xác định đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong các loại thực phẩm đóng gói bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
HỒ THỊ HỒNG MY
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AXIT BENZOIC
VÀ AXIT SORBIC TRONG CÁC LOẠI
THỰC PHẨM ĐÓNG GÓI BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH
MÃ SỐ: 60440118
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS NGÔ VĂN TỨ
Huế, Năm 2014
2
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển dân số, kinh tế, xã hội, khoa
học và công nghệ đòi hỏi các mặt hàng thực phẩm phải ngày càng dồi
dào và phong phú về số lượng, chất lượng, cũng như chủng loại và thời
gian sử dụng. Để đáp ứng nhu cầu đó trong quá trình chế biến thực
phẩm các nhà sản xuất thường thêm các chất phụ gia vào thực phẩm
nhằm cải thiện chúng. Phụ gia thực phẩm là những chất không được coi
là thực phẩm hoặc một thành phần của thực phẩm, chúng có ít hoặc
không có giá trị dinh dưỡng, được chủ động cho vào với mục đích đáp
ứng yêu cầu công nghệ trong quá trình sản xuất,chế biến, xử lí, bao gói,
vận chuyển, bảo quản. [2]
Trong đó khâu bảo quản thực phẩm không kém phần quan
trọng. Có nhiều cách để bảo quản thực phẩm như phơi, sấy khô, làm
lạnh, đóng gói, muối, ngâm tẩm hóa chất. Mỗi phương pháp có những
ưu điểm và nhược điểm riêng, trong đó việc sử dụng hóa chất bảo quản
là một biện pháp hiện đại, tiện ích, nếu sử dụng đúng liều lượng, giúp

bảo quản, làm chậm hư thối, giữ được phẩm chất và vẻ hấp dẫn của
thực phẩm, đồ uống, trái cây đóng hộp, bánh mì vv. Trong nhóm chất
bảo quản có axit benzoic và axit sorbic được sử dụng nhiều trong thực
phẩm nhằm mục đích ức chế sự phát triển của nấm men, nấm mốc gây
hư hỏng thực phẩm.
Vì lượng nhỏ axit benzoic và axit sorbic trên nền hữu cơ là
khó phân tích xác định. Do đó phải lựa chọn phương pháp phân tích
hữu hiệu nhất. Có thể phân tích hai axit này bằng nhiều phương pháp
khác nhau như quang phổ uv-vis, sắc kí khối phổ, sắc kí lỏng hiệu
năng cao… các phương pháp này cho độ nhạy, độ chính xác cao, nên
những phương pháp nầy đã được áp dụng để xác định những thành
phần riêng lẽ của các chất. Tuy nhiên, cho đến nay việc xác định
đồng thời hai axit này trong cùng một đối tượng mẫu chưa được
nghiên cứu.
Để góp phần phục vụ công tác kiểm tra an toàn thực phẩm,
đồng thời tiết kiệm chi phí, rút ngắn thời gian phân tích, chúng tôi
chọn đề tài: “ Xác định đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong
các loại thực phẩm đóng gói bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao” với hai mục tiêu :
3
- Xây dựng được qui trình phân tích đồng thời axit benzoic
và axit sorbic trong một số thực phẩm đóng gói.
- Áp dụng qui trình phân tích vào thực tế kiểm tra một số
thực phẩm đóng gói đang được sử dụng rộng rãi.
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Chất bảo quản
1.1.1 Định nghĩa về chất bảo quản
1.1.1 Định nghĩa về chất bảo quả n
1.1.2 Phân loại chất bảo quản

1.1.3 Giới hạn cho phép sử dụng một số chất bảo quản trong
thực phẩm
1.1.4 Tác động bất lợi về việc sử dụng chất bảo quản
1.2 Tổng quan về axit benzoic và axit sorbic
1.2.1 Axit benzoic
1 .2.2 Hoạt tính chống vi sinh của axit benzoic
1.2.3 Độc tính của axit benzoic
1.2.4 Axit sorbic
1.2.5 Hoạt tính chống vi sinh của axit sorbic
1.2. 6 Độc tính
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
Mục đích của luận văn là nghiên cứu xác định đồng thời axit
benzoic và axit sorbic trong thực phẩm đóng bằng phương pháp
HPLC dùng detector DAD. Những nội dung nghiên cứu cụ thể như
sau:
1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện thích hợp cho
phép xác định đồng thời hỗn hợp các chất nêu trên bằng phương pháp
HPLC dùng detector UV:
+ Xác định bước sóng phát hiện.
+ Khảo sát tốc độ dòng pha động.
+ Khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động.
2. Khảo sát các điều kiện thủy phân
4
+ Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân
+ Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp khi phân tích đồng
thời các chất thông qua độ ổn định, khoảng tuyến tính, giới hạn phát
hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ).

4. Xây dựng qui trình phân tích và áp dụng vào thực tế:
+ Xây dựng qui trình phân tích
+ Kiểm soát chất lượng qui trình phân tích thông qua độ
đúng và độ lặp lại
+ Áp dụng qui trình đã xây dựng được để phân tích một số
thực phẩm đóng gói đang lưu hành trên địa bàn thành phố Huế.
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.2.1 Thiết và dụng cụ
2.2.2 Hóa chất
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Chọn ngẫu nhiên các mẫu thực phẩm đóng gói trên thị
trường Thừa Thiên Huế, bảo quản theo qui định nhãn sản phẩm. Tiến
hành xử lí theo quy trình thích hợp trước khi phân tích [9].
2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời axit benzoic và
axit sorbic.
1. Chuẩn bị dung dịch chạy HPLC
Quá trình phân tích mẫu được tiến hành trên máy HPLC cột
pha đảo C18, với hệ dung môi pha động phân cực, do vậy mẫu phân
tích và mẫu chuẩn phải được hòa tan trong nước, dung dịch được lọc
qua màng 0,45 µm
2. Khảo sát bước sóng phát hiện
Dựa vào tài liệu tham khảo [14], chúng tôi tiến hành khảo sát
mẫu chuẩn trên máy HPLC với cột C18, thể tích tiêm 20 µL,
detector UV cho phép lựa chọn và xác định λ
max
của các chất phân
tích trên cùng một thí nghiệm.
3. Khảo sát ảnh hưởng của pha động
Mục tiêu của khảo sát là tìm ra hệ pha động thích hợp nhất

có khả năng tách pic của hai axit benzoic và axit sorbic tốt hơn so
với các pic liền kề.
5
4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng
Dựa vào trọng lượng phân tử, cấu trúc hóa học, tính chất hòa
tan, tính phân cực của axit benzoic và axit sorbic, kết hợp với việc
tham khảo tài liệu của hai hoạt chất trên, chúng tôi sử dụng kỹ thuật
sắc ký pha đảo, kỹ thuật này tỏ ra khá hữu hiệu trong việc phân tích
axit benzoic và axit sorbic.
5. Khảo sát các điều kiện thủy phân
Tiến hành thủy phân mẫu trong môi trường kiềm, để lựa
chọn nhiệt độ và thời gian tốt nhất cho quá trình thủy phân vì hai yếu
tố này ảnh hưởng nhiều nhất đến kết quả phân tích [15].
2.3.3 Tính tương thích của hệ thống sắc kí
2.3.4 Thẩm định phương pháp
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp định lượng hai
thành phần.
3.1.1. Khảo sát bước sóng phát hiện
+ Axit benzoic hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 210 ÷ 265 nm
+ Axit sorbic hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 235 ÷ 274 nm
Ở bước sóng 230 nm cả hai chất đều hấp thụ tốt. Do vậy,
chúng tôi chọn bước sóng 230 nm là bước sóng để khảo sát đồng
thời hai axit.
Hình 3.1: Phổ UV – Vis của axit benzoic và axit sorbic
6
3.1.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá
trình tách
Pha động lựa chọn là hỗn hợp: kali hyđrophosphat :

methanol, với thời gian phân tích cho mỗi lần chạy 21 phút, các
thành phần được tách hoàn toàn, phân giải rõ rệt.
Bảng 3.1. Kết quả trung bình của thời gian lưu, hệ số đối xứngvà độ
phân giải của quá trình tách hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic (n = 6)
Thời gian lưu t
R
(phút) Hệ số đối xứng - S
a
Độ phân
giải
axit
benzoic
axit sorbic
axit
benzoic
axit sorbic
13,277
(SD =
0,012)
19,978
(SD =
0,015)
1,012
(SD =
0,011)
1,233
(SD =
0,019)
10,231
(SD =

0,021)
Từ kết quả ở hình 3.1 và bảng 3.1, chương trình sắc ký đã
khảo sát cho phép tách hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic hoàn toàn
riêng lẻ. Tuy nhiên thời gian phân tích quá dài (t
R2
= 19,978 >10
phút) , do đó chúng tôi chọn 2 hướng khắc phục nhược điểm trên là
thay đổi tốc độ dòng và độ phân cực của pha động (tỉ lệ pha động).
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá trình tách


(a) (b)
7

(c)
Hình 3.2 SKĐ của Hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic
ở tốc độ dòng 1,8ml/phút, (b) 1,5ml/phút, (c) 1,0ml/phút
Bảng 3.2. Giá trị trung bình các thông số cơ bản của quá trình tách
hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic ở tốc độ dòng khác nhau (n=6)
Tốc độ dòng
ml/phút
Các thông số
1,0 1,5 1,8
Thời gian lưu t
R1
Thời gian lưu t
R2
Hệ số đối xứng S
a1
Hệ số đối xứng S

a2
Độ phân giải R

10,688
13,277
1,168
1,245
11,94
6,211
6,981
1,201
1,142
10,15
4,112
5,124
1,125
1,127
9,54
Hình 3.5: Sự phụ thuộc thời gian lưu của axit sorbic (◊)
và độ phân giải (■) vào tốc độ dòng
8
* Nhận xét:
Kết quả các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng
tới quá trình tách được trình bày ở hình 3.2; 3.3; 3.4; 3.5 bảng 3.2
Tốc độ dòng tăng làm cho tốc độ di chuyển của phân tử qua
cột sắc ký tăng, sắc ký đồ gọn và cân đối hơn, hệ số đối xứng của các
pic giảm, tuy nhiên khả năng cải thiện tính đối xứng của các pic vẫn
còn hạn chế (> 1,00).
Chúng tôi chọn tốc độ dòng 1,5ml/phút để khảo sát ảnh
hưởng độ phân cực của pha động tới quá trình tách hỗn hợp axit

benzoic và axit sorbic.
3.1.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động tới quá
trình tách
Khảo sát các tỷ lệ pha động: Tiến hành thử các tỷ lệ pha
động kali hyđrophosphat: methanol [50:50], [70:30], [90:10]. Tốc độ
dòng duy trì 1,5ml/phút.

(a) (b)
(c)
Hình 3.6. SKĐ hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic với tỷ lệ pha động
(a)[50:50], (b)[70:30], (c) [90:10].
9
Bảng 3.3. Gía trị trung bình các thông số cơ bản của quá trình tách
hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic ở tỷ lệ pha động khác nhau
(n=6)
Pha động [A:B]
Các thông số
[90:10] [70:30] [50:50]
Thời gian lưu t
R1
Thời gian lưu t
R2
Hệ số đối xứng S
a1
Hệ số đối xứng S
a2
Độ phân giải R
7,491
10,690
1,245

1,134
11,12
5,970
8,271
1,132
1,152
10,87
5,031
5,701
1,125
1,285
9,35
Hình 3.9. Sự phụ thuộc thời gian lưu của axit sorbic (◊) và độ phân
giải (■) vào độ phân cực của pha động
3.2. Khảo sát các điều kiện thủy phân
Trong đề tài nghiên cứu này,chúng tôi sử dụng phương pháp
thủy phân bằng kiềm. Trong quá trình thủy phân, yếu tố ảnh hưởng
nhiều nhất đến kết quả của mẫu phân tích là nhiệt độ thủy phân và
thời gian thủy phân
3.2.1 Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Tiến hành khảo sát:để khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến khả
năng thủy phân của hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic chúng tôi
khảo sát một dãy mẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn benzoic và axit
sorbic và thêm 25 ml dung dịch NaOH 0,1N, và mẫu nước giải khát
10
được thêm chuẩn như nhau, nhưng nhiệt độ thủy phân khác nhau (30
0C
,
40; 50
0C

; 60
0C
; 70
0C
; 80
0C
; 90
0C
; 100
0C
).
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến kết quả thuỷ phân của axit
benzoic
Nhiệt độ (
0
C)
30 40 50 60 70 80 90 100
Hàm lượng biết
trước (µg/mL)
5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00
Hàm lượng xác
định được
(µg/mL)
3,812
3,94
3
4,127
4,96
5
5,102

5,03
5
5,076 5,108
Hiệu suất thu hồi 76,2 78,86 82,54
99,3
0
102,04 100,7 101,52 102,16
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến kết quả thuỷ phân của axit
sorbic
Nhiệt độ
(
0
C)
30 40 50 60 70 80 90 100
Hàm lượng
biết trước
(µg/mL)
5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00
Hàm lượng
xác định
được
(µg/mL)
3,33 3,876
4,24
5
4,78
9
5,08
2
5,02

6
5,08
8
5,09
2
Hiệu suất
thu hồi
66,60 77,52
84,9
0
95,7
8
101,
64
100,
52
101,
76
101,
84
11
Hình 3.12. Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Kết quả khảo sát ở bảng 3.4 và 3.5 và hình 3.12. cho thấy
nhiệt độ từ 70
0
C đến 100
0
C độ thu hồi đạt được cao nhất, nên chúng
tôi chọn 70
0

C làm nhiệt độ thủy phân mẫu.
3.2.2. Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân
của hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic, chúng tôi khảo sát một dãy
mẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn benzoic và axit sorbic và thêm 25
ml dung dịch NaOH 0,1N và mẫu nước giải khát được thêm chuẩn
như nhau, nhiệt độ thủy phân như nhau 70
0C
nhưng thời gian thủy
phân khác nhau (10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45 phút). Kết quả khảo
sát được trình bày ở bảng 3.6 và 3.7. và hình 3.13.
12
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến kết quả thuỷ phân
của axit benzoic
Thời gian
(phút)
15 20 25 30 35 40 45
Hàm lượng
biết trước
(µg/mL)
5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00
Hàm lượng
xác định
được
(µg/mL)
4,26
3
4,85
6
4,98

6
5,089 5,015 5,036 5,367
Hiệu suất
thu hồi
85,26 97,12 99,72 101,78
100,3
0
100,72 107,34
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian đến kết quả thuỷ phân của axit sorbic
Thời gian
(phút)
15 20 25 30 35 40 45
Hàm lượng
biết trước
(µg/mL)
5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00
Hàm lượng
xác định
được
(µg/mL)
5,276
4,36
5
4,982 5,055 5,026 5,102 5,065
Hiệu suất
thu hồi
105,52
87,3
0
99,6

4
101,10 100,52 102,04 101,30
13
Hình 3.13. Ảnh hưởng thời gian đến quá trình thủy phân
+ Nhận xét: Kết quả khảo sát ở bảng 3.6 và 3.7 và hình 3.13
cho thấy thời gian từ 30 phút trở lên hiệu suất phản ứng thu được là
tốt nhất, chúng tôi chọn 30 phút để tiến hành thủy phân mẫu.
3.3. Qui trình định lượng
3.3.1. Khảo sát tính tương thích của hệ thống
Tiến hành tiêm 6 lần mẫu vào hệ thống sắc ký lỏng cao áp ở
các điều kiện đã lựa chọn. Tính tương thích của hệ thống sắc ký
được biểu thị bằng sai số tương đối (RSD) của kết quả sau 6 lần tiêm
của mẫu
Bảng 3.8. Kết quả độ lặp lại của hệ thống sắc ký
STT
Diện tích píc
Axit benzoic Axit sorbic
1
2
3
4
5
6
2849,817
2842,847
2842,391
2838,629
2841,715
2838,681
3180.654

3172.884
3185.803
3174.388
3175.548
3179.274
X
RSD (%)
2842,347
0,131
3178,092
0,138
14
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy sai số tương đối RSD% thu
được với hai chất đều nhỏ hơn 1%, điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký
mà chúng tôi tiến hành là phù hợp và đảm bảo sự ổn định của
phương pháp đã xây dựng.
3.3.2. Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng
* Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic của axit benzoic – axit sorbic:
Tiến hành chuẩn bị các dung dịch chuẩn như sau:
Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm: Cân riêng biệt mỗi loại
chuẩn 0,1g, thêm 2 – 3ml methanol, lắc cho tan hoàn toàn, thêm
nước vừa đủ 100 ml
Dung dịch chuẩn: Từ 2 dung dịch chuẩn gốc trên, pha ra các
chuẩn làm việc 1,0 ; 2,0 ; 5,0 ; 10,0 ; 20,0 ; 25,0 ; 50,0 ; 100,0µg/ml,
lọc qua màng milipore 0,45 µm. Sau khi máy ổn định tiến hành đo ở
điều kiện đã chọn, tiêm 20µl các dung dịch vào cột.
(a) (b)

Hình 3.14. Đường chuẩn của axit benzoic (a), axit sorbic (b)

15

+ Nhận xét: Qua các phương trình tuyến tính của từng chất
chúng tôi nhận thấy có mối tương quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa
nồng độ và diện tích píc tương ứng thu được trên sắc ký đồ, khoảng
phân tích rộng nồng độ từ 0,25 µg/ml đến 200 µg/ml, hệ số tương
quan r
2
= 0,9997 đối với axit benzoic và r
2
= 1 đối với axit sorbic.
3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
1. Giới hạn phát hiện
LOD =
b
S
y
×
0,3
Trong đó S
y
: Độ lệch chuẩn của diện tích pic trên đường hồi quy tuyến
tính, b là độ dốc của đường hồi qui tuyến tính
Bảng 3.10. Kết quả xác định giới hạn phát hiện LOD(*)
Chất
bảo
quản
Nồng độ
(x),
µg/mL

Diện
tích píc
Phương trình hồi qui tuyến
tính, hệ số tương quan (R), S
y
và LOD
Axit
benzoic
0.25
0.5
1.0
2.0
14.458
30.403
63.444
128.965
Y = 65.53x -2.117
R = 1
S
y
= 50,71
LOD = 2,3 µg/mL
Axit
sorbic
0.25
0.5
1.0
2.0
13.138
29.015

61.119
125.283
Y = 64.115x -2.
R = 1
S
y
= 49,62
LOD = 2,3 µg/mL
Phương pháp đạt LOD khá thấp (2,3µg/ml cho mỗi hoạt
chất).
2. Giới hạn định lượng
Giới hạn định lượng LOQ = (3 - 4).LOD
Giới hạn định lượng của axit benzoic:
LOQ = 3* 2,3 = 6,9 µg/mL
Tương tự giới hạn định lượng của axit sorbic:
LOQ = 3* 2,3 = 6,9 µg/mL
16
3.3.4. Xác định độ lặp lại của phương pháp
Tiến hành 5 thí nghiệm lặp lại và mỗi thí nghiệm tiêm mẫu
lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình của diện tích pic
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu nước giải khát (n =5)
Thí
nghiệm
Axit benzoic Axit sorbic
Diện tích
pic
Nồng độ
xác định
được
(µg/mL)

Diện tích
pic
Nồng độ
xác định
được
(µg/mL)
2962.913
2964.491
2961.962
2962.295
2920.285
49.84
50.17
49.83
49.83
48.15
3254.338
3273.780
3284.719
3252.137
3285.879
49.25
49.84
50.05
48.86
50.42
X
RSD (%)
49.56
1,62

49.68
1,26
Theo Horwitz, khi phân tích những nồng độ cỡ mg/L, thì sai
số trong nội bộ phòng thí nghiệm nhỏ hơn ½ RSD tính theo công
thức:RSD(%)= 2
(1 – 0,5lgC)
(C là nồng độ chất phân tích) thì đạt yêu
cầu.
+ Đối với phép phân tích axit benzoic:
RSD(%) = 1,26% ≤
)
10
50
lg5,01(
9
2
2
1
2
1
−
=
H
RSD
= 4,44%
+ Đối với phép phân tích axit sorbic:
RSD(%) = 1,62% ≤
)
10
50

lg5,01(
9
2
2
1
2
1
−
=
H
RSD
= 4,44%
3.3.5. Xác định độ đúng của phương pháp
Tiến hành thêm chính xác một lượng axit benzoic – axit sorbic
chuẩn vào mẫu thử. Tỷ lệ thêm 80 (µg/mL) ; 100 (µg/ml) ; 120 (µg/ml).
Định lượng mẫu thêm chuẩn với 3 phép thử song song.
17
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu nước giải khát (n= 3)
Hoạt chất Mẫu
Lượng có
sẵn trong
dung dịch
(µg/ml)
Lượng
thêm vào
(µg/ml)
Lượng
tìm thấy
(µg/ml)
Tỷ lệ thu

hồi
(%)
Axit
benzoic
1
31,54
50 80,25 97,42
2 100 128,64 97,10
3 150 185,24 102,47
Axit
sorbic
1
41,12
50 90,52 98,80
2 100 141,24 100,12
3 150 186,37 96,83
Để kiểm tra độ đúng của phương pháp đo, dựa vào giá trị
RSD
Horwitz
. Rev % chấp nhận được khi:
Horwitz
1
100-Rev .RSD
2
≤

Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp đo axit
benzoic
C Rev (%) 1/2.RSD
Horwitz

(%)
Kiểm tra
50 ppm 97.42 4,44 Đạt
100 ppm 97,10 4,00 Đạt
150 ppm 102,47 3,76 Đạt
Bảng 3.14. Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp đo axit
sorbic
C Rev (%) 1/2.RSD
Horwitz
(%)
Kiểm tra
50 ppm 98,80 4,44 Đạt
100 ppm 100.12 4,00 Đạt
150 ppm 96,83 3,76 Đạt
18
+ Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.9 và 3.10 cho thấy phương pháp đạt được
độ đúng tốt với độ thu hồi nằm trong khoảng từ 96,83% - 102,47%, thỏa
mãn hàm Horwitz.
3.4. Xây dựng qui trình phân tích đồng thời axit benzoic – axit
sorbic
3.4.1. Điều kiện sắc ký
- Sử dụng cột pha đảo RP18 (150 × 4,6 mm ; 3µm )
- Dung môi pha động: dung dịch kali hyđrophosphat : methanol
(70 : 30)
- Thể tích bơm mẫu 20µl
- Tốc độ dòng 1,5 ml/phút
- Nhiệt độ cột : nhiệt độ phòng
- Detector : UV bước sóng λ = 230 nm hay λ = 227 nm,
3.4.2. Kiểm soát qui trình phân tích
+ Đối với mẫu là thực phẩm dạng lỏng

+ Đối với mẫu thực phẩm là dạng rắn
3.4.3. Xây dựng đường chuẩn
3.5. Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng một số mẫu
thực phẩm trên thực tế
Tiến hành với các điều kiện sắc ký và thao tác như đã xây
dựng tùy vào hàm các hoạt chất trong chế phẩm khác nhau có thể
pha loãng khác nhau (sao cho nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính
xác định của phương pháp đã được xác định) phù hợp với quy trình
định lượng đã xây dựng.
19
Bảng 3.15. Kết quả định lượng các sản phẩm trong thực phẩm (n = 6)
Hàm lượng
hoạtchất
Tên mẫu
Nơi
Sản xuất
Axit
benzoic
(mg/kg)
Axit
sorbic
(mg/kg)
Mức cho
phép
(mg/kg)
Kết
quả
1. Mẫu nước cam
sx trên nền nước
khoáng Thanh

Tân
CT CP nước
khoáng Thanh
Tân
182,10
600
(dùng1
mình kết
hợp với cả
hai)
Đạt
2. Mẫu nước ngọt
tăng lực sx trên
nền nước khoáng
Thanh Tân
CT CP nước
khoáng Thanh
Tân
150,81
Đạt
3. Mẫu kẹo mềm
CTCP bánh
kẹo Hải Hà
597,27
1000 (dùng1
mình kết
hợp với cả
hai)
Đạt
4. Mẫu tương ớt

chin su
CT TNHH
thực phẩm
Việt Tiến
712,43 263,48 Đạt
5. Mẫu tương ớt
Lưu Hương
Cơ sở sản
xuất Lưu
Hương - Huế
1164,23
Khô
ng
6. Mẫu mắm tôm
Cô Ri
Cơ sở sản
xuất Cô Ri -
Huế
200
(axit
benzoic)
Đạt
Nhận xét:
Chúng tôi đã hoàn thành việc xây dựng phương pháp định
lượng đồng thời axit benzoic – axit sorbic trong sản phẩm thực phẩm
đóng gói bằng phương pháp HPLC và đánh giá phương pháp xây
dựng dựa trên các điều kiện tối ưu đã được khảo sát: xác định
khoảng tuyến tính, xác định độ lặp lại và độ đúng của phương pháp
định lượng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
Kết quả cho thấy phương pháp định lượng đã xây dựng được

là phù hợp, cho phép tách và định lượng được hai hoạt chất trong
20
một số sản phẩm thực phẩm đóng gói như: nước giải khát có lên
men, nước ngọt, tôm chua, tương ớt Sắc ký đồ cho hình ảnh các pic
tách rõ ràng, cân đối, độ phân giải tốt.
Khoảng tuyến tính của hai chất chúng tôi khảo sát được
tương đối rộng từ 1,00 µg/ml đến 100,00 µg/ml, cả hai chất
đều cho ra phương trình hồi qui với r
2
gần bằng 1.
21
KẾT LUẬN
Chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu đặt ra của đề tài này:
1.Tìm điều kiện sắc ký phù hợp, ổn định để định lượng đồng thời
cả hai hoạt chất axit benzoic – axit sorbic trong một số sản phẩm
thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Máy HPLC
- Cột pha đảo RP18 (150 × 4,6 mm ; 3µm )
- Dung môi pha động: dung dịch kali hyđrophotphat : methanol
(70 : 30)
- Thể tích bơm mẫu 20µl
- Tốc độ dòng 1,5 ml/phút
- Nhiệt độ cột : nhiệt độ phòng
- Detector : UV bước sóng λ = 230 nm hay λ = 227 nm,
2. Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời hai hoạt
chất axit benzoic – axit sorbic trong một số sản phẩm thực phẩm
đóng gói đối với mẫu dạng rắn và mẫu dạng lỏng.
- Thời gian phân tích ngắn từ 1 đến 9 phút.
- Khoảng tuyến tính đủ rộng cho phép định lượng với nồng độ bất
kỳ các chất cần khảo sát nằm trong khoảng tuyến tính.

- Các phương trình hồi qui được thiết lập cho mối quan hệ tuyến tính
rất chặt chẽ giữa nồng độ từng chất với diện tích pic của chúng nằm trong
khoảng với
+
9994,0
2
=
benzoic
R
+
1
2
=
Sorbic
R
22
- Phương pháp có độ lặp lại tốt có sai số tương đối RSD%
nhỏ ( n = 5)
+ axit benzoic : 1,62 %
+ axit sorbic : 1,26 %
- Phương pháp có độ đúng cao, đáng tin cậy :
+ axit benzoic : 97,10% - 102,47 %
+ axit sorbic : 96,83% - 100,12 %
Kết quả khảo sát càng khẳng định phương pháp định lượng
đã xây dựng là đáng tin cậy, góp vào phần kiểm tra chất lượng các
sản phẩm thực phẩm đóng gói trên địa bàn Thừa Thiên Huế.
* Kiến nghị
- Tăng cường cảnh báo và khuyến cáo về tính độc hại khi sử
dụng thực phẩm quá liều nhất là các sản phẩm dùng cho trẻ em dưới
1 tuổi và thực hiện đúng theo qui định của Bộ Y tế . Để chuyển từ

nhận thức đến cách thực hành cho người sản xuất, chế biến, buôn
bán và người sử dụng theo hướng vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm
giảm thiểu các vụ ngộ độc do thực phẩm gây ra.
- Cần có những nghiên cứu sâu rộng hơn, với nhiều đối
tượng mẫu cũng như số lượng mẫu nhiều hơn. Từ đó đưa ra những
giải pháp nhằm nâng cao chất lượng cuộc sống của người dân.
23