xác định hàm lượng protein trong sữa

LOGO
Phương pháp xác định hàm lượng protein trong
sữa
Thực hành phân tích thực phẩm
Trường đại học công nghiệp TP.Hồ Chí Minh
Khoa công nghệ hóa học
GVHD: Th.s Trần Nguyễn An Sa
SVTH: Nguyễn Thị Ngọc Hân 10078541
Trương Công Hoàng 10051801

GVHD Trần Nguyễn An Sa
10/31/14
Nội dung
Một số định nghĩa
Mục đích xác định
Các phương pháp xác định
2
GVHD Trần Nguyễn An Sa
10/31/14
1. Một số định nghĩa

Định lượng protein thô bằng cách xác định lượng nitrogen toàn phần và kết quả nhân với 6,25.

Nitơ tổng số: Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô.

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein.

Nitơ protein: Nitơ có trong thành phần amino acid của protein.
3
GVHD Trần Nguyễn An Sa
10/31/14

1. Một số định nghĩa

Nitơ phi protein: nitơ không có trong thành phần protein.

Đạm tổng số = Nitơ tổng số x hệ số chuyển đổi
4
GVHD Trần Nguyễn An Sa
10/31/14
2. Mục đích xác định
Dựa trên cơ sở định lượng nitrogen để định lượng và đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm protein.
5
GVHD Trần Nguyễn An Sa
10/31/14
3. Các phương pháp xác định
Phương pháp
B
E
C
D
A
Kjeldahl
Lowry
Bradford
Hồng ngoại Quang phổ UV
6
GVHD Trần Nguyễn An Sa
10/31/14
D
B
C

A
Nguyên tắc – PTPƯ
Tóm tắt quy trình
Công thức tính
Lưu ý
Phương pháp
Kjeldahl
3. Các phương pháp xác định
7
3.1 Phương pháp Kjeldahl

Nguyên tắc – PTPƯ

Protein trong sữa kết tủa bằng acid TCA. Lọc tủa

Vô cơ hóa mẫu : bằng H
2
SO
4
đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác:
H
2
SO
4
 H
2
O + SO
2
+1/2O
2

2NH
3
+ H
2
SO
4
 (NH
4
)
2
SO
4


Chưng cất đạm: đuổi NH
3
ra khỏi dung dịch bằng NaOH và hấp thu bằng dung dịch H
3
BO
3
bão hòa:
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH  Na
2
SO

4
+ 2NH
3
+ H
2
O
NH
3
+ H
3
BO
3
 NH
4
H
2
BO
3
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
8
3.1 Phương pháp Kjeldahl

Nguyên tắc – PTPƯ

Chuẩn độ dung dịch bằng HCl với hỗn hợp chỉ thị metyl đỏ và bromocresol xanh. Điểm dừng: xanh
chàm  tía nhạt
H
2
BO

3
─
+ H
+
 H
3
BO
3

Hoặc cho NH
3
sinh ra hấp thu vào một lượng chính xác H
2
SO
4
dư và chuẩn lượng dư H
2
SO
4
bằng
NaOH với chỉ thị Tashiro:
NH
3
+ H
2
O + H
2
SO
4
 (NH

4
)
2
SO
4
+ H
2
O + H
2
SO
4
dư
H
+
+ OH
─
 H
2
O
Điểm dừng : tím hồng  xanh lá mạ
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
9
3.1 Phương pháp Kjeldahl

Các chỉ thị có thể sử dụng: có pT = 5- 5,5

Tashiro (0,15g MR + 0,05g methylenxanh)/100ml ethanol, pT= 5,4

MR: pT = 5, vàng – đỏ


Bromocresol xanh : KĐM = 3,8 – 5,4 ; vàng – xanh biển
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
10
3.1 Phương pháp Kjeldahl

Tóm tắt quy trình

Chuẩn lại HCl 0,1N bằng Na
2
B
4
O
7
0,1N

Pha dung dịch Na
2
B
4
O
7
.10H
2
O : cân 3,814g định mức 200ml.Từ lượng cân tính lại nồng độ
Na
2
B
4

O
7

Pha HCl : hút 1,7ml HCl đặc định mức 200ml
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
11
3.1 Phương pháp Kjeldahl

Tóm tắt quy trình

Chuẩn lại HCl 0,1N bằng Na
2
B
4
O
7
0,1N
10ml Na
2
B
4
O
7
erlen
Chuẩn bằng HCl vừa
pha
2 giọt MR
Dừng: vàng  đỏ
Ghi V

HCl
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
12
3.1 Phương pháp Kjeldahl

Tóm tắt quy trình

Giai đoạn kết tủa protein
10/31/14 GVHD Trần Nguyễn An Sa13
3.1 Phương pháp Kjeldahl

Giai đoạn vô vơ hóa mẫu
10/31/14 GVHD Trần Nguyễn An Sa
14

Giai đoạn chưng cất
3.1 Phương pháp Kjeldahl
10/31/14 GVHD Trần Nguyễn An Sa15

Giai đoạn chuẩn độ
3.1 Phương pháp Kjeldahl
10/31/14 GVHD Trần Nguyễn An Sa16
3.1 Phương pháp Kjeldahl
Không mẫu trắng
N(%) =

Công thức tính
Có mẫu trắng
N(%) =

Hàm lượng protein: %protein = %Nx6,38
Hấp thu bằng H
3
BO
3
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
17
3.1 Phương pháp Kjeldahl
Công thức tính
N(%) =

Hàm lượng protein: %protein = %Nx6,38
Hấp thu bằng H
2
SO
4
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
18
3.1 Phương pháp Kjeldahl

Lưu ý:

Thận trọng đối với TCA CCl
3
COOH, độc,tính hủy hoại, dễ chảy, cháy , tránh ánh sáng và ẩm. Nên
đeo kính bảo vệ và găng tay.


NaOH, H
2
SO
4
đặc gây bỏng.

Xúc tác CuSO
4
cũng như K
2
SO
4
nâng nhiệt độ vô cơ hóa mẫu.

Dung dịch chuẩn HCl 0.1N được chuẩn lại bằng Na
2
B
4
O
7.

Kiểm tra đáy của bình kjeldahl trước khi cho mẫu và thuốc thử.
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
19

Nguyên tắc
Đo màu của sản phẩm khử của PMo -phosphowolframate
(thuốc thử Folin – Ciocalteau) với phức hợp Cu – protein.
Phức màu xanh tạo thành có thể đo ở bước sóng 675 nm.

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ
protein.
Dựa vào đồ thị chuẩn protein (albumin) ta có thể tính được hàm lượng
Protein trong mẫu nghiên cứu.
3.2 Phương pháp lowry
10/31/14 GVHD Trần Nguyễn An Sa20
3.2 Phương pháp lowry

Phạm vi ứng dụng
•
Xác định được nhiều loại protein khác nhau.
•
Độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1g/ml.
•
Cường độ màu tùy thuộc nhiều vào loại protein.
•
Cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch.
10/31/14 GVHD Trần Nguyễn An Sa21
3.3 Phương pháp Bradford

Phương pháp Bradford

Nguyên tắc: trích ly protein từ mẫu bằng dung môi trích ly, dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp
thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Khi chưa kết
hợp với protein λ
max
= 465nm; khi kết hợp với protein λ
max
= 595nm. Đo độ hấp thu => hàm lượng
protein.

10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
22
3.3 Phương pháp Bradford

Phương pháp Bradford
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
23
3.3 Phương pháp Bradford

Phương pháp Bradford

Cách tiến hành: xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng
độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch
protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo
mật độ quang hỗn hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế.
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
24
3.3 Phương pháp Bradford

Phương pháp Bradford
8
10/31/14
GVHD Trần Nguyễn An Sa
25