đánh giá một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (nacl)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM







NGUYỄN MẠNH QUỲNH




ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÒNG LÚA
CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẶN (NaCl)






LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU

1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ

1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

2
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3
1.1. CÂY LÚA

3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa

3
1.1.2. Đặc điểm sinh học

4
1.1.3. Đặc tính sinh thái

5
1.1.4. Giá trị kinh tế

6
1.1.5. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam

7
1.2. MẶN VÀ CƠ CHẾ CHỊU MẶN

8
1.2.1. Các kiểu đất mặn

8
1.2.2. Tác hại của mặn

8
1.2.3. Các phản ứng thích nghi của thực vật đối với môi trường mặn

9
1.3. MỘT SỐ THÀNH TỰU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VÀ
CHỌN DÒNG TẾ BÀO SOMA BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN
VITRO

12

1.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA)
TRONG PHÂN TÍCH HỆ GEN CỦA CÂY TRỒNG

13
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

17
2.1. Nguyên liệu

17
2.1.1. Nguyên liệu thực vật 17
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu

17
2.2.1. Phương pháp phân tích hoá sinh

18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2.2. Phương pháp phân tích sinh lí

21
2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử

23
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng

24
2.2.5. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

24
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

25
3.1. Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc ở thế hệ R2, R3 có nguồn gốc
từ mô sẹo qua xử lí chịu mặn

25
3.1.1.Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc ở thế hệ R2

25
3.1.2.Đặc điểm nông học của các dòng chọn lọc ở thế hệ R3

29
3.1.3. Nhận xét về một số đặc điểm nông học ở các dòng chọn lọc

31
3.2. Phân tích hóa sinh các dòng chọn lọc

31
3.2.1. Đánh giá khả năng chịu mặn ở giai đoạn hạt nảy mầm

32
3.2.1.1. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hàm lượng đường khử ở giai đoạn hạt
nảy mầm

32
3.2.1.2. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase ở giai đoạn
hạt nảy mầm

35
3.2.1.3. Mối tương quan giữa hoạt độ của  - amylase và hàm lượng đường
khử

37
3.2.1.4. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hàm lượng protein tan ở giai đoạn hạt
nảy mầm

38
3.2.1.5. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của protease ở giai đoạn hạt
nảy mầm

40
3.2.1.6. Tương quan giữa hoạt độ protease và hàm lượng protein tan

42
3.2.1.7. Nhận xét về khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc ở giai đoạn hạt
nảy mầm

43
3.3. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây
mạ

43
3.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua xác định hàm lượng proline

43
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3.3.2. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc qua gây hạn nhân
tạo bằng xử lí NaCl 0,1M

46
3.3.3. Xác định chỉ số chịu mặn tương đối ở mức độ cây mạ

47
3.3.4. Nhận xét về khả năng chịu mặn của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây
mạ

48
3.4. Đánh giá sự thay đổi ADN hệ gen của một số dòng lúa chọn lọc qua xử lí
chịu mặn.

49
3.4.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số

49
3.4.2 Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD

51
3.4.2.1. Số phân đoạn ADN xuất hiện và đa hình về phân đoạn ADN được
nhân bản

51
3.4.2.2. Sự khác nhau của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân
tử

59
3.4.3. Nhận xét sự thay đổi ADN trong hệ gen của các dòng lúa chọn lọc và

giống gốc

61
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

62
TÀI LIỆU THAM KHẢO

64
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Hạt các dòng chọn lọc thế hệ R1 và giống gốc

17
Bảng 2.2. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD được sử dụng trong
nghiên cứu

23
Bảng 3.1. Đặc điểm nông học và mức độ biến dị các dòng lúa chọn lọc thế hệ
R2

27
Bảng 3.2. Đặc điểm nông học các dòng chọn lọc từ giống CR203

30
Bảng 3.3. Hàm lượng protein, đường khử trong hạt của các dòng chọn lọc và
giống gốc

32
Bảng 3.4. Hàm lượng đường khử của các dòng chọn lọc ở giai đoạn hạt nảy
mầm khi xử lí bằng dùng dịch NaCl 0,1M

33
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase trong giai
đoạn hạt nảy mầm

35
Bảng 3.6. Tương quan giữa hoạt độ của  - amylase và hàm lượng đường khử
ở giai đoạn hạt nảy mầm

37
Bảng 3.7. Hàm lượng protein tan trong giai đoạn hạt nảy mầm của các dòng
chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M

38
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của NaCl 0,1 M đến hoạt độ protease trong giai đoạn
hạt nảy mầm

41
Bảng 3.9. Tương quan giữa hoạt độ protease và hàm lượng protein tan ở giai
đoạn hạt nảy mầm

43
Bảng 3.10. Hàm lượng proline của các dòng lúa chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M
ở giai đoạn mạ 3 lá

44
Bảng 3.11. Một số chỉ tiêu chịu ảnh hưởng của mặn ở giai đoạn mạ 3 lá

46
Bảng 3.12. Chỉ số chịu mặn tương đối của các dòng chọn lọc ở giai đoạn cây
mạ

48
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 3.13. Độ tinh sạch và hàm lượng ADN của các dòng lúa chọn lọc

50
Bảng 3.14. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản từ hệ gen của các dòng
lúa chọn lọc khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên

51
Bảng 3.15. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi
ngẫu nhiên

52
Bảng 3.16. Hệ số sai khác di truyền của các dòng chọn lọc và giống gốc

59
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

18
Hình 3.1. Hàm lượng đường khử của các dòng chọn lọc ở giai đoạn hạt nảy

mầm khi xử lí bằng dùng dịch NaCl 0,1M

34
Hình 3.2. Ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của α - amylase trong giai
đoạn hạt nảy mầm

36
Hình 3.3. Hàm lượng protein tan trong giai đoạn hạt nảy mầm của các dòng
chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M

39
Hình 3.4. Ảnh hưởng của NaCl 0,1 M đến hoạt độ protease trong giai đoạn
hạt nảy mầm

42
Hình 3.5. Hàm lượng proline của các dòng lúa chọn lọc khi xử lí NaCl 0,1M
ở giai đoạn mạ 3 lá

45
Hình 3.6. Khả năng chịu mặn của các dòng lúa chọn lọc

48
Hình 3.7. Kết quả điện di ADN tổng số tách từ dòng lúa chọn lọc

50
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M1

53
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M2

54
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M3

54
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M4

55
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M6

55
Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M7

56
Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M8

57
Hình 3.15. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M10

57
Hình 3.16. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M11

58
Hình 3.17. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M14

58
Hình 3. 18. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các dòng chọn
lọc và giống gốc

59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số trên thế giới.
Ở Việt Nam, lúa là cây nông nghiệp có vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc
dân. Theo số liệu thống kê năm 2008, nước ta có 7,4 triệu ha đất trồng lúa, sản
lượng thóc đạt 38,6 triệu tấn, bình quân năng suất đạt 6,2- 6,3 tấn/ha. Việt Nam
là một trong hai nước xuất khẩu gạo hàng đầu trên thế giới [50].
Cây lúa (Oryza sativa L.) là loại cây trồng rất mẫn cảm với các điều
kiện ngoại cảnh [9]. Nhiều yếu tố sinh thái bất lợi đã tác động lên quá trình
sinh trưởng và phát triển của cây lúa như nhiệt độ cực đoan, ánh sáng bất lợi,
lượng mưa không phù hợp [7], [8]. Đối với cây lúa nước, ở những vùng ven
biển một trong những nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất là mặn.
Đứng trước những diễn biến ngày càng nghiêm trọng của biến đổi khí hậu,
Việt Nam là một trong số các nước chịu ảnh hưởng của nước biển dâng, đặc
biệt là vùng đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long. Theo đánh
giá của ngân hàng thế giới, nếu nước biển dâng 1m, Việt Nam sẽ có 10% dân
số chịu ảnh hưởng trực tiếp và làm tổn thất khoảng 10% GDP [16]. Theo
“Nghiên cứu điển hình phục vụ báo cáo phát triển con người 2007-2008” của
UNDP, hiện nay đồng bằng sông Cửu Long có 1,77 triệu ha đất nhiễm mặn
(chiếm 45% diện tích). Một số địa phương khác như Nam Định và Thanh Hoá
diện tích nhiễm mặn là 7600 ha [16] Lúa nước là loại cây kém chịu mặn [3].
Vì vậy, nghiên cứu khả năng chịu mặn và tăng cường khả năng chịu NaCl của
các giống lúa nhằm nâng cao và ổn định sản lượng lúa trong điều kiện nhiễm
mặn là một đòi hỏi thực tiễn trong sản suất nông nghiệp.
Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học phát triển đã đóng góp
nhiều ứng dụng quan trọng trong công tác chọn tạo giống. Bằng kỹ thuật chọn
dòng biến dị soma và kỹ thuật gen có thể tạo ra các cây trồng có khả năng

chống chịu cao [13]. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã mở ra một
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
hướng mới trong công tác cải tạo giống cây trồng và góp phần làm phong phú
thêm nguồn vật liệu khởi đầu trong công tác chọn giống [1], [12], [14], [15],
[17]. Từ nguồn nguyên liệu thực vật được tạo ra nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô
đến khi tạo thành dòng, giống mới đòi hỏi trải qua quá trình đánh giá, thử
nghiệm trên đồng ruộng cũng như trong phòng thí nghiệm qua nhiều thế hệ.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Đánh giá một
số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mặn (NaCl)” .
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Tuyển chọn được dòng lúa ưu việt về đặc điểm nông học, chất lượng
hạt và khả năng chịu mặn.

- Xác định sự sai khác hệ gen của các dòng lúa chịu mặn.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1. Phân tích đặc điểm nông học của các dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo
chịu mặn (NaCl) ở thế hệ R2, R3.
3.2. Đánh giá chất lượng hạt thông qua phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh:
protein, đường tan.
3.3. Đánh giá khả năng chịu mặn (NaCl) của một số dòng chọn lọc thế hệ R3
- Đánh giá ở giai đoạn hạt nảy mầm thông qua xác định ảnh hưởng của
NaCl đến hàm lượng đường tan, hoạt độ của  - amylase, hàm lượng protein
tan và hoạt độ của protease.
- Đánh giá nhanh khả năng chịu mặn (NaCl) của các giống nghiên cứu ở
giai đoạn mạ ba lá bằng phương pháp gây mặn nhân tạo. Xác định hàm lượng
proline sau khi xử lý mặn cây mạ ba lá bằng dung dịch NaCl.
3.4. Xác định sự sai khác ADN genome của một số dòng lúa chịu mặn bằng
kỹ thuật RAPD.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY LÚA
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa
Cây lúa (Oryza Sativa L.) là cây trồng có từ lâu đời, phân bố từ 30
0
vĩ
Bắc đến 40
0
vĩ Nam và gắn liền với lịch sử phát triển của loài người. Tổ tiên
của loài lúa hiện nay là lúa dại Oryza Fatua, Oryza Zaoffcinacis, Oryza
Minuta [8].
Khoảng năm 2800 – 2700 TCN, ở Trung Quốc đã có nghề trồng lúa
[8]. Vavilov (1926) cho rằng nguồn gốc của cây lúa trồng là ở Ấn Độ [6].
Nhiều tài liệu cho rằng, nguồn gốc của cây lúa trồng là ở miền nam Việt
Nam và Campuchia [7], [8]. Có giả thuyết lại cho rằng, tổ tiên của chi lúa
Oryza là một loại cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít
nhất 130 triệu năm và phát tán khắp các châu lục trong qúa trình trôi dạt
lục địa. Khi phát hiện có nhiều loài lúa dại thuộc nhóm Euoryza ở châu
Phi, Chang (1976) đã cho rằng nguồn gốc của loài lúa trồng là ở châu Phi.
Sampath và Rao (1951) cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa là ở chân dãy
Himalaya đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale Assam, Thái Lan vì ở
vùng này có nhiều loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú [8].
Tuy chưa thống nhất nhưng đã có nhiều tài liệu , di tích khảo cổ học
chứng minh nguồn gốc của cây lúa ở vùng đầm lầy Đông Nam Á , có thể
thuộc nhiều quốc gia khác nhau rồi từ vùng nhiệt đới nóng ẩm này cây lúa
mới lan rộng ra khắp nơi [7], [8], [9].

Theo hệ thống phân loại học thực vật, cây lúa thuộc ngành thực vật có hoa
(Angios Permes), lớp một lá mầm (Mono Cotyledones), bộ hoà thảo
(Graminales), họ hoà thảo (Graminae), chi lúa (Oryza) và loài Oryza Sativa [8].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa
được thuần hoá là lúa châu Á (Oryza Sativa) và lúa châu Phi (Oryza
Glaberrima). Trong đó loài Oryza Sativa được trồng phổ biến nhất [8].
Kato và cộng sự (1928) dựa vào đặc điểm hình thái và chất liệu hạt đã
chia Oryza Sativa thành hai loài phụ (hay còn gọi là thứ) là O.Indica và
O.Japonica. Gutschin phân thêm nhóm thứ 3 là O.Javanica. Theo ông,
O.Javanica là hình thức trung gian giữa O.Indica và O.Japonica, phân bố ở
quần đảo Indonesia. Loại này chiếm phần lớn các giống lúa cạn của Nam Á
[8]. Năm 2002, IRRI đã phân thêm một thứ nữa là Intermediate (hybrids), đây
chính là kết quả lai tạo giữa các giống lúa [49].
Ở Việt Nam, dựa vào độ dẻo, mùi thơm, tỷ lệ thành phần trong nộ i nhũ,
hàm lượng amylose và amylopectin trong tinh bột mà chia thành thứ lúa nếp
(O. Sativa L. Var glutinosa Tanaka) và lúa tẻ (O. Sativa L. Var utilissima A.
Canus). Theo nhu cầu sinh thái, thời vụ gieo trồng chia thành lúa chiêm, lúa
mùa, lúa xuân… Theo chế độ nước chia thành lúa cạn và lúa nước [8].
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Lúa là loại cây trồng nhiệt đới, cây thân thảo, sinh sống hàng năm và là
cây ngắn ngày. Thời gian sinh trưởng của cây lúa được tính từ khi hạt nảy
mầm đến khi lúa chín, biến động từ 75 đến 240 ngày, thời gian này ngắn hay
dài phụ thuộc vào giống lúa, mùa vụ gieo cấy, vị trí địa lí và biện pháp kĩ
thuật canh tác [9].
Dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh, quá trình chọn lọc, bồi dưỡng
lâu đờ i đã hình thành nên nhiều giống lúa khác nhau với những đặc điểm hình
thái đặc trưng. Tuy có nhiều hình thái khác nhau nhưng chúng có những điểm

chung là được cấu tạo nên bởi các bộ phận chính là rễ, thân, lá, bông và hạt.
Rễ lúa thuộc rễ chùm gồm ba loại rễ là rễ mầm, rễ phụ và rễ bất định.
Rễ mầm chỉ có một chiếc hình thành trực tiếp từ rễ phôi trong khi nảy mầm,
nó có vai trò tiếp nước cho mầm non, về sau khô và chết. Rễ phụ phát sinh từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
các gốc thân gần mặt đất (gọi là rễ cấp 1), trên các rễ phụ phát sinh rễ thứ cấp
(rễ cấp 2). Rễ bất định được mọc ra ở các đốt thân phía trên. Rễ lúa ăn nông,
phân bố nhiều ở lớp đất mặt. Khả năng thu nhận nước và cung cấp đủ nước
thông qua hệ rễ tới các bộ phận khác của cây trong điều kiện khó khăn về
nước được coi là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tính chịu hạn của cây
[7], [8].
Thân lúa được phát triển từ thân mầm, hình ống tròn, có các đốt đặc và
lóng nằm giữa hai mắt thì rỗng được bẹ bao bọc đến khi trỗ bông. Mỗi thân
lúa thường có 4 đến 5 lóng, các lóng có độ dài khác nhau. Ba lóng sát bông
dài nhất, tổng chiều dài của ba lóng này chiếm 90 - 95% chiều dài thân [9].
Lá lúa được hình thành từ các mắt trên thân mọc ở hai bên thân lúa,
mỗi vòng có hai lá. Khi hạt lúa nảy mầm xuất hiện lá bao, lá không hoàn toàn
rồi đến lá thật thứ nhất, lá thật thứ hai, lá thật thứ ba… Lá mỏng, hẹp bản (2 –
2,5cm) và dài từ 50 – 100cm, gồm bẹ lá, tai lá, gối lá, lưỡi lá, phiến lá và gân
lá [7], [8], [9].
Bông lúa gồm trục bông, gié cấp một, gié cấp hai và hoa. Trục bông dài
từ 15 – 22cm, một bông lúa khoảng 80 – 250 hoa. Các hoa nhỏ, tự thụ phấ n là
chính mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống . Hoa lúa là hoa
lưỡng tính gồm có vỏ trấu trong và vỏ trấu ngoài , mày hoa, một nhụ y và hai
vòi nhụy có 6 chỉ nhị với bao phấ n đính lưng [7], [8], [9].
Hạt lúa thuộc loại quả dĩ nh , hạt nhỏ cứng dài từ 5 – 12mm và dày từ 2
– 3mm [8].
1.1.3. Đặc tính sinh thái

Các nhân tố sinh thái (nhiệt độ, ánh sáng, nước, đất) thường xuyên ảnh
hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Nhiệt độ là một trong những
nhân tố ảnh hưởng lên hầu hết các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây
lúa. Ở mỗi giai đoạn sinh trưởng, cây lúa yêu cầu nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ
thích hợp nhất là 28
0
– 32
0
C, ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ dưới 13
0
C [9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
Ánh sáng tác động tới cây lúa ở hai mặt: cường độ chiếu sáng và thời
gian chiếu sáng. Quang hợp của lúa nước tiến hành thuận lợi ở 250- 400
cal/cm
2
/ngày. Cường độ ánh sáng trong ngày ảnh hưởng đến quá trình ra hoa,
kết hạt ở lúa. Lúa yêu cầu nhiều nước hơn các cây trồng khác, để tạo ra 1g
chất khô cây lúa cần 628g nước. Lượng nước cần thiết cho cây lúa trung bình
6 - 7 mm
3
/ngày trong mùa mưa, 8 - 9 mm
3
/ngày trong mùa khô. Đất trồng lúa
tốt nhất là đất thịt, trung tính đến sét, có hàm lượng N, P, K tổng số cao, pH =
4,5 - 7, độ mặn nhỏ hơn 0,5% tổng số muối tan [9].
1.1.4. Giá trị kinh tế
Trong cơ cấu sản xuất lương thực của thế giới, lúa gạo chiếm 26,5%.

Sản lượng lúa đứng thứ nhất trong các cây lương thực với tổng sản lượng là
650 triệu tấn/năm. Khoảng 40% dân số trên thế giới coi lúa gạo là cây lương
thực chính, tới 25% dân số sử dụng lú a gạ o trên 1/3 khẩu phần ăn hà ng ngày.
Ở Việt Nam, 100% dân số sử dụng lú a gạ o làm lương thực chính . Trong gạo
có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng như tinh bột (62,5%), protein (7-10%),
lipit (1- 3%), xenlulo (10,9%), nước 11% [48]. Protein của hạt lúa chứa 7
axit amin không thay thế như valine, leucine, isoleucine… Do thành phần các
chất tương đối ổn định và cân đối nên lúa gạo được sử dụng rộng rãi trên
nhiều lĩnh vực khác nhau. Với vai trò là lương thực, lúa gạo được sử dụng để
chế biến trên 200 món ăn khác nhau [48].
Lúa gạo được dùng làm thức ăn cho gia súc với một lượng khá lớn. Ở
các nước phát triển, lượng lúa gạo dành cho chăn nuôi chiếm một tỷ lệ khá
cao.
Lúa gạo là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp
chế biến thức ăn gia súc, sản xuất rượu bia, sản xuất bánh kẹo…
Sản phẩm phụ của cây lúa được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau. Tấm được dù ng đ ể sản xuất rượu , cồn axeton, phấn viết mịn … Cám
được dùng để sản xuất thức ăn tổng hợp , sản xuất các vitamin nhóm B , chế
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
tạo sơn cao cấp, làm nguyên liệu chế tạo xà phòng… Vỏ trấ u để sản xuất nấm
men làm thức ăn gia súc, vật liệu đóng lót hàng, vật liệu độn cho phân hữu cơ,
làm chất đốt… Rơm rạ dùng cho công nghiệp sản xuất giấy, cát tông xây
dựng, đồ gia dụng (như chão, mũ, giầy dép…) làm thức ăn gia súc, vật liệu
sản xuất nấm… Gạo là mặt hàng xuất khẩu làm tăng thu nhập quốc dân, góp
phần ổn định an ninh lương thực nhân loại [8], [9], [48], [52] .
1.1.5. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam
Theo thống kê của FAO (1997), khoảng 92% diện tích trồng lúa tập
trung ở châu Á; 3,6% ở châu Phi; 3,1% ở Nam Mỹ; 5% còn lại ở Bắc Mỹ,

Anh, Australia. Diện tích trồng lúa có xu hướng giảm nhưng sản lượng lại
tăng đáng kể: Năm 2007 sản lượng lúa của thế giới là 652 triệu tấn, tăng
hơn 1,4% so với năm 2006. Năm 2008 sản lượng lúa thế giới đạt 688 triệu
tấn, tăng hơn 4% so với năm 2007 [50], [52]. Có 114 nước trồng lúa trên
thế giới, trong đó 18 nước có diện tích trồng lúa trên trên 1.000.000 ha tập
trung ở Châu Á , 31 nước có diện tích trồng lúa trong khoảng 100 000 ha
– 1 000 000 ha. Trong đó có 27 nước có năng suất trên 5 tấn/ha, đứng đầu
là Ai Cập (9,7 tấn/ha), Úc (9,5 tấn/ha) El Salvador (7,9 tấn/ha). Về tình
hình xuất khẩu lúa gạo, Thái Lan vẫn là nước xuất khẩu gạo dẫn đầu thế
giới (9 triệu tấn), Việt Nam đứng thứ 2 (6 triệu tấn). Pakistan, Mỹ, Ấn Độ
cũng là những nước xuất khẩu gạo quan trọng (FAO, 2010). Lúa gạo sản
xuất ra chủ yếu là để tiêu dùng nội địa, chỉ có khoảng 6 - 7% tổng sản
lượng lúa gạo trên thế giới được lưu thông trên thị trường quốc tế ( IRRI,
2010) [50].
Theo thống kế của FAO năm 2010, Việt Nam có diện tích lúa
khoảng 7,4 triệu ha đứng thứ 7 sau các nước có diện tích lúa trồng nhiều ở
Châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Bangladesh, Thái Lan Việt
Nam là một trong 10 nước sản xuất lúa gạo lớn nhất trên thế giới. Việt
Nam có tổng sản lượng lúa hàng năm đứng thứ 5 trên thế giới, nhưng lại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
là nước xuất khẩu gạo đứng thứ 2 (6 triệu tấn) sau Thái Lan (9,0 triệu
tấn), chiếm 18% sản lượng xuất khẩu gạo thế giới, 22,4% sản lượng xuất
khẩu gạo của châu Á. Việt Nam có năng suất lúa ở đạt 5,2 – 6,0 tấn/ha và
là một trong những nước có năng suất lúa cao nhất thế giới. Năng suất lúa
của Việt Nam vượt trội trong khu vực Đông Nam Á nhờ thuỷ lợi được cải
thiện đáng kể và áp dụng nhanh các tiến bộ kỹ thuật về giống, phân bón,
và bảo vệ thực vật. [50], [52].
1.2. MẶN VÀ CƠ CHẾ CHỊU MẶN

Tính chịu mặn là khả năng của thực vật sống được trong môi trường
chứa nồng độ muối cao. Tính chịu mặn là tính chất của chất nguyên sinh [3].
Nghiên cứu tính chịu mặn của thực vật có ý nghĩa không những về mặt
lý thuyết mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn bởi lẽ nước biển và đại dương chứa
3-4% muối. Trên thế giới, 25% diện tích mặt đất bị mặn, còn 1/3 diện tích đất
canh tác bị tích tụ muối do kém tiêu nước. Ảnh hưởng độc hại của nồng độ
cao các muối có thể xuất hiện kể cả khi bón liều lượng cao [3].
1.2.1. Các kiểu đất mặn
Đất được chia theo mức độ bị nhiễm mặn thành đất không mặn, mặn
yếu và đất muối. Đất không mặn chứa lượng muối hoà tan ít hơn 0,35%, mặn
yếu từ 0,3 - 0,6%, mặn mạnh 0,6 - 1% và đất muối lớn hơn 1%. Dựa theo
lượng anion trong đất, người ta phân đất mặn ra thành: mặn clorit, sunfat -
clorit, clorit - sunfat và cacbonat. Trong các kiểu đất mặn theo anion, mặn
cacbonat natri là kiểu mặn độc hại nhất vì xođa trong đất phân giải, hình
thành kiềm mạnh (hidroxit natri). Theo hàm lượng cation (mặc dầu cation
chiếm ưu thế là Na
+
), đất mặn được phân thành mặn Ca
2+
, Mg
2+
hay Ca
2+
-
Na
+
, Na
+
- Ca
2+

, Na
+
- Mg
2+
… [3]
1.2.2. Tác hại của mặn
Việc dư thừa muối trong đất đã làm tăng áp suất thẩm thấu của dung
dịch đất. Cây lấy được nước và chất khoáng từ đất khi nồng độ muối tan trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
đất nhỏ hơn nồng độ dịch bào của rễ. Tức là cây chỉ lấy được nước và chất
khoáng từ đất khi áp suất thẩm thấu và sức hút nước của rễ cây lớn hơn áp suất
thẩm thấu và sức hút nước của đất. Nếu độ mặn của đất tăng cao đến mức sức
hút nước của đất vượt quá sức hút nước của rễ thì chẳng những cây không lấy
được nước trong đất mà còn mất nước vào đất. Cây không hấp thu được nước
nhưng quá trình thoát hơi nước của lá vẫn diễn ra bình thường làm mất cân
bằng nước gây nên hạn sinh lý. Việc tăng áp suất thẩm thấu trong đất mặn quá
mức là nguyên nhân quan trọng nhất gây hại cho cây trồng trên đất mặn [3].
Mặn ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của cây như trao đổi nước,
tổng hợp các hormone, hút khoáng, vân chuyển và phân bố các chất đồng hóa
trong cây Sự dư thừa các ion trong đất làm rối loạn tính thấm của màng nên
không thể kiểm tra được các chất đi qua màng, rò rỉ các ion ra ngoài rễ. Quá
trình trao đổi chất, đặc biệt là trao đổi protein bị rối loạn, dẫn đến tích luỹ các
axit amin và amit trong cây.
Sự ức chế sinh trưởng của cây khi bị mặn là đặc trưng rõ rệt nhất.
Trong đất mặn, các thực vật kém chịu mặn ngừng sinh trưởng do các chức
năng sinh lý bị kìm hãm. Nồng độ muối càng cao thì kìm hãm sinh trưởng
càng mạnh. Tuỳ theo mức độ mặn và khả năng chống chịu mà cây giảm năng
suất nhiều hay ít [3].

1.2.3. Các phản ứng thích nghi của thực vật đối với môi trƣờng mặn
Về quan hệ đối với môi trường mặn, toàn bộ thực vật được chia thành
thực vật không chịu mặn và thực vật chịu mặn. Thực vật không chịu mặn hay
là thực vật sống ở đất không nhiễm mặn, không có khả năng sống trên đất
nhiễm mặn như cây đậu đỗ, khoai tây, nhiều giống lúa… Thực vật chịu mặn
sống trên đất nhiễm mặn, có khả năng thích nghi với môi trường chứa muối
nồng độ cao như củ cải đường, bầu bí, dưa hấu, cây rừng ngập mặn như cây
đước, sú, trang, vẹt…Đặc trưng thích nghi của thực vật đối với điều kiện môi
trường mặn là rất đa dạng. Theo các dấu hiệu cho phép cây chịu mặn, có thể
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
chia thực vật chịu mặn thành ba nhóm: nhóm chịu mặn thực sự, nhóm thực
vật thải muối và nhóm thực vật chịu mặn không thấm muối [3].
Nhóm thực vật chịu mặn thực sự là nhóm thực vật chịu mặn nhất.
Chúng có lá dày. Đại diện điển hình của nhóm chịu mặn thực sự là Saliconia
herbacea. Thực vật nhóm này hút muối vào không bào làm tăng áp suất thẩm
thấu của dịch bào để hút được nước từ đất có độ mặn cao.
Nhóm thực vật thải muối đã hấp thụ ra khỏi tế bào cùng với nước nhờ
tuyến muối chuyên hoá và loại bỏ lượng muối dư thừa cùng với lá rụng.
Nhóm thực vật chịu mặn không thấm muối mọc trên đất có độ mặn
thấp hơn, chúng duy trì áp suất thẩm thấu cao nhờ cường độ quang hợp cao và
tích luỹ nhiều cacbohydrat hoà tan, tế bào ít thấm muối [3].
Các đặc điểm thích nghi về hình thái, giải phẫu
Mặn có thể làm thay đổi một số đặc tính của cây các đặc tính có thể cải
thiện được cân bằng nước trong trường hợp đất mặn. Chúng có lá ít và nhỏ,
giảm số lượng khí khổng, tăng độ mọng nước, làm dày tầng cutin và sáp phủ
trên lá, giảm sự hình thành mô dẫn, ligin hoá rễ sớm…Do sự sinh trưởng
chậm của các bộ phận trên mặt đất nên giảm tỷ lệ thân, lá/rễ. Tất cả các đặc
điểm đó giúp cho cây giảm sự dẫn nước và thoát hơi nước để duy trì sự cân

bằng trong điều kiện mặn [3], [16].
Sự điều chỉnh thẩm thấu
Do áp suất thẩm thấu của cây thấp hơn của đất nên cây không hút được
nước. Các thực vật chịu mặn có khả năng tự điều chỉnh thẩm thấu để làm tăng
áp suất thẩm thấu trong tế bào vượt quá áp suất thẩm thấu của đất. Tốc độ và
thời gian điều chỉnh thẩm thấu phụ thuộc vào loài thực vật. Người ta đo được
tốc độ điều chỉnh thẩm thấu trung bình là 1atm/ngày. Tốc độ này chỉ theo kịp
các biến đổi xảy ra trong đất mặn. Tuỳ thuộc vào thực vật mà có cách điều
chỉnh thẩm thấu khác nhau. Một số thực vật có khả năng tích luỹ một lượng
muối cao trong tế bào, chủ yếu là muối NaCl và có thể có cả K
+
… Một số
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
thực vật có khả năng tổng hợp và tích luỹ một số chất hữu cơ đơn giản, có
phân tử lượng thấp để tăng áp suất thẩm thấu. Các chất tích luỹ chủ yếu là các
axit hữu cơ, axit amin, đường. Khi gặp môi trường mặn, trong cây lập tức
tổng hợp các chất hữu cơ nhóm này để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu của
chính mình. Ngoài ra, các hợp chất như prolin, betain, putressin cũng được
hình thành khi bị mặn [3], [15].
Hình thành các khoang chứa muối, tiết muối để giảm nồng độ muối có
thể gây độc cho cây
Các thực vật chịu mặn hình thành nhiều tế bào đồng nhất gọi là các
hạch muối. Chúng có nhiệm vụ thu gom muối ở các tế bào khác của lá và
thân. Các túi muối hoạt động trong một thời gian ngắn rồi vỡ ra tung muối ra
mặt lá. Các túi muối khác được hình thành và tiếp tục thu gom muối. Nồng độ
muối trong các túi muối cao gấp 60 lần so với các tế bào khác. Bằng cách này,
cây có thể duy trì nồng độ muối thấp trong lá. Một số thực vật hình thành các
túi muối nhưng chỉ đóng vai trò “giam giữ” muối mà không loại ra khỏi lá. Số

lượng túi muối càng nhiều thì khả năng chịu mặn càng cao. Cũng có một số
thực vật tích luỹ nhiều muối trong lá để loại muối ra khỏi cây [3].
Cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về những chỉ tiêu sinh
lí, sinh hoá trong cây lúa dưới tác động cuả mặn. Phần lớn các nhà khoa học
của nhiều nước trên thế giới tập trung nghiên cứu về ảnh hưởng của NaCl đến
sự sinh trưởng, phát triển, sự hấp thụ, vận chuyển và tích luỹ của ion Na
+
, Cl
_

trong cây mạ lúa cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Cường độ hô hấp,
quang hợp và khả năng biến dị của cây mạ lúa cũng được đề cập đến trong
một số công trình [18], [19], [21], [24], [25].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về ảnh hưởng của mặn đến cây lúa chủ
yếu là lai tạo giữa các giống có kiểu gen chịu mặn tốt để tạo ra các giống chịu
mặn. Nhiều nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu về ảnh hưởng của mặn NaCl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá và năng suất của các giống lúa có khả
năng chịu mặn khác nhau [1], [2], [24], [25].

1.3. MỘT SỐ THÀNH TỰU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU
VÀ CHỌN DÒNG TẾ BÀO SOMA BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN
VITRO
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đạt được những thành
công nhất định trong việc nghiên cứu khả năng chống chịu của cây
trồng. Nguyễn Tường Vân và cs (1994) thu được các dòng cây chịu muối ở
lúa [17]. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995, 1998) đã nghiên cứu khả năng
chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống lúa có nguồn gốc sinh thái

khác nhau tạo ra nguồn nguyên liệu cho chọn lọc [2], [13]. Hồ Hữu Nhị
(2001) khi nghiên cứu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn trong công tác chọn
tạo giống lúa đã thu được 7000 cây từ 250 bao phấn, trong đó 350 cây có thời
gian sinh trưởng cực ngắn (<100 ngày). Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo
các giống lúa CR203, CH133, Lốc, X11, C70 Đinh Thị Phòng (2001)
đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn
làm nguyên liệu cho chọn lọc. Nguyễn Thị Tâm (2004) khi xử lý mô
sẹo của các giống lúa CR203, CS4, ML107, CN2, ĐH60 ở nhiệt độ cao
(40
0
C – 42
0
C) đã hoàn thiện hệ thống nuôi cấy ở lúa và tạo ra được 197
dòng mô có khả năng chịu nóng và 520 dòng cây xanh có ý nghĩa trong
quá trình tạo giống lúa có khả năng chịu hạn [13], [14]. Hệ thống tế bào
và mô nuôi cấy còn cho phép các nhà nghiên cứu tìm hiểu và xác định
bản chất sinh học của tính chống chịu. Trần Ngọc Thạch (1999) đã
nghiên cứu tính kháng mặn trong điều kiện in vitro ở 2 giống lúa
CSR27 và HBC19 cho thấy mô sẹo có thể dùng như vật liệu cho thanh
lọc tính kháng mặn và prolin đóng một vai trò nào đó trong tính kháng
mặn của lúa ở mức độ mô sẹo. Đặng Minh Tâm, Nguyễn Thị Lang
(2003) đã nghiên cứu khả năng chịu mặn và khai thác biến dị soma 12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
dòng lúa chống chịu mặn từ nuôi cấy in vitro, nghiên cứu thành công
môi trường nuôi cấy và tái sinh thành công giống Sóc nâu, Đốc Đỏ,
Trắng Thái Lan, AS996 [24], [41].
Nghiên cứu khả năng chịu mặn ở cây trồng nói chung và cây lúa
nói riêng đã và đang được nhiều tác giả quan tâm trong thời gian gần

đây, với sự hoàn thiện về kỹ thuật và điều kiện nuôi cấy đã mở ra nhiều
triển vọng cho việc nghiên cứu khả năng chịu mặn và chọn dòng chịu
mặn ở nhiều đối tượng cây trồng.
1.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA)
TRONG PHÂN TÍCH HỆ GEN CỦA CÂY TRỒNG
Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân
đoạn ADN được nhân bản nhờ các đoạn mồi ngẫu nhiên dài từ 8 – 12
nucleotit, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990), Welsh và
McClelland (1991) [42] đồng thời xây dựng. Thành phần và các bước phản
ứng RAPD dựa trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase (PCR), chỉ khác ở kích
thước mồi và nhiệt độ bắt cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp mồi của phản ứng RAPD
vào khoảng 33
0
C- 45
0
C. Kĩ thuật RAPD có ưu điểm là sử dụng các mồi ngẫu
nhiên dài 10 nucleotit. Mồi có thể bám vào bất kì vị trí nào có trình tự
nucleotit bổ sung trên phân tử ADN khuôn. Do vậy, xác suất đoạn mồi có
được điểm gắn trên phân tử ADN mẫu rất lớn. Sự khác nhau về vị trí và số
lượng các đoạn ADN có thể ghép cặp bổ sung với mồi chính là cơ sở của sự
đa hình về phổ băng ADN được nhân bản. Sản phẩm khuếch đại được phân
tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát
được sau khi gel được nhuộm bằng hoá chất đặc trưng. Vì vậy, tính đa hình
thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản
[42]. Kỹ thuật RAPD là phương pháp tương đối đơn giản trong đánh giá hệ
gen thực vật, nó không những khắc phục được nhược điểm của phương pháp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
chọn giống truyền thống mà còn góp bảo tồn nguồn gen cây trồng và nâng

cao hiệu quả chọn lọc.
Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: ADN
khuôn (DNA template); đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là mồi
oligonucleotit có trật tự nucleotit ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10
nucleotit, trong đó C + G chiếm hơn 60%; ADN - polymerase (Taq
polymerase): hoạt động của ADN - polymerase phụ thuộc vào Mg
2+
, nồng độ
dNTP, pH, nhiệt độ biến tính ADN; Bốn loại deoxyribonucleotit triphotphat
(dNTP): ATP, TTP, CTP, GTP; Ion Mg
2+
.
Phản ứng RAPD được tiến hành qua 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn biến
tính ADN: ở nhiệt độ 95
0
C trong khoảng 30-60 giây làm cho hai mạch khuôn
ADN tách nhau. (2) Giai đoạn tiếp hợp mồi: khi nhiệt độ hạ xuống 32-40
0
C
mồi tiếp hợp và bám vào sợi ADN khuôn. (3) Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ
được nâng lên 72
0
C thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được
kéo dài với sự tham gia của ADN - polymerase.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân đoạn ADN khuôn
được nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại
được coi là ADN khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo. Vậy sau “k” chu
kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2
k
các đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu.

RAPD có thể thực hiện từ 40 - 45 chu kỳ.
Kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực và
đem lại nhiều thành tựu to lớn cho ngành sinh học phân tử. Người ta đã dùng
kỹ thuật này để thiết lập bản đồ di truyền phân tử [6], [10], [30], [34], nhận
dạng các giống cây trồng, phát hiện quan hệ phát sinh chủng loại đối với
nhiều loại cây trồng, đánh giá sự thay đổi genome của các dòng chọn lọc,
đánh giá hệ gen của giống và sự đa dạng di truyền của tập đoàn giống [26],
[27], [31], [32], [37].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
Nguyễn Thị Tâm (2004) đã cho thấy các dòng lúa chọn lọc tạo ra từ
mô sẹo lúa chịu nhiệt giống CR203, CS4, ML107 đã có những thay đổi ở
mức độ phân tử [14]. Nguyễn Thanh Tường, Nguyễn Bảo Vệ và Võ Thành
Công (2005) đã nghiên cứu đặc tính kháng mặn của các giống lúa thu thập
vùng ven biển Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng. Tính kháng mặn của các giống
lúa nghiên cứu trên được đánh giá bằng phương pháp điện di ADN với mồi
RM223 và đa dạng protein dự trữ được đánh giá bằng phương pháp điện di
SDS – PAGE. Kết quả nghiên cứu cho thấy, có 6 giống lúa thể hiện băng điện
di giống như giống chuẩn kháng mặn Đốc Phụng và 11 giống thể hiện băng
ADN giống như giống chuẩn nhiễm mặn (IR28) [15].
Đinh Thị Phòng, Lê Xuân Đắc và cs (1999) đã sử dụng 10 mồi ngẫu
nhiên để phân tích tính đa hình của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất
nước. Kết quả đã chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các dòng cây tái
sinh. Trần Duy Dương và cs (1999) đã sử dụng phương pháp RAPD trong
nghiên cứu đa hình một số dòng lúa phục vụ cho công tác chọn giống [6].
Nguyễn Việt Cường và các cs (2007) phân tích đa dạng di truyền trên 40 dòng
cây Xoan, Cóc hành và xây dựng được vườn giống cây xoan, cây tràm ở Ninh
Thuận khi sử dụng kĩ thuật RAPD [5].
Ray Wu, ĐH Cornell, Mỹ, đã phát triển 3 dòng lúa chuyển gen: Gen

tổng hợp proline p5cs, gen choline oxidase COX, dung hợp cả hai gen TPS và
TPP trong tổng hợp trehalose. Gorantla và cs (2005) nghiên cứu phổ thể hiện
các gen điều khiển tính chống chịu khô hạn với nhiều gen mục tiêu đã được
phát hiện. Karaba và cs (2007) nghiên cứu khá hệ thống với sự thể hiện của gen
HRD chuyển nạp từ Arabidopsis. Cây lúa chống hạn tiêu thụ nước ít biểu thị sự
kiện sinh khối rễ tăng lên trong điều kiện có tưới trở lại. Wang và cs (2007) đã
so sánh sự thể hiện gen giữa giống lúa nước và giống lúa cạn trong điều kiện bị
stress do khô hạn, sử dụng phương tiện cDNA microarray cho thấy sự biểu
hiện của các gen mục tiêu ở mức độ cao trong lúa cạn có thể cải tiến được khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
năng chống chịu stress do khô hạn trong lúa nước và những loài cây trồng có
liên quan gần về huyết thống [38], [46], [47]. Miguke và cs (2002) đã nghiên
cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với dạng dại của chúng trên
cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [33].
Hiện nay, các nhà khoa học đã ứng dụng kĩ thuật RAPD vào nghiên
cứu đa dạng di truyền các đối tượng gây bệnh hại ở lúa như vi khuẩn lam, rầy
nâu, ốc, sán nhằm phát hiện ra các dạng mầm bệnh, các vật trung gian truyền
bệnh khác nhau, cũng như tác hại của chúng đối với quá trình sinh trưởng và
năng suất của cây lúa, để xây dựng phương pháp phòng chống bệnh hiệu quả
[22], [23], [28]. Một hướng khác mà các nhà khoa học đang quan tâm nghiên
cứu đó là sử dụng kĩ thuật RAPD để phân tích sự sai khác di truyền cũng như
mức độ biểu hiện khác nhau ở lúa chuyển gen, đột biến gen để đánh giá hiệu
quả chuyển gen ở lúa đặc biệt là các gen kháng thuốc diệt cỏ, gen kháng sâu
bệnh [36], [39], [44].
Nghiên cứu, đánh giá và tăng cường khả năng chống chịu nhằm nâng
cao và ổn định sản lượng lúa trong điều kiện cực đoan là một đòi hỏi thực tiễn
trong sản suất nông nghiệp. Đây là vấn đề được nhiều nhà khoa học quan tâm
nghiên cứu trên nhiều đối tượng cây trồng với các mức độ khác nhau. Tuy

nhiên tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chống chịu bằng kỹ thuật
nuôi cây mô - tế bào thực vật thì mới được quan tâm nghiên cứu trong vài
năm gần đây và đã đạt được những kết quả nhất định.
Hiện nay, trong chọn giống người ta không chỉ quan tâm đến những
tính trạng hình thái, năng suất và chất lượng, mà còn quan tâm đến bản
chất sinh học phân tử của sự thay đổi các tính trạng. Kĩ thuật RAPD được
sử dụng như một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử
để phân biệt các giống hay các loài khác nhau, cũng như đánh giá hiệu quả
của công tác chọn, tạo giống cây trồng mới dựa trên các kĩ thuật sinh học
phân tử hiện đại.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

17
Chƣơng 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Nguyên liệu thực vật
Vật liệu nghiên cứu là hạt của các dòng lúa chọn lọc có nguồn gốc từ
mô sẹo qua xử lí chịu mặn của các giống lúa CR203, IR64, OM 4498, VND
95-20 (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Hạt các dòng chọn lọc thế hệ R1 và giống gốc
STT
Dòng chọn lọc
Nguồn gốc
1
R1.CR1, R1.CR3, R1.CR8, R1.CR14, R1.CR15
CR203
2
R1.OM5, R1.OM12, R1.OM16

OM 4498
3
R1.IR1, R1.IR6, R1.IR16
IR64
4
R1.VND6, R1.VND8, R1.VND18
VND 95-20

2.1.2. Hoá chất và thiết bị
+) Hóa chất: 2,4 axit dichlorphenoxyacetic (2,4-D), axit naphthylacetic
(- NAA) của hãng Sigma, K
3
Fe(Cn)
6
, Fe
2
(SO
4
)
3
,

H
2
SO
4
, ethanol 70% -
100%, khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, proline chuẩn, tinh bột chuẩn,
gelatin 10%, axit sunfosalysilic 20%, surcose, H
3

PO
4
, CH
3
COOH,
Na
2
HPO
4
.7H
2
O, NaH
2
PO
4
, NaCl, 2,3,4 Trichlo Tetrazolium chlorit (TTC),
agar, cồn, các hóa chất tách chiết ADN, hóa chất chạy PCR - RAPD, mồi
các hoá chất để phân tích có nguồn gốc từ Anh, Đức, Trung Quốc.
+) Thiết bị: cân điện tử santorius, tủ sấy carbolite, máy quang phổ
uvis cintra 40, máy li tâm lạnh hettich, nồi hấp cao áp, box cấy, máy PCR
system 9700 (pharmacia), máy điện di (biorad), máy đo quang phổ diode array
spectrophotometer, máy ổn nhiệt, máy soi uv có nguồn gốc từ Anh, Đức.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

18
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào, phòng thí
nghiệm Di truyền - Sinh học hiện đại khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư
phạm - ĐH Thái Nguyên, Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên.
Các dòng R2, R3 được trồng trong vụ mùa 2010, vụ xuân 2011, tại xã

Phúc Hà, thành phố Thái Nguyên.
Dòng chọn lọc R1
và giống gốc
Trồng ngoài đồng ruộng
Đánh giá
đặc điểm
nông học
Phân tích
chỉ tiêu
sinh lí
Phân tích
chỉ tiêu
hóa sinh
Dòng chọn lọc R2
Trồng ngoài đồng ruộng
Đánh giá
đặc điểm
nông học
Đánh giá sự
sai khác genome
các dòng chọn lọc
bằng kĩ thuật RAPD
Dòng triển vọng
Dòng chọn lọc R1
và giống gốc
Trồng ngoài đồng ruộng
Đánh giá
đặc điểm
nông học
Phân tích

chỉ tiêu
sinh lí
Phân tích
chỉ tiêu
hóa sinh
Dòng chọn lọc R2
Trồng ngoài đồng ruộng
Đánh giá
đặc điểm
nông học
Đánh giá sự
sai khác genome
các dòng chọn lọc
bằng kĩ thuật RAPD
Dòng triển vọng

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
2.2.1. Phƣơng pháp phân tích hoá sinh
Từ kết quả nghiên cứu của các tác giả khác trên cùng đối tượng và xuất
phát từ đặc điểm của đất mặn (đất có lượng muối hòa tan lớn hơn 1% ) chúng
tôi đã lựa chọn nồng độ dung dịch NaCl khi tiến hành gây mặn nhân tạo trong
các thí nghiệm là 0,1M [3], [17].
Xác định ảnh hưởng của NaCl 0,1M đến hoạt độ của  - amylase hàm
lượng đường tan, hoạt độ của protease và protein tan, giai đoạn hạt nảy mầm.