Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập Gen Cystatin ở một số giống ngô chịu hạn khác nhau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC


NGUYỄN PHƯƠNG THẢO





ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ
CHỊU HẠN KHÁC NHAU







LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1

MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng đƣợc trồng ở nhiều vùng
sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác [4].
Cây ngô không chỉ cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà còn là cây
trồng xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn. Tuy
nhiên trong những năm qua, do hạn chế về điều kiện tƣới tiêu, tập quán canh
tác và đặc biệt là việc chọn giống chịu hạn đƣa vào sản xuất chƣa đƣợc chú
trọng, thêm vào đó là diễn biến thời tiết phức tạp, hạn hán thƣờng xuyên xảy
ra nên năng suất ngô của nƣớc ta vẫn còn thấp.
Nƣớc ta có 75% diện tích là đồi núi, lƣợng mƣa hàng năm không đồng
đều giữa các vùng, do vậy tình trạng hạn hán thƣờng xuyên diễn ra dẫn đến
năng suất cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng bị giảm. Năm 2004, tỉnh
Đắc Lắc có trên 28000 ha ngô bị hạn, trong đó mất trắng 60% và giảm năng
suất 40%. Để hạn chế ảnh hƣởng của hạn tới năng suất ngô, trong những năm
gần đây nƣớc ta đã tuyển chọn và mở rộng trồng những giống ngô lai có khả
năng chịu hạn tốt, cho năng suất cao. Ngoài ra, cũng có nhiều công trình
nghiên cứu đến khả năng chịu hạn của cây ngô. Đó là kết quả đánh giá khả
năng chịu hạn của cây ngô trên đồng ruộng [17], đánh giá khả năng chịu hạn
của cây ngô non trong điều kiện hạn nhân tạo [11], [18]), nghiên cứu ảnh
hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tạo mô sẹo của ngô [14]. Có một số công
trình nghiên cứu về ngô đã tiếp cận phân tích các đại phân tử DNA nhƣ: phân
lập gen dehydrin dhn1/rab17 từ DNA genome [6]), phân lập gen dehydrin từ
cDNA [25]). Những nghiên cứu ở mức độ phân tử nhằm mục đích tìm kiếm
và phân tích gen liên quan đến đặc tính chịu hạn của cây ngô. Các nghiên cứu
đều thống nhất rằng đặc tính chịu hạn của cây ngô nói riêng và cây trồng nói

chung do nhiều gen quyết định, trong đó có gen cystatin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo giống ngô theo hƣớng
nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Đánh
giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin ở một số giống ngô chịu
hạn khác nhau”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Xác định đƣợc mức độ chịu hạn của một số giống ngô ở giai đoạn cây non.
-Xác định đƣợc mối liên quan giữa hoạt tính của enzyme α – amylase,
protease, chiều dài rễ với khả năng chịu hạn của một số giống ngô.
- Phân lập và xác định đƣợc trình tự gen cystatin ở một số giống ngô có khả
năng chịu hạn khác nhau.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá khả năng chịu hạn bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo ở giai đoạn
3, 5, 7, 9 ngày gây hạn.
- Xác định hoạt tính của α – amylase, protease trong hạt của 10 giống ngô
nghiên cứu.
- Xác định chiều dài rễ 5 ngày tuổi ở giai đoạn cây non.
- Tách chiết DNA tổng số của 10 giống ngô nghiên cứu.
- Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân gen cystatin ở một số giống ngô.
- Tách dòng gen cystatin ở 2 giống ngô: một giống chịu hạn tốt và một giống
chịu hạn kém.
- Xác định trình tự gen cystatin ở giống ngô có khả năng chịu hạn kém.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY NGÔ
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., là một loại cây lƣơng thực
thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo (Gramineae), bộ hòa thảo (Graminales).
Căn cứ vào kết quả nghiên cứu khảo cổ học, tế bào học, di truyền học…cho
thấy cây ngô có nguồn gốc từ Châu Mỹ, ngô lan truyền sang Châu Âu và
phần còn lại của thế giới sau khi có sự tiếp xúc của ngƣời Châu Âu với Châu
Mỹ. Ở Việt Nam ngô đƣợc trồng vào thế kỷ thứ XVII.
Dựa vào hạt có mày hay không có mày, hình thái bên ngoài và cấu trúc
nội nhũ của hạt, ngô đƣợc phân thành các loài phụ: ngô bọc, ngô đá, ngô răng
ngựa, ngô đƣờng, ngô nổ, ngô bột, ngô nếp, ngô đƣờng bột, ngô bán răng
ngựa. Từ các loài phụ căn cứ vào màu sắc hạt và màu sắc lõi ngô để phân
thành các thứ. Đây là cách phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngoài ra ngô
còn đƣợc phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trƣởng và
thƣơng phẩm [8].
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Ngô là cây lƣơng thực chỉ thấy ở dạng cây trồng bao gồm các bộ phận:
rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt.
Ngô có hệ rễ tiêu biểu cho bộ rễ cây hòa thảo. Tuy nhiên ngô có bộ rễ
phát triển rất mạnh, nên có khả năng hút nƣớc rất khỏe, hơn nhiều loài cây
trồng khác. Hệ rễ của cây ngô hoàn chỉnh chia thành 3 nhóm: rễ mầm, rễ đốt,
rễ chân kiềng. Rễ mầm mọc từ trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút
nƣớc, thức ăn khi cây còn non. Rễ đốt mọc vòng quanh các đốt thấp của thân.
Đây là loại rễ quyết định quá trình sinh trƣởng phát triển của cây ngô, nó giúp

cây hút nƣớc và các chất dinh dƣỡng suốt đời sống của cây. Rễ chân kiềng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4

mọc quanh các đốt thấp sát mặt đất. Rễ này giúp cây chống đỡ và bám chặt
vào đất, chúng cũng tham gia hút nƣớc và thức ăn. Số lƣợng rễ, số lông rễ và
độ dài rễ khác nhau ở mỗi giống. Đây là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá
khả năng chịu hạn của cây.
Thân ngô đặc, đƣờng kính từ 2 - 4 cm, cao từ 1,8 - 2 m. Thân ngô
trƣởng thành bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ.
Thân ngô ngoài nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận
chuyển chất hữu cơ, ngoài ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất
hữu cơ.
Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Các bộ phận
của lá bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa lá. Theo hình thái và vị trí trên thân, lá
ngô đƣợc chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá bẹ, lá bi. Số lá, độ lớn của
lá phụ thuộc vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác, mùa vụ, số lá
ngô thƣờng biến động từ 15 - 20 lá. Đặc điểm nổi bật là lá ngô có rất nhiều
khí khổng. Trung bình một lá ngô có từ 2 - 6 triệu khí khổng, trên 1mm
2
lá có
từ 500 - 900 khí khổng. Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ
tới điều kiện hạn hán. Lá ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời
làm nhiệm vụ trao đổi khí, hô hấp, dự trữ dinh dƣỡng…
Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc. Cơ quan sinh sản đực (bông
cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây song ở những vị trí khác nhau.
Hoa đực nằm ở đỉnh cây. Hoa cái phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm
nách nhiều nhƣng chỉ có từ 1 - 3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Số
bắp trên cây phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ và phân bón.
Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi,

nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt bao xung quanh hạt là một màng nhẵn. Lớp
alơrôn nằm dƣới vỏ hạt. Nội nhũ là phần chính của hạt chứa 70 - 78% khối
lƣợng hạt với giá trị dinh dƣỡng khá cao so với các loại hạt ngũ cốc khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5

Phôi ngô có: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dƣới lá
mầm, rễ mầm và chồi mầm. Trong bốn phần này thì lá mầm thƣờng phát triển
rõ rệt nhất. Phôi ngô lớn chiếm 8 - 15% trọng lƣợng hạt. Màu sắc hạt phụ
thuộc đặc tính di truyền của giống và chủng loại, vì vậy hạt ngô có nhiều màu
sắc khác nhau nhƣ: trắng, vàng, tím, da cam, đỏ…Mỗi bắp ngô có từ 200 -
1000 hạt phụ thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh, sinh thái, trung bình mỗi
bắp có từ 500 - 600 hạt.
Quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây ngô đƣợc chia thành hai giai
đoạn: giai đoạn sinh dƣỡng và giai đoạn sinh thực. Giai đoạn sinh dƣỡng
đƣợc tính từ khi gieo đến trỗ cờ. Giai đoạn sinh thực đƣợc tính từ trỗ cờ đến
chín hoàn toàn. Căn cứ vào đặc điểm quá trình sinh trƣởng phát triển có thể
chia ra các giai đoạn sinh trƣởng phát triển quan trọng sau đây: giai đoạn hạt
nảy mầm và mọc; giai đoạn từ mọc đến 3 lá; giai đoạn từ 3 lá đến 7 lá; giai
đoạn từ 7 lá đến trổ cờ; giai đoạn từ trỗ cờ đến tung phấn, phun râu; giai đoạn
từ thụ phấn đến chín [8].
Trong từng giai đoạn cây ngô yêu cầu các điều kiện khác nhau và mỗi
giai đoạn đều có ảnh hƣởng khác nhau đến các yếu tố tạo thành năng suất và
chất lƣợng hạt ngô [8].
1.1.3. Giá trị kinh tế của cây ngô
Ngô là một trong những cây lƣơng thực quan trọng trong nền kinh tế
toàn cầu. Bên cạnh vai trò cung cấp lƣơng thực cho con ngƣời, ngô còn là
nguyên liệu quan trọng của công nghiệp chế biến thức ăn gia súc và công
nghệ sinh học. Nhiều nƣớc đang sử dụng ngô để chế biến ethanol - năng
lƣợng sạch của tƣơng lai.

Ngô là cây lƣơng thực nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, tất
cả các nƣớc trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau. Nếu nhƣ ở
châu Âu khẩu phần ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; châu Á là cơm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6

(gạo), cá, rau xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt.
Ngoài ra, bắp ngô bao tử còn đƣợc sử dụng làm rau cao cấp, lấy hạt làm
nguyên liệu chế biến các mặt hàng có giá trị dinh dƣỡng cao nhƣ sữa ngô, ngô
ngọt đóng hộp, đóng lọ…
Ngô là thức ăn giàu năng lƣợng, là thành phần quan trọng trong thức ăn
hỗn hợp cho gia súc và gia cầm. Hầu nhƣ 70% chất dinh dƣỡng trong thức ăn
tổng hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tƣởng cho đại
gia súc, đặc biệt là bò sữa.
Ngô cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp. Ngƣời ta đã sản xuất
khoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lƣơng thực - thực
phẩm, công nghiệp dƣợc và công nghiệp nhẹ.
Ngoài ra ngô còn là nguồn hàng hóa xuất khẩu có giá trị cao. Trên thế
giới hàng năm lƣợng ngô xuất nhập khẩu khoảng 70 triệu tấn đem lại nguồn
lợi nhuận kinh tế lớn [9].
Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là
cây màu quan trọng nhất đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau. Cây
ngô không chỉ cung cấp lƣơng thực cho ngƣời, vật nuôi mà còn là cây trồng
xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn [4].
1.1.4. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô
Thành phần hydratcacbon ở ngô chủ yếu là tinh bột (60 - 70%), lipid
chủ yếu là acid béo, protein ở dạng zein chiếm đa số, hàm lƣợng đƣờng
khoảng 3,5%, lƣợng tro khoảng 1 - 2,4%, chất khoáng chiếm trên 60% khối
lƣợng của phôi [8].
Tinh bột ngô hình tròn, hình đa diện, góc cạnh rõ rệt, kích thƣớc

khoảng 8 - 35 µm. Tinh bột tập trung chủ yếu ở nội nhũ và đƣợc chia thành
hai dạng là tinh bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh bột sừng). Đặc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7

điểm tinh bột của nội nhũ hạt là một tiêu chuẩn để phân loại loài ngô phụ.
Hàm lƣợng tinh bột ở ngô tẻ (68%) nhiều hơn ở ngô nếp (65%) [8].
Tỷ lệ chất béo trong hạt ngô tƣơng đối cao (3 - 6%), chủ yếu tập trung
trong mầm ngô. Trong chất béo của ngô có 50% là acid linoleic, 31% là acid
oleic, 13% là acid panmitic và 3% là stearic. Hàm lƣợng lipid là một chỉ tiêu
quan trọng để đánh giá chất lƣợng hạt [5].
Tỷ lệ protein trong hạt ngô 8 - 12%. Protein chính của ngô là zein, một
loại prolamin gần nhƣ không có lysine và tryptophan. Protein của ngô đƣợc
chia thành 3 loại chính: protein hoạt tính (enzyme), protein cấu tạo và protein
dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất. Hàm lƣợng protein cũng
nhƣ các thành phần amino acid bị thay đổi bởi những tác động của các yếu tố
di truyền (giống) và môi trƣờng, kỹ thuật canh tác.
Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm. Ngô cũng có
nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6 ). Vitamin PP hơi thấp cộng với
thiếu tryptophan một amino acid có thể tạo vitamin PP. Riêng ngô vàng chứa
nhiều carotene (tiền vitamin A) [9].
1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam
1.1.5.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
Với những giá trị kinh tế và sử dụng của mình, cây ngô đƣợc xem là
cây lƣơng thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu chỉ đứng thứ ba sau lúa
gạo và lúa mỳ. Ngô là cây có địa bàn phân bố rộng nhất thế giới, trải rộng từ
40
o
N đến gần 55
o

B, từ độ cao 1 - 2 m đến 400 m so với mực nƣớc biển [9].
Do đó ngô đƣợc trồng ở hầu hết các nơi trên thế giới nhƣ Châu Mỹ, Châu Âu,
Châu Úc, Châu Phi và Châu Á. Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô giữa các
châu lục có sự chênh lệch nhau tƣơng đối lớn đƣợc thể hiện ở bảng 1.1 [58].
Diện tích trồng ngô giữa các châu lục có sự chênh lệch nhau,
trong đó Châu Mỹ là khu vực có diện tích trồng ngô lớn nhất, năm 2008 là
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8

60,4 triệu ha đến năm 2010 là 63,1 triệu ha, chiếm gần 40% diện tích ngô trên
toàn thế giới. Đứng thứ hai là Châu Á chiếm 33,2%. Châu Âu có diện tích
trồng ngô thấp, chiếm khoảng 8,7% diện tích trồng ngô thế giới. Châu Mỹ là
khu vực có năng suất cao nhất đạt 71,0 tạ/ha, đứng thứ hai là khu vực Châu
Âu: 60,6 tạ/ha, thấp nhất là Châu Á: 45,8 tạ/ha (năm 2010). Sở dĩ Châu Á có
năng suất thấp nhƣ vậy là do khu vực này có điều kiện bất thuận nhƣ; hạn
hán, lũ lụt, đất canh tác chƣa thuận lợi.
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn
2008 - 2010
Khu vực
Diện tích
(Triệu ha)
Năng suất
(Tạ/ha)
Sản lượng
(Triệu tấn)

2008
2009
2010
2008

2009
2010
2008
2009
2010
Châu Âu
15,4
13,8
14,1
60,5
60,7
60,6
93,2
84,0
85,6
Châu Á
52,4
53,5
53,7
45,5
43,8
45,8
238,4
234,5
246,1
Châu Mỹ
60,4
61,4
63,1
68,6

71,9
71,0
439,5
441,5
447,9
Thế giới
161,2
158,8
161,9
51,3
51,6
52,1
827,5
819,7
844,4
(Nguồn FAOSTAT, 2011)
Giai đoạn 2008 - 2009, Châu Mỹ có năng suất tăng mạnh, tăng 3,3 tạ/ha;
Châu Âu tăng nhẹ: 0,2 tạ/ha; khu vực Châu Á có năng suất giảm (giảm 1,7
tạ/ha) do các điều kiện bất thuận. Về sản lƣợng, Châu Mỹ là khu vực dẫn đầu
sản lƣợng ngô trên toàn thế giới, năm 2008 đạt 439,5 triệu tấn chiếm 53,1%
tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế giới. Đứng thứ hai là khu vực Châu Á đạt
238,4 triệu tấn, chiếm 28,8% tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế giới. Năm 2010
Châu Mỹ đạt 447,9 triệu tấn, chiếm 53,0% tổng sản lƣợng ngô trên toàn thế
giới, khu vực Châu Á đạt 246,1 triệu tấn, chiếm 29,1% tổng sản lƣợng ngô
trên toàn thế giới.
Nhƣ vậy, trong giai đoạn từ năm 2008 đến năm 2010 diện tích trồng
ngô trên toàn thế giới tăng không đáng kể, nhƣng do áp dụng các thành tựu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9

khoa học kỹ thuật tiên tiến, đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngô lai
nên năng suất và sản lƣợng ngô của thế giới có sự nhảy vọt, nhất là ở các
nƣớc có nền kinh tế phát triển có điều kiện thâm canh cao và sử dụng 100%
giống ngô lai trong sản xuất. Bên cạnh đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học
tạo ra các giống ngô chuyển gen có năng suất cao, có khả năng chống chịu
sâu bệnh cũng góp phần đƣa sản lƣợng ngô thế giới tăng cao. Tình hình sản
xuất ngô ở các nƣớc trên thế giới cũng có sự khác nhau [58].
Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 2010
Tên nước
Diện tích
(Triệu ha)
Năng suất
(Tạ/ ha)
Sản lượng
(Triệu tấn)
Argentina
2,90
78,12
22,68
Mỹ
32,96
95,92
316,17
Brazin
12,81
43,75
56,06
Trung Quốc
32,52
54,60

177,54
Ấn Độ
7,18
19,60
14,10
(Nguồn FAOSTAT, 2011)
Trên thế giới, Mỹ là nƣớc có diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô lớn
nhất đạt 32,96 triệu ha, với tổng sản lƣợng đạt 316,17 triệu tấn, năng suất bình
quân đạt 95,92 tạ/ha. Kết quả trên có đƣợc, trƣớc hết là nhờ sự đầu tƣ cho
nghành nông nghiệp, không ngừng cải thiện các kỹ thuật canh tác, đồng thời
ứng dụng công nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống đã góp phần đƣa năng
suất và sản lƣợng ngô của nƣớc này cao hơn các nƣớc khác. Các giống cây
trồng chuyển gen đƣợc tạo ra nhờ công nghệ sinh học đã đƣợc trồng phổ biến,
đem lại lợi nhuận nông nghiệp cao, trong đó nƣớc Mỹ tập trung vào các cây
mũi nhọn là bông, đậu tƣơng và ngô.
Có thể nói Mỹ và Trung Quốc là hai nƣớc có diện tích trồng ngô lớn
nhất và cao gấp nhiều lần so với các quốc gia khác. Mỹ và Trung Quốc, cùng
với Ấn Độ là những nƣớc xuất khẩu ngô lớn, các nƣớc nhập khẩu ngô chính
là Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Malaysia, Mexico, châu Phi…[9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10

1.1.5.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
Trƣớc đây, sản xuất ngô ở Việt Nam còn nhỏ lẻ và phân tán, chủ yếu là
tự cung tự cấp theo nhu cầu của hộ nông dân. Ngành sản xuất ngô nƣớc ta
thực sự có những bƣớc tiến vọt do áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật,
đặc biệt là việc sử dụng các giống ngô lai và mở rộng diện tích trồng ngô lai
vào sản xuất, kết hợp các biện pháp kỹ thuật canh tác theo yêu cầu của giống
mới.
Bảng 1.3. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô của Việt Nam từ

2006 - 2010
Năm
Diện tích
(1000 ha)
Năng suất
(tấn/ha)
Sản lượng
(1000 tấn)
2006
1033,10
3,73
3854,50
2007
1096,10
3,93
4303,20
2008
1440,20
3,18
4573,10
2009
1089,20
4,01
4371,70
2010
1126,39
4,09
4606,80
(Nguồn FAOSTAT, 2011)
Từ năm 2006, năng suất và sản lƣợng ngô của Việt Nam đã có những

bƣớc nhảy vọt cao nhất từ trƣớc tới nay. Tốc độ tăng trƣởng diện tích, năng
suất và sản lƣợng ngô của Việt Nam cao hơn nhiều lần, lợi nhuận trồng ngô
lai cao hơn hẳn các loại cây trồng khác. Năm 2006, diện tích trồng ngô của cả
nƣớc (trong đó diện tích trồng ngô lai chiếm ƣu thế) đạt 1.033.100 ha, tổng
sản lƣợng trên 3.730.000 tấn. Năm 2008, diện tích trồng ngô tăng lên
1.440.200 ha, tổng sản lƣợng lên tới hơn 4.573.100 tấn. Đến năm 2009, do
quá trình công nghiệp hóa diễn ra mạnh, diện tích đất dành cho các ngành
công nghiệp và du lịch đƣợc mở rộng, diện tích đất nông nghiệp bị giảm nên
diện tích trồng ngô ở nƣớc ta giảm còn 1.089.200 ha và sản lƣợng cũng giảm
xuống còn 4.371.700 tấn (giảm 4,4% so với năm 2008). Nhờ việc đƣa các
giống ngô lai chịu hạn, năng suất cao nhƣ C919, LVN10,…và các giống ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11

lai do Viện nghiên cứu ngô cung cấp vào sản xuất đã đƣa năng suất ngô trong
nƣớc tăng lên dù diện tích và sản lƣợng đều giảm. Năm 2010 diện tích trồng
ngô đạt 1.126.390 ha, tăng 3,3% so với năm 2009, sản lƣợng đạt trên
4.606.800 tấn, cao nhất từ trƣớc tới nay [58].
Tuy nhiên, sản lƣợng ngô của Việt Nam vẫn thấp hơn so với sản lƣợng
ngô thế giới. Có nhiều nguyên nhân khiến sản lƣợng ngô của nƣớc ta chƣa
cao nhƣ: do chƣa tập trung sản xuất ngô, do điều kiện khí hậu, tập quán canh
tác,…Ngoài ra, tại một số vùng miền núi khó khăn về sản xuất lúa nƣớc nên
nông dân phải trồng ngô làm lƣơng thực thay thế gạo, làm thức ăn chăn nuôi.
Các giống ngô đƣợc trồng đều là các giống truyền thống của địa phƣơng,
giống cũ nên năng suất rất thấp. Do đó, sản lƣợng ngô trong nƣớc không đủ
phục vụ cho con ngƣời cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi. Hàng năm
Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một lƣợng lớn ngô, đậu tƣơng làm thức ăn cho
gia súc. Chính vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu để có biện pháp cải tạo giống
ngô theo hƣớng tăng năng suất và chất lƣợng là rất cần thiết.
1.2. ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ

1.2.1. Hạn và ảnh hưởng của hạn tới cây trồng
1.2.1.1. Khái niệm hạn
Nƣớc là thành phần bắt buộc của tế bào sống, có nƣớc thực vật mới
hoạt động bình thƣờng đƣợc. Nhƣng hàm lƣợng nƣớc trong thực vật không
giống nhau, thay đổi tùy thuộc loài hay các tổ chức khác nhau của cùng một
loài thực vật. Hàm lƣợng nƣớc còn phụ thuộc vào thời kỳ sinh trƣởng của cây
và điều kiện ngoại cảnh mà cây sống. Cung cấp nƣớc cho cây là điều kiện
không thể thiếu đƣợc để đảm bảo thu hoạch tốt. Việc thỏa mãn nhu cầu nƣớc
cho cây là điều kiện quan trọng nhất đối với sự sống bình thƣờng của cây.
Ngƣợc lại, hạn là hiện tƣợng xảy ra khi cây bị thiếu nƣớc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12

Hạn là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nƣớc của thực vật do môi trƣờng
gây nên làm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Hạn cũng
có thể đƣợc định nghĩa là sự thiếu lƣợng nƣớc do mƣa hoặc tƣới nƣớc trong
một thời gian dài tạo ra sự cạn kiệt độ ẩm trong đất và gây nên tổn thƣơng cho
thực vật [12]. Có ba loại hạn cơ bản: hạn đất, hạn không khí và hạn sinh lý.
Hạn đất xảy ra khi lƣợng nƣớc dự trữ cho cây hấp thu trong đất bị cạn kiêt
nên cây không hút đủ nƣớc và mất cân bằng nƣớc. Hạn không khí xảy ra khi
độ ẩm không khí quá thấp làm cho quá trình thoát hơi nƣớc của cây quá
mạnh, cây không hút đủ nƣớc và dẫn đến mất cân bằng nƣớc trong cây. Hạn
sinh lý xảy ra do trạng thái sinh lý của cây không cho phép cây hút đƣợc nƣớc
mặc dù trong môi trƣờng không thiếu nƣớc. Hạn sinh lý kéo dài cũng tác hại
nhƣ hạn không khí và hạn đất. Nếu hạn đất kết hợp với hạn không khí thì mức
độ tác hại với cây tăng lên gấp nhiều lần.
1.2.1.2. Ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng
Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển trong điều kiện khô
hạn gọi là cây chịu hạn. Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với hạn.
Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho sự sinh trƣởng và phát triển của

cây, giảm năng suất sinh học.
Hạn tác động lên cây theo hai hƣớng chính là làm tăng nhiệt độ cây và
gây mất nƣớc trong cây [12]. Mức độ thiếu hụt nƣớc càng lớn thì càng ảnh
hƣởng xấu đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây, nếu thiếu nƣớc nhẹ
sẽ làm giảm tốc độ sinh trƣởng, thiếu nƣớc trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo
nguyên sinh chất làm tăng cƣờng quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt
nƣớc, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thƣơng và
chết.
Đối với thực vật nói chung và cây ngô nói riêng, hạn ảnh hƣởng nhất
tới hai quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây đó là giai đoạn cây non và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13

giai đoạn ra hoa. Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng
suất gieo trồng. Nó làm giảm 50% năng suất cây trồng và có khi còn hơn thế
nữa.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn của cây ngô
Ngô là cây trồng không đòi hỏi nhiều nƣớc và có khả năng chịu hạn
cao. Để tổng hợp đƣợc 1 kg chất khô ngô cần 260 - 349 kg nƣớc, trong khi
lúa cần 400 - 500 kg, đậu tƣơng cần 500 - 530 kg. Trong quá trình nảy mầm
thì nhu cầu về nƣớc của ngô chỉ là 30%, còn của đậu tƣơng là 50% [12].
Nhu cầu về nƣớc và khả năng chịu hạn của cây ngô qua từng thời kỳ sinh
trƣởng có khác nhau. Ở thời kỳ đầu cây ngô phát triển chậm, tích lũy ít chất xanh
nên không cần nhiều nƣớc. Ở thời kỳ 7 - 13 lá ngô cần 28 - 35 m
3
nƣớc/ngày/ha.
Thời kỳ xoắn nõn, trổ cờ, phun râu cần 65 - 70 m
3
nƣớc/ngày/ha. Ở giai đoạn cây
non khi gặp hạn cây có thể dễ dàng vƣợt qua, nếu ở những giai đoạn sau nhƣ

giai đoạn từ 10 lá, trỗ cờ, tung phấn, phun râu mà gặp hạn thì dẫn đến năng
suất giảm đáng kể.
Đặc tính chịu hạn của cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng mang
tính đa gen. Trên thực tế vẫn chƣa tìm đƣợc gen thực sự quyết định tích chịu
hạn của cây ngô mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn. Để
đánh giá tính chịu hạn của cây ngô ngƣời ta dựa vào các đặc điểm nhƣ: hình
thái bộ rễ, kích thƣớc lá, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, tỷ lệ cây hai
bắp, tỷ lệ cây không bắp, sự chênh lệch thời gian tung phấn và phun râu, các
gen quy định tính chịu hạn…[14].
1.2.3. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và di truyền của tính chịu hạn của cây ngô
1.2.3.1. Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn của cây ngô
Trong điều kiện thiếu nƣớc cực đoan cây ngô có hai cơ chế chủ yếu để
chống chịu hạn, đó là sự thích nghi và phát triển của bộ rễ, đồng thời duy trì
áp suất thẩm thấu của tế bào để hút đƣợc nhiều các phân tử nƣớc từ môi
trƣờng [12].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14

Vai trò của bộ rễ: nhiều nghiên cứu cho thấy cây ngô sống trong môi
trƣờng thiếu nƣớc có bộ rễ dài, khỏe, mập, có sức đâm sâu hơn để hút đƣợc
nƣớc ở những tầng đất sâu. Rễ ngô có khả năng đâm sâu gần 2 m và lan rộng
trên 2 m. Rễ ngô có khả năng phân nhánh rất mạnh với sự phát triển đặc biêt
của lông hút (ƣớc tính trên 1mm
2
bề mặt rễ ngô có trên 400 lông hút). Vì vậy
cả bộ rễ ngô có tổng số bề dài và bề mặt tiếp xúc với đất rất rộng để hút đƣợc
nhiều nƣớc hơn khi gặp hạn [14].
Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu: là một đặc tính của tế bào khi
tế bào bị mất nƣớc do hạn, nóng, lạnh…Khi tế bào bị mất nƣớc dần dần, các
chất hòa tan sẽ đƣợc tích lũy trong tế bào chất (nhƣ: đƣờng, acid hữu cơ,

amino acid, các ion…), các chất này có tác dụng điều chỉnh áp suất thẩm thấu.
Áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận đƣợc những phân tử
nƣớc ít ỏi còn trong đất. Bằng cơ chế nhƣ vậy thực vật có thể chịu đƣợc sự
mất nƣớc trong thời gian ngắn [16].
1.2.3.2. Cơ sở hóa sinh của tính chịu hạn của cây ngô
Chịu hạn ở thực vật thƣờng là kết quả của nhiều cơ chế đáp ứng stress
hoạt động đồng thời. Một số cơ sở hóa sinh của tính chịu hạn bao gồm: hoạt
độ enzyme



- amylase, protease, acid abscisic (ABA), proline…
Enzyme

- amylase thuộc nhóm hydrolase có trong cơ thể động vật
(nƣớc bọt, tụy tạng), thực vật (hạt hòa thảo nảy mầm), nấm mốc, vi khuẩn. Ở
thực vật, sự tăng hoạt độ của

- amylase sẽ làm tăng hàm lƣợng đƣờng do
tinh bột bị thủy phân, nên làm ảnh hƣởng tới sự điều hòa áp suất thẩm thấu
khi cây gặp hạn. Vì thế, dựa vào sự biến động hàm lƣợng

- amylase cũng có
thể sơ bộ đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu.
Protease đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể thực vật, nhất là trong
thời kỳ nảy mầm của hạt. Nó tham gia vào quá trình phân giải protein dự trữ
trong hạt nhằm cung cấp amino acid cho thời kỳ phát triển đầu tiên của cây.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15

Protease cũng tham gia vào phân giải các protein lạ hoặc protein bị biến tính
khi gặp điều kiện cực đoan (hạn, lạnh, nóng…) [7].
Abscisic acid (ABA) là hocmone thực vật liên quan đến sự điều chỉnh
sinh lý, sinh trƣởng và phát triển, đáp ứng với môi trƣờng của thực vật bậc
cao. ABA đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình của tế bào thực vật
nhƣ: sự phát triển của hạt, sự ngủ, sự nảy mầm, sinh trƣởng phát triển, đáp
ứng với stress của môi trƣờng. ABA chủ yếu đƣợc tổng hợp ở rễ cây do phản
ứng với stress của môi trƣờng. Khi cây gặp hạn, ABA có vai trò điều chỉnh sự
trao đổi nƣớc trong cây hạn chế sự mất nƣớc và làm cây thích nghi đƣợc với
điều kiện khô hạn. Về cơ chế ngƣời ta cho rằng ABA làm biến đổi điện hóa
qua màng và do đó điều tiết sự tiết ion K
+
[16].
Proline là một amino acid có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội bào và
các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu trong
tế bào, đồng thời là một amino acid ƣa nƣớc có khả năng giữ và lấy nƣớc cho
tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na
+
tƣơng tác với protein màng, ngăn
chặn sự phá hủy của màng và các phức protein khác. Các kết quả nghiên cứu
đều cho thấy khi cây trồng gặp hạn thì cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng
hợp proline [7].
1.2.3.3. Cơ sở di truyền của tính chịu hạn của cây ngô
Tính chịu hạn ở cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng do nhiều gen
quy định, các gen liên quan đến tính chịu hạn đã đƣợc phân lập nhƣ: HSP,
LEA, LTP, P5CS, cystatin…

HSP (Heat Shock Protein)
HSP có ở hầu hết các loài thực vật và chiếm khoảng 1% protein tổng số
của lá. HSP xuất hiện trong cả các quá trình sinh trƣởng bình thƣờng và các

giai đoạn biệt hóa mô của thực vật, chúng đƣợc tổng hợp thêm trong điều kiện
cực đoan của môi trƣờng. Dựa vào khối lƣợng phân tử, ngƣời ta phân loại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16

HSP ở thực vật ra làm 6 nhóm: HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP20,
HSP8,5 [48].
Trong đó, nhóm HSP70, HSP60 có đại diện của chất môi giới phân tử
(MGPT), MGPT là một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau, chúng tham gia
tạo cấu trúc không gian đúng cho phân tử protein mới tổng hợp, chuyển protein
qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự huỷ hoại của
protein chƣa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu sự phân giải protein bị biến tính.
Nhóm HSP 8,5 (Ubiquitin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhƣng không
phải là MGPT, chúng có hoạt tính proteinase và thực hiện chức năng phân
giải protein nhƣng không có hoạt tính enzyme, ngăn chặn các protein này gây
độc cho tế bào.
Các nhóm HSP100, HSP90 đều có tính bảo thủ cao và có hoạt tính
ATPase. Một số tìm thấy trong tế bào bình thƣờng nhƣng phần lớn chúng
sinh ra khi gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, nóng, lạnh. Chức
năng chính của chúng là ngăn chặn sự co cụm của protein và tái hoạt hoá
protein biến tính [45].
Trong tế bào thực vật, HSP tập trung thành các hạt sốc nhiệt HSG (Heat
Shock Granules). Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử, các hạt HSG gồm các
hạt HSP và mRNA. Các HSP gắn kết trên các RNA polymerase để ngăn cản
sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình bị stress nóng. Sau sốc nóng,
các hạt này phân tán và liên kết dày đặc với các ribosome hoạt động sinh tổng
hợp protein [42].

LEA (Late embryogenis abudant protein)
Khi cây trồng gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ: nóng, lạnh,

phèn, mặn, hạn,…làm cho tế bào bị mất nƣớc, LEA là loại protein đƣợc tổng
hợp với số lƣợng lớn trong giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi, nó là
một trong những nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện mất nƣớc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17

của tế bào. Nhóm gen mã hóa loại protein LEA còn đóng vai trò quan trọng
trong sự chịu khô của hạt. Khi hiện tƣợng mất nƣớc xảy ra, RNA của chúng
xuất hiện trong hạt đang hình thành và dần trở thành một lƣợng lớn gồm
nhiều loại RNA thông tin khác nhau trong hạt chín và bị phân giải hết trong
quá trình nảy mầm. Ngoài ra LEA không những điều chỉnh quá trình mất
nƣớc khi hạt chín, mà còn hạn chế sự mất nƣớc bắt buộc do các điều kiện
ngoại cảnh bất lợi gây ra.
Mức độ phiên mã của gen LEA đƣợc điều khiển bởi ABA và mức độ
mất nƣớc của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào. Nhiều gen LEA đã đƣợc
nghiên cứu, phân lập, xác định chức năng. Một đặc điểm nổi bật của nhóm
protein này là: giàu acid amin không ƣa nƣớc, không chứa cystein và
tryptophan, có vùng xoắn

và có khả năng chịu nhiệt. Chúng thay thế vị trí
nƣớc trong tế bào và thực hiên các chức năng nhƣ: cô lập ion, bảo vệ protein
màng tế bào, hủy protein biến tính và điều chỉnh áp suất thẩm thấu [12],[50].



LTP (Lipid Transfer Protein)
Các protein vận chuyển lipid LTP (Lipid Transfer Protein) là protein có
liên quan tới đặc tính chịu khô hạn ở thực vật. LTP có khả năng tạo phức với
một số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào,
giúp hạn chế sự mất nƣớc. Bên cạnh đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình

thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế
tác hại của stress môi trƣờng (muối, hạn). Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu
và đtg nhận thấy rằng hàm lƣợng của mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều
kiện stress muối, hạn hay hàm lƣợng ABA ngoại bào tăng cao [34].
LTP đƣợc chia thành hai dạng khác nhau về khối lƣợng phân tử. Dạng
thứ nhất có khối lƣợng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối
lƣợng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2). Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảo
thủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại proline [32]. Có thể
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18

nói LTP đóng vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều
kiện khô hạn.

Gen
P5CS (gen mã hóa enzyme Pyrroline-5-carboxylate synthetase)
Nhóm gen P5CS mã hóa tổng hợp pyrroline-5-carboxylate synthetase.
Enzyme P5SC giữ vai trò trung tâm trong quá trình điều hòa sinh tổng hợp
proline ở thực vật. Các nghiên cứu sử dụng enzyme này nhằm mục đích điều
khiển hàm lƣợng proline để thích ứng và tăng cƣờng khả năng chống chịu của
cây đối với các bất lợi về áp suất thẩm thấu và oxy hóa của môi trƣờng đã
đƣợc thực hiện ở nhiều loài cây khác nhau. Nhƣ vậy, sự biểu hiện của gen
P5CS mạnh sẽ làm tăng hàm lƣợng proline, có vai trò tăng áp suất thẩm thấu
của tế bào và cây trong điều kiện hạn hán [15].
1.2.4. Cystatin và vai trò của cystatin với tính chịu hạn
1.2.4.1. Cystatin
Cystatin (CYS) là một dạng protein ức chế hoạt động của cysteine
proteinase. Trong cơ thể sống, cysteine proteinase thực hiện nhiều chức năng
quan trọng nhƣ: Trƣởng thành protein, làm mới protein để phù hợp với những
thay đổi bên ngoài và loại bỏ protein bất thƣờng, protein gấp cuộn [29]. Khi

thực vật gặp hạn, cysteine proteinase hiện diện nhƣ những proteinase tham gia
vào quá trình thủy phân protein dự trữ. Quá trình này có thể bị cản trở bởi
những chất ức chế proteinase đƣợc gọi là cystatin [22].
Cystatin đƣợc phân bố ở cả thực vật, động vật và vi sinh vật cho thấy
đây là nhóm chất đóng vai trò quan trọng với sự tồn tại, sinh trƣởng và phát
triển của sinh vật [40]. Sự sai khác về kích thƣớc, khối lƣợng của phân tử
protein, về số lƣợng và vị trí các liên kết disulphide…là căn cứ để phân loại
cystatin thành 4 họ [29].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19

Cystatin họ 1, đƣợc biết là họ stefin, không chứa liên kết disulfide hoặc
các nhóm carbohydrate, nó có trọng lƣợng phân tử khoảng 11kDa, gồm 100
gốc amino acid [35].
Cystatin họ 2, là protein có hai liên kết disulfide trong chuỗi ở gần đầu
carbon cuối cùng và đƣợc glycosyl hóa, có trọng lƣợng phân tử khoảng 13 -
24 kDa với 115 amino acid [21].
Cystatin họ 3, có tên là Kininogen, bao gồm các Kininogen huyết tƣơng,
nó lớn hơn các thành viên khác của hai họ kia và hầu hết là các phức hợp
phân tử cystatin có trọng lƣợng phân tử cao (60 - 120 kDa) với khoảng 355
gốc amino acid có chứa các liên kết disulfide. Các Kininogen giữ vai trò quan
trọng trong quá trình đông tụ máu.
Ngƣời ta đã tìm thấy ở các cystatin họ I và II dạng pentapeptide Gln-
Val-Val-Ala-Gly và trình tự tƣơng đồng Gln-X-Val-Y-Gly ở các cystatin họ
II. Ngoài ra, trình tự Phe-Ala-Val đƣợc định vị gần đầu carboxyl và dipeptide
Phe-Try gần đầu amino, là trình tự bảo thủ của cystatin họ II nhƣng không tìm
thấy ở các cystatin họ I và III. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng vùng
pentapeptide và dipeptide này đóng vai trò quan trọng trong việc bám với
cysteine proteinase [35].
Ngoài ba họ trên, dựa vào sự khác nhau giữa cystatin phân lập từ động

vật và thực vật, ngƣời ta còn bổ sung thêm họ phytocystatin [44], gồm hầu hết
các chất ức chế cysteine proteinase của thực vật, chúng có tính chất chung với
hầu hết các cystatin họ I và II. Trong họ phytocystatin thì oryzacystatin từ hạt
gạo là chất ức chế nguồn gốc thực vật đầu tiên đƣợc nghiên cứu sâu sắc nhất.
Nó có mối liên hệ về mặt cấu trúc và chức năng với cystatin lòng trắng trứng
gà (Barett). Oryzacystatin cũng đƣợc xếp vào cystatin nhóm I do sự vắng mặt
của liên kết disulfide, chuỗi pentapeptide cũng đƣợc tạo thành bởi Gln-Val-
Val-Ala-Gly ( gốc thứ 57 - 61) và khối lƣợng phân tử xấp xỉ 11,5 kDal với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20

102 gốc amino acid. Trình tự amino acid của oryzacystatin giống 30% với
cystatin họ II, nó có vùng trình tự Phe-Ala-Val (gốc thứ 29 - 31) và Phe - Try
(gốc thứ 83 - 84), điều đó chứng tỏ oryzacysstatin cũng có thể xếp vào nhóm
cystatin họ II.
Các chất ức chế cysteine proteinase có nguồn gốc từ thực vật đƣợc chia
làm hai nhóm, nhóm 1 gồm chủ yếu là phytocystatin có chứa vùng đơn và
nhóm thứ 2 có chứa vùng đa, nhƣ multicystatin đƣợc phân lập từ củ khoai tây
và cystatin của lá cà chua. Cystatin phân lập từ củ khoai tây không chứa vùng
bảo thủ Gln-X-Val-Y-Gly [49]. Tám chất ức chế Bromelain dạng iso đƣợc
phân lập từ thân dứa cũng thể hiện sự khác biệt so với các cystatin khác vì
không chứa vùng bảo thủ Gln-X-Val-Y-Gly nhƣng lại có sự tƣơng đồng về
mặt cấu trúc với chất ức chế trypsin/chymotrypsin từ hạt đậu tƣơng. Từ thực
tế này ngƣời ta đã cho rằng, rất có thể các chất ức chế protease có chung
nguồn gốc [30].
Nhiều mô hình tƣơng tác giữa cystatin và cysteine proteinase đã đƣợc mô
tả. Nhìn chung có ba vùng tƣơng tác là: gốc Gly gần đầu amino, vùng bảo thủ
trung tâm Gln-Val-Val-Ala-Gly và cấu trúc kẹp tóc bậc 2 gần đầu carboxyl.
Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, liên kết disulfide không tham gia vào tƣơng
tác này [23]. Đối với oryzacystatin, Abe và Arai đã tiến hành nghiên cứu về

vùng hoạt động ức chế của nó với papain. Kết quả cho thấy, oryzacystatin bậc
một có khả năng ức chế papain, vùng Gln-Val-Val-Ala-Gly và vùng Pro - Try
là những cofactor trong tƣơng tác này [20].
Gen cystatin đã đƣợc nghiên cứu và phân lập ở: táo [43], lúa [36], carrot
[41], đậu tƣơng [37], [25], khoai tây [50], đậu đũa [31] và ngô [20].
Khi điều kiện bất lợi xảy ra, protein thƣờng bị biến tính, tế bào bị tổn
thƣơng nên cysteine proteinase tham gia vào quá trình loại bỏ protein bị biến
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21

tính làm cho cây thích nghi với các tác động của bên ngoài. Hoạt động của
cysteine proteinase lại bị ức chế bởi cystatin.
Vì vậy, nghiên cứu và phân lập gen cystatin giữa các giống ngô có khả
năng chống chịu khác nhau nhằm xác định chỉ thị phân tử trong chọn giống
ngô có khả năng chịu hạn tốt và tạo cơ sở cho việc nghiên cứu làm giảm sự
tích lũy cystatin giúp thay đổi khả năng chống chịu của cây trồng nói chung
và cây ngô nói riêng.
1.2.4.2. Cysteine proteinase
Quá trình phân giải protein ở thực vật diễn ra phức tạp với sự tham gia
của nhiều enzyme, bằng nhiều con đƣờng khác nhau trong các thành phần
khác nhau của tế bào. Trong đó, sự phân giải protein với sự tham gia của
enzyme cysteine protease chiếm tới 30% tổng hoạt động phân giải protein.
Cysteine proteinase là enzyme có vai trò thiết yếu trong quá trình sinh
trƣởng và phát triển của thực vật, sự già và chết theo chƣơng trình của tế bào,
sự tích lũy protein dự trữ trong hạt, huy động protein dự trữ và khả năng
chống chịu với những stress của môi trƣờng. Chúng tham gia vào sự hoàn
thiện protein, tái tạo protein và loại bỏ protein biến tính nhằm giúp cây thích
ứng với những tác động của môi trƣờng bên ngoài.
Cysteine proteinase hoạt động bằng cách loại bỏ đoạn amino tận trong
chuỗi polypeptide để tạo ra các enzyme hoạt động. Vùng amino tận (hay còn

gọi là proregion) không những giữ vai trò trong việc ức chế hoạt động của
enzyme mà còn giúp protein mới đƣợc tổng hợp cuộn xoắn chính xác và bảo
vệ enzyme chống lại tác động bất lợi của ngoại cảnh.
Ở động vật có xƣơng sống, cysteine proteinase liên quan đến hệ thống
phân giải protein của lysosome và giữ vai trò ngoại bào trong một vài quá
trình trao đổi chất [45]. Ở động vật không xƣơng sống nhƣ giun tròn và nhậy,
cysteine proteinase là enzyme tiêu hóa. Ở động vật chân đốt nhƣ tôm hùm,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22

chúng không những giữ vai trò trong tiêu hóa mà còn liên quan đến hệ thần
kinh [41]. Ở côn trùng, cystein proteinase tìm thấy trong cả cơ quan tiêu hoá
và một số mô khác nữa, chứng tỏ chúng giữ nhiều vai trò khác nhau [51].
Ở thực vật, cysteine proteinase đƣợc tìm thấy chủ yếu trong không bào
và có thể tham gia biến đổi protein dự trữ trong suốt quá trình nảy mầm của
hạt, điều đó cung cấp nguồn dinh dƣỡng nitơ hỗ trợ cho sự phát triển của cây
non. Ngoài ra, ngƣời ta còn tìm thấy cysteine proteinase trong môi trƣờng
ngoại bào của cây xung và cây đu đủ [42].
1.2.4.3. Gen cystatin
Gen cystatin ở thực vật mã hóa protein cystatin ức chế hoạt động của
cysteine protease. Trong những năm gần đây, cystatin đƣợc bàn luận nhiều
bởi mối liên quan của nó tới tính chống chịu yếu tố bất lợi của ngoại cảnh
nhƣ: nóng, lạnh, mặn, hạn…[39], [54], đặc biệt là tính chống chịu hạn. Khi
gen này hoạt động, sản phẩm tạo thành sẽ tham gia vào việc hạn chế sự phân
giải các chất và do đó bảo vệ các cấu trúc trong tế bào.
Đặc tính tăng sự biểu hiện của các gen cystatin trong điều kiện bất lợi
của môi trƣờng đƣợc phát hiện trên nhiều cây trồng khác nhau và từ nhiều
phần khác nhau của cây. Gen cystatin đƣợc phân lập đầu tiên từ mRNA của
cây lúa, ký hiệu là OC1 có đoạn mã hóa dài 309 nucleotide, mã hóa phân tử
protein dài 102 amino acid [19]. Ở cây đậu xanh, gen cystatin đƣợc Kang và

đtg phân lập, đọc trình tự từ mRNA và công bố tại ngân hàng gen Quốc tế có
mã số D38130 với kích thƣớc 304 nucleotide, đoạn mã hóa gồm 267
nucleotide mã hóa 88 amino acid [55]. Cũng thuộc nhóm cây đậu đỗ, gen
cystatin ở cây đậu tƣơng khá lớn, có kích thƣớc 5863bp trên đó có 4 exon và
3 intron đƣợc Misaka phân lập năm 2000 [57]. Ở cây lạc, Vũ Thị Thu Thủy
cũng đã phân lập đƣợc đoạn gen cystatin có chiều dài 461bp với 2 exon và 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23

intron; Protein do gen mã hóa có 98 amino acid [15]. So với gen cystatin phân
lập từ DNA hệ gen, gen cystatin phân lập từ mRNA chiếm số lƣợng lớn hơn.
Kết quả nghiên cứu ở ngô cho thấy, có 10 gen cystatin của ngô, các gen
ký hiệu là CC gồm có CC1, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9, và
CC10 [39]. Trong 10 gen cystatin ở ngô, có 9 gen đƣợc phân lập từ mRNA,
chỉ có gen CC1 phân lập từ DNA. Kích thƣớc gen CC1 chứa 2024bp, trong
đó có 3 exon và 2 intron, 3 exon mã hóa phân tử protein dài 134 amino acid
[56]. Sự biểu hiện của gen cystatin là khác nhau ở các thời kỳ phát triển khác
nhau của cây ngô. Trong 10 gen cystatin ở ngô, CC1 ƣu tiên biểu hiện trong
cờ non, hai gen CC8, CC10 biểu hiện trong việc phát triển hạt, 7 gen CC còn
lại biểu hiện trong hai hoặc nhiều mô khác nhau. Riêng trong điều kiện chịu
ảnh hƣởng của sự thiếu hụt nƣớc có tới 5 gen cùng biểu hiện, đó là các gen
CC2, CC3, CC4, CC5 và CC9 [39].
Trong điều kiện bất lợi (nóng, hạn, lạnh…) sự biểu hiện của gen
cystatin tăng cao hơn trong nhiều loại cây trồng, vì thế có thể sử dụng cystatin
để nâng cao khả năng chống chịu của thực vật với môi trƣờng bất lợi [54].
1.2.4.4. Chức năng của cystatin
Dự đoán kết quả về phản ứng của tế bào khi bị thiếu hụt nƣớc, Bray
(1993) đã đề cập sản phẩm của các gen tham gia duy trì chức năng tế bào
trong suốt giai đoạn mất nƣớc, đó là nhóm chất ức chế hoạt động của protease
[24]. Khi gen này hoạt động, sản phẩm tạo thành sẽ tham gia vào bảo vệ các

enzym, hạn chế sự phân giải các chất do đó bảo vệ các cấu trúc trong tế bào.
Diop và đtg (2004) đã phân lập trình tự gen VuCl từ mRNA (cDNA)
mã hóa cystatin từ lá cây đậu cô ve (Vigna unguiculata (L.) Walp.). Các
protein VuCl tái tổ hợp (rVuCl) đƣợc biểu hiện từ cDNA là một chất ức chế
hiệu quả hoạt động của papain. Sự biểu hiện của gen VuCl trong tế bào phản
ứng với tác động của các yếu tố bất lợi phi sinh học (hạn hán, ABA ngoại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24

sinh) đƣợc phân tích bởi phƣơng pháp Northern blot và Western blot. Kết quả
cho thấy, trong các mô lá của cây đậu cô ve thuộc hai giống khác nhau về khả
năng chịu hạn, các yếu tố bất lợi phi sinh học đã tạo ra sự tích tụ các
polypeptide VuCl. Sự khác nhau về mật độ tích tụ cystatin tƣơng ứng với mức
độ chịu đựng của cây đậu cô ve [27].
Việc nghiên cứu gen cystatin không những giải quyết mối liên quan của
gen với tính chống chịu hạn mà còn liên quan đến khả năng chống vi sinh vật,
chống côn trùng gây bệnh đối với cây trồng [47], [54].