Công nghệ biểu hiện gen trên nấm men

CÔNG NGHỆ GEN
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc
NHÓM : 3
LỚP: 52CNSH
TOPIC
TOPIC
TỔNG QUAN
Saccharomyces cerevisiae (???!!!)
I
II
TẠO DÒNG TẾ BÀO NẤM MEN BIỂU
HIỆN α-AMYLASE CHỊU NHIỆT
TRÊN BỀ MẶT TẾ BÀO
NỘI DUNG
NỘI DUNG

Là sinh vật nhân chuẩn, có thể nuôi cấy với quy
mô lớn, cấu trúc gen đã được giải trình vào năm
1996 kích thước 1,35×10
7
I. Tổng quan
I. Tổng quan
1. Đặc điểm nấm men

Có đặc tính không gây
bệnh, không tạo nội độc tố,
có quá trình ứng dụng lâu
dài trong thực phẩm nên
S.cerevisiae được xếp vào
nhóm sinh vật an toàn
GRAS.


So với tế bào hữu nhũ, tế
bào nấm men sinh trưởng
tương đối nhanh.

Có khả năng tạo sinh khối lớn, thao tác di
truyền đơn giản, protein sản phẩm được tiết
ra môi trường nên thu hồi dễ dàng.

Có các cải biến sau dịch mã (đường hóa,
phosphoryl hóa) để tạo protein có đầy đủ hoạt
tính sinh học
2. Các loại vector

Hầu hết các vector sử dụng trong tế bào
nấm men là những vector vận chuyển mà nó
có thể sao chép trong cả E.coli và
S.cerevisiae.

Các loại vector:
•
Vector sát nhập YIp
•
Vector YEp (plasmid 2 µm)
•
Vector YRp
•
Vector YCp
•
Vector YAC

1
Vector sát
nhập YIp
2
Vector YEp
2 loại vector thường
dùng
Vector sát nhập YIp

Vector sát nhập có tính bền vững cao, chỉ
mất 1% qua 1 thế hệ, không cần áp lực chọn
lọc.

Sự sát nhập vector vào bộ gen của nấm
men xảy ra nhờ sự trao đổi chéo giữa vector
và nhiễm sắc thể tạo nên 2 dạng DNA tương
đồng mang ở giữa nó là trình tự DNA của
vector.

Tần số sát nhập khoảng 1-10 thể biến
nạp/µg DNA
vector YEp (plasmid 2 µm)

S. cerevisiae có thể chứa plasmid tự nhiên gọi
là plasmid 2 µm, có kích thước 6318bp, số bản
sao trong tế bào khoảng 50-100, chiếm 1-2%
tổng DNA

Plasmid 2 µm được sử dụng để thiết kế các

vector tự sao chép độc lập trong tế bào nấm men
là YEp.

Tần số biến nạp của plasmid rất cao, đạt 10
4
–
10
5
thể biến nạp/µg DNA, thường rất bền vững,
chỉ bị đào thải ở mức 1% trong một tế bào

Các gen mã hóa cho các enzyme cần thiết cho
quá trình sinh tổng hợp các chất dinh dưỡng
thiết yếu cho tế bào.

Các gen chọn lọc trội được tìm thấy từ gen ở
các tế bào chủ nấm men hoang dại như CUP1
hoặc từ nấm men biến đổi di truyền như G418
R
.
3. Gen chọn lọc

Các promoter được nhận biết bởi RNA
polymerase của tế bào nấm men chia làm 2 vùng
chức năng
Nhân tố TATA
- Đóng vai trò trong
việc xác định vị trí khởi
đầu phiên mã.

- Sự phiên mã thông
thường bắt đầu từ
nucleotide thứ 30 sau
trình tự TATA.
Nhân tố điều hòa
thượng lưu
- Nằm ở thượng lưu
nhân tố TATA.
- Là vị trí gắn các
protein điều hòa
4. Promoter
Công nghệ biểu hiện gen mã hóa
enzyme α- amylase chịu nhiệt
trên bề mặt tế bào
Saccharomyces cerevisiae.
A. Vật liệu
1. Các vi sinh vật

Escherichia coli DH5α
Saccharomyces ceereviseae MT8-1
2. các plasmid
Plasmid pICAS1
Plasmid pKTH10
-
Có kích thước 6,8 kbp,
mang gen kháng
neomycine và đoạn 2,2kb
chứa gen amyQ mã hóa
cho enzyme α-amylase

từ B.amyloliquefaciens.
- Plasmid pKTH10 này
được cung cấp bởi giáo
sư người Đức.
Pbluescript
Có kích thước 2958bp, chứa
gen chọn lọc Amp
•
Taq DNA polymerase.
•
Pfu Turbo DNA polymerase.
•
10X PCR buffer: dùng cho Taq polymerase (KCl
500mM, MgCl2 15mM, Tris-HCl 100mM, pH9).
•
10X Pfu PCR butffer.
•
dNTP.
3. Thành phần pản ứng PCR
Cặp mồi để khuếch đại gen amyQ
4. Enzyme cắt giới hạn
XhoI
NhoI
HincII
B. Quy trình thực hiện
Chuẩn bị E.coli khả nạp (DH5α)
B
i
ế
n

n
ạ
p

v
e
c
t
o
r

p
K
T
H
1
0
T
ạ
o

d
ò
n
g

v
ớ
i

s
ố

l
ư
ợ
n
g

l
ớ
n
pICAS1
p
B
l
u
e
s
c
r
i
p
t
Thu nhận pKTH10
PCR với
cặp mồi
đặc hiệu
cho

amyQ
Cặp mồi
này tạo
vị trí cắt
XhoI và
NcoI
XhoI
NcoI
amyQ
Thu nhận
pICAS1
bằng pp
SDS-kiềm
Thu nhận
pBluescript
bằng pp
SDS-kiềm
Chuẩn bị vector và DNA đích
1. Tạo dòng Ecoli pICAS1/DH5α,
pBluescript/DH5α