Xây dựng quy trình nuôi cấy virus cúm a(h1n1) trên tế bào mdck bằng hệ thống vi hạt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





TRẦN NGỌC THỦY TIÊN




XÂY DỰNG QUY TRÌNH
NUÔI CẤY VIRUS CÚM A(H1N1)
TRÊN TẾ BÀO MDCK BẰNG HỆ THỐNG VI HẠT

Chuyên ngành: Di Truyền Học
Mã số: 60 42 70


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. CAO THỊ BẢO VÂN




Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2010

Lời cảm ơn
Lôøi caûm ôn
Em xin chân thành cảm ơn Cô TS. Cao Thị Bảo Vân đã tận tình quan tâm, hướng dẫn
và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian em thực tập và làm luận văn
tại Labo Sinh học phân tử – Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur TpHCM.
Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Phòng Đào tạo sau Đại học, Quý Thầy Cô
trong bộ môn Di truyền – Khoa Sinh học Trường ĐH KHTN TpHCM, và Quý Thầy
Cô giảng viên thỉnh giảng đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích.
Em xin chân thành cảm ơn Cô ThS. Kim Dung và anh Thương – Labo Kiểm định – đã
tạo điều kiện về hóa chất, thiết bị và hỗ trợ kỹ thuật karyotyping cho em.
Em xin chân thành cảm ơn Cô TS. Quế Hương và các anh chị thuộc Labo Arbovirus
đã hỗ trợ em thiết bị chụp ảnh nhiễm sắc thể.
Chân thành cảm ơn các chị, các bạn của Labo Sinh học Phân tử, nhất là bạn Nhi và bạn
Chỉnh, đã cùng trao đổi, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu và hỗ trợ, giúp đỡ Tiên
trong suốt thời gian Tiên thực hiện luận văn và làm việc tại Phòng.
Cảm ơn các anh chị và các bạn lớp CH Di truyền K16 cũng như các bạn Hương, Hiền,
Ý lớp 00CNSH đã cùng Tiên học tập và động viên Tiên hoàn thành luận văn.
… Me ohc sn6e9d me9d xa9d hna fam scuhp jhnah xgn7uhn fu6eihn jt6aht fav xem
jhnam jc7ul jihgn, jc7ul jgn6o9d, jc7ul hnis fn6ougn n7o rmac! St6ahn jpus yus me
ihk xgn7uhn me i7or rob gn6ohk fav, M6al Gn6on jn6eiv 7uht n6el me r7ohc hna
fu6a9d fyagn xgn7uhn f7ut, auq m8an ab st6ous me n6eb n6oul xa9d hna n7o rmac!
Me rauc gn7o7uht u6ey fgnuc 6ov F6ot, hna n7o rmac.
Cuối cùng, những tình cảm thiêng liêng nhất con xin dành cho bố Dũng, mẹ Châu
và chị hai Minh Anh – những người đã luôn dõi theo và kiên nhẫn ủng hộ mọi bước
đường con đi…



TpHCM, ngày 08 tháng 11 năm 2010

Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
Mục lục
i
Mục lục
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục i
Danh mục chữ viết tắt iv
Danh mục bảng v
Danh mục hình ảnh vi
Đặt vấn đề viii
Phần 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1
1.1.1. Ưu điểm của công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào 1
1.1.2. Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt sử dụng trong sản xuất virus 3
1.2. Tế bào MDCK 6
1.2.1. Định nghĩa 6
1.2.2. Lịch sử phát triển dòng tế bào MDCK 6
1.2.3. Một số ứng dụng của tế bào MDCK 6
1.2.4. Ưu điểm của tế bào MDCK 7
1.2.5. Đặc điểm của tế bào MDCK 8
1.2.5.1. Đặc điểm hình thái 8
1.2.5.2. Đặc điểm di truyền 8
1.2.5.3. Đặc điểm sinh lý 8
1.2.6. Điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK 9
1.3. Virus cúm A(H1N1) mới 2009 10
1.3.1. Sơ lược về virus cúm A 10
1.3.2. Virus cúm A(H1N1) mới 2009 12

1.3.2.1. Các đặc điểm của virus cúm A(H1N1) mới 2009 12
1.3.2.2. Tình hình dịch cúm A(H1N1) mới 2009 trên thế giới và tại Việt Nam 17
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
Mục lục
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
ii
Phần 2. Vật liệu – Phương pháp
2.1. Vật liệu 20
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm 20
2.1.1.1. Hóa chất 20
2.1.1.2. Sinh phẩm 22
2.1.2. Dụng cụ 23
2.1.3. Thiết bị 24
2.2. Phương pháp 25
2.2.1. Kiểm tra sự hiện diện của mycoplasma trong dịch nuôi cấy tế bào 25
2.2.2. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào 25
2.2.3. Nuôi cấy tế bào và virus trên vi hạt Cytodex1 27
2.2.4. Định kiểu nhân (karyotyping) 29
2.2.5. Xác định hiệu giá virus bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu 31
2.2.6. Xác định hiệu giá virus bằng TCID
50
theo Reed – Muench (1938) 32
2.2.7. Xác định liều gây nhiễm MOI 34
Phần 3. Kết quả và biện luận
3.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M0643
[5% CO
2
, 10%FBS] 36
3.2. So sánh hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK trong các môi trường khi thay đổi
nồng độ FBS và CO

2
40
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ trypsin TPCK lên sự sống sót của tế bào
MDCK 44
3.4. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho virus NIBRG-121xp-E1 48
3.5. Xác định liều xâm nhiễm tối ưu của virus NIBRG-121xp-E1 55
3.6. Khảo sát thời gian bám và tăng trưởng của tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1
61
3.7. Ứng dụng các điều kiện nuôi cấy thích hợp đã được khảo sát để nuôi cấy virus
NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 65
Mục lục
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
iii
3.8. Kiểm tra sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền 68
Phần 4. Kết luận và đề nghị
4.1. Kết luận 75
4.1.1. Các điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 75
4.1.2. Các điều kiện nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 75
4.1.3. Sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền 76
4.1.4. Quy trình nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt. 76
4.2. Đề nghị 77
Các công trình đã công bố 78
Tài liệu tham khảo 79
Phụ lục 87




Danh mục chữ viết tắt
iv

Danh mục chữ viết tắt
ATCC : American Type Culture Collection (ngân hàng tế bào giống tại Hoa Kỳ)
BHK : Baby Hamster Kidney (tế bào thận chuột con)
BSA : Albumin from Bovine Serum (albumin từ huyết thanh bê)
CDC : Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm Kiểm soát và Ngăn ngừa dịch bệnh)
CPE : Cytopathetic Effect (hiệu ứng hủy hoại tế bào)
DEAE : Diethylaminoethyl
ECACC : The European Collection of Cell Cultures (ngân hàng tế bào châu Âu)
EDTA : Ethylene-diamin-tera-acetic acid
FBS : Fetal Bovine Serum (huyết thanh bào thai bê)
HA : Haemagglutination Assay (phản ứng ngưng kết hồng cầu)
MDCK : Madin – Darby Canine Kidney (tế bào thận chó Madin – Darby)
MOI : Multiplicity Of Infection (liều xâm nhiễm)
PBS : Phosphate Buffered Saline (muối đệm phosphate)
PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gene)
TCID
50
: 50% The Tissue Culture Infectious Dose
(liều xâm nhiễm của virus gây hủy hoại 50% số giếng tế bào)
TPCK : L-tosylamino-2-phenylethyl chloromethyl keton
Tolylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl keton
Vero : Vervet Monkey Origin (African green monkey kidney)
(tế bào thận khỉ xanh châu Phi)
WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
Danh mục bảng
v
Danh mục bảng

Trang
Bảng 1.1. Một số loại vi hạt thương mại hiện hành 5
Bảng 1.2. Tóm tắt chức năng của các protein trong virus cúm A 11
Bảng 3.1. Nồng độ FBS và CO
2
dùng để so sánh hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK
trong môi trường M0643 và M1018 40
Bảng 3.2. Các thông số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào MDCK khi nuôi cấy
trong các môi trường 43
Bảng 3.3. CPE và hiệu giá (HA và TCID
50
) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy
trên tế bào MDCK ở 37
o
C và 35
o
C 50
Bảng 3.4. Các liều xâm nhiễm (MOI) của virus NIBRG-121xp-E1 được dùng để
khảo sát liều xâm nhiễm tối ưu 55
Bảng 3.5. CPE và hiệu giá (HA và TCID
50
) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy
trên tế bào MDCK trong các môi trường với các liều xâm nhiễm khác nhau 57
Bảng 3.6. Thể tích dịch virus NIBRG-121xp-E1dùng xâm nhiễm tế bào MDCK
nuôi cấy trên vi hạt Cytodex1 65
Bảng 3.7. Hiệu giá (HA và TCID
50
) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy bằng hệ
thống vi hạt 66

Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
Danh mục hình ảnh
vi
Danh mục hình ảnh
Trang
Hình 1.1. Tế bào được nuôi cấy trên vi hạt Cytodex 4
Hình 1.2. Tế bào MDCK chụp dưới kính hiển vi điện tử (vật kính X10) 8
Hình 1.3. Virus cúm A: cấu trúc virus và 11 protein được mã hóa từ 8 mảnh RNA
11
Hình 1.4. Bộ gene tái tổ hợp của virus cúm A(H1N1) mới 2009 13
Hình 1.5. Hình thái của virus cúm A(H1N1) mới 2009 14
Hình 1.6. Chu trình xâm nhiễm của virus cúm A(H1N1) mới 2009 15
Hình 1.7. Tần suất xuất hiện của các phân type virus cúm trên thế giới từ ngày
19/4/2009 đến 14/8/2010 (WHO, 25/8/2010) 18
Hình 2.1. Tế bào được nhuộm bằng dung dịch trypan blue 21
Hình 2.2. Phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer 26
Hình 2.3. Mô hình đường cong tăng trưởng của tế bào 27
Hình 2.4. Nhân tế bào được nhuộm với dung dịch acid citric-tím tinh thể 29
Hình 2.5. Nguyên tắc của phản ứng ngưng kết hồng cầu 31
Hình 2.6. Phương pháp thực hiện phản ứng HA trên plate 96 giếng đáy chữ V (hoặc
U) 32
Hình 2.7. Phương pháp thực hiện TCID
50
trên plate 96 giếng đáy bằng 34
Hình 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M0643 [5%
CO
2
, 10% FBS] 37
Hình 3.2. Sự tăng trưởng của tế bào MDCK qua 7 ngày nuôi cấy (theo thứ tự từ

trên xuống dưới) trong các môi trường với nồng độ CO
2
và FBS khác nhau 39
Hình 3.3. Hiệu quả nuôi cấy tế bào MDCK của các môi trường khi thay đổi nồng
độ FBS và CO
2
41
Hình 3.4. Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong môi trường M1018 [0%
CO
2
, 10% FBS] 43
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
Danh mục hình ảnh
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
vii
Hình 3.5. Sơ đồ phân bố các nồng độ trypsin TPCK trên plate 12 giếng 44
Hình 3.6. Ảnh hưởng của các nồng độ trypsin TPCK lên sự sống sót của tế bào
MDCK trong môi trường M0643 (a) và M1018 (b) 47
Hình 3.7. Sơ đồ phân bố các bậc pha loãng virus NIBRG-121xp-E1 trên plate 6
giếng 49
Hình 3.8. CPE và hiệu giá (HA và TCID
50
) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy
trên tế bào MDCK ở 37
o
C (a) và 35
o
C (b) trong môi trường M0643 53
Hình 3.9. CPE và hiệu giá (HA và TCID
50

) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy
trên tế bào MDCK ở 37
o
C (a) và 35
o
C (b) trong môi trường M1018 54
Hình 3.10. CPE và hiệu giá (HA và TCID
50
) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy
trên tế bào MDCK trong môi trường M0643 với các liều xâm nhiễm khác nhau 59
Hình 3.11. CPE và hiệu giá (HA và TCID
50
) của virus NIBRG-121xp-E1 nuôi cấy
trên tế bào MDCK trong môi trường M1018 với các liều xâm nhiễm khác nhau 60
Hình 3.12. Hệ thống bình khuấy dùng nuôi cấy tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1
61
Hình 3.13. Thời gian bám và tăng trưởng của tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1
với môi trường M0643 (a) và M1018 (b) 64
Hình 3.14. Kết quả nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt với môi
trường M0643 (a) và M1018 (b) 67
Hình 3.15. Tần suất xuất hiện các bộ nhiễm sắc thể của tế bào MDCK nuôi cấy
trong các môi trường 71
Hình 3.16. Kết quả định kiểu nhân và so sánh hình thái của tế bào MDCK sau
nhiều đời cấy chuyền (đời P12+8 và P12+20) trong môi trường M0643 (a) và
M1018 (b) 74
Hình 4.1.
Sơ đồ quy trình nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt
76

Đặt vấn đề

viii
Đặt vấn đề
Từ năm 1995, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã khuyến nghị sử dụng tế bào động
vật thay thế dần trứng gà trong nuôi cấy virus cúm nhằm tạo ra được một lượng sinh
khối lớn virus đảm bảo chất lượng với thời gian sản xuất ngắn nhất và giá thành hợp
lý hơn. Trong số các dòng tế bào thường trực đã được kiểm tra, đánh giá thì MDCK
(tế bào thận chó), Vero (tế bào thận khỉ xanh châu Phi) và PER.C6 (tế bào võng
mạc phôi người) là 3 dòng tế bào đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn để có thể được
dùng trong sản xuất virus cúm. Ngày nay, công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào
MDCK đang được triển khai nghiên cứu ở nhiều quốc gia và được các hãng dược
phẩm, hóa chất uy tín trên thế giới sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học, chẩn
đoán dựa trên những ưu điểm vượt trội của tế bào MDCK và các hệ thống nuôi cấy
với giá thể vi hạt (microcarrier). Với hệ thống vi hạt, việc nuôi cấy tế bào/virus
không những có thể được tiến hành ở quy mô hàng ngàn lít mà nó còn cho phép
kiểm tra toàn diện và tự động hóa nhiều khâu trong quy trình sản xuất nên góp phần
nâng cao chất lượng của sản phẩm tế bào/virus được nuôi cấy. Tuy nhiên, so với hệ
thống nuôi cấy huyền phù tế bào trong các bình lên men, công nghệ nuôi cấy tế
bào/virus bằng hệ thống vi hạt hiện vẫn là 1 kỹ thuật còn khá mới mẻ ở Việt Nam
và cũng chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm.
Các trận dịch cúm dường như luôn xảy ra trong suốt lịch sử loài người. Trong thế
kỷ 20, thế giới đã có 3 thảm họa cúm (1918 – 1929; 1957 – 1958; 1968 – 1969) làm
thiệt mạng hàng triệu người. Vào tháng 04/2009, dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21 do
virus cúm A(H1N1) mới 2009 đã xuất phát từ Mexico, và chỉ sau 2 tháng, WHO đã
công bố đại dịch mức 6 khi virus cúm H1N1/2009 đã lan rộng toàn cầu. Tính đến
ngày 06/08/2010, đã có trên 214 quốc gia và vùng lãnh thổ xác nhận có trường hợp
nhiễm virus cúm H1N1/2009 với số ca mắc lên đến hàng trăm ngàn người và 18449
người tử vong. Theo báo cáo của Bộ Y tế, đến ngày 20/03/2010, Việt Nam đã xác
định được 11202 trường hợp dương tính với virus cúm A(H1N1) mới 2009 tại
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
Đặt vấn đề

Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
ix
60/64 tỉnh, thành phố, và bệnh nhân tử vong gần đây nhất vào tháng 08/2010 đã
nâng tổng số trường hợp tử vong của cả nước lên 60 người.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu xây dựng quy trình nuôi cấy virus cúm
A(H1N1) chủng NIBRG-121xp-E1 bằng hệ thống vi hạt sử dụng tế bào MDCK và
vi hạt Cytodex1.
Vì virus NIBRG-121xp-E1 là 1 chủng virus mới với các khảo sát ban đầu cho thấy
chủng virus này nhân lên rất yếu ngay cả trên trứng gà, và hệ thống vi hạt là 1
phương pháp nuôi cấy mới; do đó, chúng tôi lần lượt tiến hành các thí nghiệm cơ
bản nhằm chuẩn hóa lại từng điều kiện nuôi cấy cho tế bào MDCK và chủng virus
NIBRG-121xp-E1. Điều này có ý nghĩa hết sức quan trọng vì đây là cơ sở để có thể
đưa quy trình nuôi cấy này từ quy mô phòng thí nghiệm ra sản xuất lớn.
Mục tiêu của đề tài
• Chuẩn hóa các điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK nhằm nâng số lượng tế bào
lên tối đa.
• Thích ứng và chuẩn hóa các điều kiện nuôi cấy chủng virus NIBRG-121xp-
E1 trên tế bào MDCK.
• Áp dụng các điều kiện đã chuẩn hóa để nuôi cấy virus NIBRG-121xp-E1
bằng hệ thống vi hạt Cytodex1.
• Kiểm tra sự ổn định của tế bào MDCK sau nhiều đời cấy chuyền.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• Thời gian nghiên cứu: đề tài được thực hiện từ tháng 12/2009 đến tháng
8/2010.
• Địa điểm nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học
Phân tử, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur TpHCM.



Phần 1

1.1. Công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào
1.2. Tế bào MDCK
1.3. Virus cúm A(H1N1) mới 2009
1. Tổng quan tài liệu
1
1.1. Công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào
1.1.1. Ưu điểm của công nghệ nuôi cấy virus cúm trên tế bào
Từ hơn 50 năm qua, hầu hết sinh khối virus cúm đã và vẫn đang được sản xuất trên
trứng gà có phôi [14], [42], [44], [46], [57]. Tuy nhiên, từ năm 1995, Tổ chức Y tế
Thế giới (WHO) đã khuyến khích việc phát triển sản xuất sinh khối virus cúm trên
tế bào thay cho trứng gà [18], [57]. Một trong những lý do của sự khuyến nghị này
là nhu cầu sinh khối virus dùng cho các chế phẩm sinh học, chẩn đoán có thể gia
tăng rất nhanh nếu có dịch cúm xảy ra trong khi việc cung cấp số lượng lớn trứng
gà sạch có phôi trong một khoảng thời gian ngắn là hoàn toàn không thể [18], [22],
[46], [57].
Ngoài khả năng sản xuất nhanh số lượng lớn virus khi có nhu cầu, việc nuôi cấy
virus cúm trên tế bào còn có nhiều ưu điểm khác so với việc nuôi cấy virus cúm trên
trứng gà có phôi. Những ưu điểm này bao gồm:
• Nguồn cung cấp trứng gà cần được dự trù trước khoảng 1 năm và có thể bị
gián đoạn nếu xảy ra dịch cúm gia cầm [14], [22], [42], [44], [46], [47], [57].
Trong khi đó, quá trình nuôi cấy tế bào có thể đáp ứng nhanh hơn, tức thời
hơn và nguồn tế bào không bị giới hạn [14], [42], [46].
• Quy trình nuôi cấy virus cúm trên trứng gà đòi hỏi nhiều nhân công và hiệu
suất của phương pháp này tương đối thấp [42], [57]. Trong khi đó, hệ thống
nuôi cấy virus cúm trên tế bào có thể giảm 40% chi phí nhân công và hiệu
suất được cải thiện gấp 3 lần so với nuôi cấy virus trên trứng [46].

• Chất lượng thay đổi của trứng gà có thể tạo ra những tác động bất lợi đến
chất lượng của virus được sản xuất [18]. Trong khi đó, các hệ thống nuôi cấy
tế bào ngày nay thường hiện đại và có thể kiểm soát được chất lượng đồng
nhất của tế bào [42].
• Trứng gà thường chứa các loại retrovirus và các tác nhân bất lợi khác nên có
thể có khả năng các tác nhân này sẽ hiện diện trong sản phẩm virus [18],
[22], [44], [46], [47]. Trong khi đó, các dòng tế bào đã được kiểm tra đạt các
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
2
tiêu chuẩn của WHO hoàn toàn không chứa tác nhân xâm nhiễm nên sản
phẩm virus thu nhận được ít có sự hiện diện của các protein ngoại nhiễm,
đồng thời rất đồng nhất và ổn định giữa các lô [18], [46], [47].
• Các loại môi trường không huyết thanh có thể được sử dụng để nuôi cấy tế
bào và virus cúm nhằm ngăn ngừa sự dị ứng với các protein có trong huyết
thanh hay trứng gà. Điều này giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với việc sử
dụng virus cúm sống trong các chế phẩm sinh học bởi vì các protein trong
trứng gà rất khó được tinh sạch hoàn toàn [14], [18].
• Đã có những bằng chứng cho thấy một số chủng virus cúm (bao gồm virus
cúm người) khi được phân lập và cấy chuyền trên trứng gà có thể bị mất 1
trong số các domain trên kháng nguyên hemagglutinin làm cho virus được
tạo ra khác với virus hoang dại; điều này dẫn đến sự không chính xác của các
đáp ứng miễn dịch, làm giảm độ đặc hiệu và hiệu quả bảo vệ của các chế
phẩm sinh học có nguồn gốc từ sản phẩm virus này đối với chủng virus gây
dịch đang lưu hành. Trong khi đó, việc phân lập và cấy chuyền các chủng
virus cúm trên tế bào MDCK (tế bào thận chó) không ghi nhận được hiện
tượng biến đổi này, virus được tạo ra không có sự khác biệt so với virus
hoang dại nên các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ sản phẩm virus này có
độ đặc hiệu và hiệu quả bảo vệ tốt hơn, các thử nghiệm lâm sàng cũng an

toàn hơn [14], [18], [42], [44], [47].
• Một số chủng virus cúm gia cầm không thể tăng sinh trên trứng gà nếu
không được biến đổi di truyền nhưng lại có thể tăng sinh trên tế bào, nhờ vậy
việc nuôi cấy các chủng virus này trên tế bào cho phép sản xuất được các chế
phẩm sinh học đối với các chủng virus nói trên [47].
Tế bào lưỡng bội tiên phát (primary diploid cell) và tế bào thường trực (continuous
cell) là hai loại tế bào thường được dùng để nuôi cấy virus. Tuy nhiên, với các ưu
điểm như: được mô tả đầy đủ các đặc điểm di truyền; được kiểm soát hầu hết các
tác nhân bất định; chất lượng ổn định; có thể nuôi cấy trên quy mô lớn trong các nồi
lên men với giá thể vi hạt (microcarrier) hay nuôi cấy huyền phù; nhạy cảm với các
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
3
biến thể của cùng 1 loài virus và bảo tồn được các đặc tính di truyền của virus sau
nuôi cấy;… mà hiện nay các dòng tế bào thường trực được WHO công nhận và cho
phép ứng dụng rộng rãi hơn so với tế bào lưỡng bội tiên phát [44].
Trong số các dòng tế bào thường trực đã được kiểm tra, đánh giá thì MDCK, Vero
(tế bào thận khỉ xanh châu Phi) và PER.C6 (tế bào võng mạc phôi người) là 3 dòng
tế bào đáp ứng đủ các tiêu chuẩn để có thể được dùng trong sản xuất virus cúm A, B
[14], [42], [46], [47]. Gần đây, việc phát triển các chế phẩm sinh học chứa virus
cúm bất hoạt có nguồn gốc từ sản phẩm virus được nuôi cấy trên tế bào MDCK
hoặc Vero đã gặt hái được nhiều tiến bộ đáng kể với các hệ thống nuôi cấy tế bào
bằng chai xoay hay các bình khuấy dung tích lớn sử dụng giá thể vi hạt [18], [57].
1.1.2. Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt sử dụng trong sản xuất
virus

Cho đến nay, các dòng tế bào cần giá bám vẫn được nuôi cấy bằng chai MD, flask
T, chai Roux và chai xoay. Tuy nhiên, với các phương pháp truyền thống này, khi
quy mô sản xuất được mở rộng thì số lượng chai nuôi cấy sẽ tăng lên rất nhiều dẫn
đến sự tốn kém nhiều nhân công, thời gian và chi phí sản xuất. Vì vậy, từ những

năm 1967, nhiều phương pháp nuôi cấy tế bào mới đã được phát triển tập trung vào
việc gia tăng năng suất nuôi cấy như: hệ thống nuôi cấy mô đa diện (Schleicher và
Weiss, 1968), hệ thống mao dẫn bán thấm (Knazek cùng cộng sự, 1972), khối tế
bào (aggregate) – tế bào lớp đơn tụ lại thành khối có đường kính 20 – 500µm
(Tolbert và Feder, 1978), sự bao nang hóa (encapsulation) – tế bào được giữ lại bên
trong các hạt làm từ agarose, karageenan, calcium alginate,… (Nilsson và Mosbach,
1980). Đặc biệt, với sự phát triển của các vi hạt vào năm 1967 bởi van Wezel và sự
cải tiến của các vi hạt được làm giảm khả năng trao đổi ion vào năm 1979 bởi
Levine cùng cộng sự, việc sản xuất các chế phẩm sinh học từ nuôi cấy tế bào đã trở
thành 1 “giấc mơ có thật” [66].
Vi hạt là những cấu trúc hình cầu có kích thước 100 – 180µm, thường được làm từ
DEAE sephadex, cellulose, thủy tinh, gelatine, collagen. Chúng cung cấp 1 diện
tích bề mặt nuôi cấy lớn trong 1 thể tích/diện tích nuôi cấy nhỏ. Hệ thống nuôi cấy
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
4
tế bào với giá thể vi hạt là sự kết hợp của hình thức nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy
lớp đơn. Đối với vi hạt cứng, tế bào bám dính và tăng trưởng trên bề mặt vi hạt ở
dạng lớp đơn (Hình 1.1). Đối với vi hạt xốp, còn gọi là macrocarrier, tế bào phát
triển bên trong vi hạt nên không bị tác động bởi lực khuấy trong bình nuôi cấy [66].
Hình 1.1. Tế bào được nuôi cấy trên vi hạt Cytodex [66].
Hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt có nhiều lợi thế so với các hệ thống nuôi
cấy quy mô lớn khác, bao gồm:
• Cung cấp diện tích bề mặt nuôi cấy lớn trong 1 thể tích/diện tích nuôi cấy
nhỏ và có thể gia tăng diện tích bề mặt nuôi cấy bằng cách gia tăng nồng độ
vi hạt, nhờ đó mà mật độ tế bào nuôi cấy được gia tăng và hiệu suất sản
phẩm từ nuôi cấy trên tế bào cũng gia tăng.
• Quá trình nuôi cấy tế bào được tiến hành trên 1 hệ thống năng suất cao thay
cho việc dùng nhiều chai nuôi cấy năng suất thấp, nhờ đó mà môi trường
nuôi cấy được sử dụng hiệu quả và tiết kiệm hơn.

• Dễ dàng theo dõi và kiểm soát được các điều kiện nuôi cấy như pH, nồng độ
O
2
, CO
2
,… do môi trường nuôi cấy luôn được khuấy đều.
• Dễ dàng lấy mẫu tế bào.
• Dễ dàng thu nhận tế bào cũng như các sản phẩm từ nuôi cấy tế bào do các vi
hạt có thể nhanh chóng lắng xuống đáy bình nuôi cấy.
• Dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất khi kết hợp vi hạt với các nồi lên men,
các bình phản ứng sinh học (bioreactor) dung tích lớn.
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
5
Nhờ các ưu điểm nói trên, hệ thống nuôi cấy tế bào với giá thể vi hạt là lựa chọn
phổ biến của các nhà sản xuất các chế phẩm sinh học. Ngoài ra, hệ thống này còn là
1 công cụ tuyệt vời để nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của sinh học tế bào, sự
biệt hóa và trưởng thành của tế bào, các quá trình biến dưỡng,… [66].
Bảng 1.1. Một số loại vi hạt thương mại hiện hành [66].
Loại vi hạt Tên thương mại Thành phần cấu tạo
1. Dextran Cytodex-1 DEAE dextran
Cytodex-2 Dextran được phủ lớp amine bậc 4
Superbeads DEAE dextran
Microdex DEAE dextran
Dormacell DEAE dextran nhị phân
2. Nhựa Biosilon Polystyrene tích điện
Biocarriers Polyacrylamide /
4-Dimethylaminopyridine (DMAP)
Cytospheres Polystyrene tích điện
3. Gelatin Cytodex-3 Dextran được phủ lớp gelatin

Gelibeads Gelatin
4. Thủy tinh Bioglas Nhựa được phủ lớp thủy tinh
Ventreglas Nhựa được phủ lớp thủy tinh
5. Cellulose DE-52/53 DEAE – Cellulose
Một số loại vi hạt thương mại hiện hành được liệt kê ở Bảng 1.1. Việc lựa chọn loại
vi hạt thích hợp để sử dụng phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy và hình thái của tế
bào. Ví dụ như để nuôi cấy virus và thu nhận các sản phẩm từ tế bào thì vi hạt
dextran là tốt nhất; nếu tế bào cần được làm bong khỏi bề mặt nuôi cấy thì vi hạt
gelatin hay thủy tinh là lựa chọn ưu tiên; nếu tế bào có khả năng bám dính thấp thì
cần lưu ý loại vi hạt cho phép bám dính lượng tế bào tối đa. Nếu tế bào có hình thái
giống nguyên bào sợi thì vi hạt có lớp phủ điện tích trên bề mặt sẽ giúp tế bào bám
dính tốt hơn; nếu tế bào có hình thái giống tế bào biểu mô thì vi hạt có lớp phủ
gelatin là lựa chọn phù hợp [66].
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
6
1.2. Tế bào MDCK
1.2.1. Định nghĩa
Tế bào MDCK (Madin – Darby Canine Kidney) là 1 dòng tế bào biểu mô được
phân lập từ thận chó và có thể nuôi cấy được ở dạng lớp đơn [69].
1.2.2. Lịch sử phát triển dòng tế bào MDCK
Tháng 09/1958, Madin và Darby đã phân lập thành công tế bào MDCK từ thận chó
(giống Cocker Spaniel) trưởng thành và khỏe mạnh [11], [18], [22], [71], [73]. Tế
bào MDCK ban đầu này có hình thái giống như nguyên bào sợi và được nuôi trong
môi trường Earle’s Buffered Saline Solution (Earle’s BSS) (95%) có bổ sung 0,5%
lactalbumin hydrolysate và 5% huyết thanh bê. Tế bào được cấy chuyền sau mỗi 7
ngày nuôi cấy và được làm bong khỏi bề mặt nuôi cấy bằng dung dịch trypsin–
versene. Sau 6 lần cấy chuyền, tế bào MDCK trở nên giống với tế bào biểu mô.
Mặc dù vẫn phải được phân tách khỏi bề mặt nuôi cấy bằng dung dịch trypsin nồng
độ cao nhưng dòng tế bào MDCK này đã có thể được cấy chuyền một cách dễ dàng

[73].
Ít năm sau, một số dòng tế bào MDCK khác đã được phát triển như dòng tế bào
MDCK-NIH (1961) và dòng tế bào MDCK-USD (1963) [68]. Đến năm 1965, tế
bào MDCK được gửi vào Ngân hàng chủng giống Hoa Kỳ ATCC [22]. Hiện nay,
nhiều dòng tế bào MDCK thích hợp cho những mục đích nghiên cứu khác nhau
đang được các ngân hàng tế bào cung cấp cho các phòng thí nghiệm trên toàn thế
giới [70], [71]; trong đó, được sử dụng nhiều nhất là 3 dòng: MDCK CCL34
(ATCC), MDCK 84121903 (ECACC) và MDCK 33016 (nuôi cấy huyền phù) [16].
1.2.3. Một số ứng dụng của tế bào MDCK
Tế bào MDCK được sử dụng phổ biến trong những chương trình giám sát sức khỏe
cộng đồng, nghiên cứu virus học lâm sàng và được dùng tại các phòng thí nghiệm
trên toàn thế giới để phân lập và nuôi cấy virus cúm type A, B [22], [73].
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
7
Bên cạnh đó, tế bào MDCK cũng thường được dùng làm mô hình cho những khảo
sát về các đặc tính tổng quát của tế bào biểu mô [19], [22], [69] và các cơ chế vận
chuyển ion cơ bản trong các dạng tế bào [11], [19].
Ngoài ra, tế bào MDCK còn được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau như
nghiên cứu sự điều hòa thể tích tế bào [40], sự vận chuyển thuốc qua biểu mô ruột
[19], đánh giá tính thấm của màng tế bào [19],… dựa trên các đặc tính hình thái,
sinh lý của chúng.
1.2.4. Ưu điểm của tế bào MDCK
Tế bào MDCK thường được sử dụng để phân lập virus cúm và được cân nhắc để
dùng trong việc sản xuất sinh khối virus cúm nhờ vào những ưu điểm vượt trội của
nó, như:
• Khả năng nhân sinh khối tế bào lớn và nhanh [68].
• Khả năng tạo ngân hàng tế bào và các đặc tính của dòng tế bào này đã được
nghiên cứu thấu đáo, chi tiết [68].
• Có thể tăng trưởng trong 1 phổ pH rộng và dễ dàng khôi phục sức sống sau

thời gian trữ lạnh [16].
• Ít nhạy cảm khi được chuyển sang môi trường không huyết thanh [16] nên có
thể thích ứng với điều kiện nuôi cấy không huyết thanh [22], [46], [47], [68].
• Có thể nuôi cấy trên quy mô lớn bằng các hệ thống nuôi cấy năng suất cao
như hệ thống phản ứng sinh học, hệ thống vi hạt [42] do không quá nhạy
cảm với tốc độ khuấy cũng như các thiết bị cung cấp khí CO
2
[16].
• Có khả năng kháng với sự xâm nhiễm của prion [16].
• Thích hợp cho sự tăng trưởng của virus cúm do sự mất hoạt tính trypsin và
sự tích lũy các chất ức chế trypsin ở tế bào MDCK thấp nên không làm ảnh
hưởng đến sự tăng trưởng của virus trong những điều kiện bình thường [21],
[46], [68].
• Sản xuất được virus với số lượng lớn và hiệu giá đủ cao để có thể dùng
trong sản xuất các chế phẩm sinh học thương mại [14], [42], [46], [47].
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
8
• Nhạy cảm với một phổ rộng các chủng virus cúm khác nhau [22].
1.2.5. Đặc điểm của tế bào MDCK
1.2.5.1. Đặc điểm hình thái
Trong nuôi cấy, tế bào MDCK có hình thái giống với tế bào biểu mô, dạng thuôn và
mọc sát khít vào nhau tạo thành một lớp đơn [19], [34], [69], [73] (Hình 1.2).
Hình 1.2. Tế bào MDCK chụp dưới kính hiển vi quang học (vật kính X10).

1.2.5.2. Đặc điểm di truyền
Bộ gene của tế bào MDCK gồm 2n=78 nhiễm sắc thể, trong đó có 2 nhiễm sắc thể
tâm lệch lớn được xem là nhiễm sắc thể X và có thêm 1 hoặc 2 nhiễm sắc thể tâm
giữa/gần giữa. Hiện tượng đa bội trong 1 quần thể tế bào MDCK chiếm 0,2% [71],
[73].

1.2.5.3. Đặc điểm sinh lý
MDCK là dòng tế bào thường trực và có số lần phân chia vô hạn.
Các tế bào MDCK liên kết với nhau rất vững chắc và bám dính mạnh vào bề mặt
nuôi cấy [34], [61].
Thông thường, tế bào MDCK chỉ phát triển ở dạng lớp đơn và tính thấm qua các lớp
đơn tế bào MDCK tương đối chậm (tính chất này thay đổi giữa các dòng tế bào
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
9
khác nhau) [69]. Tuy nhiên, tùy vào mục đích sử dụng mà tế bào MDCK cũng có
thể được biến đổi để thích ứng với dạng nuôi cấy huyền phù tế bào [70].
Tế bào MDCK thể hiện dương tính với keratin khi được nhuộm bằng thuốc nhuộm
immunoperoxidase [71] và phép phân tích bằng huỳnh quang miễn dịch giúp khẳng
định tế bào MDCK có nguồn gốc từ thận chó [73].
Tế bào MDCK thích hợp cho sự tăng trưởng của một phổ rộng các virus động vật
như: virus cúm type A và B, virus viêm miệng mụn nước (vesicular stomatitis virus,
VSV, chủng Ấn Độ), virus viêm gan lây nhiễm ở chó (infectious Canine Hepatitis),
virus mụn nước ngoại ban ở heo (vesicular exanthema virus of swine, SVEV), virus
viêm tủy xám type 2 ở người (Poliovirus), virus vaccine (Vaccinia), Coxsackie B5,
Adenovirus và Retrovirus [59], [60], [71], [73].
Ngoài ra, một số đặc tính sinh lý khác như sự đáp ứng với các stress ưu trương, khả
năng trao đổi các ion,… của tế bào MDCK cũng đã được Devuyst cùng cộng sự
(1994) [11], Rindler cùng cộng sự (1979) [34], Stefan cùng cộng sự (1998) [40],
Stephanie cùng cộng sự (1998) [41] nghiên cứu và mô tả chi tiết. Với các stress ưu
trương, tế bào MDCK đáp ứng bằng sự điều hòa gia tăng thể tích tế bào trong một
thời gian ngắn (nhờ vào việc thu nhận các chất điện phân vô cơ) và bằng sự điều
hòa gia tăng thể tích tế bào trong một thời gian dài (nhờ vào việc tích lũy các chất
thẩm thấu hữu cơ) [40]. Tế bào MDCK còn giữ một vai trò trong sự điều hòa acid-
base nhờ vào khả năng trao đổi các ion Cl
–

–HCO
3
–
, Cl
–
[11].
1.2.6. Điều kiện nuôi cấy tế bào MDCK
Tế bào MDCK không yêu cầu những điều kiện nuôi cấy đặc biệt. Để đạt được sự
tăng trưởng tối đa, tế bào MDCK chỉ cần được nuôi cấy trong các môi trường cơ
bản có bổ sung 2mM glutamine, 1% các amino acid không thiết yếu và 10% huyết
thanh bào thai bê. Các bình nuôi cấy cần được cung cấp 5% CO
2
và giữ ở 37
o
C
[59], [60], [71], [73].
Tế bào MDCK có thể được bảo quản bằng nitơ lỏng ở -196
o
C trong môi trường
tăng trưởng (95%) và DMSO (5%) [71].
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
10
Do tính chất liên kết chặt với nhau và bám dính mạnh vào bề mặt nuôi cấy, nên tế
bào MDCK cần được rửa bằng PBS ít nhất 2 lần trước khi ủ với dung dịch
trypsin/EDTA 0,25% trong khoảng 10 – 15 phút ở 37
o
C để được làm bong khỏi bề
mặt nuôi cấy [59], [60], [71].
1.3. Virus cúm A(H1N1) mới 2009

1.3.1. Sơ lược về virus cúm A
Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là những virus có vỏ bao với bộ gene phân
đoạn gồm các mảnh RNA (-) mạch đơn (không bắt cặp) và hầu hết mỗi mảnh chỉ
mã hóa 1 loại protein của virus (Bảng 1.2) [8], [32], [36], [50].
Căn cứ vào sự khác nhau của các protein lõi gồm 2 protein cấu trúc, protein nền (M)
và nucleoprotein (NP) của chúng mà virus cúm được chia thành 3 type riêng biệt:
virus cúm type A, virus cúm type B, virus cúm type C [36], [50].
Virus cúm type A:
chỉ gồm 1 loài là virus cúm A [63] và được phân lập lần đầu tiên
từ heo vào năm 1930 [13], [33], [39], [56]. Virus cúm A được chia thành các phân
type dựa trên 2 glycoprotein kháng nguyên bề mặt chính của chúng là
hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) (phân bố theo tỉ lệ 4:1) với 16 phân
type HA và 9 phân type NA [8], [29], [32], [50], [63], [64]. Virus cúm A có phổ
truyền nhiễm rộng bao gồm thủy cầm, người, gia cầm, heo, ngựa, chó và động vật
biển hữu nhũ [32], [50], [64]. Đối với các loài thủy cầm, virus cúm A nhân lên ở
ruột non và được bài tiết qua phân; chim không biểu hiện bệnh và làm lan truyền
virus trên diện tích rộng [50]. Virus cúm A có sự biến đổi di truyền lớn xảy ra giữa
các chủng và chúng gây ra nhiều đại dịch làm hàng triệu người chết trên toàn thế
giới [29], [50], [63], [64]. Các virion của virus cúm A có vỏ bao, có thể có hình cầu
(đường kính khoảng 100nm) hoặc hình sợi (chiều dài khoảng 300nm) [8]. Với các
chủng virus cúm A phân lập từ lâm sàng và chưa trải qua nhiều lần cấy chuyền trên
trứng hay tế bào thì virion thường có hình sợi, trong khi với các chủng virus cúm A
được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm thì virion hình cầu lại chiếm đa số [63].
Tổng kích thước bộ gene của virus cúm A là 13588 base [63] (Hình 1.3).
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
11
Bảng 1.2. Tóm tắt chức năng của các protein trong virus cúm A [8].
Protein Chức năng
PB2 Tiểu phần polymerase; nhận diện mũ chụp mRNA

PB1 Tiểu phần polymerase; kéo dài RNA, hoạt tính endonuclease
PB1-F2 Protein phụ; hoạt tính pro-apoptotic
PA Tiểu phần polymerase; hoạt tính protease
HA Glycoprotein bề mặt; kháng nguyên chính, hoạt tính gắn kết
với thụ quan và dung hợp màng tế bào chủ
NP Protein gắn RNA; điều hòa vận chuyển vào nhân
NA Glycoprotein bề mặt; hoạt tính sialidase, giúp phóng thích virus
M1 Protein nền; tương tác với vRNP, điều hòa vận chuyển RNA ra
khỏi nhân, giúp virus nẩy chồi
M2 Kênh ion; giúp virus tháo vỏ và lắp ráp các thành phần
NS1 Protein gây phản ứng interferon, điều hòa sự biểu hiện gene
của vật chủ
NEP (NS2) Vận chuyển RNA virus ra khỏi nhân
Cách gọi tên virus cúm: Type virus / vật chủ (nếu vật chủ là người thì không ghi) /
vị trí địa lý phân lập đầu tiên / số chủng phân lập / năm phân lập (phân type HA và
NA nếu là virus cúm A). Ví dụ: A/Chicken/Hong-Kong/220/97 (H5N1) [8], [36],
[50].
Hình 1.3. Virus cúm A: cấu trúc virus và 11 protein được mã hóa từ 8 mảnh RNA [65].
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
12
1.3.2. Virus cúm A(H1N1) mới 2009
1.3.2.1. Các đặc điểm của virus cúm A(H1N1) mới 2009
Virus cúm A(H1N1) mới 2009 cũng là 1 virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae
có bộ gene gồm 8 mảnh RNA (-) mã hóa các protein PB1, PB1-F2, PB2, PA, NP,
HA, NA, M1, M2, NS1 và NS2.
a. Bộ gene
Bằng phương pháp giải trình tự và định type gene (genotyping), các nhà khoa học
đã xác định virus cúm A(H1N1) mới 2009 là dòng virus hoàn toàn mới với bộ gene
là sự tái tổ hợp giữa 3 nguồn virus cúm heo, gia cầm và người (Hình 1.4).

• Gene PB2 và PA xuất phát từ dòng virus cúm heo tái tổ hợp, với nguồn gốc
ban đầu là virus cúm gia cầm xâm nhiễm vào quần thể heo tại Bắc Mỹ vào
năm 1998 [10], [13], [29], [32], [39], [51].
• Gene PB1 xuất phát từ dòng virus cúm heo tái tổ hợp, với nguồn gốc ban
đầu là virus cúm gia cầm xâm nhiễm người năm 1968, sau đó dòng virus từ
người này tiếp tục xâm nhiễm vào heo năm 1998 [10], [13], [29], [32], [39],
[51].
• Gene HA, NS và NP xuất phát từ dòng virus cúm heo cổ điển, có quan hệ
gần gũi với gene HA, NS và NP của virus cúm A(H1N1) gây đại dịch chết
người năm 1918. Virus cúm H1N1/1918 được cho là cũng đã xâm nhiễm
vào heo trong khoảng năm 1918, sau đó lan truyền trong các dòng virus cúm
heo cổ điển và tái tổ hợp [10], [13], [29], [32], [39], [48], [51].
• 2 gene còn lại là NA và M xuất phát từ dòng virus cúm heo Á-Âu (Eurasian
swine virus), với nguồn gốc ban đầu hoàn toàn từ virus cúm gia cầm xâm
nhiễm vào quần thể heo Á-Âu vào năm 1979 [10], [13], [29], [32], [39],
[48], [51]; sau đó tiếp tục lan truyền trong vùng Á-Âu và chưa từng được
ghi nhận ngoài vùng Á-Âu [13].
1. Tổng quan tài liệu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
13
Hình 1.4. Bộ gene tái tổ hợp của virus cúm A(H1N1) mới 2009 [13].
Một số điểm khác biệt giữa virus cúm A(H1N1) mới 2009 so với các chủng virus
cúm độc lực cao (H1N1/1918 và H5N1) đã được ghi nhận. Những khác biệt này
cho thấy virus cúm H1N1/2009 sở hữu các amino acid theo dạng độc lực thấp [29]:
• Vị trí phân cắt HA của các chủng virus cúm H1N1/2009 không chứa nhiều
amino acid có tính base trong khi các chủng virus độc lực cao đều sở hữu
nhiều amino acid có tính base tại vị trí này [20], [29], [51].
• Tất cả các chủng virus cúm H1N1/2009 đều có 1 Glutamic acid tại vị trí 627
trên protein PB2 trong khi tất cả các chủng virus cúm người đã biết trước đây
lại có Lysine tại vị trí này và Glu

627
là điển hình của virus cúm gia cầm [10],
[13], [20], [29], [51].
• Protein PB1-F2 của các chủng virus cúm H1N1/2009 bị cắt ngắn bởi sự hiện
diện của 1 stop codon tại vị trí 12 trong khi protein này lại liên kết với tính
sinh bệnh của virus cúm H1N1/1918 và H5N1 [10], [13], [29].
• Protein NS1 của các chủng virus cúm H1N1/2009 cũng bị cắt ngắn bởi 1 stop
codon tại vị trí 220 – điều này làm mất đi domain phối tử PDZ, một domain
nhận diện protein-protein nằm trong 1 loạt các con đường truyền tín hiệu tế
bào liên kết với tính sinh bệnh của virus cúm H1N1/1918 và H5N1 [10],
[13], [29].