Nghiên cứu, xác định mối quan hệ giữa kiểu gene Halothane và chất lượng tinh dịch một số lợn đực giống nuôi tại Thái Nguyên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“Nghiên cứu, xác định mối quan hệ
giữa kiểu gene Halothane và chất lượng tinh dịch
một số lợn đực giống nuôi tại Thái Nguyên ”
Giáo viên hướng dẫn : ThS. Ngô Thành Trung
ThS. Nguyễn Quốc Trung
TS. Ngô Thị Kim Cúc
Sinh viên thực hiện : Đào Văn Hoàng
Lớp : CNSHA - K55
“Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu
cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học"
HÀ NỘI – 2013
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản
thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các cá nhân,
tập thể và đơn vị khác.
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy - ThS.
Ngô Thành Trung, bộ môn Công nghệ sinh học Động vật; thầy - ThS. Nguyễn Quốc
Trung, phó trưởng bộ môn Công nghệ sinh học Phân tử và Ứng dụng, trường Đại
học Nông nghiệp Hà Nội; cô – TS. Ngô Thị Kim Cúc, trưởng bộ môn Di truyền
giống vật nuôi, Viện Chăn nuôi Quốc gia đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chỉ
bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo và các cán bộ bộ môn Công
nghệ sinh học Động vật, khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nông nghiệp Hà

Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong trường Đại học Nông
nghiệp Hà Nội đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 4 năm học qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, công nhân viên của Trạm truyền
giống gia súc – Trung tâm vật nuôi Thái Nguyên, phòng thí nghiệm JICA – HUA
đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp trong thời gian vừa
qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn trong nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học
lớp CNSHA – K55, CNSHB – K55, CNSHA – K56, CNSHB – K56, CNSHC – K56 đã
tham gia giúp đỡ tôi rất nhiệt tình trong quá trình làm đề tài tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã
luôn ở bên tôi, chăm sóc, động viên tôi và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này.
Hà Nội, ngày 3 tháng 1 năm 2014
Sinh viên
Đào Văn Hoàng
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi
TÓM TẮT BÁO CÁO vi
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu 1
1.3 Yêu cầu 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Tổng quan về tinh dịch và thành phần tinh dịch ở lợn 3
2.2 Hình thái, cấu tạo tinh trùng và quá trình sinh tinh ở lợn 5

2.2.1 Hình thái và cấu tạo tinh trùng 5
2.2.2 Quá trình hình thành tinh trùng 7
2.3 Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch lợn 9
2.3.1 Thể tích tinh dịch 9
2.3.2 Hoạt lực tinh trùng 9
2.3.3 Nồng độ tinh trùng 10
2.3.4 Độ pH của tinh dịch 10
2.3.5 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 10
2.3.6 Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác 10
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch và tinh trùng lợn 11
2.4.1 Giống 11
2.4.2 Tuổi của lợn đực 11
2.4.3 Các yếu tố thời tiết, khí hậu 11
2.4.4 Trạng thái sức khỏe của lợn đực giống 11
2.4.5 Tần suất khai thác 12
2.4.6 Ảnh hưởng của một số gene 12
2.4.7 Chế độ dinh dưỡng 12
2.5 Tổng quan về gene Halothane trên lợn 13
2.5.1 Ảnh hưởng của gene Halothane tới chất lượng thịt 19
2.5.2 Ảnh hưởng của gene Halothane tới chất lượng tinh dịch 20
2.5.3 Ảnh hưởng của gene Halothane đến sức sinh sản 21
2.5.4 Tác động tích cực của kiểu gene Halothane 21
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
3.1 Vật liệu nghiên cứu 23
3.1.1 Đối tượng 23
3.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 23
3.2 Nội dung nghiên cứu 24
3.3 Phương pháp nghiên cứu 24
3.3.1 Phương pháp xác định pH của tinh dịch 24
3.3.2 Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng 24

3.3.3 Phương pháp xác định hoạt lực tinh trùng 26
3.3.4 Phương pháp xác định tinh trùng kỳ hình 26
3.3.5. Phương pháp xác định sức kháng của tinh trùng 26
ii
3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 27
3.3.7 Phương pháp lấy mẫu lông lợn 27
3.3.8 Phương pháp tách chiết DNA từ gốc lông lợn 27
3.3.9 Phương pháp PCR 28
3.3.10 Phương pháp cắt bằng Enzyme cắt giới hạn 29
3.3.11 Phương pháp điện di 30
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
4.1 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chất lượng tinh dịch 33
4.1.1 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu pH tinh nguyên 33
4.1.2 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu thể tích tinh dịch 34
4.1.3 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng 36
4.1.4 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu nồng độ tinh nguyên 37
4.1.5 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu kỳ hình tổng số tinh nguyên 39
4.1.6 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu sức kháng tinh trùng 41
4.1.7 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu V.A.C 42
4.2. Ảnh hưởng của gene Halothane tới chất lượng tinh dịch 44
4.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ gốc lông 44
4.2.2. Kết quả quá trình PCR nhân gene Halothane 45
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49
5.1. Kết luận 49
5.2. Đề nghị 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
iii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần hóa học tinh dịch của một số loài gia súc [9] 5
Bảng 4.1. Kết quả phân tích các chỉ tiêu tinh nguyên của các giống lợn nghiên cứu 32

Bảng 4.2. Giá trị trung bình pH tinh nguyên của 3 giống lợn nghiên cứu 33
Bảng 4.3. Giá trị trung bình thể tích tinh dịch của 3 giống nghiên cứu 34
Bảng 4.4. Giá trị trung bình hoạt lực tinh trùng của 3 giống nghiên cứu 36
Bảng 4.5. Giá trị trung bình nồng độ tinh nguyên của 3 giống nghiên cứu 38
Bảng 4.6. Giá trị trung bình kì hình tổng số tinh nguyên của 3 giống nghiên cứu 39
Bảng 4.7. Giá trị trung bình sức kháng tinh trùng của 3 giống nghiên cứu 41
Bảng 4.8. Giá trị trung bình VAC của 3 giống nghiên cứu 42
Bảng 4.9. Bảng giá trị OD các mẫu DNA ở bước sóng 260 nm 44
iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu tạo tinh trùng lợn 7
Hình 2.2. Sơ đồ quá trình sinh 8
tinh trùng 8
Hình 2.3. Sơ đồ cơ chế điều hòa 8
nội tiết quá trình sinh tinh 8
Hình 2.4. Trình tự một đoạn của gene Halothane 14
Hình 2.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gene Halothane 15
(N. Stanisic và cs, 2012) 15
Hình 2.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme HhaI 15
(N. Stanisic và cs, 2012) 15
Hình 2.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gene Halothane với DNA được tách
chiết theo phương pháp 2 16
Hình 2.8. Hình ảnh điện di sản phầm PCR sau khi ủ với Enzyme CfoI 17
(Reginaldo Gaspar Bastos và cs (2000) [34]) 17
Hình 2.9. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme BsiHKAI 18
Hình 2.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme Hin PI 19
Hình 2.11. Hình ảnh thịt PSE và DFD 20
Hình3.1. Buồng đếm Thoma 25
Hình 3.2. Vùng đếm tinh trùng 25
Hình 3.3. Cách đếm tinh trùng 25

Hình 3.4. Sơ đồ phương pháp 2 lọ xác định tính kháng 27
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình pH tinh nguyên của 3 giống lợn 33
Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình thể tích tinh dịch của 3 giống 35
Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình hoạt lực tinh trùng của 3 giống 36
Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình nồng độ tinh nguyên của 3 giống 38
Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình tỉ lệ kì hình tổng số tinh nguyên của 3 giống
40
Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình sức kháng tinh trùng của 3 giống 41
Hình 4.7. Biểu đồ thể hiện giá trị VAC của 3 giống nghiên cứu 43
Hình 4.8. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ gốc lông của các cá thể thuộc các
giống nghiên cứu 44
Hình4.9. Hình ảnh điện di DNA tách chiết từ đuôi và lông 45
Hình 4.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 46
Hình 4.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi giảm thể tích DNA đi một nửa 47
Hình 4.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với nồng độ mồi khác nhau 47
Hình 4.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với Master Mix và thành phần riêng lẻ 48
v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
< Nhỏ hơn
> Lớn hơn
± Cộng hoặc trừ
A Hoạt lực của tinh trùng (%)
C Nồng độ tinh trùng (triệu tinh trùng / ml)
V Thể tích tinh dịch (ml)
K Tỷ lệ kỳ hình (%)
V.A.C Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần xuất tinh
R Sức kháng
bp Base pair
BSA Brovin Serum Albumine
cs Cộng sự

dd Dung dịch
EDTA Etylendiamine tetra acetic acid
TE Tris.HCl/EDTA
TAE Tris.HCl/Axit Axetic/EDTA
DNA Deoxy nucleic acid
NST Nhiễm sắc thể
LH Luteinizing hormone
FSH Follicle-stimulating hormone
GH Hormone sinh trưởng
TNNT Thụ tinh nhân tạo
Nu Nucleotide
ryr1 rynodine receptor
PCR Polymerase Chain Reaction
RE Restriction Enzyme (Enzyme cắt giới hạn)
U Unit (đơn vị)
PSE pale, soft, exudative (nhạt màu, mềm, rỉ dịch)
DFD dark, firm, dry (sậm màu, cứng, khô)
HN Halothane Negative
HP Halothane Positive
GTTB Giá trị trung bình
SD Standard deviation
TÓM TẮT BÁO CÁO
Nghiên cứu nhằm đánh giá, so sánh ảnh hưởng của yếu tố giống (Piétrain
thuần, Landrace thuần và PiDu) đến chất lượng tinh dịch của 1 số lợn đực thí
nghiệm nuôi tại Trạm truyền giống gia súc - Trung tâm giống vật nuôi Thái
Nguyên, xã Hóa Thượng, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Trên cơ sở đó, tiếp
vi
tục đánh giá ảnh hưởng của kiểu gene Halothane tới chất lượng tinh dịch của các
lợn đực thí nghiệm thuộc các giống trên.
Thí nghiệm 1 – Đánh giá ảnh hưởng của nhân tố giống đến chất lượng tinh

dịch lợn: sử dụng tinh dịch 18 lợn đực giống (6 con Piétrain thuần, 6 con Landrace
thuần và 6 con lai PiDu), mỗi con lặp lại sáu lần. Đánh giá các chỉ tiêu tinh dịch
gồm pH, hoạt lực (A - %), thể tích (V - ml), nồng độ (C - triệu tinh trùng/ml), kỳ
hình (K - %), R (sức kháng của tinh trùng), V.A.C (tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần
khai thác). So sánh giá trị trung bình của các chỉ tiêu giữa các giống lợn. Kết quả:
Giống Landrace có thể tích tinh dịch trong 1 lần khai thác (V-ml) lớn nhất
(300.56±42.18), thứ 2 là giống Piétrain (275±30.66), thấp nhất là giống PiDu
(203.02±5.9) (P<0.05). Giống Piétrain và PiDu có nồng độ tinh trùng (triệu tinh
trùng/ml) tương đương (lần lượt là 263.33±10.17 và 263.064.52), giống Landrace
có nồng độ thấp hơn (220.00±5.06) (P<0.05). Giống Landrace có hoạt lực tinh trùng
(A-%) (68.50±1.10), thấp hơn hai giống Piétrain và PiDu (lần lượt là 76.56±1.00 và
77.28±0.56) (P<0.05). Giá trị V.A.C tổng hợp (tỉ tinh trùng/lần) giữa các giống có
sai khác rất rõ rệt, giống Piétrain lớn nhất (55.37±6.50), thứ 2 là giống Landrace
(45.33±6.35), thấp nhất la giống PiDu (41.29±1.60) (P<0.05). Độ pH tinh dịch giữa
hai giống Piétrain và PiDu không có sự sai khác (7.31±0.05 và 7.28±0.03), cao hơn
giống Landrace (7.11±0.03) (P<0.05). Chỉ tiêu sức kháng khác nhau rõ rệt giữa các
giống Piétrain (3897.22±59.08), Landrace (3402.78±41.39) và PiDu
(3515.83±51.46) (P<0.05).
Chỉ tiêu kì hình tổng số giữa các giống có sự khác nhau rõ rệt, giống PiDu có
giá trị lớn nhất (8.11±0.27), thứ hai là giống Landrace (7.33±0.57), thấp nhất là
giống Piétrain (5.36±0.13) (P<0.05).
Thí nghiệm 2 – Kiểm tra kiểu gene Halothane của các đực giống thí nghiệm:
Thu mẫu lông của các con đực giống từ thí nghiệm 1, kiểm tra kiểu gene Halothane,
so sánh chất lượng tinh dịch của các đực giống thuộc nhóm kiểu gene NN, Nn và
nn. Từ đó, rút ra kết luận về ảnh hưởng của kiểu gene Halothane đến chất lượng
tinh dịch lợn đực giống nghiên cứu. Kết quả: đã tách chiết thành công DNA từ các
mẫu thể hiện qua kết quả chạy điện di và đo OD kiểm tra độ tinh sạch. Đã chạy
vii
PCR nhân trình tự đặc hiệu của gene Halothane, do ảnh hưởng của một số nhân tố
chưa biết do đó chỉ hoàn thành phản ứng nhân ở một số mẫu, chưa tiến hành cắt

bằng enzyme giới hạn để kiểm tra kiểu gene. Cần phải có thí nghiệm tiếp theo để
xác định nguyên nhân và thực hiện thành công quy trình xác định kiểu gene
Halothane của lợn từ mẫu gốc lông.
viii
PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Chăn nuôi lợn trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đóng vai trò
hết sức quan trọng trong hệ thống chăn nuôi. Lợn là loài gia súc được nuôi nhiều và
cung cấp lượng thực phẩm lớn nhất cho con người. Theo số liệu thống kê ngày
01/04/2013 của Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, cả nước có khoảng 26.98
triệu con lợn, tăng 1.08% so với cùng kỳ năm 2012 [1]. Đến năm 2011, Việt Nam
đứng thứ tư trên thế giới về tổng số đàn lợn nái, sau Trung Quốc, Hoa Kỳ, Brazil và
đứng thứ hai châu Á về sản xuất thịt lợn.
Để có được những con số ấn tượng đó, ngoài những giống lợn nhập nội, một
phần đóng góp không nhỏ là do chúng ta đã sử dụng lợn đực ngoại hoặc lợn lai 2, 3,
4 và 5 máu (như lai hai máu PiDu) để cải thiện đặc tính di truyền của đàn lợn trong
nước. Các giống lợn này tạo ra tổ hợp mang ưu thế lai cao, đáp ứng được năng suất,
chất lượng thịt và hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi.
Trong cùng điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng, công tác thú y giống nhau thì có
nhiều yếu tố như: giống, nhiệt độ, độ ẩm, kiểu gene… gây hưởng đến khả năng sản
xuất và chất lượng tinh dịch. Trong đó, hai yếu tố giống và kiểu gene mà lợn mang có
ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng tinh dịch. Trong đó, Halothane là gene gây ảnh
hưởng, đã và đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu.
Hiện nay, ở Việt Nam ngành chăn nuôi đang ngày càng phát triển, các trung
tâm, công ty, trại giống đều có đàn lợn giống với quy mô khá lớn. Tuy nhiên, nguồn
giống hiện nay rất đa dạng và thường không được xác định kiểu gene Halothane. Vì
vậy, việc ứng dụng phương pháp xác định kiểu gene Halothane chính xác sẽ làm
tăng hiệu quả sản xuất, nâng cao thu nhập cho người chăn nuôi.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu
xác định mối quan hệ giữa kiểu gene Halothane và chất lượng tinh dịch một số

lợn đực giống nuôi tại Thái Nguyên”.
1.2 Mục tiêu
Đề tài thực hiện nhằm xác định 2 mục tiêu sau đây:
1
Mục tiêu 1: Xác định sự ảnh hưởng của yếu tố giống (Piétrain thuần,
Landrace thuần và lợn lai hai máu PiDu) tới chất lượng tinh dịch của lợn đực thông
qua đánh giá các chỉ tiêu của tinh dịch: Thể tích tinh dịch trên một lần khai thác (V-
ml), nồng độ tinh trùng (C-triệu/ml), hoạt lực tinh trùng (A-%), sức kháng tinh trùng
(R), chỉ tiêu tổng hợp V.A.C (tỷ/lần), tỷ lệ tinh trùng kì hình (K-%) và giá trị pH của
tinh trùng. Từ đó, rút ra sự ảnh hưởng của yếu tố giống tới chất lượng tinh dịch.
Mục tiêu 2: Xác định sự ảnh hưởng của kiểu gene Halothane tới chất lượng
tinh dịch trên các lợn đực giống từ đó xác định tương quan tổng hợp của hai yếu tố
giống và kiểu gene Halothane tới chất lượng tinh dịch.
1.3 Yêu cầu
- Sau khi xử lí thống kê bằng phần mềm SAS trong Nông nghiệp và kiểm tra
kiểu gene Halothane, xác định được sự ảnh hưởng của yếu tố giống, kiểu gene
Halothane đến chất lượng tinh dịch của các con lợn đực giống tiến hành thí nghiệm.
Các chỉ tiêu đánh giá gồm: thể tích tinh dịch (V-ml), hoạt lực tinh trùng (A-%),
nồng độ tinh trùng (C-triệu tinh trùng/ml), tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một
lần khai thác tinh (V.A.C-tổng số tinh trùng tiến thẳng trong 1 lần khai thác tinh),
độ pH của tinh dịch, tỉ lệ tinh trùng kì hình (K-%) và sức kháng của tinh trùng (R).
- Số liệu trung thực, các kết luận dựa trên so sánh thống kê.
2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về tinh dịch và thành phần tinh dịch ở lợn
Ở lợn đực ngoại, khi đã thành thục về tính dục (8 - 9 tháng tuổi và khối lượng
cơ thể đạt 90 - 100 kg), người ta có thể cho phối giống trực tiếp hay lấy tinh bằng
tay qua phương pháp nhảy giá.
Theo Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993) [10] có thể quan sát thấy lợn
đực có 3 giai đoạn xuất tinh rõ rệt như sau:

- Giai đoạn thứ 1 tiết ra 10 - 20 ml dịch trong suốt không có tinh trùng, đây gọi
là tinh thanh. Chất này có tác dụng rửa đường niệu sinh dục.
- Giai đoạn thứ 2 kéo dài khoảng 1 - 2 phút, tiết ra khoảng 100 - 120 ml, chất
này gồm tinh trùng và các chất phân tiết của các tuyến sinh dục như tiền liệt,
Cowper, tinh nang.
- Giai đoạn thứ 3 là giai đoạn bài tiết chủ yếu của các tuyến sinh dục phụ (150
- 200 ml). Số lượng tinh trùng ở giai đoạn này ít, giai đoạn này kéo dài khoảng 4 - 5
phút.
Đặc điểm của tinh dịch lợn
Đặc điểm chung
Theo Milovanov (1972) [42], tinh dịch có ba đặc điểm chung :
+ Tinh dịch là dịch tiết của cơ quan sinh dục đực khi con đực thực hiện có
kết quả phản xạ sinh dục.
+ Tinh dịch được hình thành một cách tức thời khi con đực phóng tinh, nghĩa
là lúc nó hưng phấn cao nhất trong quá trình thực hiện phản xạ giao phối.
+ Tinh dịch gồm hai thành phần cơ bản là tinh trùng và tinh thanh.
Tinh trùng là tế bào sinh dục đực, là yếu tố chính làm cho lợn nái có thể thụ
thai. Ở lợn, tinh trùng trong tinh dịch chỉ chiếm 2 - 7% (Ogiuwn f.v, 1977; Levin
K.L,1980) [8].
Tinh thanh là chất tiết của các tuyến sinh dục phụ. Ở các loài gia súc khác
nhau các tuyến này phát triển không giống nhau. Ở lợn, tuyến tinh nang và tuyến
Cowper bài tiết nhiều, cho nên tinh dịch lợn thường nghèo fructose.
Các đặc tính của tinh dịch lợn [12]
3
+ Tỷ trọng
Trong tinh dịch, tỷ trọng tinh trùng nặng hơn tinh thanh nên tỷ trọng tinh
dịch thường chịu ảnh hưởng của số lượng tinh trùng có trong tinh dịch. Trong một
mẫu tinh nếu tỷ trọng càng cao thì nồng độ tinh trùng càng đậm đặc. Tỷ trọng tinh
dịch lợn thường là 1,020 - 1,022.
+ Độ nhớt của tinh dịch

Độ nhớt của tinh dịch phụ thuộc vào tỷ trọng và thành phần chất nhầy có
trong tinh dịch. Tinh dịch lợn thường có độ nhớt là 2,4 - 2,6. Việc xác định độ nhớt
có tác dụng rất lớn trong việc tạo ra môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch, vì
môi trường phải có độ nhớt tương đương với độ nhớt tinh dịch.
+ Áp suất thẩm thấu của tinh dịch
Áp suất thẩm thấu có vai trò quan trọng đối với đời sống tinh trùng, nhất là khi
tinh trùng được pha loãng trong các môi trường nhân tạo. Nếu áp suất thẩm thấu của
môi trường đẳng trương thì sức sống tinh trùng thuận lợi. Ngược lại, nếu môi trường
nhược trương hoặc ưu trương đều có hại cho tinh trùng, vì sẽ làm cho tinh trùng teo đi
hoặc trương phồng và chết đi một cách nhanh chóng. Tinh trùng lợn đực giống có độ thẩm
thấu tương đối lớn có giá trị dao động giữa 240 và 380 mOsmol (Weitze,1990) [16].
+ Độ pH của tinh dịch
Độ pH của tinh dịch có mối tương quan nghịch với mật độ tinh trùng.
Khi còn trong phần phụ hoàn (phần túi tinh), tinh trùng có mật độ cao nên
pH của tinh dịch thấp. Ở lợn, pH từ 6,4 - 6,8.
Khi ra ngoài, tinh trùng được pha loãng với tinh thanh nên pH thường tăng
lên. Đối với lợn, tinh dịch có độ pH từ 7,2 - 7,8.
+Năng lực đệm
Năng lực đệm của một chất là khả năng ổn định lực toan, kiềm của nó khi
thêm một tác nhân toan hoặc kiềm vào chất đó. Năng lực đệm của tinh dịch lợn
thường đạt 1,300 - 1,500.
Thành phần hóa học của tinh dịch lợn
4
Tinh dịch là một chất lỏng rất phức tạp. Cho tới nay, thành phần hóa học của
nó vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhiều chất người ta mới định tính
được mà chưa định lượng.
Bảng 2.1. Thành phần hóa học tinh dịch của một số loài gia súc [9].
Thành phần Tinh dịch lợn (%) Tinh dịch bò (%) Tinh dịch ngựa (%)
Nước 95,00 90,00 98,00
Protein 3,80 5,80 1,04 - 2,28

Lipid 0,03 0,15 0,04
Fructose 0,01 0,23 - 0,87 0,005
Acid Citric 0,13 0,72 0,06
Acid Lactic 0,02 0,04 - 0,06 0,03
P tổng số 0,06 0,08 0,02
K 0,10 0,23 0,07
Na 0,28 0,28 0,07
Ca 0,09 0,02
Cl 0,33 0,22 0,48
+ Các enzyme trong tinh dịch
Trong tinh dịch có nhiều loại enzyme như: hyaluronidase, mucidase,
catalase, lipase, amynase, photphotase…, tất cả các enzyme này đều tham gia vào
quá trình sống và hoạt động của tinh trùng. Trong đó, hyaluronidase là enzyme
được tiết ra từ thể đỉnh của tinh trùng, giúp phá vỡ liên kết giữa các tế bào cumulus
bao quanh trứng, giúp cho tinh trùng thụ tinh được với trứng.
2.2 Hình thái, cấu tạo tinh trùng và quá trình sinh tinh ở lợn
2.2.1 Hình thái và cấu tạo tinh trùng
Tinh trùng gia súc nói chung có dạng con nòng nọc. Chiều dài đầu gần gấp
đôi chiều rộng, bề dày không đáng kể, do đó đầu có dạng một tấm bầu dục. Trông
thẳng đầu có hình quả trứng, trông nghiêng đầu có hình tấm hơi cong.
Tinh trùng là một tế bào đơn bội, gồm 3 phần: đầu, cổ thân và đuôi.
Đầu tinh trùng có hình bầu dục, bao gồm nhân và acrosome. Nhân chiếm
87% thể tích của đầu, là nơi chứa thông tin di truyền. Hai phần ba mặt ngoài phía
trước của đầu tinh trùng được bao bọc bởi một "mũ" dày gọi là acrosome hình thành
từ bộ máy Golgi. Acrosome là một loại lysosome đặc biệt, chứa các enzyme tương
tự như các enzyme có mặt trong các lysosome của các tế bào sinh dưỡng. Trong đó,
5
hyaluronidase là enzyme có khả năng phân giải protein. Những enzyme này đóng
vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của tinh trùng vào trứng lúc thụ tinh.
Cổ thân là phần rất ngắn, hơi eo lại, cắm vào hốc ở đáy phía sau của nhân.

Phần cổ thân chứa nhiều loại enzyme oxy hoá khử giúp cho các phản ứng trao đổi
chất của tinh trùng. Phần cổ thân đính với phần đầu rất lỏng lẻo để khi đầu xâm
nhập vào trứng thì cổ bị gãy và đuôi rơi ra.
Đuôi là phần có liên quan đến chức năng vận động. Đuôi được chia ra các
phần: đuôi giữa, đuôi chính, gốc đuôi.
- Đuôi giữa có 9 cặp vi ống ngoài, 2 vi ống trung tâm và được bọc quanh
bằng 9 sợi ưa osmi, tất cả tạo thành bó trục. Bó trục được phủ bên ngoài bằng một
bọc ty thể xếp theo đường xoắn ốc (lò xo ty thể) và kết thúc ở vòng nhẫn genesen.
Ty thể có chứa các enzyme oxy hoá và photphoryl hoá, ty thể được coi là nguồn
phát sinh năng lượng cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng.
- Đuôi chính không được bao bọc bằng ty thể mà chỉ có bó trục ở giữa và
những sợi ưa osmi vây bên ngoài. Hệ thống này được bao phủ bởi một vỏ bọc bằng
những sợi chắc, vỏ bọc này duy trì khả năng ổn định cho các yếu tố co rút của đuôi.
- Gốc đuôi không có màng sinh chất bên ngoài, các sợi trục bên không tạo
thành vòng xoắn nữa mà chúng được giải phóng ra thành chùm tơ đuôi giúp cho
tinh trùng vận động và chuyển hướng được dễ dàng.
6
Hình 2.1. Cấu tạo tinh trùng lợn
2.2.2 Quá trình hình thành tinh trùng
Quá trình hình thành tinh trùng được chia làm nhiều giai đoạn:
- Giai đoạn sinh sản: từ một tế bào tinh nguyên nó sinh sản bằng cách nhân đôi,
mục đích là tăng số lượng tế bào, nhưng số lượng nhiễm sắc thể không thay đổi.
- Giai đoạn sinh trưởng: tế bào tinh nguyên tăng cường quá trình đồng hóa, làm
cho kích thước tế bào to ra. Đến cuối giai đoạn sinh trưởng tế bào phôi được gọi là
tinh bào cấp I.
- Giai đoạn thành thục: đây là lần phân chia giảm nhiễm, từ một tế bào lưỡng
bội (2n NST) tạo thành hai tế bào đơn bội (n NST) với hai loại mang nhiễm sắc thể
giới tính khác nhau: NST X và NST Y.
- Giai đoạn hoàn chỉnh cấu tạo: tinh trùng phát triển đuôi, phía ngoài tinh trùng
được bao bọc bởi lớp màng lipoprotein có chức năng bảo vệ và dinh dưỡng cho tinh

trùng.
7
+ Nhân tế bào thu nhỏ lại và biến thành đầu tinh trùng, phần lớn tế bào chất dồn
về một phía tạo thành cổ thân. Một số thể Golgi tập trung ở đầu mút phía trước của
tiền tinh trùng tạo thành acrosome.
+ Các ty thể chuyển tới vùng cổ thân, phần lớn các tế bào chất biến đi chỉ còn
lại một lớp mỏng bao quanh miền ty thể và đuôi.
+ Quá trình biến thái xảy ra trên tế bào dinh dưỡng Sertoli trong lòng ống sinh
tinh, trong khoảng thời gian 14 - 15 ngày. Sau đó, chúng trở thành tinh trùng non và
rơi vào ống sinh tinh, được đẩy về phía phụ dịch hoàn.
- Giai đoạn phát dục: ở phụ dịch hoàn, tinh trùng non tiếp tục phát dục và thành
thục. Trong quá trình di chuyển từ đây đến cuối dịch hoàn phụ, tinh trùng phải di
chuyển với đoạn đường khá dài khoảng trên 100m nằm uốn khúc quanh co. Trong
quá trình này nhiều tinh trùng non bị phân hủy.
Các chất nội tiết liên quan đến quá trình sinh tinh bao gồm GH, FSH, LH,
Testosterone và Inhibin.
Hình 2.2. Sơ đồ quá trình sinh
tinh trùng
Hình 2.3. Sơ đồ cơ chế điều hòa
nội tiết quá trình sinh tinh
8
2.3 Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch lợn
2.3.1 Thể tích tinh dịch
Thể tích tinh dịch (V - ml) là số ml tinh dịch sau khi lọc bỏ keo phèn trong
một lần thực hiện thành công phản xạ xuất tinh. Thể tích tinh dịch phụ thuộc vào
các yếu tố: giống, kiểu gene, độ tuổi, cá thể, kỹ thuật khai thác tinh, tần suất lấy tinh
và mùa vụ lấy tinh Trong tinh dịch lợn có chứa một lượng khá lớn hạt thể selatin,
chiếm tỷ lệ 20 - 30% lượng tinh dịch, chúng là sản phẩm của tuyến Cowper. Khi
xuất tinh, những hạt thể selatin gặp enzyme vegikinase của tuyến tinh nang rồi đọng
lại thành những tinh thể lớn hơn. Sau đó, các thể này hấp phụ nước và tăng lên về

thể tích, người ta gọi đó là keo phèn (Trần Tiến Dũng và cs, 2002) [13].
Trong giao phối tự nhiên, keo phèn có tác dụng bịt lỗ tử cung không cho tinh
dịch chảy ra ngoài. Trong thụ tinh nhân tạo cần phải nhanh chóng loại bỏ keo phèn,
nếu không nó sẽ hấp phụ một phần nước trong tinh dịch và một số lượng lớn tinh
trùng. Do đó, khi xác định thể tích tinh dịch cần phải loại bỏ keo phèn bằng cách lọc
qua nhiều lớp vải gạc hoặc giấy lọc.
2.3.2 Hoạt lực tinh trùng
Hoạt lực tinh trùng (A - %) thể hiện tỷ lệ các dạng vận động của tinh trùng
trong tinh dịch. Có 3 dạng vận động của tinh trùng: vận động tiến thẳng, vận động
tại chỗ và không vận động. Tỷ lệ phần trăm của các dạng vận động này được quy
thành 3 chỉ tiêu tinh trùng vận động sau:
- Tỷ lệ tinh trùng vận động tiến thẳng - P (Progessive motility (%)): là tỷ lệ
phần trăm số tinh trùng có hoạt động tiến thẳng.
- Tỷ lệ tinh trùng vận động tại chỗ - L (Local motility (%)): là tỷ lệ phần
trăm số tinh trùng có hoạt động vòng tròn, lắc lư tại chỗ.
- Tỷ lệ tinh trùng không hoạt động - I (Immotile (%)): là tỷ lệ phần trăm số
tinh trùng không hoạt động hoặc đã chết.
Ở Việt Nam, chỉ tiêu P (tỷ lệ tinh trùng vận động tiến thẳng) được đồng nhất
với chỉ tiêu A (hoạt lực tinh trùng).
9
2.3.3 Nồng độ tinh trùng
Nồng độ tinh trùng (C - triệu tinh trùng/ml) là số tinh trùng có trong 1 ml tinh
nguyên. Nồng độ tinh trùng là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng tinh
dịch, kết hợp với chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng làm cơ sở để tính toán số liều tinh sản xuất
và hệ số pha loãng.
2.3.4 Độ pH của tinh dịch
pH được xác định bởi nồng độ ion H
+
trong tinh dịch. pH của tinh dịch liên
quan đến khả năng sống và thụ tinh của tinh trùng. pH của tinh dịch toan tính thì

tinh trùng hoạt động yếu, thời gian sống kéo dài. Ngược lại, pH của tinh dịch kiềm
tính thì tinh trùng hoạt động mạnh, thời gian sống bị rút ngắn.
Theo Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc Đại (1996) [7], pH tinh dịch lợn có
tính kiềm yếu (7.2 - 7.5).
2.3.5 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K - %) là số tinh trùng có hình dạng bất thường so
với tổng số tinh trùng đếm được trong quá trình kiểm tra. Có hai thời kỳ có thể gây
nên tình trạng kỳ hình ở tinh trùng:
- Kỳ hình ngay trong quá trình sinh tinh - tinh trùng kỳ hình sơ cấp, bắt
nguồn từ nguyên nhân có liên quan đến bệnh lý ở cơ quan sinh tinh.
- Sau khi tinh trùng được bài tiết ra - tinh trùng kỳ hình thứ cấp, bắt nguồn từ
nguyên nhân có liên quan đến ngoại cảnh hoặc kỹ thuật không đúng trong khâu xử
lý tinh dịch.
2.3.6 Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác
Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác (V.A.C - tỷ tinh
trùng/lần) là một trong các chỉ tiêu quan trọng có liên quan chặt chẽ với sức sống
tinh trùng và số liều tinh dịch có thể sản xuất được. Chỉ tiêu này dùng để đánh giá
khái quát chất lượng tinh dịch và năng lực sản xuất tinh trùng của một đực giống.
Chỉ tiêu này là tích số của V (ml), A (%), C (triệu/ml). V.A.C càng cao thì sức sản
xuất tinh trùng và chất lượng tinh dịch càng tốt. Ví dụ: V.A.C đối với lợn đực giống
từ 30 tỷ trở lên; đối với bò đực từ 4 tỷ trở lên; đối với trâu đực từ 3 tỷ trở lên là tốt
(Trần Tiến Dũng và cs, 2002) [13].
10
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch và tinh trùng lợn
2.4.1 Giống
Các giống khác nhau có phẩm chất tinh dịch khác nhau. Lợn đực nội có
phẩm chất tinh dịch thấp hơn nhiều so với giống lợn ngoại. Các giống lợn nội như:
Móng Cái, Mường Khương chỉ đạt 1 - 6 tỷ tinh trùng tiến thẳng (V.A.C) trong một
lần xuất tinh, trong khi đó các giống lợn ngoại nuôi tại Việt Nam như Yorkshire,
Landrace, Duroc trắng thì tổng số tinh trùng tiến thẳng đạt từ 16 đến 90 tỷ trong

một lần xuất tinh. Trong các yếu tố cấu thành chỉ tiêu tổng số tinh trùng tiến thẳng
thì sự khác nhau cơ bản giữa các giống lợn nhập ngoại là nồng độ tinh trùng và thể
tích tinh dịch. Các giống lợn nội có nồng độ tinh trùng từ 20 - 50 triệu/ml tinh dịch,
còn các giống lợn ngoại đạt 170 - 500 triệu/ml (Lê Xuân Cương, 1985) [6].
2.4.2 Tuổi của lợn đực
Tuổi của lợn đực có ảnh hưởng rõ rệt tới phẩm chất tinh dịch. Kennedy và
Wilkins (1984) [23] đã tiến hành đánh giá 166 lợn đực giống về các chỉ tiêu: thể tích
tinh dịch, nồng độ tinh trùng, liều lượng tinh dịch. Kết quả thu được cho thấy lợn đực
giống 24 - 29 tháng tuổi cho tinh dịch đáp ứng các chỉ tiêu trên là tốt nhất. Trong khi
những lợn đực giống dưới 9 tháng tuổi hoặc trên 30 tháng có chất lượng tinh dịch thấp
hơn.
2.4.3 Các yếu tố thời tiết, khí hậu
Thời tiết khí hậu và các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng có ảnh hưởng rõ rệt đến
phẩm chất tinh dịch. Những tháng nóng phẩm chất tinh dịch kém hơn những tháng
mát. Theo Nguyễn Tấn Anh, 1985 [8], vào mùa đông tháng 12, 1, 2 thì tổng số tinh
trùng/lần xuất của lợn Landrace nuôi tại Hà Nội đạt tương ứng là 55.4; 39.1 và 40.7
tỷ, trong khi đó chỉ đạt 27.3 - 28.7 tỷ tương ứng với các tháng thứ 8, 9; đặc biệt
tháng nóng nhất tháng là 6 và 7 số tinh trùng giảm xuống còn có 16.2 - 20.6 tỷ.
Nhiệt độ tối ưu cho khả năng sản xuất tinh của lợn là 20
o
C (Kemp và cs, 1989) [22].
2.4.4 Trạng thái sức khỏe của lợn đực giống
Trạng thái sức khỏe có ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất tinh dịch của
lợn đực giống (Leman và Rodeffer, 1976) [24]. Khi lợn đực giống bị ốm hay sức
khỏe yếu, chúng không muốn nhảy giá hay khả năng phóng tinh kém, chất lượng
11
tinh giảm. Do vậy, lợn đực giống nên được kiểm tra và tlợn dõi sức khỏe thường
xuyên để có chế độ phối giống thích hợp.
2.4.5 Tần suất khai thác
Lợn đực giống sử dụng quá nhiều dẫn đến kiệt quệ và chất lượng tinh kém.

Trái lại, khi sử dụng ít quá, lợn có cơ hội tích lũy các chất dinh dưỡng dưới dạng
mỡ, gây nên hiện tượng béo và tích mỡ dưới da, dẫn tới phản xạ kém và chất lượng
tinh kém. Do vậy, sử dụng lợn đực giống nên đúng và thích hợp với từng cá thể.
Đối với lợn ngoại tần suất khai thác thích hợp nhất là 2 lần/tuần.
2.4.6 Ảnh hưởng của một số gene
Ở lợn đực giống, có 1 số gene có ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng tinh
dịch, ví dụ như gene Halothane. Ở gene Halothane, khi gene này tồn tại ở trạng thái
đồng hợp trội (NN) thì có thể tích tinh dịch trên 1 lần khai thác (V-ml), hoạt lực tinh
trùng (A-%), nồng độ tinh trùng (C-triệu/ml), tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C)
và pH cao hơn khi lợn ở trạng thái dị hợp (Nn) (Hà Xuân Bộ và cs, 2011)[2]. Đỗ
Đức Lực và cs (2013) [4] cũng đã kết luận rằng lợn mang kiểu gene NN có thể tích
tinh dịch, hoạt lực tinh trùng cao hơn lợn mang kiểu gene Nn.
2.4.7 Chế độ dinh dưỡng
Muốn cho lợn đực giống sản xuất nhiều tinh dịch với phẩm chất tốt thì điều
quan trọng nhất là phải cung cấp cho lợn đực giống đầy đủ dinh dưỡng (protein,
khoáng và vitamin).
Protein rất quan trọng trong dinh dưỡng của lợn đực giống, khi thiếu protein
hoặc protein có chất lượng không tốt sẽ làm cho phẩm chất tinh dịch kém, ảnh
hưởng xấu tới đời con, giảm sức khỏe đực giống, sớm bị loại thải. Do vậy, việc
cung cấp protein cần chú ý cân đối các axit amin không thay thế.
Audet và cs (2004) [15] đã nghiên cứu thấy việc bổ sung vitamin có thể tác
động đến hiệu suất sinh tinh của lợn đực giống, đặc biệt trong khoảng thời gian
stress gây ra do tần suất khai thác tinh dịch cao. Vitamin quan trọng nhất là vitamin
A, D, E.
12
Vitamin A cần thiết cho sự sinh trưởng, sinh sản và kháng bệnh. Nếu thiếu
vitamin A thì tinh hoàn có thể bị teo, ống dẫn tinh bị thoái hóa gây cản trở cho sự
sản sinh tinh trùng, làm tinh dịch ít có tinh trùng hoặc tinh trùng có hoạt lực yếu.
Vitamin D có vai trò tham gia vào quá trình chuyển hóa canxi và phospho.
Nếu khẩu phần thiếu vitamin D sẽ làm ảnh hưởng đến hấp thu canxi, photpho của

cơ thể, ảnh hưởng gián tiếp đến phẩm chất tinh dịch.
Vitamin E có vai trò làm tăng khả năng tái sinh của ống sinh tinh. Chúng
kích thích tuyến yên tiết ra kích dục tố làm tăng nồng độ, chất lượng tinh trùng và
làm tăng khả năng tái sinh của ống sinh tinh. Thiếu vitamin E sẽ dẫn đến tình trạng
sản xuất tinh trùng ít và hoạt lực tinh trùng kém.
Các chất khoáng như canxi, kẽm, sắt, mangan có vai trò hoạt hóa 1 số
enzyme, tăng thể tích tinh trùng, tăng khả năng nhu cầu tình dục.
2.5 Tổng quan về gene Halothane trên lợn
Năm 1991, một nhóm các nhà khoa học đứng đầu là MacLennan lần đầu tiên
đã xác định được trình tự của gene Halothane trên lợn (Fujii và cs, 1991) [26] (hình
2.4). Ở lợn, gene Halothane nằm trên nhiễm sắc thể số 6 (6p1.1-q2.1), có chiều dài
119.871 Nu, bắt đầu từ Nu thứ 42.840.240 cho tới Nu thứ 42.960.110 (nguồn
ncbi.nlm.nih.gov), gồm 2 allen: N và n, tạo nên 3 kiểu gene NN, Nn và nn. Theo
MacLennan và cs, 1991 [26], gene đột biến lặn n là kết quả của sự đột biến C-
cytosin thành T-thymin ở vị trí base nitơ 1843 (GCGCTC thành GTGCTC) của
gene mã hóa thụ thể rynodine (ryr-1), thụ thể này nằm trong kênh phóng thích
Canxi của lưới nội bào ở tế bào cơ (Fujii và cs, 1991) [26] khiến cho axit amin ở vị
trí 615 chuyển từ Arginine thành Cysteine. Vì vậy, nó làm thay đổi chức năng và
cấu trúc của Protein trong kênh phóng thích ion, và nó được biểu hiện qua kênh ion
Canxi có lỗ thủng. Hậu quả là khi bị kích thích bởi các yếu tố stress trong thời gian
dài, kênh Canxi mở liên tục gây co cứng cơ.
Sở dĩ người ta đặt tên là gene Halothane vì trước đây, để phát hiện kiểu hình
của gene này, người ta cho lợn ngửi chất gây mê bay hơi halothane. Nếu các chi lợn
duỗi thẳng và cứng cơ thì xác định phản ứng Halothane dương tính và ngược lại
13
phản ứng Halothane âm tính khi lợn dãn cơ bình thường sau 3 phút ngửi chất gây
mê này.
Hình 2.4. Trình tự một đoạn của gene Halothane
Năm 2012, N. Stanisic và cs [33] tiến hành tách chiết DNA từ mẫu lông lợn
theo quy trình:

- Lông được rửa với cồn 90%, sau đó rửa sạch với nước cất khử trùng
- Làm khô lông, sau đó cắt gốc lông với độ dài 0.5 cm, bỏ vào ống Eppendorf
1.5ml
- Bổ sung thêm 500 µl 5% Chelex 100 và ủ ở 56
0
C trong 60 phút
- Voltex ống Eppendorf, để trong bể ổn nhiệt ở 97
0
C trong 30 phút
- Giữ ống Eppendorf ở 4
0
C chờ tới khi PCR.
N. Stanisic và cs [33] sử dụng trình tự mồi chạy phản ứng PCR nhân gene
Halothane:
Mồi xuôi có trình tự: 5’GGAGGGTTCTAAGCTCTGGG3’
Mồi ngược có trình tự: 5’TGACCCCTAGGTGCTGGAT3’
Thành phần các hóa chất của quá trình PCR nhân gene Halothane (V= 20
µl) gồm:
+ 10X PCR Buffer: 2 µl
+ dNTP Mixture (2.5 pmol/µl): 0.6 µl
+ Mồi xuôi và mồi ngược (5 pmol/µl): 0.5 µl mỗi loại
+ DNA (25 ng/µl): 1.0 µl
+ rTaq (5U/µl): 0.2 µl
+ H
2
O:15.2 µl
N. Stanisic và cs [33] tiến hành PCR với chu trình nhiệt (kết quả nhân gen
thể hiện trong hình 2.5):
+ 94
0

C – 5 phút
+ 94
0
C – 30 giây; 55
0
C – 30 giây; 72
0
C – 1 phút (30 chu kì)
14
+ 72
0
C – 5 phút
+ 4
0
C – 10 phút
Hình 2.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gene Halothane
(N. Stanisic và cs, 2012)
Bước tiếp theo, sản phẩm PCR được ủ với Enzyme cắt giới hạn HhaI ở 37
0
C
trong 2h. Sản phẩm sau khi ủ được điện di trên Agarose 1% để kiểm tra sản phẩm.
Hình 2.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme HhaI
(N. Stanisic và cs, 2012)
Năm 2000, Reginaldo Gaspar Bastos và cs [34] tiến hành tách chiết DNA,
sử dụng 2 phương pháp:
Phương pháp 1 (Bauerová và cs, 1996): [35]
- 10 gốc lông được bỏ trong 100 µl Lysis buffer
Lysis buffer gồm có các thành phần: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA,
100 mM NaCl, 2% SDS, 70 mM DTT and 0.4 mg/ml of proteinase K.
- Ủ qua đêm ở 45

0
C
- Sau đó, lấy 5µl dung dịch làm phản ứng PCR
Phương pháp 2 (Drissing và cs, 1996) [36]:
15
- Ủ 1 – 3 gốc lông ở nhiệt độ phòng (5 phút) trong dd 0.5 µl 0.1 M NaOH
- Thêm 4.5 µl 0.02M Tris.HCl (pH 7.4)
Tiến hành phản ứng PCR với thể tích 25 µl gồm các thành phần sau:
- dNTP: 200 µM
- PCR buffer: 2.5 µl
- MgCl2 1.5 mM
- Mồi: 0.2 µM mỗi mồi
+ Mồi xuôi: 5’-GTTCCCTGTGTGGCAATGGTG-3’
+ Mồi ngược: 5’-ATCTCTAGAGCCAGGGAGCAAGTTCTCAGTAAT-3’)
- Taq DNA poly-merase (CENBIOT/RS, UFRGS): 1U
- DNA extraction solution: 5µl
Tiến hành phản ứng PCR theo chu trình nhiệt:
+ 94
0
C – 4 phút
+ 94
0
C – 1 phút; 56
0
C – 1 phút; 72
0
C – 1 phút (30 chu kì)
+ 72
0
C – 7 phút

+ 4
0
C – ∞
Với quy trình trên, đoạn DNA nhân lên có chiều dài 81 bp.
Hình 2.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gene Halothane với DNA được
tách chiết theo phương pháp 2
16