kỹ thuật thao tác trên gen

1
KỸ THUẬT THAO TÁC TRÊN GEN
2
3
Nhu cầu cắt chính xác vị trí trên DNA trong tạo dòng
4
Nhu cầu cắt chính xác vị trí trên DNA trong tạo dòng
5
Tạo dòng DNA mục tiêu
được nhân bản bằng kỹ
thuật PCR
6
7
1. KỸ THUẬT PCR
8
PCR: nhân
bản sao
một đoạn
DNA mục tiêu
in vitro
Phản ứng PCR:
nhiều chu kỳ sao
mã, mỗi chu kỳ
gồm 3 bước:
- Biến tính
(denaturation)
- Bắt cặp
(annealing)
- Kéo dài
(elongation)
9

10
Các bước trong phản ứng PCR và phân tích sản phẩm
11
Các thông số ảnh hưởng đến hiệu quả nhân bản
của phản ứng PCR
- Chất lượng và nồng độ của DNA dùng làm khuôn
- Nhiệt độ bắt cặp của mồi và khuôn
- Nồng độ Mg
2+
- Nồng độ dNTP
- Thời gian của ba bước trong phản ứng
- Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
12
Mồi của PCR quyết định tính đặc hiệu
của phản ứng PCR
13
Chiều dài của mồi ảnh hưởng đến tính đặc hiệu
của phản ứng PCR
- Mồi 8bp: tần suất xuất
hiện 4
8
= 1/65.536bp,
tương đương 46.000
trình tự trên 3 x 10
9
bp ở
bộ gen người
- Mồi 17bp: tần suất
xuất hiện 4
17

= 1/18x10
9
- Mồi quá dài: thời gian
bắt cặp sẽ tăng lên
- Kích thước trung bình
tối ưu của mồi: ≈ 20bp
14
Nhiệt độ các bước trong phản ứng PCR
- Nhiệt độ các bước trong 1 chu kỳ của phản ứng PCR:
+ Nhiệt độ biến tính: thông thường 94ºC
+ Nhiệt độ bắt cặp mồi – khuôn: phụ thuộc khuôn và mồi
+ Nhiệt độ kéo dài: thông thường 72ºC (gần nhiệt độ tối ưu của Taq
DNA polymerase)
- Nhiệt độ bắt cặp quyết định tính đặc hiệu của phản ứng:
+ Thấp: nhiều sự bắt cặp không chuyên biệt, tạo nhiều sản phẩm
không đặc hiệu
+ Cao: không đảm bảo sự bắt cặp của mồi-khuôn, không cho phản
ứng khuếch đại
- Nhiệt độ bắt cặp tối ưu:
không cao và không quá
thấp hơn so với hơn
nhiệt độ tan Tm của mồi-
khuôn
- Xác định Tm bằng công
thức: Tm = (4x[G+C]) +
(2x[A+T])ºC
15
Nhiệt độ và thời gian các bước trong phản ứng PCR
16
Sản phẩm của phản ứng PCR và phân tích

- PCR phân tích: nhằm có thông tin về sự hiện diện hay không của
một trình tự DNA chuyên biệt, số lượng bản sao của gen, sự biểu hiện
của gen (RT-PCR)…
- PCR điều chế: nhằm thu được đoạn DNA, gen mục tiêu
- Phân tích sản phẩm PCR phân tích:
+ Điện di xác định kích thước sản phẩm PCR
+ Phân tích bằng enzyme cắt giới hạn
+ Lai phân tử
+ Giải trình tự
- Phân tích sản phẩm PCR điều chế:
+ Điện di phân tích sản phẩm PCR
+ Tinh chế sản phẩm PCR
+ Tạo dòng
+ Giải trình tự
17
Phân tích sản phẩm của phản ứng PCR bằng
enzyme cắt giới hạn
18
Tinh chế sản phẩm PCR điều chế
- Điện di trong gel agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp
- Cắt miếng gel chứa vạch DNA của sản phẩm khuếch đại
- Đun chảy gel trong Eppendorf
- Xử lý bằng phenol, phenol chloroform, chloroform
- Tủa bằng ethanol
Một số đặc điểm lưu ý của Taq DNA polymerase
- Tổng hợp thừa một A ở đầu 3’OH
- Không có hoạt tính 5’ exonuclease để sửa sai do vậy sản
phẩm PCR chứa nhiều base sai lệch (1/300 sau 30 chu kỳ)
19
Sản phẩm PCR bởi

Taq DNA
polymerase chứa
nhiều sai sót
20
Tạo
dòng
sản
phẩm
PCR
21
Hệ thống giới hạn, biến đổi type II
Cắt chính xác tại trình tự nhận diện:
Sau3A ↓GATC
EcoRI G↓TTAAC
PstI CTGCA↓G
SmaI CCC↓GGG
SfiI CCTGCA↓GG
22
Sản phẩm cắt của RE type II
23
Trình tự nhận diện của một số RE type II thông dụng
24
Enzyme cắt tạo đầu bằng (blunt) và đầu dính (sticky)
25
Một số enzyme khác nhau tạo đầu dính giống nhau