tìm hiểu về enzyme α -amylase

Luận văn tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về enzyme α-amylase.
1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme α-amylase [1, 2].
- Là enzyme ngoại bào thủy phân liên kết α – 1,4 – glucoside một cách ngẫu nhiên ở vị trí
bất kì nhưng chủ yếu tập trung giữa mạch amylose và amylopectin nên nó thuộc loại endo
– enzyme. Các α-amylase được phân loại theo hoạt động và tính chất của chúng , α-
amylase thủy phân tinh bột tạo thành sản phẩm là các dextrin phân tử nhỏ, maltose và
glucose. Tuy nhiên, tùy nguồn gốc mà α-amylase từ các vi sinh vật có thể có sản phẩm
thủy phân theo tỷ lệ các thành phần không giống nhau (Forgaty 1990) [1].
- Một số α-amylase tạo maltose: khi sử dụng α-amylase từ nấm mốc Asp.oryzae các sản
phẩm chính của quá trình thủy phân thường là maltose và maltotriose ; α-amylase từ
Streptomyces hygroscopicus là một endo – enzyme có thể thủy phân tinh bột tới 75 -85 %
sản phẩm chứa maltose. Enzyme này còn có hoạt tính transglycosylase, maltotriose được
chuyển thành maltotetraose sau đó thủy phân thành maltose mà không tạo ra glucose; α-
amylase ngoại bào của chủng Thermonospora có khả năng thủy phân tinh bột cho sản
phẩm chính là glucose và maltose (Forgaty 1990, Neidleman 1991) [2].
1.1.2 Cấu tạo của α-amylase [1, 2, 3, 4] .
Cấu tạo của α-amylase gồm ba tiểu đơn vị, A là tiểu đơn vị lõi được nối với tiểu đơn
C có cấu trúc 8 đoạn β – sheet, tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β – sheet được lồng vào tiểu đơn
vị A. Tiểu đơn vị B quyết định hoạt tính enzyme và liên kết enzyme – cơ chất. Nó cũng
ảnh hưởng đến isoform và các tính chất đặc biệt của isoform này. Có một ion Ca
2+
nối
giữa tiểu đơn vị A và B. Tuy nhiên, ở α-amylase của nấm mốc, liên kết này yếu và có thể
bị hạn chế (Brzozowski 1997, 2000, Ferrari 1993, Marco 1996).
Trang 1
Luận văn tốt nghiệp
Tâm hoạt động:
- Có chứa một số gốc acid amin đặc hiệu. Thông thường các nhóm đặc hiệu của nó
là nhân imidazol và nhóm hydroxyl.

- α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng.
- Protein của các α-amylase có tính chất của acid yếu và tính chất của globulin.
- Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 – 5,7. Phân tử lượng của các α-amylase
từ các nguồn khác nhau rất gần nhau (của nấm mốc 45000 – 50000, của malt 59000).
Thành phần acid amin:
- α-amylase từ các nguồn khác nhau có các thành phần acid amin khác nhau, mỗi
loại α-amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, song chúng đều khá giàu tyrosin
và tryptophan.
- Các acid glutamic và aspartic chiếm gần ¼ tổng lượng acid amin cấu thành phân
tử enzyme.
- Trong α-amylase rất ít methinonine và chỉ có khoảng 7- 10 gốc cystenie trừ α-
amylase của Bac.subtilis không có các liên kết sulfuahydryl và disulfuahydryl.
- Trong thành phần acid amin của α-amylase của Asp.oryzae có chứa ít arginine và
histidine nên cũng chứa ít nhóm amin và hàm lượng nito, do đó chúng mang tính acid
hơn.
Phần lớn α-amylase có phân tử lượng tương đối gần nhau (khoảng 40000 Da) song
có những trường hợp như α-amylase của B.stearolthermophilus có phân tử lượng là
15600 Da (Campbell, Manning1964). Người ta nhận thấy rằng phân tử lượng của α-
amylase giảm đi (chỉ còn khoảng 14000 đến 15000) còn hàm lượng Ca lại tăng theo nhiệt
độ nuôi vi sinh.
Không giống các α-amylase khác, α-amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi
protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol manose, 1 mol glucose, 2 mol
hexoseamin trên 1 mol enzyme (Akabori và cộng sự, 1955). Vai trò của các polyose này
vẫn chưa rõ, song người ta đã biết rằng nó không tham gia vào thành phần trung tâm hoạt
động và nằm ở phía trong phân tử enzyme.
Calcium và vai trò của nó trong phân tử α-amylase [5]:
Trang 2
Luận văn tốt nghiệp
- α-amylase là một metalloenzyme (enzyme cơ kim). Các α-amylase đều chứa từ 1 –
30 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi phân tử enzyme thì α-amylase

mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc
bậc 3 của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của enzyme (Molodova, 1965).
- Calcium còn bảo đảm độ bền của α-amylase đối với tác động gây biến tính và sự
phân hủy bởi các enzyme phân hủy protein.
- α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Đặc tính này có thể liên quan
đến hàm lượng calcium trong phân tử của nó.
- α-amylase của vi khuẩn ưa nhiệt có chứa calcium nhiều hơn của α-amylase từ nấm
mốc nên nó bền nhiệt hơn.
- Ion Ca
2+
làm ổn định α-amylase của malt, của vi sinh vật (trong đó có cả 3 loại α-
amylase từ Asp.flavus, Asp.awamori, Asp.oryzae). α-amylase từ Asp.awamori và từ
Asp.oryzae được ổn định bởi Al
3+
, ion sắt ức chế hoạt động của α-amylase từ
Asp.awamori và từ Asp.oryzae.
Tất cả các α-amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng ( Cu
2+
, Hg
2+
, Ag
+
…).
Các kim loại như Li
+
, Na
+
, Mg
2+
, Cr

3+
, Mn
2+
, Zn
2+
, Co
2+
, Cd
2+
, Sn
2+
không ảnh hưởng mấy
đến α-amylase.
1.1.3 Cơ chất của enzyme α-amylase [6, 7].
Cơ chất của quá trình thủy phân: gồm các polysaccharide chứa các liên kết α – 1,4-
glucoside và chủ yếu là các glucan: tinh bột và glycogen (tinh bột động vật).
1.1.3.1 Tinh bột.
- Tinh bột bao gồm hai cấu tử là amylose và amylopectin, các chất này khác hẳn
nhau về tính chất lý học và hóa học. Amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin lại
tạo màu tím đỏ. Chúng cũng khác nhau về tính hòa tan. Amylose dễ hòa tan trong nước
Trang 3
Luận văn tốt nghiệp
ấm và tạo dung dịch có độ nhớt không cao còn amylopectin chỉ tan trong nước nóng và
tạo dung dịch có độ nhớt cao. Về phân tử lượng cũng có sự khác biệt rõ rệt. Amylose có
phân tử lượng từ 3.10
5
– 10
6
, còn amylopectin có phân tử lượng từ 5.10
4

– 10
6
. Trong tinh
bột tỷ lệ amylose và amylopectin thường là 1:4.
- Về cấu tạo: hai thành phần trên đều có chứa các đơn vị cấu tạo là glucose. Trong
amylose các gốc glucose được gắn với nhau nhờ liên kết α – 1,4 – glucoside tạo nên một
chuỗi dài gồm 200 – 1000 gốc glucose. Phân tử amylose bao gồm một số chuỗi xếp song
song nhau, trong đó các gốc glucose cuộn lại theo hình xoắn ốc. Mỗi chuỗi amylose có
một đầu không khử và một đầu khử.
- Trong phân tử amylopectin, các gốc glucose không những gắn với nhau nhờ liên
kết α – 1,4 – glucoside mà còn nhờ liên kết α – 1,6 – glucoside. Vì thế mà nó có cấu trúc
nhánh. Phân tử amylopectin chỉ có một đầu khử duy nhất. Người ta còn tìm thấy trong
thành phần của phân tử amylopectin còn có một ít phospho. Phospho được gắn vào
nguyên tử cacbon thứ sáu của gốc glucose.
1.1.3.2 Glycogen
- Là polysaccharide dự trữ của cơ thể người và động vật. Vì vậy, người ta coi nó là
polysaccharide đặc trưng của động vật hay “tinh bột động vật”.
- Ngoài ra, người ta còn phát hiện nó ở các nguồn khác nhau như nấm mốc, nấm
men và ở một vài loại hạt ngô. Glycogen có vai trò quan trọng trong chuyển hóa glucid ở
cơ thể động vật và ở nấm men khi lên men rượu. Nó hòa tan được trong nước nóng. Khi
tác dụng với iod sẽ cho màu đỏ tím hoặc màu đỏ nâu giống màu của amylopectin với iod.
- Phân tử lượng của glycogen xê dịch trong một khoảng khá lớn và có thể đạt tới
4.10
6
tương ứng với số gốc glucose khoảng 24000.
- Glycogen có cấu tạo gần giống với amylopectin của tinh bột nhưng mức độ phân
nhánh nhiều hơn. Trong phân tử của glycogen cũng có liên kết α – 1,4 – glucoside và α –
1,6 – glucoside nhưng liên kết α – 1,6 – glucoside nhiều hơn ở amylopectin. Các đoạn
mạch phía trong và ngoại vi của glycogen ngắn hơn của amylopectin. Chiều dài trung
bình của các đoạn mạch nhánh chỉ có 12 – 14 gốc glucose.

Trang 4
Luận văn tốt nghiệp
1.1.4 Cơ chế xúc tác [1, 2, 8].
Cơ chế phản ứng thủy phân tinh bột:
- Không phụ thuộc nguồn gốc của chất xúc tác, mỗi khi mối liên kết α – 1,4 –
glucoside bị phân cắt thì tại ngay điểm đó lập tức được liên kết với các nhóm ion của
nước.
- Khảo sát quá trình thủy phân tinh bột ở trong môi trường giàu nước bởi enzyme α-
amylase , người ta thấy rằng, các chất xúc tác bẻ gẫy mối liên kết glucoside giữa cacbon
số 1 (C
1
) với nguyên tử oxy. Ở mạch amylose, khi mối liên kết α – 1,4 – glucoside bị
phân cắt thì nhóm hydroxyl (OH
-
) của nước sẽ liên kết với cacbon số 1 (C
1
) của gốc
glucoside bên trái, còn cation hidro (H
+
) sẽ liên kết với O
-
ở nguyên tử C
4
ở gốc glucoside
bên phải. Đối với mạch amylopectin, khi mối liên kết α – 1,6 – glucoside bị cắt đứt, thì
nhóm OH
-
của nước sẽ liên kết với nguyên tử C
1
ở mạch chính, còn H

+
sẽ liên kết với O
-
ở
nguyên tử C
6
ở mạch nhánh.
- Một cách tổng quát, nếu tất cả các mối liên kết glucoside của tinh bột bị phân cắt
(bao gồm n gốc) thì cần có (n – 1) phân tử nước để liên kết với chúng và sẽ tạo ra n phân
tử đường glucose. Nhưng vì n là đại lượng lớn cho nên hiệu số n và (n-1) có thể xem là
không đáng kể. Lúc đó phương trình thủy phân tinh bột có thể biểu diễn:
( C
6
H
10
N
5
)
n
+ n H
2
O  n C
6
H
12
O
6
- Nếu chỉ tính cho một gốc glucose thì có thể viết ngắn gọn:
C
6

H
10
N
5
+ H
2
O  C
6
H
12
O
6
162 18 180
Từ đây ta có thể rút ra kết luận: lượng glucose thu hồi theo lý thuyết từ phản ứng thủy phân
hoàn toàn tinh bột bằng 111,11% lượng cơ chất tham gia ở đầu vào.
- Trong thực tế, sản phẩm thủy phân của tinh bột thường tính theo lượng đường
maltose, lúc đó sự cân bằng sản phẩm có thể tính theo phương trình:
( C
6
H
10
N
5
)
n
+ n/2 H
2
O  n/2 C
12
H

22
O
11
Trang 5
Luận văn tốt nghiệp
n162 n/2. 18 n/2 . 342
- Một đặc điểm quan trọng của liên kết glucoside trong các polysaccharide là chỉ có
các electron δ mà không có các electron π tham gia. Trong trường hợp như vậy, đóng vai
trò phân cực là electron δ. Do hiệu ứng cảm ứng của nguyên tử oxy trung tâm còn gây ra
một sự tập trung điện tích nào đó trên nguyên tử oxy, nên nó tích điện âm.
- α-amylase từ các nguồn khác nhau có rất nhiều điểm giống nhau. α-amylase
không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó còn thủy phân cả hạt tinh bột chưa hồ hóa nhưng
với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá tình nhiều giai đoạn [1,8]:
- Ở giai đoạn đầu – giai đoạn dextrin hóa – chỉ một số liên kết trong phân tử có thể
bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột bị
giảm nhanh (cả amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
- Ở giai đoạn thứ hai – giai đoạn đường hóa- các dextrin phân tử thấp vừa mới tạo
thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetramaltose, trimaltose không tạo màu với iod. Các
chất này bị thủy phân rất chậm bởi amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.
- Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành
oligosaccharide gồm 6 -7 gốc glucose ( 6 -7 gốc glucopyranose một). Sau đó các
polyglucose này lại bị phân cắt tiếp tục nên các polyglucose này cứ ngắn dần lại và bị
phân giải chậm đến maltotetraose, maltotriose và maltose.
- Qua một thời gian dài dưới tác động của α-amylase, sản phẩm thủy phân của α-
amylase chứa 13% glucose và 87% maltose.
- Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng tương tự, nhưng vì α-amylase
không phân cắt được liên kết α – 1,6 – glucoside ở chổ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nói
trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin thấp phân tử và isomaltose (8%).

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotriose,
maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột
chủ yếu tạo ra dextrin thấp phân tử không cho màu với iod và một ít maltose. Vì vậy,
Trang 6
Luận văn tốt nghiệp
người ta thường gọi nó là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Sơ đồ biểu diễn cho
sự thủy phân này như sau:
Tinh bột + Maltos
e
+ Glucose
Glycoge
n
nhiều ít
Nhận định này đã tồn tại trong thời gian khá dài. Tuy nhiên, sau đó người ta tìm
thấy rằng trong nấm mốc có α-amylase vừa biểu lộ hoạt tính dextrin hóa cao vừa tạo một
lượng đường lớn glucose và maltose.
Pakumuro và cộng sự cho rằng trong số các α-amylase của vi khuẩn có loại α-
amylase dextrin hóa, có loại α-amylase đường hóa. Khi thủy phân tinh bột bằng α-
amylase đường hóa thì có tới 60% (và hơn nữa) tinh bột bị phân giải, còn bằng α-amylase
dextrin hóa thì mức độ depolymer hóa không vượt quá 30 – 40% (Robyt, Prench, 1977).
So với α-amylase của nấm mốc, α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóa
vượt trội hơn là hoạt lực đường hóa. Theo số liệu của Lifsitx và Braznitsenco, khả năng
dextrin hóa của chế phẩm enzyme từ asp.oryzae cao hơn khả năng đường hóa 1,75 lần,
còn ở Bac.subtilis thì cao hơn 2 lần (2000).
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột không còn nguyên,
còn α-amylase của vi khuẩn lại có khả năng phân hủy các hạt tinh bột chưa được hồ hóa
lần hồ tinh bột (Brovaretx,Popadicts và đồng sự, 1967). Chế phẩm α-amylase của
B.subtilis phân giải hạt tinh bột chưa được hồ hóa 2 -2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase
của nấm mốc ( Lixink, Popadicts, 2001).
Ở các giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác dụng

của α-amylase từ vi khuẩn. Dextrin do α-amylase của vi khuẩn tạo ra khi phân giải tinh
bột có mạch dài hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc.
Trang 7
+
H
2
O

Luận văn tốt nghiệp
α-amylase của vi khuẩn Bac.subtilis tác dụng lên amylose tạo ra các dextrin có mạch
dài khoảng 6 – 8 gốc glucose ( G
6
, G
7
, G
8
). Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo
sơ đồ:
G
6
 G
1
+ G
5
G
7
 G
1
+ G
6

Hay G
2
+ G
5
G
8
 G
2
+ G
6
Hay G
3
+ G
5
(Robyt, French)
Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân amylose là glucose và maltose. Đối với α-
amylase của vi khuẩn, tỷ lệ glucose : maltose thu được là 1 : 5; còn đối với α-amylase của
nấm mốc tỷ lệ này là 1 : 3,79 (Hanrahan, Caldwell, 1987).
Fenikxova và Ermosina cho biết rằng các maltopentaose và maltohexaose thủy phân
theo sơ đồ sau:
G
5
 G
1
+ G
4
G
6
 G
2

+ G
4
Hay 2G
3
Hay G
5
+ G
1
α-amylase của nấm mốc và vi khuẩn không tấn công liên kết α – 1,6 – glucoside của
amylopectin nên khi thủy phân, nó sẽ tạo thành các dextrin giới hạn phân nhánh. Sản
phẩm đầu tiên của sự phân giải amylopectin bởi α-amylase vi khuẩn là dextrin có 6 gốc
glucose, còn sản phẩm cuối cùng là glucose, maltose và các maltodextrin (saccharide có
phân nhánh) từ các maltodiose đến maltohexaose. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh
bột dưới tác dụng của α-amylase của nấm mốc chủ yếu là maltose, tiếp đến là maltotriose
(Sproster, Uhlig, 1987).
Nếu dùng nồng độ α-amylase vi sinh vật tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 -85%
tinh bột thành đường lên men. Với α-amylase vi khuẩn, tinh bột bị thủy phân thành
glucose và maltose đến 70 -75%. Còn với α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa
đến glucose và maltose có thể đến 84 – 87%.
Vận tốc thủy phân tinh bột bởi α-amylase vi khuẩn Bac.subtilis ở giai đoạn đầu cao
hơn α-amylase Asp.oryzae tới 20% và giảm mạnh khi đạt được 30 – 32% sự thủy phân.
Trang 8
Luận văn tốt nghiệp
1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme α-amylase [1, 4, 8, 9].
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống
nhau.
pH:
- α-amylase từ nấm mốc có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,5 – 4,8 ; pH tối thích
của đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,7 – 5,4)
và của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 ( hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 – 7,0).

- Theo số liệu của Liphsis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của
chế phẩm α-amylase từ Asp.oryzae giống nhau và nằm trong vùng pH 5,6 – 6,2 (2000).
Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 –
7,0 (2001).
- Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α-amylase của nấm mốc
Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis.
Ở pH 3,6 và nhiệt độ 0
0
C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 – 30 phút; α-
amylase của vi khuẩn bị vô hoạt 50%; trong khi đó hoạt lực của α-amylase từ nấm mốc
hầu như không giảm bao nhiêu (Fenikxcova, Ermoshina, 2005).
- Trong dung dịch α-amylase của nấm mốc được bảo quản tốt ở pH 5,0 – 5,5; α-
amylase dextrin hóa của nấm mốc đen có thể chịu được pH 2,5 – 2,8. Ở 0
0
C và ở pH 2,5
nó chỉ bị vô hoạt sau một giờ (Bernfeld, Okazaki, Kitahara, Kurushima, Ermoshina,
2005).
- Ngoài α-amylase không bền acid ra, các loại nấm mốc Asp. Awamori, Asp.
Butatea, Asp.usamii còn tạo ra tới 5 – 10% α-amylase bền acid. Trong khi đó nấm mốc
Asp.niger 475 lại chỉ tạo ra các α-amylase bền acid. Nó không bị mất hoạt tính ở pH 2,5;
nhiệt độ 30
0
C trong vòng 1 giờ.
Bảng 1.1: Độ bền acid của α-amylase mốc đen [8].
Trang 9
Luận văn tốt nghiệp
Chủng
Hoạt độ dextrin
hóa tổng số
(đv/ml)

Hoạt độ dextrin
hóa bền acid
(đv/ml)
Hoạt độ dextrin
hóa bền acid, %
hoạt độ tổng số
Asp.awamori 0,5 0,08 16
Asp.usamii 45 0,43 0,1 23
Asp.usamii 45 – 56 0,5 0,11 22
Asp.usamii 45 – 21 0,4 0,06 15
Asp.niger 475 0,35 0,34 97
- Ở pH < 4,0 α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt hoàn toàn (Virits, 1996). Theo
Uhlig, α-amylase của nấm bền ở vùng pH 5,3 – 8,0 còn α-amylase của vi khuẩn bền ở
khoảng pH 5,0 – 10,0 (2000).
Nhiệt độ:
- Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau
cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm mốc rất nhạy với tác động của nhiệt, nhiệt độ
tối thích của nó là 50
0
C, α-amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động
tối thích ở 58 – 60
o
C. Trong sản xuất rượu người ta thường đường hóa bằng canh trường
nấm mốc ở 50 – 52
o
C, và bằng malt ở 60 – 65
o
C, α-amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt
cao hơn cả. Nhiệt độ tối thích của nó là 70 – 75
o

C (Liphsis, Bragnitsenko, 1997), α-
amylase của Bac.stearothermophilus… vẫn giữ được hoạt lực trong một thời gian dài ở
85
o
C và cao hơn nữa (Manning Campbell, Karpukina, 2001).
- α-amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92
o
C trong khi đó α-amylase của
nấm mốc bị vô hoạt ở 70
o
C (Kozmina, 2002). Trong dung dịch hồ tinh bột, α-amylase của
vi khuẩn chỉ bắt đầu vô hoạt nhanh khi nhiệt độ cao hơn 77
0
C. Ở 70
0
C, α-amylase của
nấm mốc đã bị mất 50% hoạt lực, còn α-amylase của malt hầu như chưa bị mất hoạt lực.
Trang 10
Luận văn tốt nghiệp
Bảng 1.2: Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau (Miller, Johnson, 2005)
[9].
Nhiệt độ Hoạt độ α-amylase, % so với hoạt độ ban đầu
0
C Nấm mốc Malt Vi khuẩn
65 100 100 100
70 52 100 100
75 3 58 100
80 1 25 92
85 - 1 58
90 - - 52

95 - - 8
- Trong dung dịch đệm pH 4,7; α-amylase của asp.oryzae rất nhạy với tác động của
nhiệt độ cao, thậm chí ở 40
0
C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%,
hoạt lực đường hóa còn 27 – 85%. Ở 50
0
C trong 2 giờ, α-amylase của nó bị vô hoạt hóa
hoàn toàn.
- Miller và cộng sự còn nhận thấy rằng α-amylase của vi khuẩn có thể giữ được một
phần hoạt lực thậm chí ngay cả khi đun sôi trong nước một thời gian ngắn. Tính bền nhiệt
của α-amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn. Trong sản xuất, α-amylase của vi khuẩn được
sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng ở nhiệt độ cao. Ở Tây Đức đã
tuyển chọn được một chủng Bac.subtilis mà α-amylase của nó không khác gì của vi khuẩn
thông thường về đặc tính tác dụng lên tinh bột, song lại có độ bền nhiệt khá cao (Sprister,
Uhlig, 2000). Tính chất α-amylase của chủng bền nhiệt này cũng đặc trưng cho
Bac.suptilis; pH tối thích 6,0; bị vô hoạt hoàn toàn ở pH 4,0 và bị vô hoạt một nửa ở pH
8,0.
- Những khác biệt về tính chất như nhiệt độ và pH tối thích, mức độ thủy phân và
đặc tính thủy phân của α-amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to
lớn cho việc ứng dụng chúng một cách hợp lý và hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của
quá trình sản xuất.
Nồng độ cơ chất:
Trang 11
Luận văn tốt nghiệp
- Nồng độ cơ chất ảnh hường khá mạnh đến khối lượng và chất lượng của sản phẩm
thủy phân do sự phân cắt của α-amylase. Nhìn chung nếu nồng độ cơ chất khá loãng,
lượng đường tạo ra theo cơ chất càng nhiều, đặc biệt là nhóm đường thấp phân tử có khả
năng lên men được. Tuy nhiên, tương quan đó không phải là tỷ lệ thuận.
- Ngoài ra, gần đây, các nhà nghiên cứu đã tìm hiểu và thấy rằng thành phần

amylose , amylopectin và cấu trúc tinh bột cũng là những yếu tố ảnh hưởng khá mạnh
đến tác dụng thủy phân của enzyme α-amylase. Nguồn tinh bột khác nhau cùng ảnh
hưởng đến quá trình thủy phân khác nhau.
1.1.6 α-amylase từ vi khuẩn Bac.licheniformis [3, 10].
- Bacillus được xem là giống vi sinh vật quan trọng nhất để sản xuất α-amylase
trong công nghiệp. Đã có nhiều nghiên cứu để sản xuất α-amylase bền nhiệt từ các chủng
Bac.amyloliquefaciens và Bac.licheniformis.
- α-amylase bền nhiệt từ Bac.licheniformis được nghiên cứu tách trong hệ hai pha
PEG/dextran, sau đó cho chạy qua hệ sắc kí lọc gel và sắc kí trao đổi ion (Ivanova, 1993).
Sử dụng gradient pH là một phương pháp thường được sử dụng trong công nghiệp để tinh
sạch enzyme. Dobransky đã dùng phương pháp này để tinh sạch α-amylase từ các chủng
Bac.subtilis khác nhau. Các pick thu được có độ tách tốt, lượng dung dịch enzyme ban
đầu có thể đạt tới 1000L, với nồng độ protein 3g/100mL. tinh sạch α-amylase sản xuất bởi
chủng chuyển gen bằng phương pháp sắc kí miễn dịch cũng đang được quan tâm (Pandey,
2000).
- Các tính chất của α-amylase ngoại bào dường như phản ánh điều kiện pH và nhiệt
độ của môi trường sống. Bac.flavothermus phát triển trong môi trường pH 6,0 và nhiệt độ
65
o
C tổng hợp α-amylase có pH
opt
và t
o
opt
tương ứng là 5,5 – 6,0 và 60
o
C. Một số tính chất
của α-amylase ngoại bền nhiệt từ Bac.subtilis đã được nghiên cứu, khả năng bền nhiệt của
enzyme phụ thuộc vào hàm lượng Ca
2+

, enzyme bị vô hoạt mạnh bởi EDTA và N –
bromosucinimide. Một số tác giả đã nghiên cứu tính chất của α-amylase có nguồn gốc từ
chủng Bac.subtilis (57700 Da); chúng bị vô hoạt bởi các kim loại như Hg
2+
, Fe
3+
, Al
3+
và
Trang 12
Luận văn tốt nghiệp
được kích hoạt bởi Mn
2+
, Co
2+
đã thu nhận được amylse nội bào của Bac.subtilis SUH4 –
2 với tỷ lệ monomer/dimer tương ứng là 3/2 trong đệm phosphate pH 7,0. Enzyme này
được cho là có vai trò quan trọng trong quá trình đồng hóa cacbon ở cytoplasm. Các dạng
α-amylase biến tính và sau khi khôi phục hoạt tính của Bac.subtilis cũng được nghiên cứu
nhờ sử dụng phát xạ huỳnh quang (Cho, 2000).
1.1.7 Ứng dụng của enzyme α-amylase [11].
- Ngày nay các amylase từ vi sinh vật đã thay thế acid trong công nghiệp thủy phân
tinh bột, đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia. Các enzyme có độ tinh sạch cao và
những tính chất phù hợp có triển vọng to lớn trong công nghiệp dược và công nghệ hóa
chất tinh khiết.
- Nhờ thành tựu của công nghệ sinh học, ứng dụng của amylase đang mở rộng ra
nhiều lĩnh vực khác. Một số amylase và lipase đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu
sinh học. Có nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng
amylase.
- Hệ phân tích Ciba Corning Express dựa trên dung dịch thuốc thử chứa α-amylase

cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao, α-amylase
được sử dụng trong phân tích cyclodextrin.
1.2 Sơ lược về enzyme cố định.
1.2.1 Giới thiệu.
1.2.1.1 Định nghĩa [12].
Enzyme cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa:
- Nghĩa hẹp: enzyme không hòa tan là enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ,
pha này có thể tách riêng với môi trường dung dịch phản ứng. Pha enzyme không hòa tan
trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.
Trang 13
Luận văn tốt nghiệp
- Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng
thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cả
enzyme được cố định vào một chất mang, cả enzyme có trong tế bào sống, chúng được cố
định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử
dụng nhiều lần.
- Enzyme không hòa tan hay enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được
gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzyme
từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan.
1.2.1.2 Đặc điểm của enzyme cố định [12].
Enzyme cố định có đặc điểm như sau:
- Hoạt tính của enzyme cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzyme tự do cùng
loại. Sở dĩ có sự thay đổi hoạt tính riêng của enzyme cố định là do những nguyên nhân
sau:
• Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự
khác biệt với điện tích của enzyme thì khi gắn enzyme vào chất mang, cấu trúc không
gian của enzyme có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà
sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cùng giảm.
• Do enzyme bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho
sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất bị kém đi.

- Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có một
số sai khác nhất định:
• Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang.
• Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng.
•
- Enzyme cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzyme tự do nhờ có tác dụng che
chở của chất mang.
- Enzyme cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzyme tự do cùng loại.
- Enzyme cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzyme tự do.
Trang 14
Luận văn tốt nghiệp
- Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một
cách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzyme cố định cao hơn enzyme tự do.
1.2.1.3 Ưu nhược điểm của enzyme cố định [12].
Ưu điểm:
- Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài.
- Enzyme cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzyme, do đó
nó không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không
tốn chi phí cho việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm.
- Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzyme ra
khỏi dung dịch cơ chất.
- Enzyme cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzyme tự
do.
- Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục.
Nhược điểm:
- Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme.
- Trong đa số trường hợp, enzyme có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quá trình cố
định.
Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzyme cố
định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzyme cũng như ứng

dụng enzyme cố định vào sản xuất công nghiệp.
1.2.2 Các phương pháp cố định enzyme [12].
Các phương pháp cố định enzyme được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý.
Trang 15
Luận văn tốt nghiệp
Bảng 1.3: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme [12].
Phương pháp hóa học
Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm
Phương pháp gắn
enzyme lên chất mang
bằng liên kết cộng hóa
trị
Liên kết giữa enzyme và chất
mang là liên kết bền, do đó hạn
chế tối đa sự mất mát enzyme
trong quá trình phản ứng.
Hoạt tính enzyme có thể bị
giảm do những biến đổi về
cấu trúc của enzyme trong
quá trình cố định.
Phương pháp gắn các
phân tử enzyme lại với
nhau bằng liên kết cộng
hóa trị
Tạo được liên kết rất bền trước
các tác nhân pH, nhiệt độ…
Thường được dùng phối hợp
với các phương pháp khác.
Chi phí cao, thao tác thực
hiên tương đối phức tạp.

Hoạt tính enzyme có thể bị
giảm do những biến đổi về
cấu trúc của enzyme trong
quá trình cố định.
Phương pháp vật lý
Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm
Phương pháp gắn
enzyme lên chất mang
bằng tác nhân vật lý
Thao tác thực hiện đơn giản.
Điều kiện tiến hành cố định
enzyme ôn hòa nên không làm
mất hoạt tính của enzyme trong
quá trình cố định.
Có khả năng tái sử dụng chất
mang.
Do lực tương tác giữa
enzyme và chất mang yếu
nên dễ xảy ra hiện tượng
nhả hấp phụ trong quá trình
sử dụng enzyme cố định do
khuấy trộn hay do thay đổi
nhiệt độ, pH của môi
trường.
Phương pháp nhốt
enzyme
Thao tác đơn giản.
Không đòi hỏi phải có các
nhóm tạo liên kết nên phù hợp
với nhiêu loại enzyme.

Hiệu quả cố định enzyme cao.
Có thể cố định đồng thời nhiều
enzyme.
Chỉ thích hợp cho phản ứng
với cơ chất có khối lượng
phân tử nhỏ.
Phương pháp hóa học:
- Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị.
- Gắn các phân tử enzyme lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị.
Trang 16
Luận văn tốt nghiệp
Phương pháp vật lý:
- Hấp phụ enzyme lên chất mang bằng liên kết vật lý như sau: lực mao quản, liên kết
ion, lực Van der Walls….
- Phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể.
1.2.3 Vật liệu cố định.
Vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả
của quá trình cố định enzyme. Trong đó, không có đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định
nào thích hợp cho tất cả các loại enzyme và cũng không có enzyme nào thích hợp với tất
cả các loại vật liệu cố định [13].
Vật liệu cố định enzyme và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu
hữu cơ [13], [14].
Vật liệu vô cơ:
- Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn
mòn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzyme thường khó khăn hơn.
- Một số chất mang vô cơ thông dụng như: thủy tinh xốp, các oxid kim loại như oxid
nhôm, oxid mangan, oxid magie, silicagel…
Vật liệu hữu cơ:
- Đặc điểm: chất mang hữu cơ thường có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH
2

,
-COOH, -OH, -SH,… nên dễ kết gắn với enzyme nhưng độ bền với tác động của môi
trường không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn
công.
- Một số chất hữu cơ thông dụng như: Polypeptide, dẫn xuất của sterol, polymer của
acid malic và của acid metacrylic, polysaccharide, nilon, dẫn xuất cellulose, dextran, tinh
bột, agarose.
Trang 17
Luận văn tốt nghiệp
- Cellulose và dẫn xuất của cellulose là CM-cellulose, DEAE-cellulose,
nitrocellulose… là những vật liệu rẻ hơn so với agarose nhưng lại không đồng nhất,
thường chỉ sử dụng ở dạng sợi, và dạng tinh thể (microcrystalline).
- Cellulose là vật liệu được nghiên cứu cố định enzyme đầu tiên, các quy trình cố
định trên vật liệu này được nghiên cứu khá hoàn chỉnh. Cellulose thường được dùng để
hấp thụ, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị với enzyme hoặc nhốt trong gel.
- Chitin là hợp chất được Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin
từ năm 1823. Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng
dụng làm vật liệu cố định enzyme và tế bào. Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến
trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose.
- Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là một polymer của các gốc 2-acetoamide-2-
deoxy-β-D-glucoza, liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glycoside. Chitin có trong thành
phần cấu trúc vỏ của côn trùng, vỏ tôm cua, sò, vách tế bào sinh vật,…Chitin là một vật
liệu có chứa nhóm chức –OH và cho liên kết với enzyme, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng
hấp thụ tốt, dễ tạo màng. Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các liên
kết hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa các lớp với nhau trong mạng tinh thể.
- Chitin là một polymer kỵ nước, độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và
bền về mặt hóa học. Gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzyme trên chitin, chủ yếu
bằng phương pháp hấp thụ và liên kết công hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde.
- Chitin được tìm thấy trong thành tế bào của nấm sợi. Nó là chất hữu cơ chiếm
lượng lớn để hình thành nên lớp vỏ ngoài của động vật không xương sống (côn trùng,

giáp xác…) [13].
- Về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa học
duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin được thay thế cho
nhóm hydroxyl (-OH) ở cellulose.
- Chitosan là dẫn xuất của chitin khi được deacetyl hóa trong kiềm mạnh. Chitosan
dễ tạo màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm - NH
2
. Chitosan có thể cố định enzyme
bằng phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt enzyme trong gel
chitosan.
Trang 18
Luận văn tốt nghiệp
- Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như acid formic, acid
dipic, acid acetic. Chitosan là một polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao, có các
nhóm amin hoạt động, các nhóm hydroxyl có thể tham gia phản ứng hóa học.
1.3 Enzyme α-amylase cố định.
1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài
- Lịch sử nghiên cứu cố định enzyme bắt đầu từ năm 1916, khi Nelson và Griffin
quan sát khả năng thủy phân đường saccharose của invertase nấm men hấp phụ trên than
hoạt tính.
- Sau đó đến năm 1949 Micheal và Iuers đã sử dụng phương pháp acid hóa
carboxymethyl cellulose để cố định những chuỗi protein có hoạt tính.
- Năm 1953 Grubhofer và Schleith cố định một vài enzyme như carboxypeptidase,
pepsin, ribonuclease bằng liên kết cộng hóa trị trên nhựa polyaminostyren được diazo
hóa.
- Chang (1954) đã tạo ra các vi tiểu cầu có gắn enzyme để chống dị ứng khi đưa vào
cơ thể.
- Mizt (1956) đã cố định enzyme catalase lên DEAE-celllulose bằng liên kết ion.
Beerfeld và Wan mô tả phương pháp nhốt các enzyme trypsin, papain, amylase và
ribonuclease trong gel polyacrylamide vào năm 1963. Năm 1964 Quiocho và Richards đã

chứng minh khả năng khâu mạch các enzyme carboxypeptidase A bằng glutaraldehyde.
Cũng năm 1964, Chang đã tiến hành nhốt enzyme hydratase trong các vi hạt.
- Enzyme cố định đầu tiên được ứng dụng ở quy mô công nghiệp vào năm 1969 do
Chibata và các cộng sự. Enzyme aminoacylase được cố định trên DEAE-sephadex nhờ
liên kết ion để chuyển hóa hỗn hợp D, L-acid amin thành L-acid amin. Mosbach (1970)
đã cố định tổ hợp cả 3 enzyme là β-galactosidase, hexokinase và gluco-6-phosphat
dehydrogenase bằng liên kết cộng hóa trị với hạt sephadex. Tế bào vi sinh vật đầu tiên
được ứng dụng ở qui mô công nghiệp được thực hiện bởi Chibata (1973), Chibata và các
cộng sự đã cố định E.coli trong gel polyacrylamide để sản xuất acid L-aspartic từ
ammonium fumarat nhờ hoạt tính aspartase rất cao của E.coli [13].
Trang 19
Luận văn tốt nghiệp
- Hiện nay trong công nghiệp, enzyme cố định được sử dụng chủ yếu trong sản xuất
syrup giàu fructose (HFS) và penicillin bán tổng hợp.
Ở Việt Nam, những nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu trong vài năm gần đây,
kết quả thu được còn rất hạn chế. Năm 1994 - 1995 Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP. Hồ Chí
Minh nghiên cứu cố định enzyme glucoisomerase trên các hạt silochrom B
2
hoạt hóa bằng
glutaraldehyde. Hiện nay Viện cũng đang nghiên cứu sử dụng chế phẩm glucoisomerase
cố định của Novo để sản xuất syrup fructose, tuy nhiên chỉ mới ở qui mô phòng thí
nghiệm [14].
- Những năm gần đây, Phòng công nghệ bức xạ, viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã
có nhiều công trình nghiên cứu cố định enzyme, tế bào và các chất có hoạt tính sinh học
khác bằng bức xạ như cố định glucoamylase, protease, vi khuẩn tả (Vibro cholerae), tế
bào nấm men (Saccaromyces servisase), vi khuẩn xử lý nước thải trên polymer tổng hợp
được chế tạo bằng kỹ thuật bức xạ.
- Có một số công trình nghiên cứu về amylase cố định, tuy nhiên các nghiên cứu
không được ứng dụng trong công nghiệp. Do amylase thường được cố định trong các chất
mang dạng xốp, tinh bột lại có kích thước lớn nên cơ chất và enzyme khó tiếp xúc với

nhau, quá trình truyền khối thấp và hiệu suất sử dụng enzyme cố định không cao. Thiết bị
sử dụng trong công nghiệp thường là cột nhồi không phù hợp với dòng cơ chất liên tục là
tinh bột dạng hạt, khối có kích thước lớn. Trong các cột nhồi kiểu này dễ xảy ra hiện
tượng tắc nghẽn dòng ở lối vào, cơ chất tụ tập thành từng đám làm tăng áp suất cột, phá
vỡ hình dạng hay gây nén các hạt xốp dẫn đến hiệu suất quá trình và chất lượng sản phẩm
thấp [15].
- Các nghiên cứu về cố định amylase tập trung chủ yếu cố định glucoamylase và một
vài nghiên cứu về cố định α-amylase. Glucoamylase của hãng Novo cố định trên hạt silic
xốp được sử dụng trong thiết bị cột nhồi và thiết bị tầng sôi để thủy phân tinh bột sắn sau
khi đã dịch hóa. Và thực hiện các nghiên cứu về mô hình hóa quá trình phản ứng, nhiệt
động học phản ứng, nghiên cứu quá trình truyền khối trong và ngoài hạt cũng như các
nghiên cứu về độ bền nhiệt, năng lượng vô hoạt và thời gian bán hủy của enzyme cố định
và hòa tan. Thiết bị tầng sôi có nhiều ưu điểm hơn thiết bị dạng cột nhồi, không có hiện
Trang 20
Luận văn tốt nghiệp
tượng hạn chế khuếch tán và hiệu suất thủy phân tinh bột dạng hạt 98,5% với thời gian
lưu chỉ 10 phút. Glucoamylase cũng được gắn trên bề mặt các hạt siêu mịn polystyrene,
các chỉ số động học như V
max
, K
m
, khả năng chịu nhiệt, pH… của enzyme tốt hơn so với
enzyme tự do [8].
- Đã có một số công trình nghiên cứu cố định α-amylase trên polyacrylamide, canxi
alginate và sepharose.
- Polyacrylamide có tính ưu việt, enzyme ít bị biến đổi trong gel nhưng
dimethyaminopropionate chất khởi đầu cho quá trình trùng hợp rất độc, không thể sử
dụng trong thực phẩm. Canxi alginate có nhiều trong tự nhiên chủ yêu được chiết từ rong
nâu gần như không mùi không vị, nhược điểm là quá trình truyền khối gặp trở ngại do cấu
trúc tinh bột lớn khó đi vào cấu trúc gel.

- α-amylase cũng được nghiên cứu cố định trên sepharose nhưng phương pháp này
có nhược điểm chất hoạt hóa CNBr độc tính cao và chế phẩm không thể sử dụng trong
các thiết bị có cánh khuấy [16].
- Chin Jen Tien, Been Huang Chiang (1999) đã cố định α-Amylase trên hạt keo là
sản phẩm H
2
SO
4
và ZrOCl
2
sau khi được xử lí bởi 3-aminopropyltriethoxysilane (3-
APTES) và glutaraldehyde 0,5%. Chế phẩm thu được có hoạt tính 59,8 đv/g [8].
- Serpil Aksoy, Nesrin Hasirci (2000) cố định α-amylase trên 2-hydroxythel
metharylate (HEMA), và trên styrene-2-hydroxyethyl methacrylate (St-HEMA) các chế
phẩm trên được hoạt hóa bởi epichlorohydrin (ECH). Enzyme cố định có hoạt tính 61,7 –
67% so với enzyme tự do, sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ 4
o
C hoạt tính còn 38,9% [15].
- Với những cố gắng tìm ra chất mới, Yang (1998) đã sử dụng chất mang
perfluorpolymer phủ poly – vinyl - alcohol để cố định α-amylase. Enzyme cố định khá
bền với nhiệt độ và các dung dịch gây biến tính mạnh, đặc biệt nó có độ bền cơ học cao,
có thể tái sử dụng trong thiết bị có cánh khuấy. Enzyme cố định chỉ mất 20% hoạt tính
sau 3 tuần ở 72
o
C [17, 18].
- Chen (1998) tìm ra một loại màng gồm các hạt hydrogel được gắn trên nền
polyester, rất nhạy với nhiệt độ, có khả năng đóng mở các lỗ xốp, tạo ra hiệu ứng có /
không có hoạt tính enzyme tương ứng với nhiệt độ. Enzyme cố định trên màng có độ bền
nhiệt cao, được sử dụng trong thiết bị liên tục có khả năng tăng hiệu suất thủy phân và
khả năng tách sản phẩm khỏi cơ chất [15].

Trang 21
Luận văn tốt nghiệp
1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme α-amylase [8, 13, 22].
Theo Scouten Gerhartz có 4 phương pháp cố định enzyme:
- Phương pháp liên kết với vật liệu cố định.
- Phương pháp khâu mạch.
- Phương pháp nhốt trong khuôn gel.
- Tổ hợp các phương pháp trên.
1.3.2.1 Phương pháp liên kết với các vật liệu cố định:
Phương pháp liên kết cộng hóa trị:
Đây là phương pháp cố định enzyme phổ biến, đảm bảo liên kết vững chắc của
enzyme và cơ chất.
Ưu điểm:
- Do được liên kết chặt chẽ bằng liên kết cộng hóa trị nên enzyme không bị rửa giải
trong suốt quá trình sử dụng.
- Dễ dàng tiếp xúc với cơ chất vì enzyme được gắn trên bề mặt.
Nhược điểm:
- Cấu trúc của enzyme có thể bị thay đổi bởi quá trình liên kết có thể dẫn đến mất
hoạt tính.
- Do liên kết chặt nên có thể dẫn đến cản trở hoạt động của enzyme, giảm khả năng
tiếp xúc với cơ chất.
- Vật liệu cố định không tái sử dụng được.
Tóm lại, phương pháp này chỉ phù hợp cho những enzyme mắc tiền và ổn định hoạt
tính khi cố định, thường ứng dụng với mục đích phân tích.
Hoạt hóa bằng cyanogen bromit .
Dùng cho các vật liệu có nhóm – OH như polysaccharide, chất hoạt hóa CNBr và
các sản phẩm trung gian tạo thành rất độc, nên cần có thiết bị bảo vệ trong khi tiến hành
thí nghiệm.
Trang 22
Luận văn tốt nghiệp

Phương pháp hoạt hóa acid:
- Với các vật liệu cố định có nhóm chức – COOH như carboxymetyl, cellulose…Giá
thể được chuyển hóa thành dẫn xuất metyl ester, sau đó thành hydrade khi phản ứng với
hidrazin và cuối cùng là acid.
- Acid sẽ phản ứng với enzyme ở nhiệt độ thấp 0 – 5
o
C; pH 7,8.
Hoạt hóa bằng diazo:
- Đối với những vật liệu cố định có nhóm amin vòng thơm như polyaminostyren,
aminobenzyl cellulose có thể hoạt hóa theo phương pháp này. Phản ứng liên kết với
enzyme xảy ra ở nhiệt độ thường, môi trường trung tính.
- Phản ứng alkyl hóa: Nhóm halogen trên vật liệu dễ phản ứng với nhóm amino,
nhóm sunfuahydride của enzyme. Những chất mang halogen acetyl cellulose, cellulose có
thể hoạt hóa theo phương pháp này.
Hoạt hóa bằng glutaraldehyde:
Các nhóm vật liệu có nhóm amin như polyacrylamide, aminoetyl, cellulose, chitin,
chitosan có thể sử dụng phương pháp này.
R-NH
2
+ HOC-(CH
2
)-COH  R-N=CH(CH
2
)CHO
R-N=CH(CH
2
)CHO + H
2
N-E  R-N=CH(CH
2

)CH=N-E
Hoạt hóa bằng carbodiimide:
Những vật liệu cố định có nhóm carboxyl có thể hoạt hóa bằng các dẫn xuất
carbodiimide đặc biệt là N,N dicyclohexylcarbodiimide. Khi có mặt chất này enzyme dễ
dàng liên kết cộng hóa trị với vật liệu cố định, phản ứng ở môi trường acid yếu.
1.3.2.2 Phương pháp liên kết ion:
Phương pháp này có nhiều ưu điểm ở qui mô công nghiệp vì có các ưu điểm sau:
Ưu điểm:
Trang 23
Luận văn tốt nghiệp
- Cố định enzyme bằng liên kết ion là phương pháp đơn giản, vật liệu có thể tái sử
dụng lại.
- Enzyme không bị biến đổi hóa học nên hoạt tính enzyme cố định cao.
- Vật liệu cố định mang điện tích làm tăng nồng độ của cơ chất, do đó làm tăng khả
năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme và làm tăng hoạt tính enzyme cố định.
Nhược điểm:
- Enzyme và vật liệu cố định ảnh hưởng nhiều đến sự thay đổi pH, nhiệt độ, lực ion,
dung dịch đệm sử dụng.
- Các vật liệu cố định thường sử dụng là các dẫn xuất trao đổi ion như CM-, DEAE-,
AE-, cellulose, sephadex, chitosan…
1.3.2.3 Phương pháp hấp thu vật lí :
- Qui trình: trộn lẫn dung dịch enzyme, để một thời gian rồi lọc, rửa phần enzyme
không hấp thụ. Enzyme cố định trên giá thể nhờ các lực liên kết yếu như liên kết hydro,
liên kết kị nước, lực vander Walls.
- Enzyme không chịu bất kì một sự thay đổi nào về mặt hóa học nên hoạt tính của
enzyme cố định thường từ 50 – 100% so với enzyme tự do.
- Khả năng hấp phụ của enzyme phụ thuộc vào các điều kiện môi trường, như nhiệt
độ, nồng độ enzyme, diện tích bề mặt tiếp xúc của vật liệu cố định.
1.3.2.4 Phương pháp khâu mạch [21,23]:
OHC(CH

2
)
3
CHO + (NH
2
)
n
– E  -CH=N-E-N=CH(CH
2
)
3
CH=N-
Glutaraldehyde Enzyme Phân tử enyzme khâu mạch
1.3.2.5 Phương pháp nhốt [20,24,25]:
Ưu điểm:
Trang 24
Luận văn tốt nghiệp
- Phương pháp này khá đơn giản, không chỉ cố định một loại enzyme mà có thể cố
định nhiều enzyme.
Nhược điểm:
- Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất nên hoạt tính giữa enzyme cố
định thường thấp, nhất là trong trường hợp cơ chất có khối lượng phân tử lớn.
- Vật liệu cố định không sử dụng lại.
- Nhốt trong cấu trúc mạng gel.
- Enzyme nhốt trong cấu trúc mạng gel của các polymer như polysacharide, protein,
polymer tổng hợp như polyacrylamide…Enzyme hoặc tế bào sẽ được tạo hỗn hợp với
dung dịch monomer và các chất khâu mạch khác, sau đó sẽ được polymer hóa bởi các tác
nhân hóa học, hoặc bức xạ.
- Trong trường hợp polymer hóa bằng bức xạ gamma, enzyme và monomer được
hoạt hóa bằng cách làm lạnh ở nhiệt độ -78

o
C, sau đó hỗn hợp được chiếu xạ. Kỹ thuật
này dễ tạo ra cấu trúc siêu lỗ trên giá thể polymer và hạn chế enzyme mất hoạt tính bởi
bức xạ.
- Các polymer thường được dùng trong phương pháp này là gel alginate,
carrageenan và chitosan. Alginate và carrageenan là các polyanion dễ tạo hạt trong dung
dịch muối Ca, K. Nhược điểm các gel này không bền trong môi trường phosphate. Để
khắc phục một phần nhược điểm này có thể cho gel khâu mạch trong glutaraldehyde.
Dạng liposome:
- Enzyme được nhốt trong màng lipid, thường là phospholipid.
Dạng màng siêu lọc:
- Nguyên tắc của phương pháp này tương tự như phương pháp nhốt trong vi nang.
Enzyme được giữ trong các màng siêu lọc, phương pháp này được ứng dụng để cố định
enzyme glucoamylase, glutaminate, galactosidase.
Dạng vi nang:
- Enzyme được nhốt trong màng bán thấm, nhưng lại thấm đối với cơ chất. Vì
enzyme hoạt động trong môi trường dung dịch nên khả năng tiếp xúc giữa enyzme và cơ
Trang 25