Nghiên cứu hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của loài thông lá dẹt (pinus krempfii lecomte) và ngũ gia bì hương (acanthopanax trifoliatus l merr )

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM


VIỆN HOÁ HỌC




LÊ THỊ HỒNG NHUNG








NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA LOÀI THÔNG LÁ DẸT (
PINUS KREMPFII
LECOMTE) VÀ

NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (
ACANTHOPANAX TRIFOLIATUS
L. MERR.).

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC















Hà Nội – Năm 2014
2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng có ai công bố trong các công trình
nghiên cứu trước đây.

Tác giả luận án


Lê Thị Hồng Nhung














3

LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tôi
đã nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cô, các nhà khoa học cũng
như đồng nghiệp, bạn bè và người thân.
Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến PGS. TS. Trịnh
Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi, tận tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận
án.
Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TSKH. Trần Văn Sung đã tạo điều kiện tốt

nhất để tôi được học tập, nghiên cứu tại Phòng Tổng hợp hữu cơ và cũng là người
đã ủng hộ tôi thực hiện luận án này.
Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ –
Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành
bản luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã
giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương
trình đào tạo.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội
cùng Ban lãnh đạo Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời
gian học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng
nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà nội, ngày……. tháng…… năm 2014
Tác giả luận án
4

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ………….……………………………….……… v
DANH MỤC CÁC HÌNH ………………………………………….…… vi
DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………… … iix
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………ix
MỞ ĐẦU………….……………………………….……………… … ……… 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về hai loài nghiên cứu 3
1.1.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) 3
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật loài Thông lá dẹt 3
1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu loài Thông lá dẹt 4

1.1.1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Pinus 5
1.1.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) 8
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương 8
1.1.2.2. Ứng dụng trong y học dân gian của loài Ngũ gia bì hương 9
1.1.2.3. Tình hình nghiên cứu của loài Ngũ gia bì hương 9
1.2. Các hợp chất flavonoid 14
1.2.1. Cấu trúc hóa học 14
1.2.2. Hoạt tính sinh học 16
1.3. Các hợp chất triterpene khung lupane 19
1.3.1. Cấu trúc hóa học 19
1.3.2. Hoạt tính sinh học 19
1.4. Chuyển hóa hóa học hợp chất triterpene khung lupane và hoạt tính sinh
học của chúng 22
1.4.1. Chuyển hóa nhóm OH 22
1.4.1.1. Chuyển hóa thành ester 22
1.4.1.2. Chuyển hoá thành ketone, acid, oxime, amine 24
1.4.1.3. Chuyển hóa thành carbamate 26
1.4.2. Chuyển hoá nhóm isopropenyl 27
5

1.4.2.1. Khử hoá nối đôi ∆ 20(29) 27
1.4.2.2. Oxy hoá nối đôi ∆ 20(29) 28
1.4.2.3. Chuyển hoá ở vị trí allyl của nối đôi 28
1.4.3. Chuyển hóa nhóm 28-COOH 29
1.4.3.1. Chuyển hóa thành ester 29
1.4.3.2. Chuyển hóa thành amide 30
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 32
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 32
2.1.1. Nguyên liệu 32

2.1.2. Hóa chất 32
2.1.3. Thiết bị 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu 33
2.2.1.Phương pháp chiết tách 33
2.2.1.1. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Thông lá dẹt 33
2.2.1.2. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Ngũ gia bì hương 34
2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc 34
2.2.3.Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 35
2.2.3.1. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis 35
2.2.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào 35
2.2.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa 37
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 39
3.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) 38
3.1.1. Cặn chiết n-hexane 40
3.1.2. Cặn chiết ethyl acetate (EtOAc) 40
3.1.2.1. Phân lập chất 40
3.1.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được 42
3.1.3. Cặn chiết n-buthanol (n-BuOH) 43
3.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) 45
3.2.1. Phân lập các hợp chất từ loài Ngũ gia bì hương 45
6

3.2.1.1. Quá trình phân lập 45
3.2.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được 48
3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của hai chất AT1, AT2 48
3.2.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 48
3.2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 57
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64
4.1. Kết quả từ loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) 64
4.1.1. Thành phần hóa học của cặn n-hexane 64

4.1.2. Các chất phân lập được từ cặn EtOAc 65
4.1.2.1. Tectochrysin (PK1) 65
4.1.2.2. Pinostrobin (PK2) 68
4.1.2.3. Pinobanksin (PK3) 71
4.1.2.4. Galangin (PK4) 75
4.1.2.5. Strobopinin (PK5) 78
4.1.2.6. Crytostrobin (PK6) 82
4.1.3. Chất phân lập được từ cặn chiết n-BuOH 85
4.2. Kết quả từ loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L. Merr.) . 92
4.2.1. Các hợp chất được phân lập và xác định từ loài Ngũ gia bì hương. 92
4.2.1.1. 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1) 92
4.2.1.2. 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2) 95
4.2.1.3. 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3) 98
4.2.2. Các dẫn xuất chuyển hóa hóa học của hợp chất AT1, AT2 105
4.2.2.1. Các dẫn xuất của AT1 106
4.2.2.2. Các dẫn xuất của AT2 112
4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và chuyển hóa hóa học.117
4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào 117
4.3.2. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis 119
4.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa 120
BẢNG TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN HÓA HOÁ
HỌC TỪ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU………….… … 122
7

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128
CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 132
TÀI LIỆU THAM KHẢO 133
PHỤ LỤC

8

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang





Sơ đồ 1.1
Ester hoá acid betulinic ở vị trí 3
β
-OH tạo các hợp chất
56.1–56.8
22
Sơ đồ 1.2
Ester hoá betulinic acid ở vị trí 3
β
-OH tạo hợp chất 57
23
Sơ đồ 1.3
Chuyển hóa nhóm 3
β
-OH, 28-OH của betulin
23
Sơ đồ 1.4 Chuyển hóa nhóm 28-OH của betulin tạo dẫn xuất 64, 65 24
Sơ đồ 1.5
Chuyển hoá nhóm 3
β

-OH của betulinic acid thành ketone,
oxime, amine.
25
Sơ đồ 1.6 Tổng hợp acid betulinic từ betulin 25
Sơ đồ 1.7 Tổng hợp các dẫn xuất carbamate của betulinic acid 26
Sơ đồ 1.8 Chuyển hóa các dẫn xuất carbamate của betulin 27
Sơ đồ 1.9
Khử hoá nối đôi
∆
20(29) của betulinic acid
27
Sơ đồ 1.10
Oxi hóa nối đôi
∆
20(29) của betulinic acid
28
Sơ đồ 1.11 Chuyển hóa vị trí allyl của nối đôi tạo hợp chất 85- 87 29
Sơ đồ 1.12 Tổng hợp một số dẫn xuất este của 23-hydroxy betulinic acid 30
Sơ đồ 1.13 Tổng hợp dẫn xuất A43-D của betulinic acid 31
Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết rễ Thông lá dẹt 39
Sơ đồ 3.2 Phân lập các chất từ cặn chiết EtOAc của rễ Thông lá dẹt 41
Sơ đồ 3.3 Phân lập chất PK7 từ cặn chiết n-BuOH của rễ Thông lá dẹt 44
Sơ đồ 3.4 Quy trình chiết mẫu Ngũ gia bì hương 45
Sơ đồ 3.5 Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichlorometan của loài
Ngũ gia bì hương
47
Sơ đồ 4.1 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 106
Sơ đồ 4.2 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 112
9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Ảnh cây và tiêu bản của loài Thông lá dẹt 4
Hình 1.2 Hình ảnh về loài Ngũ gia bì hương 8
Hình 1.3 Vòng benzopyrano của hợp chất flavonoid 14
Hình 4.1 Phổ khối ESI-MS (positive) của chất PK1 67
Hình 4.2. Phổ
1
H-NMR của chất PK1 (500 MHz, DMSO-d
6
) 67
Hình 4.3 Phổ
13
C-NMR và DEPT của chất PK1 (125 MHz, DMSO-d
6
) 68
Hình 4.4 Phổ
1
H-NMR của chất PK2 (500 MHz, CD
3
OD) 70
Hình 4.5 Phổ
1
H-NMR (giãn) của chất PK2 (500 MHz, CD
3
OD) 70
Hình 4.6 Phổ
13

C-NMR và DEPT của chất PK2 (125 MHz, CD
3
OD) 71
Hình 4.7 Phổ khối FT-IR của chất PK3 73
Hình 4.8 Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất PK3 73
Hình 4.9 Phổ
1
H-NMR của chất PK3 (500 MHz, CD
3
OD) 74
Hình 4.10 Phổ
1
H-NMR (giãn) của chất PK3 (500 MHz, CD
3
OD) 74
Hình 4.11 Phổ
13
C-NMR của chất PK3 (125 MHz, CD
3
OD) 75
Hình 4.12 Phổ ESI-MS (positive ion) của chất PK4 77
Hình 4.13 Phổ
1
H-NMR của chất PK4(500 MHz, CD
3
OD) 77
Hình 4.14 Phổ
13
C-NMR của chất PK4 (125 MHz, CD
3

OD) 78
Hình 4.15 Phổ FT-IR của chất PK5 80
Hình 4.16 Phổ
1
H-NMR của chất PK5 (500 MHz, CD
3
OD) 81
Hình 4.17 Phổ
1
H-NMR (giãn) của chất PK5 (500 MHz, CD
3
OD) 81
Hình 4.18 Phổ
13
C-NMR và DEPT của chất PK5 (125 MHz, CD
3
OD) 82
Hình 4.19 Phổ
1
H-NMR của chất PK6 (500MHz, CD
3
OD) 84
Hình 4.20 Phổ
1
H-NMR (giãn) của chất PK6 (500MHz, CD
3
OD) 84
Hình 4.21 Phổ
13
C-NMR và DEPT của chất PK6 (125MHz, CD

3
OD) 85
Hình 4.22 Một số tương tác chính trong phổ HMBC của chất PK7 86
Hình 4.23 Một số tương tác chính trong phổ NOESY của chất PK7 87
Hình 4.24 Chất burselignan (PK7a) 87
10

Hình 4.25 Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất PK7 88
Hình 4.26 Phổ
1
H NMR của chất PK7 (500 MHz, CD
3
OD) 89
Hình 4.27 Phổ
13
C và DEPT của chất PK7 (125 MHz, CD
3
OD) 89
Hình 4.28 Phổ HSQC của chất PK7 90
Hình 4.29 Phổ HMBC của chất PK7 90
Hình 4.30 Phổ NOESY của chất PK7 91
Hình 4.31 Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất AT1 94
Hình 4.32 Phổ
1
H-NMR của chất AT1 (500 MHz, CDCl
3
) 94
Hình 4.33 Phổ
13
C-NMR và DEPT của chất AT1 (125MHz, CDCl

3
) 95
Hình 4.34 Phổ ESI-MS (positive ion) của chất AT2 97
Hình 4.35 Phổ
1
H-NMR của chất AT2 (500 MHz, CDCl
3
) 97
Hình 4.36 Phổ
13
C-NMR và DEPT của chất AT2 (125MHz, CDCl
3
) 98
Hình 4.37 Các tương tác chính trên phổ COSY, HMBC của chất AT3 100
Hình 4.38 Phổ FT- IR của chất AT3 101
Hình 4.39 Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất AT3 101
Hình 4.40 Phổ
1
H-NMR của chất AT3 (500 MHz, CD
3
OD) 102
Hình 4.41 Phổ
1
H-NMR (giãn) của chất AT3 (500 MHz, CD
3
OD) 102
Hình 4.42 Phổ
13
C-NMR và DEPT của chất AT3 (125 MHz, CD
3

OD) 103
Hình 4.43 Phổ HSQC của chất AT3 103
Hình 4.44 Phổ HMBC của chất AT3 104
Hình 4.45 Phổ COSY của chất AT3 104

11


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số thành phần thường có trong tinh dầu, nhựa của chi
Pinus
6
Bảng 1.2 Một số terpene tiêu biểu được phân lập từ thân gỗ của chi
Pinus
7
Bảng 1.3 Một số khung flavonoid thường gặp 15
Bảng 3.1 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT6, AT7 50
Bảng 3.2 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT10 – AT12 52
Bảng 3.3 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT15 – AT17 55
Bảng 3.4 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT20 – AT23 58
Bảng 4.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của cặn chiết n-
hexane bằng phương pháp GC-MS
64
Bảng 4.2 Số liệu phổ
1
H-,
13

C-NMR của PK1 và tectochrysin 66
Bảng 4.3 Số liệu phổ
1
H,
13
C-NMR của PK2 và pinostrobin 69
Bảng 4.4 Số liệu phổ
1
H,
13
C-NMR của PK3 và số liệu của pinobanksin 72
Bảng 4.5 Số liệu phổ
1
H,
13
C-NMR của PK4 76
Bảng 4.6 Số liệu phổ
1
H-,
13
C-NMR của PK5 và (2S)-Strobopinin 79
Bảng 4.7 Số liệu phổ
1
H-,
13
C-NMR của PK6 và (2S)-Cryptostrobin 83
Bảng 4.8 Số liệu phổ
1
H,
13

C-NMR của PK7, (+)-Isolariciresinol và
Burselignan
87
Bảng 4.9 Số liệu phổ
1
H-,
13
C-NMR của AT1 và 24-nor-11α-hydroxy-
3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid
93
Bảng 4.10 Số liệu phổ
1
H-,
13
C-NMR của AT1 và 24-nor-3α,11α
dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid
96
Bảng 4.11 Số liệu phổ
1
H,
13
C-NMR của AT3 (CD
3
OD, 500/125MHz) 99
Bảng 4.12 Kết quả hoạt tính gây độc tế bào 117
12

Bảng 4.13 Kết quả hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis 119
Bảng 4.14 Kết quả hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH 120
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1
H-NMR Proton Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
13
C-
NMR
Carbon -13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
DEPT Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer
Phổ DEPT
HMBC Heteronuclear Multiple Bond
Correlation
Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt
nhân
HSQC Heteronuclear Single Quantum
Coherence
Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt
nhân
1
H-
1
H-
COSY
1
H-
1

H- Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân
1
H-
1
H
ESI-MS Electron Spray Ionization-Mass
Spectroscopy
Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử
HR-ESI-
MS
High Resolution Electron Spray
Ionization Mass Spectroscopy
Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng
phun mù điện tử
FT-IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại
s singlet
d doublet
t triplet
q quartet
dd doublet of doublet
dt doublet of triplet
br broad
m multiplet
J (Hz) Hằng số tương tác (Hz)

13

δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính
bằng ppm (phần triệu)
CC Column Chromatography Sắc ký cột

SKLM Sắc ký lớp mỏng
KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô
Hep-G2
Hepatocellular carcinoma human

Ung thư gan người
MCF-7 Adeno carcinoma Ung thư vú
Lu Human lung carcinoma Ung thư phổi
RD Human rhabdomyosarcoma Ung thư màng tim
TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-
acetate

IC
50
Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% tế bào thử nghiệm
EC
50
Effective concentration 50% Liều có hiệu quả trên 50% tế bào thử
nghiệm
MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu
Ac CH
3
CO- Acetyl
Me -CH
3
Methyl
Bu -C
4
H
9

Butyl
Et -C
2
H
5
Ethyl
DMSO Dimetylsunfoxit
TMS Tetrametyl Silan
4-DMAP 4-dimetylaminopyridin
THF Tetrahydrofuran
TEA Triethylamine
AZT Azidothymidine
TBDPSCl

Tert-Butyldiphenylchlorosilane
DIBALH Diisobutylaluminium hydride
EDCI 1-Ethyl-3-(3-
14

dimethylaminopropyl)carbodiimide
PL Phụ lục
rt Room temperature Nhiệt độ phòng
H hiệu suất phản ứng
R
f
Retention factor
[α
D
] Năng suất quay cực
LSP Lượng sản phẩm

CTPT Công thức phân tử
KLPT Khối lượng phân tử



15


















16

MỞ ĐẦU

Y học cổ truyền phương Đông có một lịch sử lâu đời và là một kho tàng y
dược phong phú từ hàng nghìn năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học

kỹ thuật nói chung, y học nói riêng, nền y học cổ truyền đang có những đóng góp to
lớn vào việc phòng và chữa bệnh, làm tăng tuổi thọ của con người và nâng cao chất
lượng cuộc sống. Nhiều hợp chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên được sử dụng
làm thuốc có hiệu quả như atermisinin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua
L.) làm thuốc chống sốt rét diệt thể phân liệt, taxol từ cây Thông đỏ (Taxus
Cuspidata) được sử dụng làm thuốc chống ung thư…Ngoài ra, người ta còn có thể
sử dụng dịch chiết của thảo dược làm thực phẩm chức năng trong việc hỗ trợ chữa
bệnh như dịch chiết từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) là thuốc điều
trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) ở nam giới và u xơ tử cung ở
nữ giới, hay gần đây là sản phẩm từ dịch chiết của 7 loại thảo dược quý (Khổ qua,
Dây thìa canh, Hoài sơn, Sinh địa, Thương truật, Linh chi và tảo Spirulina) có khả
năng điều trị đái tháo đường… Với những kết quả đạt được cho thấy việc nghiên
cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và
thực tiễn cao, đặc biệt ở Việt Nam, một nước có thảm thực vật phong phú, có nguồn
tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá.
Ngoài việc phân lập các hợp chất trong thiên nhiên, các nhà khoa học còn
tiến hành chuyển hóa hóa học từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu nhằm tạo ra các
hoạt chất mới có hoạt lực cao hơn, ưu việt hơn, độc tính thấp hơn. Đây cũng là một
phương pháp để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, định hướng cho ngành
hóa dược. Theo thống kê dựa vào đơn thuốc ở Mỹ công bố cho thấy trên 50% loại
thuốc được kê đơn chứa các hoạt chất có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc được tổng hợp
dựa vào cấu trúc của các hợp chất tự nhiên.
Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) thuộc chi Pinus, họ Pinaceae.
Loài này mới chỉ có một công bố duy nhất trên thế giới từ năm 1966 và là một thực
vật đặc hữu của Việt Nam, “hóa thạch sống” hiếm hoi còn sót lại cho đến ngày nay.
17

Việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt
ngoài ý nghĩa về khoa học còn có ý nghĩa rất lớn về mặt xã hội.
Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) thuộc chi

Acanthopanax, họ Araliaceae. Ngay từ những năm 80 của thế kỷ trước, đã có nhiều
công trình công bố về thành phần hóa học của cây này. Nhiều hợp chất triterpene
acid có khung lupan với hàm lượng khá cao đã được phân lập và xác định. Tuy
nhiên, cho đến nay chưa có công trình khoa học nào về nghiên cứu tổng hợp các
dẫn xuất triterpene từ cây này được công bố.
Trên nền tảng đó, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hóa học và thăm
dò hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) và Ngũ
gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)”.
Mục tiêu của luận án:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii
Lecomte)
2. Nghiên cứu chiết tách các chất, đặc biệt là các triterpene khung lupane có
hàm lượng cao từ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) để làm
nguyên liệu cho quá trình chuyển hóa.
3. Tổng hợp các dẫn xuất từ các triterpene phân lập được
4. Khảo sát hoạt tính sinh học như khả năng kháng chủng Bacillus subtilis, khả
năng gây độc với một số dòng tế bào ung thư, khả năng chống oxi hóa của các dịch
chiết và các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu
ứng dụng các hợp chất này trong công nghệ hóa dược.




CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

18

1.1. Tổng quan về hai loài nghiên cứu
1.1.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật loài Thông lá dẹt

Thông lá dẹt hay còn được gọi là Thông hai lá dẹt hay Thông lá dẹp, Thông
Sré (Pinus krempfii, tên đồng nghĩa là Ducampopinus krempfii (Lecomte) A. Chev),
thuộc chi Pinus, họ Thông Pinaceae. Loài này được ví như “sứ giả thời tiền sử” -
sinh cùng thời với khủng long, là một thực vật cổ “hóa thạch sống” hiếm hoi còn sót
lại cho đến ngày nay. Hiện tại, Thông hai lá dẹt được xếp ở loài hiếm, mức độ đe
dọa có thể bị tuyệt chủng (bậc R) do nạn săn lùng của sơn tràng và do môi trường
sống của chúng (rừng) bị thu hẹp đáng kể. Loài thông cổ với đặc trưng là có hai lá
dẹt hình lưỡi kiếm, là loài đặc hữu của Việt Nam, nó phân bố hẹp ở tỉnh Lâm Đồng
và đây là loài thông được nhiều nhà thực vật học trên thế giới hết sức quan tâm [1],
[2], [3], [4].
Thông lá dẹt là những cây đại thụ cao trên dưới 30m, đường kính có thể đạt
1,5-1,6m, đôi khi tới 2m. Tán của cây thường khá rộng, dày, sẫm màu và có hình rẻ
quạt. Đoạn thân dưới cành lớn, hầu như không có cành nhánh, tròn đều và đâm
thẳng vào tán lá. Cây mầm thường có khoảng 10-13 lá mầm đầu tiên có hình xoắn
cong về một hướng như lưỡi liềm, lá dài khoảng 2-3cm, sau đến là các lá nhỏ mọc
quanh thân, dài 1,5-2,5cm. Khi cây ở độ tuổi non (5-20 tuổi), lá dài và rộng bản (dài
10-15cm) hơn lá cây trưởng thành, xếp như hai lưỡi kéo ở phần đầu cành. Khi cây
trưởng thành, lá nhỏ và ngắn lại (dài 4-5cm), màu sẫm, mọc thành búi dày ở đầu
cành, làm cho tán cây thông già trở nên dày và sẫm màu hơn [3].
Hạt màu nâu nhạt và có cánh trắng khi chín, hạt có thể phát tán trong một
phạm vi tương đối rộng và nón quả còn tồn tại một thời gian trên cây. Quả chín vào
mùa mưa.
19


Hình 1.1. Ảnh cây và tiêu bản của loài Thông lá dẹt
(lưu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam)
Trong công trình Thực vật học đại cương của Đông Dương, Hickel cho biết
thông lá dẹt thường gặp ở độ cao 1200 - 1500m và cây mọc thành quần thụ lớn. Ở
Việt Nam, Thông lá dẹt phân bố chính ở Lâm Đồng, song nơi dễ tiếp cận nhất là

vùng Cổng Trời, trên dãy Hòn Nga thuộc xã Lát, huyện Lạc Dương, cách thành phố
Đà Lạt 20km hoặc vùng núi Bidoup nằm trong khu bảo tồn thiên nhiên Thượng Đa
Nhim, địa phận Long Lanh, cách thành phố Đà Lạt 50km.
1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
loài Thông lá dẹt
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, mới chỉ có duy nhất một công trình
nghiên cứu về thành phần hóa học loài này của Holger Erdtman, Thụy Sĩ được công
bố vào năm 1966. Từ thân gỗ Thông lá dẹt thu tại Nha Trang, Việt Nam, 10 chất là
chrysin (5,7-dihydroxyflavone) (1), strobopinin (2), cryptostrobin (3),
demethoxymatteucinol (6,8-dimethylpinocembrin) (4), pinosylvin (5), pinosylvin
monomethylether (6), tectochrysin (7), pinobanksin (8), pinocembrin (9),
pinostrobin (10) đã được nhóm nghiên cứu này phân lập và nhận dạng [4]. Điều thú
20

vị là tất cả các hợp chất này đều thuộc nhóm flavanoid. Trong đó, các hợp chất C-
methyl flavanoid như 2, 3, 4, 8, 9 là các hợp chất có cấu trúc thú vị [4],[5]:
RO
HO
5:
R=H
6:
R=Me
O
O
HO
OH
H
R
H
8:

R=OH
9:
R=H
OOH
O O
7
OOH
O O
10
O
O
HO
OH
1
O
O
HO
OH
H
H
H
2
H
3
C
O
O
HO
OH
H

H
H
4
H
3
C
CH
3


Bên cạnh đó, thành phần chính của nhựa gỗ được xác định là dehydroabietic
acid và của tinh dầu là các monoterpenoid, thành phần đặc trưng có mặt trong hầu
hết tình dầu của các loài thông, đặc biệt là α- và β-pinen.
1.1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của chi Pinus
Trong khi loài Thông lá dẹt mới chỉ được nghiên cứu rất ít thì có nhiều loài
thuộc chi Pinus lại có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần và hoạt tính sinh
học đã được công bố và cho thấy có nhiều điều thú vị ở chi này. Theo thống kê trên
thế giới đến năm 2012 có trên 450 hợp chất được phân lập từ hơn 80 loài thuộc chi
21

Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpene (diterpene
khung abietane, cembrane; lignan; steroid….), phenol, flavonoid và flavonoid
glycoside [5], [6].
Hầu hết các loài thông đều có chứa tinh dầu và nhựa. Thành phần chính là
các acid thuộc khung abietane, pimarane và monoterpenoid đặc trưng như α,β-
pinene, có thể còn có β- phellandrene (P. contorta, P. banksiuna). Tuy nhiên, ở một
số loài P. sylvestris, P. albicaulis lại thấy có sự xuất hiện của sesqui- và diterpene
như (+)-δ-cadinene, (-)-torreyol. Đặc biệt, loài P. jefieyi có thể sản sinh ra loại nhựa
mà thành phần chính của nó là n-heptane, một hợp chất không có sự liên quan nào

đến các hợp chất terpene.





torreynol
H
H
H
OH

Bảng 1.1. Một số thành phần thường có trong tinh dầu, nhựa của chi Pinus
Một điều thú vị là thân gỗ của hầu hết các loài Pinus nghiên cứu đều có chứa
các hợp chất flavonoid như pinosylvin (5), pinobanksin (8), pinocembrin (9), và các
dẫn xuất monomethyl của chúng. Ngoài ra, phần lớn các hợp chất xác định được từ
chi này là các hợp chất terpene như thunbergene được phân lập từ hai loài P.
22

thunbergii, P. Albicaulis và lambertianic, communic acid – hai diterpene khung
labdane có mặt trong các loài P. lambertiana, P. Elliottii tương ứng. Từ hạt của P.
sylvestris, hai diterpene acid khung labdane là pinifolic và dehydropinifolic acid
cũng được phân lập. Một chất mới thuộc nhóm này, anticopalic acid đã được tìm
thấy trong dịch chiết từ vỏ cây và gỗ của loài thông trắng P. monticola.

Bảng 1.2. Một số terpene tiêu biểu được phân lập từ thân gỗ của chi Pinus
Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi này
cũng được công bố.
Hoạt tính sinh học của các loài này được các nhà khoa học đánh giá cao là
khả năng chống oxi hóa. Từ vỏ của loài P. radiata và P. pinaster đã phân lập được
procyanidin, catechin và gallic acid - các hợp chất được biết đến với khả năng
chống oxi hóa [7], [8], [9]. Trong một công trình công bố năm 2012 của Osman
Ustun cho thấy tinh dầu của năm loài P. brutia, P. halepensis, P. nigra, P. pinea và
P. sylvestris đều cho hoạt tính chống oxi hóa [10].
Năm 2012, Ipek Suntar và cộng sự còn phát hiện khả năng chống viêm của
23

tinh dầu một số loài thuộc chi này như P. brutia Ten., P. halepensis Mill., P. nigra
Arn., P. pinea L. và P. sylvestris L. [11].
Ngoài ra, tinh dầu của một số loài khác như P. halepensis Mill., P.
densiflora, P. thunbergii, P. rigida lại cho thấy khả năng kháng vi sinh vật rất tốt
[12], [13].
1.1.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương
Ngũ gia bì hương có tên khoa học là Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.,
thuộc chi Acanthopanax, họ Araliaceae. Cây bụi trườn, vươn cao hay dài đến 2-7m,
có phân cành,vỏ lúc non màu xanh, khi già
màu nâu xám, có nhiều gai nhọn sắc; cuống dài
2,5-3,5 cm, có gai; 3-5 lá chét, từ hình trứng
thuôn có mép khía răng khô đến hình thuôn dài
ở mép có gai nhọn (var. setosus Li), lá chét
giữa thường lớn hơn các lá chét bên; kích
thước lá chét thường 4-8 x 1,5-3 cm. Cụm hoa
dạng chùm tán, mọc ở đầu cành; hoa màu vàng
ngà hay trắng ngà, có cuống mảnh, dài 0,7-1

cm. Đài 5, nhỏ; cánh hoa 5 hình tam giác tròn
đầu. Nhị 5, chỉ nhị dài hơn cánh hoa. Bầu 2 ô,
đầu nhụy chẻ đôi. Quả hình cầu, hơi dẹt, khi
chín màu tím đen. 1-2 hạt nhỏ. Vỏ thân, vỏ rễ
và lá vò nát có mùi thơm đặc biệt [14], [15],
[16].
Hình 1.2. Hình ảnh về loài Ngũ
gia bì hương [14]
Ngũ gia bì hương phân bố ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, các nước Đông
Dương cho tới Philippin. Ở Việt Nam có gặp ở Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Cao
Bằng, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Hòa Bình. Mọc ở rừng rậm nhiệt đới thường xanh mưa
mùa ẩm, ở độ cao 200 - 1500m. Cây thích nghi ở ven suối, vách đá ẩm, ven đường
24

mòn. Lúc nhỏ ưa bóng và ẩm, khi lớn ưa sáng và có thể sống trong điều kiện khắc
nghiệt về đất đai và khí hậu. Tái sinh bằng chồi, rễ và giâm cành. Mùa hoa tháng 7 -
9; mùa quả chín tháng 12.
1.1.2.2. Ứng dụng trong y học dân gian của loài Ngũ gia bì hương
Trong y học, loài này được dân gian sử dụng để chữa nhiều loại bệnh khác
nhau. Vỏ, rễ, thân, lá làm thuốc bổ, tăng lực, mạnh gân cốt, kích thích tiêu hóa, ăn
ngon miệng, ngủ tốt, chữa đau nhức xương, mỏi gối, đau lưng, thấp khớp, ho, cảm
mạo, viêm ruột, đi tả, sỏi thận.
Vỏ được coi như một vị thuốc bổ. Nước sắc và rượu chế từ vỏ cây được dùng
phổ biến làm thuốc bổ nâng cao sức của các cơ, tăng trí nhớ, ngoài ra còn dùng làm
thuốc chữa bệnh phụ khoa, chữa đàn ông liệt dương, chữa các bệnh dạ dày, nhất là
nó còn có hiệu lực để chữa bệnh chậm lớn của trẻ em. Vỏ ngâm rượu cũng dùng
chữa bệnh tê thấp.
Rễ và cành lá dùng chữa: 1. Cảm mạo sốt cao, ho, đau ngực; 2. Đau lưng,
phong thấp đau nhức khớp; 3. Đau dạ dày, viêm ruột, đau bụng tiêu chảy; 4. Vàng
da, viêm túi mật; 5. Sỏi niệu đạo, bạch đới; 6. Gãy xương, viêm tuyến vú. Dùng 30 -

60g, sắc uống; 7. Dùng ngoài chữa đòn ngã, eczema, mụn nhọt và viêm mủ da. Rễ
tươi và lá được giã đắp ngoài hoặc nấu nước rửa, tắm.
Cành nhỏ nấu lên rửa, tắm chữa ngứa, ghẻ. Rễ và lá của nó cùng với hoa cúc
trắng giã nhỏ đắp mụn nhọt và nứt kẽ chân cũng có công hiệu [14], [15], [16].
1.1.2.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của loài Ngũ gia bì hương
Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
loài cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) đã được các nhà
khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam công bố.
a. Thành phần hóa học
Các kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều hợp chất thuộc nhóm chất triterpene
đã được tìm thấy từ loài cây này.
25

Năm 1971, các nhà khoa học của Đại học Quốc gia Đài Loan đã nghiên cứu
về thành phần của loài này thu hái ở Taipei - Đài Loan. Từ dịch chiết MeOH, các
hợp chất (1,2,3,4,5,6)-cyclohexanehexol (scyllitol, 11) và myo-inositol (12) đã được
phân lập. Cũng chính từ cặn chiết này khi hòa tan trong nước và chiết phân lớp với
benzene nhóm tác giả đã phân lập được taraxerol (13), β-sitosterol (14), các ankan
C
29
– C
33
, hai rượu béo triacontanol (15) và dotriacontanol (16) [17].



Từ lá của loài này thu hái gần Hà Nội, Ph.D.Ty và cộng sự đã phân lập và
xác định được năm triterpene acid khung lupane mới 17-21 là 3α,11α-dihydroxy-
23-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid (17); 3α, 11α-dihydroxylup-20(29)-en-28-oic

acid (18); 30α, 11α,23-trihydroxylup-20(29)-en-28-oic acid (19) và hai hợp chất
nor-triterpene: 24-nor-3α, 11α-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid (20); 24-nor-
11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid (21). Và cũng từ các chất phân lập
được, nhóm nghiên cứu đã tạo được 17 các dẫn xuất khác nhau bằng các phản ứng
este hóa, ankyl hóa,… [18], [19], [20].