QG-11-3 96
Thermoactinomyces thalophilus sub group C 42
Bảng 2. Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật [28]
Vi sinh vật
KLPT
(KDa)
Điều kiện tối ưu Độ bền pI Km
(mg/ml)
Vmax
(µmol
/ phút /
pH Nhiệt
độ

pH (giờ) Nhiệt độ
(giờ)
Nấm mốc
Acrophialophora
nainiana
22 7,0 55 - 60 (1) - 16 - -
Aspergillus awamori 39 5,5-6 55 - - 5,7-
6,7
1,0 10000
23 5,0 50 - - 3,7 0,33 3333
26 4,0 45-50 - - 3,3-
3,5
0,09 455
Aspergillus nidulans 34 6 56 4,0-6,7 56 3,4 0,97 1091
Aureobasidium pullula
ns
Y-2311-1
25 4,8 54 4,5 50 9,4 7,6 2650
Cephalosporium sp. 35 7,5- 50 - - 6,3 5,26 118,4
24 7,5- 50 - - 4,4 4,16 145,2
Erwinia chrysanthemi
42
5,5
55
4-7
35
8,8
-
-
Penicillium

purpurogenum
33 7,0 60 6,0-7,5
(24)
40 (3) 8,6 - -
23 3,5 50 4,5-5,5
(24)
40 (3) 5,9 - -
Trichoderma viride
22
5
53
-
-
9,3
4,5
160
Trichoderma harzianun
20
5,0
50
-
40
-
0,58
0,106
Vi khuẩn
Aeromonas caviae ME1
20
7
50

3,0-4,0
6.5-8
7,1
9,4
4330
Bacillus sp. Strain SPS-0
99
6,0
75
-
70 (4)
0,7
145
Bacillus sp. W1
(JCM2888)
21.5 6 65 4,5-10 - 8,5 4,5 -
49.5 7,9 70 4,5-7,0 - 3,7 0,95 -
Streptomyces T-7
20.64
3
4,5-5,5 60 5,0 (
144)
37 (264) 7,8 10 7600
Streptomyces sp. No 50 5,5-6,5 60-65 5,5-6,5 55 7,1 9,1 -
25 5,0-6,0 60-65 5,0-6,0 55 10.06 - -
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
3137 25 5,0-6,0 60-65 5,0-6,0 55 10.26 11.2 -

Thermotoga thermarum
266
b
6 80 - - - 0,36 1,18
35
c
7 90- - - - 0,24 19,5
1.7. ỨNG DỤNG CỦA XYLANASE
1.7.1. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Việc sử dụng enzym xylanase cho thức ăn của động vật đã thu hút sự quan
tâm của các nhà khoa học. Sự kết hợp của xylanase với thức ăn của gà con làm
giảm độ nhớt trong ruột, tăng hiệu quả hấp thu thức ăn. Kết quả là cải thiện đáng kể
trọng lượng của chúng [29]. Theo Feoli và các cộng sự thì việc bổ xung xylanase
vào bột mì gia súc và bột đậu tương với một tỷ lệ nhất định cũng cải thiện được
năng suất và hiệu suất tiêu thụ thức ăn của lợn [30]. Các nghiên cứu khác cũng chỉ
ra rằng việc bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cỏ
ling lăng, ngũ cốc ) đã làm tăng hiệu quả tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suất
trong chăn nuôi [31].
1.7.2. Trong sản xuất bánh
Các xylanase cũng được cho rằng có thể cải thiện chất lượng của bánh mì với
việc làm tăng thể tích đặc trưng của bánh. Điều này càng được nâng cao khi sử
dụng chung với amylase. Xylanase có tính axit từ Aspergillus oryzae được sử dụng
để sản xuất thực phẩm thương mại truyền thống của Nhật như là sake (một loại
rượu từ gạo) và shoyu koji (từ đậu nành và hạt lúa mì). Người ta chỉ ra rằng hiệu
quả phân giải thành tế bào đậu tương và lúa mì cải thiện giá trị sử dụng các vật liệu
thô và làm giảm lượng bã ép lọc đậu tương. Multifect và Enzeko là tên thương mại
của một số các xylanase thương mại cũ được sử dụng trong công nghệ làm bánh.
Novozyme đưa ra một số các enzym xylanase mới, có thể là kết hợp với các enzym
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49

61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
khác, để cải thiện bột nhào, đặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ. Một số các
enzym xylanase thương mại như Celluclast BG, Fungamyl Super AX, Fungamyl
Super MA and the Pentopan® [31].
1.7.3. Trong sản xuất rượu vang
α-L-arabinofuranosidase và β-D-glucopyranosidase được sử dụng trong quá
trình sản xuất thực phẩm cho các chất thơm, rượu vang và nước hoa quả. Vi sinh
vật bám trên quả nho với mật độ vừa phải sẽ làm tăng các chất hóa học phức tạp và
tăng chất lượng cảm quan của rượu vang. Điều này do các vi sinh vật này sinh
xylanase, enzym này được cho rằng có khả năng giúp đỡ sự phá hủy thành tế bào
của nho và vì thế làm tăng lượng monoterpenyldiglycoside, chất mà tạo mùi thơm.
Hiện nay, chưa có một enzym thương mại nào có tiềm năng để sử dụng trong sản
xuất rượu vang và nó vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển. [31]
1.7.4. Trong sản xuất cồn nhiên liệu
Sự tiêu thụ nhanh chóng nguồn năng lượng hóa thạch đang cần sự thay thế
từng bước một với các nguồn thay thế, nguồn này phải thân thiện với môi trường và
phải góp phần bảo vệ trái đất thoát khỏi sự khủng hoảng. Để thu được bioethanol
cần biến đổi nguyên liệu từ thực vật qua các bước như: tiền xử lý bằng hóa chất, sau
đó thủy phân lignocellulose biopolymer thành các đường khử (sử dụng enzym hoặc
hóa chất), rồi lên men các đường khử thành rượu, và cuối cùng là chưng cất và tinh
chế bioethanol [32]. Tuy nhiên, tiền xử lý và sử dụng hóa chất để thủy phân làm giá
thành sản xuất cồn còn cao và gây ảnh hưởng lớn tới môi trường. Do đó mà các nhà
nghiên cứu đang cố gắng sử dụng công nghệ enzym để thực hiện quá trình này, việc
nghiên cứu tạo ra các loại enzym có hoạt lực cao, và phối hợp sử dụng các enzym
như xylanase, cellulase, laccase đang được đẩy mạnh nghiên cứu.
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội

1.7.5. Trong chất hoạt động bề mặt
Alkyl glycoside là một trong những chất quan trọng nhất của các chất hoạt
động bề mặt. Về phương diện thương mại, chúng được sản xuất từ các đường đơn
như là glucose và một rượu béo. Nhưng sự glycosyl hóa sử dụng polysaccharide thì
dễ dàng thực hiện hơn trong sản xuất công nghiệp, bởi vì sự thủy phân của
polysaccharide và các bước tiếp theo có thể được bỏ qua. Xylanase từ
Aureobasidium pullulans được sử dụng cho sự glycosyl hóa của xylan, 1-octanol
and 2-ethyl hexanol thành octyl-β-D-xylobioside, xyloside and 2-ethylhexyl-β-D-
xylobioside tương ứng [31].
1.7.6. Trong tẩy trắng giấy và bột giấy
Sự tiến bộ trong ứng dụng của công nghệ sinh học tới công nghệ sản xuất
giấy và bột giấy đã có những phát triển có ý nghĩa qua những năm gần đây. Một
trong những ứng dụng thành công nhất là việc sử dụng endo-1,4-β-D-xylanase cho
bước tiền xử lý quá trình tẩy trắng bằng Clo và Clo dioxit. Dựa trên nghiên cứu của
một lượng lớn các phòng thí nghiệm và nhà máy, nó đang được thiết lập để tiền xử
lý cho bột giấy kraft với xylanase đã nâng cao một cách có ý nghĩa khả năng tẩy
trắng của bột giấy bằng cách sử dụng các tác nhân tẩy trắng bằng Clo tiếp theo. Lợi
ích có ý nghĩa nhất của việc tẩy trắng tìm thấy từ việc tiền xử lý bằng xylanase là
làm nó sáng hơn, giảm lượng hóa chất tẩy trắng cần thiết mà vẫn cho độ sáng cao,
và giảm lượng hợp chất Clo hữu cơ trong nước thải tẩy trắng. Hiệu quả của tiền xử
lý bằng xylanase dựa trên các tác nhân tẩy trắng có chứa oxy được nghiên cứu với
một bột giấy kraft gỗ mềm. Bột giấy được tiền xử lý với một dung dịch chứa
xylanase 12%. Xử lý enzym cũng làm loại bỏ một lượng nhỏ của lignin làm giảm
giá trị kappa của bột giấy đi 3%. Sự tăng tính nhớt có thể là do các phân tử
polysaccharide khối lượng phân tử cao được làm giàu, diễn ra khi xylan được loại
bỏ [33].
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội

1.8. TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ XYLANASE
Mặc dù tính chịu nhiệt có thể tốt cho quá trình sản xuất của các enzym bền
nhiệt, nhưng nó thường không có tính thực tế bởi năng suất thấp và quá trình lên
men có nhiệt độ cao cần các trang thiết bị đặc biệt. Kỹ thuật gen đã tạo ra được các
sản phẩm mang tính thương mại nhờ việc chuyển gen vào các cơ thể chủ thích hợp
để sản xuất. Sự biểu hiện của các protein ngoại lai vào trong hệ thông prokaryote
được sử dụng một cách rộng rãi nhất bởi khả năng biểu hiện ở mức cao, cả trong
những nghiên cứu cơ bản và trong sản xuất thương mại. Thêm vào đó, tốc độ sinh
trưởng nhanh và sự dễ dàng trong việc nuôi cấy của E. coli khiến nó rất được quan
tâm và trở thành loài được sử dụng để biến nạp gen chủ yếu dùng để sản xuất các
sản phẩm chuyển gen hiện nay. Ngoài E. coli nấm men cũng được sử dụng khá
nhiều để biểu hiện gen.
Một loạt các nghiên cứu gần đây đã tách dòng và biểu hiện xylanase trong
các vật chủ vi khuẩn và nấm men khác nhau. Một số ví dụ, xylanase được tách dòng
vào trong E. coli bao gồm A. oryzae (Kimura cs., 2002), A. pullulans var.
melanigenum (Ohta cs., 2001), Bacillus lyticus (Srivastava and Mukherjee,
2001), Clostridium thermocellum (Fernandes cs., 1999) and Caldocellum
saccharolyticum (Lüthi cs., 1990). Một số xylanase từ A. pullulans var.
melanigenum (Tanaka cs., 2004), T. lanuginosus IOC-4145 (Damaso cs., 2003) và
A. niger (Berrin cs., 2000) được biểu hiện trong Pichia pastoris [31].
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Nguồn phân lập
Mẫu dùng để phân lập nấm mốc là mẫu mốc tương của thị trấn Bần, tỉnh
Hưng Yên, mẫu nước thải nhà máy giấy tại Quảng Ninh và mẫu gỗ mục tại Thanh
Trì, Hà Nội.

Bảng 3. Nguồn phân lập nấm mốc
Mẫu Thời gian lấy Số lần lấy Địa điểm
Gỗ mục 25-08-2008
12-11-2008
2 Xã Vạn Phúc,
Thanh Trì, Hà Nội
Đất tại hồ xử lý
nước thải nhà máy
giấy
14-12-2007
09-03-2008
2 Nhà máy giấy
Quảng Ninh
Mốc tương 10-04-2008
23-05-2008
16-06-2008
3 Thị trấn Bần,
Hưng Yên
2.1.2. Hóa chất
 Các hóa chất dùng trong phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc và cảm ứng
sinh xylanase:, Birchwood xylan của Fuka, Các hóa chất axit 3,5-
dinitrosalisilic, saccharose , NaNO
3
, KCl, Fe
2
SO
4
, MgSO
4
, KH

2
PO
4
, cao nấm
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
men, saccharose, aga, axit 3,5-dinitrosalisilic, CH
3
COOHNa,… từ Trung
Quốc
 Hóa chất dùng để tách chiết DNA tổng số, điện di DNA, của hãng sigma,
Merk: Tris base, Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), CTAB, NaCl, β-
mercaptoethanol, Sodium dodecyl sulphate (SDS), Natri axetat, etanol 100%,
etanol 70%, Clorofoc:isoamyalcohol (24:1), agarose, ethydium bromide
(EtBr),
 Hóa chất dùng trong khi thực hiện phản ứng PCR gồm: 4 loại
deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP), MgCl
2
và Taq polymerase
(Fermentas), primer được tổng hợp từ công ty Sigma
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng thuộc phòng thí nghiệm Vi sinh và kỹ thuật di truyền và
phòng thí nghiệm công nghệ cao thuộc Viện công nghệ Sinh học-công nghệ thực
phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội, bao gồm:
• Các loại cân điện tử
• Nồi khử trùng (Nhật bản)
• Tủ cấy vô trùng
• Máy khuấy trộn Vontex (Rotolab, OSI)

• Micropipet các loại (Biohit)
• Máy đo pH (Mettler Toledo)
• Máy ổn nhiệt
• Máy li tâm (Eppendorf, CHLB Đức)
• Máy li tâm lạnh (Avanti TM 30 Centifuge Beckman)
• Hệ thống điện di (Bio-Rad)
• Bộ điện di DNA (Advance Tech, Nhật bản)
• Máy soi chụp ảnh gel.
• Máy PCR Biorad, USA.
• Tủ lạnh sâu -20
o
C, -85
o
C (Sanyo, Nhật bản)
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân lập
Để tiến hành phân lập các chủng nấm mốc, sử dụng môi trường Czapek với
thành phần:
NaNO
3
: 3 g KH
2
PO
4
: 1 g
MgSO

4
7H
2
O : 0,5 g KCl : 0,5 g
FeSO
4
: 0,01 g Saccharose : 30 g
Cao nấm men : 5 g Aga : 20 g
Nước : 1000 ml,
thanh trùng ở điều kiện nhiệt độ 121
o
C trong thời gian 20 phút.
Các mẫu phân lập được nghiền bằng cối vô trùng sau đó hòa tan bằng nước
cất thanh trùng. Pha loãng rồi hút khoảng 100 µl dịch, trang đều trên mặt thạch.
Nuôi ở 30
o
C trong thời gian 48 giờ. Sau đó chuyển các chủng nấm mốc có khuẩn
lạc riêng rẽ vào các ông nghiệm thạch nghiêng của môi trường Czapek.
2.2.2. Xác định hoạt tính xylanase trên môi trường đặc
Chủng nấm mốc được cấy chấm điểm trên môi trường Czapek trong đó
saccharose được thay thế bằng xylan với hàm lượng 2 g/l. Nuôi ở 30
o
C trong 3 ngày
sau đó sử dụng lugol và congo đỏ để xác định đường kính thủy phân của enzym
xylanase. Các chủng nấm mốc được lựa chọn dựa vào tỷ lệ giữa đường kính phân
hủy cơ chất và đường kính khuẩn lạc.
2.2.3. Xác định hoạt độ xylanase bằng phương pháp DNS
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với
thuốc thử axit dinitro salicylic. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-

K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
nồng độ đường khử. Biết được mật độ quang của dung dịch đường khử nghiên cứu,
dựa vào đồ thị chuẩn xylose với thuốc thử này suy ra hàm lượng đường khử của
dịch nghiên cứu.
Từ hàm lượng đường khử ta suy ra được hoạt độ của endo-β-1,4-xylanase
với cơ chất là xylan 0,5% pha trong đệm citrate pH=4,5. Phản ứng enzym được tiến
hành ở 50
o
C trong 15 phút.
“Một đơn vị hoạt độ của enzym xylanase được định nghĩa là lượng enzym có khả
năng thủy phân xylan tạo 1 µmol xylose trong thời gian 1 phút ở điều kiện 50
o
C”.
Hình 6. Đường chuẩn xylose theo phản ứng DNS
Công thức tính hoạt độ enzym xylanase:
H =
f
ODkcODtn
×
××
−
1,0150036,0
)(
(U/ml)
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49
61
Đồ án tốt nghiệp Trường đại học Bách Khoa Hà Nội

Trong đó H: hoạt độ enzym xylanase, U/ml
ODtn: giá trị OD của mẫu thí nghiệm đo ở bước sóng 540nm
ODkc: giá trị OD của mẫu kiểm chứng đo ở bước sóng 540nm
0,0036: hệ số của đường chuẩn
15: thời gian phản ứng, phút
0,1: lượng dịch enzym tham gia phản ứng, ml
f: hệ số pha loãng dịch enzym
2.2.4. Phương pháp định tên nấm mốc
Định tên theo phương pháp xác định hình thái:
Nuôi nấm mốc trên môi trường Czapek, quan sát màu sắc bào tử, đặc điểm
khuẩn lạc bằng mắt thường và quan sát hệ sợi, bào tử dưới kính hiển vi quang học
Định tên theo phương pháp sinh học phân tử:
Khuếch đại đoạn DNA chứa vùng ITS1 – 5,8S – ITS2. Trong đó ITS1 là
đoạn DNA nằm giữa vùng gen mã hoá protein 18S và 5,8S của ribosom, 5,8 S là
đoạn gen mã hoá protein 5,8S còn ITS2 là đoạn DNA nằm giữa vùng gen mã hoá
protein 5,8S và 28S của ribosom. ITS1 và ITS2 là đoạn rất biến đổi đối với các loài
khác nhau nên có thể dựa vào trình tự của nó mà xác định được loài nấm mốc
2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA
Nguyên tắc:
Nguyễn Thành Chung Lớp CNSH 2-
K49