Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM




LÊ THỊ HỒNG TRANG




TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi
CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





Thái Nguyên – 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM



LÊ THỊ HỒNG TRANG



TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi
CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC
Mã số: 60.42.01.21




Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS. TS Chu Hoàng Mậu



Thái Nguyên - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, một số kết quả
cộ . Mọi trích dẫn trong luận văn
đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực, một phần đã đƣợc công bố trên Tạp chí Khoa học-Công nghệ
đồng tác giả, phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận
tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thu Hiền, Trƣờng Đại học Y-Dƣợ
ững ý kiến quý báu
và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệ ề tài luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền &
Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm –Đại học Thái
Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng – KTV phòng Công nghệ tế bào thực
vật, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí
nghiệm của đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu K
& Nhân văn miền núi đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học
tập và hoàn thành khoá học.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến bố mẹ, anh chị cùng bạn bè đã động viên,
khuyến khích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.
-
- .
Tác giả


Lê Thị Hồng Trang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………
i
LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………….
ii
MỤC LỤC………………………………………………………………
iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT …………… …………………
v
DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH………………………………………………
viii

MỞ ĐẦU……………………………………………………………
1
.
1
.
2

2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………
3
1.1. Cây đậu tƣơng………………………………………………………
3
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm nông sinh học của đậu tƣơng……………
3
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và trong nƣớc………
7
1.2. Bệnh khảm và virus gây bệnh khảm SMV, BYMV………………
10
1.2.1. Bệnh khảm đậu tƣơng…………………………………………….
10
1.2.2. Virus gây bệnh khảm SMV và BYMV…………………………
11
1.3. Kỹ thuật RNAi……………………………………………………
12
1.3.1. Cơ chế ức chế gen của kỹ thuật RNAi……………………………
12
…
14
…………
16

1.4.1. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen vào mô đích…………
16
1.4.2. Chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens …………………
17
1.4.3. Hệ thống tái sinh và hệ thống chọn lọ ……….
19
1.4.4.
22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP…………………………
24
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ…………………………
24

24
.………………………………………………………….
25
2.1.3. Thi
25

25
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………….
26
2.2.1. Phƣơng pháp tạo vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp…………….
26
2.2.2. Phƣơng pháp gây tổn thƣơng nách lá mầm……………………….
27

2.2.3. Phƣơng pháp tái sinh cây đậu tƣơng từ nách lá mầm…………….
28
2.2.4. Phƣơng pháp lây nhiễm và tạo cây đậu tƣơng chuyển gen……….
28
2.2.5. Phân tích cây đậu tƣơng chuyển gen……………………………
32
2.2.6. Phƣơng pháp xác định hiệu suất chuyển gen…………………….
34
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
35
3.1. KẾT QUẢ TẠO A. TUMEFACIENS MANG VECTOR CHUYỂN
GEN pK7GW-CPi (SMV-BYMV)……………………………………

35
3.2.
……

37
3.3.
TƢƠNG
41
3.3.1. Tái sinh in vitro và chuyể -
giống đậu tƣơng ĐT12 và DT2008
41
3.3.2. 0
46
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
51
CÔNG
52

TÀI LIỆU THAM KHẢO
53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AS
Acetosyringone
A. tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
BAP
6-Benzyl Amino Purine
Bp
Base pair (cặp base)
BYMV
Bean yellow mosaic virus
CCM
Cocultivation medium
CP
Coat protein (protein vỏ)
CTAB
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
cs
Cộng sự
ĐC
Đối chứng
EDTA
Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid
FAO
Food and Agriculture Organization of the United Nations

(Tổ chức lƣơng thực và nông nghiệp liên hợp quốc)
GA3
Gibberellic acid
GM
Môi trƣờng nảy mầm
gus
Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase
hpRNA
Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc)
IhpRNA
Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron)
IAA
Indoleacetic acid
IBA
Indole-3butyric acid
Kb
Kilo base
Km
Kanamycin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


LB
Luria and Bertani
MS
Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
NAA
α-Naphthaleneacetic acid
PCR

Polymerase chain reaction
RISC
RNA-inducing silencing complex
RM
Môi trƣờng ra rễ
RNA
Ribonucleic acid
RNAi
RNA interference
SIM
Môi trƣờng tạo chồi
SEM
Môi trƣờng kéo dài chồi
siRNA
Short interfering RNA
SMV
Soybean mosaic virus
TAE
Tris Acetate EDTA
Taq
Thermus aquaticus
Ti- plasmid
Plasmid tạo khối u
T
0,
T
1
Các thế hệ cây đậu tƣơng chuyển gen
T
0

Cây đậu tƣơng chuyển gen tái sinh chồi
T
1
Hạt của cây chuyển gen T
0
nảy mầm thành cây T
1
Vir
Virulence Region
v/p
Vòng/phút
YEP
Yeast extract peptone


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC BẢNG



Trang
Bảng 1.1.
Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới từ năm 2008 đến
2012………………………………………………………….

8
Bảng 1.2.
ậu tƣơng củ ố
nƣớc đứng đầu thế giớ 2010, 2011, 2012

8
Bảng 1.3.
Sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2007 – 2013…………….
9
Bảng 2.1.
Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro………………
29
Bảng 2.2.
Thành phần đệm tách DNA tổng số…………………………
32
Bảng 2.3.
Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
33
Bảng 2.4.
Thành phần của phản ứng PCR
33
Bảng 3.1.
Ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm
đến khả năng tạo đa chồi…………………………………….

38
Bảng 3.2.
- -
A. tumefaciens
……………………………………………


43
Bảng 3.3.

Khả năng phát sinh chồi, kéo dài chồi và khả năng ra rễ của
hai giống ĐT12 và DT2008 trong quá trình chuyển gen

44
Bảng 3.4

49






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


DANH MỤC CÁC HÌNH



Trang
Hình 1.1.
Cấu trúc hệ gen của SMV…………………………………
11
Hình 1.2.
Cơ chế RNA can thiệp………………………………………
13
Hình 2.1.
Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
26

Hình 2.2.
Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tƣơng…
30
Hình 3.1.
Kết quả điệ ản phẩm colony-PCR trực tiếp từ
khuẩn lạc……………………………………………………

36
Hình 3.2.

37
Hình 3.3.
Kết quả gây tổn thƣơng, tạo đa chồi nách lá mầm bằng các
phƣơng thức khác nhau ở hai giống ĐT12 và DT2008……

39
Hình 3.4.
Kết quả tái sinh và chuyển gen ở giống đậu tƣơng ĐT12 và
DT2008

42
Hình 3.5.
Kết quả tỷ lệ tạo đa chồi, kéo dài chồi và đƣa cây ra giá thể…
45
Hình 3.6.
ổng số tách từ
Đ 2008

46
Hình 3.7.

ện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấ
- ậu tƣơng chuyể
12


47
Hình 3.8.
ện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu
trú - ậu tƣơng
chuyể 2008


48


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỞ ĐẦU

1.
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae), đây
là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị dinh dƣỡng và kinh tế cao. Ở Việt Nam,
theo số liệu thống kê chính thức của Chính phủ, đậu tƣơng đƣợc trồng ở 25 tỉnh
trên cả nƣớc, trong đó 65% ở miền Bắc và 35% ở miền Nam. Tuy nhiên, sản
lƣợng đậu tƣơng vẫn còn thấp và còn phải nhập khẩu từ các nƣớc khác để đáp
ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc [54]. Hạn chế lớn nhất đối
với sự phát triển của đậu tƣơng là dễ bị nhiễm virus, các bệnh do virus gây ra
thƣờng không gây chết cây nhƣng làm giảm năng suất và chất lƣợng của cây
trồng. Bệnh khảm lá đậu tƣơng và khảm vàng đậu tƣơng là hai bệnh hại có
triệu chứng gần giống nhau, xuất hiện phổ biến ở cây đậu tƣơng do soybean

mosaic virus (SMV) và bean yellow mosaic virus (BYMV) gây ra.
virus này thuộc nhóm potyvirus, có vật liệu di truyền là sợi đơn RNA [56].
Chúng lan truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới, số lƣợng vật chủ trung gian càng
nhiều thì tỷ lệ nhiễm bệnh càng lớn, bệnh xuất hiện càng sớm thì sẽ dẫn đến
thất thu càng nặng. Những biện pháp thƣờng sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng
này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ mà không thể chống
lại triệt để.
Hiện nay, nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, ngƣời ta đã
tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh bằng
cách đƣa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gen) của virus vào hệ gen của
thực vật. hành công đầu ở cây thuốc lá và cây cà chua kháng lại
virus khảm thuốc lá, đu đủ kháng lại virus bệnh đốm vòng
. Bên cạnh đó, kỹ thuật RNAi (RNA interference)
đƣợc biết đến là một kỹ thuật hiện đại và chống lại các bệnh do
virus gây ra ở thực vật. Cấu trúc RNAi chứa trình tự gen lặp lại đảo chiều của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

virus mục tiêu đƣợc sử dụng để chuyển vào cây, nó sẽ đƣợc biểu hiện thành
RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen và
kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Nhiều
giống cây trồng kháng đƣợc các loại bệnh virus khác nhau đã đƣợc tạo ra bằng
kỹ thuật chuyển gen RNAi, nhƣ cây đậu tƣơng chuyển gen
kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%,
cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dƣa chuột (CMV), kháng virus
khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 lo i virus này [5], [13], [26].
Đây là tiền đề quan trọng giúp mở ra khả năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen
RNAi trên các loại cây trồng quan trọng khác [55].
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Tạo cây đậu
tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của hai loài

SMV và BYMV”.
2. Mục tiêu nghiên cứu

.
3. Nội dung nghiên cứu
cấu trúc RNAi A. tumefaciens vi khuẩn tái tổ hợp;
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của phƣơng thức gây tổn thƣơng nách lá mầm
đạt hiệu quả tạo đa chồi và kéo dài chồi cao nhất;
3.3. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô nách lá mầm và tạo
cây đậu tƣơng chuyển gen;
3.4. Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật
PCR.





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm nông sinh học của đậu tƣơng
Đậu tƣơng có bộ NST 2n = 40, tên khoa học là Glycine max (L) Merrill,
thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bƣớm (papilionideae) và bộ
Phaseoleae. Đậu tƣơng có thể đƣợc phân loại theo đặc điểm thực vật học, theo
thời gian sinh trƣởng và theo thời vụ là một trong số những cây
trồng có lịch sử lâu đời nhất của loài ngƣời.
Dựa vào sự đa dạng về hình thái của hạt, Fukuda (1933) và nhiều nhà

khoa học đã thống nhất cây đậu tƣơng có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung
Quốc) xuất phát từ một loại đậu tƣơng dại, thân mảnh, dạng dây leo, có tên
khoa học là Glycile Soja Sieb và Zucc. Từ Trung Quốc đậu tƣơng đƣợc lan
truyền sang các nƣớc Đông Nam châu Á dần khắp thế giới,
đƣợc nông dân các nƣớc châu Á coi đây là một trong các cây trồng chính [11].
Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc trồng đã lâu đời, từ thế kỷ 13 Lê Quý Đôn
đã ghi trong “Vân đài loại ngữ” là cây đậu tƣơng đƣợc trồng ở một số tỉnh vùng
Đông Bắc, miền Bắc nƣớc ta [1], [4]. Mặc dù, đƣợc trồng từ rất sớm nhƣng chỉ
trong vài chục năm gần đây đậu tƣơng mới đƣợc quan tâm, phát triển và ngày
nay nó đƣợc xem là một giống cây trồng có giá trị dinh dƣỡng cao, chiếm một
vị trí quan trọng trong nền kinh tế. Nhƣng diện tích trồng và sản lƣợng chƣa
cao so với các nƣớc trên thế giới
Cây đậu tƣơng thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu hạt bao
gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt [4], [58]:
Rễ cây đậu tƣơng gồm rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30-50
cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ. Bộ rễ của đậu tƣơng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

có nhiều nốt sần là kết quả cộng sinh của một loại vi sinh vật hình que có tên
khoa học là Rhizobium japonicum với rễ cây đậu tƣơng. Trong một nốt sần có
khoảng 3 - 4 tỷ vi sinh vật, mà ta chỉ có thể nhìn thấy chúng qua kính hiển vi
phóng đại 600 - 1000 lần nên đậu tƣơng có vai trò cải tạo đất rất tốt, 1 ha trồng
đậu tƣơng nếu sinh trƣởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N.
Thân cây đậu tƣơng thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều
lông nhỏ. Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang
màu nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc
của hoa sau này. Sự khác biệt của cây đậu tƣơng với cây trồng khác là khi cây
ra hoa rộ lại là lúc thân cành phát triển mạnh nhất. Đây là giai đoạn hai quá
trình sinh trƣởng sinh dƣỡng và sinh trƣởng sinh thực cạnh tranh nhau dẫn đến

khủng hoảng thiếu dinh dƣỡng, cho nên cần phải cung cấp đầy đủ dinh dƣỡng
trƣớc khi vào thời kỳ này và tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển thuận lợi.
Cây đậu tƣơng có 3 loại lá là lá mầm, lá nguyên và lá kép. Lá mầm (lá tử
diệp) khi mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì
chuyển sang màu xanh. Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dƣỡng nuôi
cây mầm, cho nên khi trồng đậu tƣơng nên làm đất tơi nhỏ và chọn hạt to cây
sẽ mọc khoẻ, sinh trƣởng tốt. Lá nguyên (lá đơn) xuất hiện sau khi cây mọc từ
2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau. Lá đơn to màu
xanh bóng là biểu hiện cây sinh trƣởng tốt. Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của
một giống có khả năng chịu rét. Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh
trƣởng không bình thƣờng. Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá kép
mọc so le thƣờng có màu xanh tƣơi khi già biến thành màu vàng nâu. Lá có
nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu hạn
khoẻ nhƣng thƣờng cho năng suất thấp. Những giống lá to chống chịu hạn kém
nhƣng thƣờng cho năng suất cao hơn. Nếu 2 lá kép đầu to và dày thƣờng biểu
hiện giống có khả năng chống chịu rét.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Hoa đậu tƣơng nhỏ, không hƣơng vị, thuộc loại hoa đồng chu lƣỡng tính
trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1
nhụy. Màu sắc của hoa thay đổi tuỳ theo giống và thƣờng có màu tím, tím nhạt
hoặc trắng. Đa phần các giống có hoa màu tím và tím nhạt. Hoa phát sinh ở
nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa ra nhiều nhƣng tỷ lệ rụng rất cao khoảng
30% có khi lên tới 80% [1].
Số quả biến động từ 2 đến 20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới 400
quả trên một cây. Một quả chứa từ 1 tới 5 hạt, nhƣng hầu hết các giống quả
thƣờng từ 2 đến 3 hạt. Hạt đậu tƣơng có nhiều hình dạng khác nhau: Hình tròn,
hình bầu dục, tròn dẹt,… Giống có màu vàng giá trị thƣơng phẩm cao. Trong
hạt, phôi thƣờng chiếm 2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối

lƣợng hạt. Hạt to nhỏ khác nhau tuỳ theo giống, khối lƣợng một nghìn hạt thay
đổi từ 20-400 g trung bình từ l00-200 g [4], [58].
Chu kì sống của cây đậu tƣơng đƣợc chia ra 5 giai đọan phát triển là giai
đoạn nảy mầm – cây con; giai đoạn sinh trƣởng thân, lá; giai đoạn ra hoa; giai
đoạn hình thành quả, hạt và giai đoạn chín [4].
Giai đoạn nảy mầm – cây con đƣợc tính từ khi gieo hạt giống xuống đất,
hạt hút ẩm trƣơng lên, rễ mọc ra, thân vƣơn lên đội hai lá mầm lên khỏi mặt
đất, lá mầm xòe ra, thân mầm tiếp tục phát triển thành thân chính. Trong giai
đoạn này cây con chủ yếu sống dựa vào nguồn chất dinh dƣỡng dự trữ ở hai lá
mầm, đến khi hết chất dinh dƣỡng các lá mầm này chuyển dần sang màu vàng
rồi rụng và đồng thời cùng lúc đó mà bộ rễ phát triển đủ khả năng hút nƣớc và
chất dinh dƣỡng để nuôi cây. Giai đoạn này dài hay ngắn tùy thuộc ở điều kiện
ngoại cảnh. Nếu gieo vào vụ hè thì giai đoạn này ngắn hơn giai đoạn ở vụ
đông. Thông thƣờng thời gian này khoảng 15 – 20 ngày sau khi gieo. Thời kì
này chính là thời kì quyết định mật độ của cây con cũng nhƣ sức sinh trƣởng
của cây đậu tƣơng sau này.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Kể từ khi cây con ra đƣợc 1 – 2 lá kép thì bắt đầu giai đoạn sinh trƣởng
của thân và lá kéo dài tới khi cây bắt đầu ra hoa. Thời kỳ đầu của giai đoạn này
cây con sinh trƣởng rất chậm, trong khi đó rễ của nó lại phát triển nhanh cả về
chiều sâu lẫn chiều ngang, các nốt sần đƣợc hình thành và phát triển, mở đầu
cho hoạt động cố định đạm khí trời để cung cấp cho cây. Đến thời kì cây chuẩn
bị ra nụ, ra hoa thì tốc độ sinh trƣởng của cây tăng lên nhanh. Chính lúc này là
mấu chốt để tạo ra thân cây to, mập, các đốt ngắn. Giai đoạn này dài hay ngắn
cũng tùy thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện ngoại cảnh, nhƣng nói chung vào
khoảng 20 – 40 ngày.
Khác với một số cây khác là cây đậu tƣơng khi đã ra hoa thì các bộ phận
khác nhƣ rễ, thân, lá vẫn tiếp tục sinh trƣởng và phát triển. Giai đoạn này sinh

trƣởng dài hay ngắn tùy thuộc vào đặc tính của giống là chín sớm hay muộn.
Thời kì này cây đậu tƣơng rất mẫn cảm với điều kiện khí hậu thời tiết bất thuận
nhƣ mƣa to, gió lớn, khô, nóng, lúc đó mặc dù số hoa của mỗi cây có rất
nhiều nhƣng kết quả cuối cùng là số hoa đƣợc thụ phấn và kết quả sẽ rất ít, vì
thông thƣờng 75% số hoa thƣờng bị thui và rụng
Quả đậu tƣơng đầu tiên đƣợc hình thành trong vòng 7–8 ngày kể từ lúc
hoa nở. Trong điều kiện bình thƣờng sau khoảng 3 tuần lễ là quả phát triển đầy
đủ. Lúc các chùm quả non đã xuất hiện thì các chất dinh dƣỡng trong lá đƣợc
vận chuyển về nuôi hạt làm cho hạt nảy mầm. Vào thời kì này sự sinh trƣởng
của cây chậm lại dần. Các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm trong giai đoạn này sẽ có
tác động rất lớn đến tốc độ phát triển của quả và hạt.
Khi hạt đã phát triển đạt đến kích thƣớc tối đa, các khoang hạt đã kín,
quả đã đủ mẩy thì cây ngừng sinh trƣởng. Khi các hạt đã rắn dần và đạt đến độ
chín sinh lý vỏ hạt có màu sắc đặc trƣng của giống, còn vỏ quả thì chuyển dần
sang màu vàng, vàng tro, xám, lá của cây cũng chuyển dần sang úa vàng và
rụng dần. Hàm lƣợng dầu trong hạt đƣợc ổn định sớm vào thời kì hạt đang phát

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

triển nhƣng hàm lƣợng protêin thì vẫn còn chịu ảnh hƣởng của điều kiện dinh
dƣỡng của cây cho đến cuối thời kì của quá trình chín.
Một số sinh thái cũng không nhỏ
của cây đậu tƣơng . Đất trồng
đậu tƣơng thích hợp nhất là đất thịt nhẹ, tơi xốp, sâu màu, thoáng, thoát nƣớc,
pH từ 6,5-7,2. T ừng giai đoạn sinh trƣởng, phát triển cây đậu tƣơng có
yêu cầu nhiệt độ khác nhau: Thời kỳ mọc nhiệt độ thích hợp nhất là 18-22
o
C,
phạm vi nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho thời kỳ mọc là 10
o

C và 40
o
C. Nhiệt độ
thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng cành lá là 20-23
o
C, thấp nhất là 15
o
C, cao
nhất là 37
o
C. Nhiệt độ thấp ảnh hƣởng đến ra hoa kết quả; nhiệt độ dƣới 10
o
C
ngăn cản sự phân hoá hoa, dƣới 18
o
C đã có khả năng làm cho quả không đậu.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho thời kỳ ra hoa là 22-25
o
C. Nhiệt độ thích hợp nhất
cho thời kỳ hình thành quả và hạt là 21-23
o
C, thấp nhất là 15
o
C cao nhất là
35
o
C. Thời kỳ chín nhiệt độ thích hợp nhất là 19-20
o
C. Nhiệt độ 25-27
o

C hoạt
động của vi khuẩn nốt sần tốt nhất. Hạt nảy mầm đòi hỏi độ ẩm đất 60-65%.
Nhu cầu nƣớc của cây đậu tƣơng thay đổi tuỳ theo điều kiện khí hậu, kỹ thuật
trồng trọt và thời gian sinh trƣởng. Đậu tƣơng có phản ứng với độ dài ngày, các
giống khác nhau phản ứng với độ dài ngày khác nhau [53].
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và trong nƣớc
Đậu tƣơng là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế
giới, đứng hàng thứ tƣ sau cây lúa mì, lúa nƣớc và ngô. Do khả năng thích ứng
rộng nên nó đã đƣợc trồng ở khắp năm châu lục, nhƣng tập trung nhiều nhất ở
châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là châu Á. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế
giới trong những năm gần đây đƣợc thể hiện trong bảng 1.1.



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Bảng 1.1. đậu tương trên thế giới từ năm
2008 đến 2012
Năm
Diện tích (triệu ha)
Năng suất (tạ/ha)
Sản lƣợng (triệu tấn)
2008
96,45
23,98
231,26
2009
99,32
22,49
223,40

2010
102,61
25,85
265,25
2011
103,60
25,32
262,35
2012
105,00
23,03
241,84
*Nguồn: số liệu thống kê của FAOSTAT, 2012, ( [59].
Hàng năm, trên thế giới trồng khoảng 105 triệu ha với năng suất bình
quân khá cao 23-25 tạ/ha đã tạo ra một sản lƣợng đậu tƣơng gấp hơn 2 lần so
với 20 năm về trƣớc (năm 1990: sản lƣợng đậu tƣơng là 108,46 triệu tấn).
Trong đó các nƣớc trồng đậu tƣơng đứng hàng đầu trên thế giới về diện tích
gieo trồng và sản lƣợng là Mỹ, Braxin và Trung Quốc (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. ậu tương của số nƣớc
đứng đầu thế giới trong 2010, 2011, 2012
Nƣớc
Năm 2010
Năm 2011
Năm 2012
Diện
tích
Năng
suất
Sản
lượng

Diện
tích
Năng
suất
Sản
lượng
Diện
tích
Năng
suất
Sản
lượng
Mỹ
31,00
29,22
90,60
29,86
28,20
84,19
30,80
26,64
82,05
Braxin
23,33
29,47
68,76
23,97
31,12
74,82
24,98

26,37
65,85
Trung
Quốc
8,52
17,71
15,08
7,89
18,36
14,49
6,75
18,96
12,80
*Nguồn: số liệu thống kê của FAOSTAT, 2012, ( [59]
* Đơn vị:Diện tích (triệu/ha), Năng suất (tạ/ha), Sản lượng (triệu tấn)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Ở nƣớc ta, cây đậu tƣơng đã đƣợc trồng rất sớm từ khi còn là một cây
hoang dại sau đó đƣợc thuần hoá và đƣa vào trồng nhƣ một cây có giá trị kinh
tế cao. Tuy nhiên, trƣớc cách mạng tháng 8/1945 diện tích trồng đậu tƣơng còn
ít đạt 32 ha (1944), năng suất thấp 4,1 tấn/ha.
Sau khi đất nƣớc thống nhất diện tích và năng suất đậu tƣơng đã tăng lên
đáng kể. Những năm gần đây, diện tích đậu tƣơng đã đƣợc mở rộng [1], [11].
Tuy nhiên, năng suất đem lại chƣa cao và sản lƣợng còn thấp. Tình hình sản
xuất đậu tƣơng của nƣớc ta trong những năm gần đây đƣợc thể hiện qua bảng
1.3.
Bảng 1.3. Sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2007 – 2013

2007

2008
2009
2010
2011
2012
*
2013
*
Diện tích canh tác (nghìn ha)
190,1
192,1
146,2
197,8
173,6
200
230
(tấn/ha)
1,45
1,39
1,46
0,02
1,46
1,5
1,52
Tổng sản lƣợng (nghìn tấn)
275,5
267,6
213,6
296,9
254,2

300
350
*Nguồn: Tổng cục thống kê * số liệu dự báo. [60]
Nhìn chung, quy mô sản xuất đậu tƣơng trong nƣớc còn tƣơng đối nhỏ
và không đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc. Diện tích đất trồng và sản
lƣợng biến đổi theo từng năm do điều kiện thời tiết mƣa to kéo dài, diện tích bị
thu hẹp. Sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc ta năm 2011 giảm 14% so với năm 2010
xuống còn 254,2 nghìn tấn. Bên cạnh đó, cùng với nhịp độ tăng dân số và việc
thay đổi tập quán sử dụng dầu thực vật thay mỡ động vật, thì nhu cầu dầu thực
vật đặc biệt là dầu đậu tƣơng sẽ tăng lên, nhƣ vậy việc phát triển sản xuất đậu
tƣơng trong nƣớc là rất cần thiết.
Theo số liệu thống kê chính thức, đậu tƣơng đang đƣợc trồng tại 25 trong
số 63 tỉnh thành cả nƣớc, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại
các khu vực phía Nam. Đầu năm 2012, Thủ tƣớng Chính phủ cũng đã phê
duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển sản xuất ngành nông nghiệp đến năm 2020

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

và tầm nhìn đến năm 2030. Theo đó, diện tích đất quy hoạch đậu tƣơng khoảng
100 ngàn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm 2020 diện tích gieo trồng
khoảng 350 ngàn ha, sản lƣợng 700 ngàn tấn; vùng sản xuất chính là đồng bằng
sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên.
1.2. B NH KHẢM DO SMV
1.2.1. Bệnh khảm trên cây đậu tƣơng
Bệnh khảm đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Mỹ vào những năm đầu của thập
niên 1900, là một trong những bệnh xuất hiện và gây thiệt hại ở nhiều nơi trồng
đậu tƣơng trên thế giới. Khi bị nhiễm bệnh năng suất có thể giảm trên 25%.
Mức độ của bệnh tùy thuộc vào giống và khí hậu tuy nhiên ở nhiệt độ cao bệnh
không biểu hiện triệu chứng ra ngoài. Bệnh xuất hiện càng sớm sẽ dẫn đến thất
thu càng nặng. Khi nhiễm bệnh lá bị mất màu, loang lổ giống nhƣ tấm khảm, lá

nhỏ lại, phát triển không đều, bìa lá cong xuống làm lá biến dạng. Phiến lá bị
xếp nếp nhăn nhúm, có màu loang lổ xanh nhạt và xanh đậm và thƣờng dày
hơn lá bình thƣờng. Dọc gân lá, mô tế bào nổi rộp lên những mụn màu xanh
đậm. Cây lùn do các lóng thân phát triển kém. Trái và hạt phát triển chậm lại,
nhất là các trái ở phần trên của cây. Trái chín chậm, hạt nhỏ, vỏ hạt bị đổi thành
màu nâu nhạt và đậm không đều từ tễ hạt lan ra. Triệu chứng bệnh đƣợc biểu
hiện rõ ở 18,5
0
C và trên 29,5
0
C triệu chứng bệnh sẽ ở dạng tiềm ẩn [10], [39],
[57].
Ở đậu tƣơng, bệnh khảm phát triển mạnh vào vụ đông giai đoạn cây ra
hoa, hình thành quả và gây hại nặng trên những ruộng đậu tƣơng chăm sóc
kém, bón nhiều đạm hoặc phân không cân đối. Virus gây bệnh khảm do SMV
và BYMV là một trong những bệnh virus điển hình nhất ở đậu tƣơng. Chúng có
hình sợi mềm, thuộc nhóm Potyvirus. Virus có thể lan truyền qua 16 loại rệp
thuộc họ Aphididae pisum, Aphisfabae, Myrus persicae là những loài rệp
truyền bệnh chính. Sự lây lan từ cây bệnh sang cây khỏe do rệp muội ở ngoài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

đồng vẫn là chủ yếu, ngoài ra bệnh còn truyền qua hạt, đôi khi có tới 30% số
hạt giống thu từ các cây bị bệnh có chứa virus trong hạt [65].
1.2.2. Virus gây bệnh khảm
SMV và BYMV . SMV
thuộc chi potyvirus, họ potyviridae, đƣợc phát hiện lần đầu tiên bởi Clinton
(1915), Gardener và Kendrick (1921) tại Hoa Kỳ.
1.1).

Hình 1. 1. Cấu trúc hệ gen của potyvirus [66]
Các hộp khác nhau đề cập đến các gen khác nhau
(UTR) vùng 5 'và 3': vùng chưa dịch mã;
CP: protein vỏ của virus;
Nib: RNA polymerase phụ thuộc RNA;
P1, P3, Nia: protease;
CI: protein hình trụ;
VPg: protein liên kết;
HC-Pro: thành phần trợ giúp và protease.

SMV sinh ra thể vùi trong tế bào cây bệnh. Thể vùi có dạng hình múi
khế hay hình chong chóng. Thời gian tồn tại của virus trong cây bệnh là 2-5
ngày, nhiệt độ mất hoạt tính Q
10
là 55-70
0
C. Khi bị chiếu tia cực tím virus bị
mất hoạt tính trong hai giờ. Độ pH thích hợp là 6. Nhiệt độ thích hợp để virus
nhân lên trong tế bào cây bệnh là 21-26
0
C. Tại Hoa Kỳ, SMV đã đƣợc phân
thành chín chủng bằng cách sử dụng các phản ứng di truyền trên tám giống cây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

trồng đậu tƣơng. Các chủng hiện đang đƣợc biết đến là từ G1 đến G7, G7a, và
C14. SMV có dạng hình sợi mềm với chiều dài khoảng 750nm, đƣờng kính
khoảng 11-15nm. Axit nucleic là RNA dạng sợi đơn, phân tử lƣợng 3,25 x 106
Kda, tổng kích thƣớc bộ gen khoảng 10,4 Kb. Thành phần bộ gen bao gồm
24,3% G; 29,9% A; 14,9% C và 30,9% U [17]. Hệ gen của SMV gồm các gen

mã hóa cho 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polipeptid .
Ngoài SMV, BYMV cũng gây nên bệnh khảm ở đậu tƣơng
. Trƣớc đây, bệnh khảm vàng lá do BYMV gây ra
thƣờng bị nhầm lẫn với bệnh khảm do SMV gây ra và sau này mới đƣợc xác
nhận là do virus khác gây ra. Bệnh này tƣơng đối ít nghiêm trọng hơn bệnh
khảm, hầu nhƣ cây vẫn tăng trƣởng và cho năng suất bình thƣờng. BYMV là
một loại virus thuộc chi potyvirus, họ potyviridae, có vật liệu di truyền là sợi
đơn RNA. So với phần lớn các potyvirus BYMV có phạm vi ký chủ rất rộng
trên toàn thế giới, có khả năng lây nhiễm bệnh vào cả các cây họ đậu và không
thuộc họ đậu. BYMV có dạng sợi mềm, có chiều dài khoảng 750 nm, đƣờng
kính 15 nm. Hệ gen chứa 9547 nucleotide không bao gồm đuôi polyA, khung
đọc mở (ORF) có 9168 nucleotide bắt đầu ở vị trí 206 và kết thúc ở vị trí 9374,
có khả năng mã hóa cho một polyprotein với 3056 acid amin [22]. BYMV
không đƣợc mang truyền qua hạt giống mà chỉ có thể lan truyền qua các loài
rầy mềm nhƣ: Aphis tabae Seop. và Macrosiphum pisi Kalt. Virus này có một
số dạng chuyên tính khác nhau, gây ra các triệu chứng bệnh khác nhau chút ít
và có thể chịu đƣợc độ pha loãng 1:1000 và mất hoạt tính ở 56-60
o
C [57].
1.3. KỸ THUẬT RNAi
1.3.1. Cơ chế ức chế gen
Năm 1998, hai nhà khoa học Mỹ là Fire và Mello đã công bố phát hiện
của họ về một cơ chế có thể làm suy biến mRNA đƣợc sao mã từ một gen xác
định và họ gọi đó là “RNA can thiệp”. Cơ chế này đƣợc kích hoạt khi các phân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

tử RNA kép (dsRNA) xuất hiện trong tế bào. Khi đó chuỗi dsRNA kích hoạt
“cỗ máy” sinh hoá, làm suy biến các phân tử mRNA đƣợc sao mã di truyền từ
DNA không đƣợc chức năng mã. Với việc khám phá ra cơ chế

can thiệp RNA Fire Mello đã giành Giải Nobel Y học năm 2006 [52].

Hình 1.2. Cơ chế RNA can thiệp

Các phần tử quan trọng tham dự vào cơ chế can thiệp RNA này là hai
enzymes, Dicer và Argonaute, và những RNA kích thƣớc nhỏ (siRNA) đƣợc
tạo ra từ RNA sợi đôi (dsRNA). Khi có sự xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA
vào tế bào, Dicer lập tức cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn
hơn, khoảng 21-23 nucleotide, gọi là siRNA. Sau khi bị cắt ngắn bởi Dicer,
chuỗi kép RNA can thiệp đƣợc tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn
RNA với đầu 5’ có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất đƣợc chọn để tiếp
tục liên kết với Argonaute. Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA này xảy ra trong
phức hệ RISC (RNA-induced silencing complex), trong đó có chứa Argounaute
và Helicase. Phức hệ RISC sau đó thu nhận các phân tử phiên mã mRNA của tế
bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn RNA can thiệp lúc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

này đang có mặt trong phức hệ RISC. Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt
cặp các bases tƣơng đồng với trình tự của si RNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng
giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA. Phức hệ RISC sẽ cắt mRNA, làm phân tách
phân tử mRNA mà không giải mã nên không có protein nào đƣợc tổng hợp hay
nói cách khác làm cho RNA bị suy thoái [21].
RNAi đóng vai trò rất quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhiễm của
các virus vào cơ thể vật chủ. Bên cạnh đó RNAi còn đƣa ra nhiều ứng dụng thú
vị trong kỹ thuật gen tạo ra những cơ hội mới trong nghiên cứu sinh học y
dƣợc, kỹ thuật gen và chăm sóc sức khỏe. Khám phá ra RNAi không chỉ cung
cấp cho chúng ta một công cụ thí nghiệm mạnh mẽ mới để nghiên cứu chức
năng của các gen mà còn có nhiều tiềm năng trong những ứng dụng tƣơng lai
của can thiệp RNA trong y học, sinh học.

Dựa vào hoạt động của cơ chế RNAi, có thể thiết kế các vector chuyển
gen mang cấu trúc RNAi có khả năng ức chế hoạt động của gen ngoại lai, nhằm
tạo giống cây chuyển gen kháng bệnh virus hữu hiệu. Vector mang gen là đoạn
cDNA có nguồn gốc từ RNA của virus. Chúng đƣợc đƣa vào tế bào vật chủ để
khi virus xâm nhiễm, các đoạn cDNA này sẽ bắt cặp bổ sung và cắt phân tử
mRNA của virus thành những siRNA dẫn tới không tổng hợp đƣợc protein và
không biểu hiện bệnh.
RNAi là một hiện tƣợng phổ biến xảy ra ở sinh vật nhân chuẩn và đóng
vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh họ đặc biệt là quá trình kháng
virus. Gần đây, RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại
các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế
hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại
virus ở thực vật [14]. Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng
chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hoá protein vỏ CP, enzyme phiên
mã RdRp ) có khả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc chứng minh bằng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau
nhƣ: Potato virus Y PVY cucumber mosaic virus CMV, Plum pox potyvirus
PPV Tobaco mosaic virus TMV và Potato virus Y PVY [16], [41], [45], [50]
Cho đến nay, đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus đƣợc
công nhận và trồng thƣơng mại nhƣ: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng
(papaya ringspot virus, PRSV) đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc,
Philippine [6]; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus,
Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đƣợc công nhận và
trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, đƣợc
công nhận và trồng ở Trung Quốc… Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng
chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để đƣợc

công nhận là giống cây trồng thƣơng mại nhƣ: Sắn chuyển gen kháng African
cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus
(Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus
X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus);
Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển
gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus) [37]
Ở đậu tƣơng, đã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen
trong việc nâng cao tính chống chịu bệnh đã đạt đƣợc kết quả. Năm 2007,
Bonfim và cộng sự đã tạo ra đƣợc một dòng cây đậu chuyển gen kháng virus
BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93% [26]. Lim và cs
(2007) nghiên cứu chuyển gen HC-pro vào cây đậu tƣơng đã nhận thấy rằng,
cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV sau 2 tuần triệu chứng nhiễm bệnh khảm
lá do SMV biến mất và lƣợng SMV đã giảm đáng kể, tuy nhiên HC-Pro của
SMV đã gây biến đổi hình thái lá và giảm sự tạo hạt ở các cây đậu tƣơng
chuyển gen [28].