nghiên cứu nhân giống địa lan trần mộng xuân (cymbidium lowianum) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM




VŨ THỊ HẢI



NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN
TRẦN MỘNG XN (CYMBIDIUM LOWIANUM)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY IN VITRO.





LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP






THÁI NGUN - 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM



VŨ THỊ HẢI


NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN
TRẦN MỘNG XN (CYMBIDIUM LOWIANUM)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP NI CẤY IN VITRO.

CHUN NGÀNH: LÂM HỌC
MÃ SỐ: 60.62.02.01


LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS: DƢƠNG MỘNG HÙNG




THÁI NGUN - 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận văn này là hồn
tồn trung thực, có thực tiễn; chƣa đƣợc bảo vệ ở bất kỳ một hội đồng khoa
học hay học vị nào.
Tơi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn dều đã
đƣợc cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong Luận văn này đều đƣợc chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả luận văn



Vũ Thị Hải













Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
ii
LỜI CẢM ƠN
Với mong muốn góp phần cơng sức cho sự phát triển giống lan Trần

mộng xn, tơi đã th
(Cymbidium lowianum)
Trong thời gian làm đề tài và viết bản luận văn này, ngồi sự cố gắng lỗ
lực của bản thân, tơi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ. Nhân dịp
này tơi xin chân thành cảm ơn về sự giúp đỡ q báu đó.
Trƣớc tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hƣớng dẫn
khoa học PGS. TS Dƣơng Mộng Hùng đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình giúp
đỡ, truyền đạt những kiến thức q báu cho tơi trong suốt q trình nghiên
cứu và hồn thiện đề tài.
Tơi xin cảm ơn các thầy, cơ giáo và Ban giám hiệu Trƣờng Đại học
Nơng – Lâm Thái Ngun, Trung tâm học liệu Đại học Thái Ngun đã tạo
những điều kiện thuận lợi, cung cấp những tài liệu cần thiết cho tơi hồn
thành các nội dung và chƣơng trình mà luận văn đặt ra.
Tơi xin cảm ơn Ban giám đốc và cán bộ cơng nhân viên của Vƣờn
Quốc gia Hồng Liên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong nghiên cứu, thu
thập số liệu và thừa kế các số liệu sẵn có để hồn thành tốt luận văn.
Cuối cùng tơi xin cảm ơn các đồng nghiệp trong Bộ phận ni cấy mơ
tế bào thực vật, bạn bè và ngƣời thân trong gia đình đã động viên, giúp đỡ tơi
trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn.
Xin trân thành cảm ơn!
Thái Ngun, năm 2013
Tác giả luận văn


Vũ Thị Hải


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
iii

MỤC LỤC
1
CHƢƠNG I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4
1.1 Khái niệm về nhân giống in vitro 4
1.2 Giới thiệu về họ lan 4
n 8
1.4 Thành tựu đạt đƣợc trong ni cấy mơ hoa lan 9
1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới 9
1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 10
1.5 Cơ sở khoa học của ni cấy mơ in vitro 12
1.5.1 Dựa trên tính tồn năng của tế bào 12
1.5.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 12
1.6 Quy trình nhân giống in vitro 13
1.6.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ 13
1.6.2 Giai đoạn 2: Ni cấy khởi động 14
1.6.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh 14
1.6.4 Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hồn chỉnh 14
1.6.5 Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngồi điều kiện tự nhiên 15
1.7 Các phƣơng thức nhân giống vơ tính in vitro 15
1.7.1 Hoạt hóa chồi nách 15
1.7.2 Tạo chồi bất định 15
1.7.3 Tạo phơi vơ tính 16
1.8 Một số trƣờng hợp thƣờng gặp trong q trình ni cấy in vitro . 16
1.8.1 Tính bất định về mặt di truyền 16
1.8.2 Sự nhiễm mẫu 16
1.8.3 Sự hóa nâu 17
1.8.4 Hiện tượng thủy tinh hóa 17
1.9 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống in vitro 18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
iv
1.9.1 mẫu cấy 18
1.9.2 Mơi trường ni cấy 18
1.9.2.1 Mơi trường vật lý 18
1.9.2.2 Mơi trường hóa học 19
1.9.3 Các chất điều hòa sinh trưởng 21
1.9.3.1 Auxin 21
1.9.3.2 Gebberelin 22
1.9.3.3 Các Xytokinin 22
1.9.3.4 Ethylene 22
1.9.3.5 Các chất ức chế tăng trưởng 23
1.9.3.6 Kết luận 23
1.9.4 Điều kiện vơ trùng 23
1.9.5 Phòng ni 24
CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1 Nội dung nghiên cứu 25
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27
2.2.1 Phương pháp luận 27
2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể 27
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp khử trùng vật
liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 27
2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường và nồng độ
chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 28
2.2.2.3 Thí nghiệm 3:Nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường ni cấy và
nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến khả năng tạo protocom 29
2.2.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST
đến khả năng nhân nhanh chồi 30
2.2.2.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ
ra rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
v
2.2.2.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến
tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm 32
2.2.3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 33
2.2.3.1 Phương pháp thu thập số liệu 33
2.2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu 34
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36
3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả
năng tái sinh của mẫu cấy 36
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng và nồng độ chất điều hồ
sinh trƣởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 40
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ chất
ĐHST Ki và BA đến khả năng nhân protocom 43
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng
nhân nhanh chồi 46
3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ
trung bình/ cây, chiều dài rễ 49
3.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và
chiều cao cây con ở vƣờn ƣơm 53
KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 59
4.1. Kết luận 59
4.2. Tồn tại 59
4.3. Kiến nghị 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
PHỤ LỤC 63
Phụ lục 1: Mơi trƣờng Murashige- Skoog (MS, 1962) 63
Phụ lục 2: Mơi trƣờng MS cải tiến (MS*) 64

Phụ lục 3: Mơi trƣờng Vacin &Went (VW) 65
Phụ lục 4: Phân tích kết quả khử trùng mẫu cấy. 66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
vi
Phụ lục 5: Phân tích kết quả ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và
nồng độ BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy. 70
Phụ lục 6: Phân tích kết quả ảnh hƣởng của mơi trƣờng và nồng độ
chất điều hòa sinh trƣởng BA, Ki đến khả năng nhân Protocom. 73
Phụ lục 7: Phân tích kết quả ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng
BA, KI đến khả năng nhân nhanh chồi. 74
Phụ lục 8: Phân tích ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA
đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây và chiều dài rễ 75
Phụ lục 9: Phân tích kết quả ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến
tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vƣờn ƣơm 77

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Cơng thức khử trùng cho từng loại mẫu 28
Bảng 2.2. Ảnh hƣởng của mơi trƣờng hóa học và nồng độ chất ĐHST đến khả
năng tái sinh của hạt lan. 29
Bảng 2.3 Ảnh hƣởng của mơi trƣờng và nồng độ chất ĐHST Ki, BA đến khả năng
tạo protocom. 30
Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân
nhanh thể chồi. 31
Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến sự ra rễ 32
Bảng 3.1a: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng HgCl2 36
Bảng 3.1b: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng cồn 37
Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của 2 loại mơi trƣờng và nồng độ chất
điều hòa sinh trƣởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy 40
Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ
chất ĐHST Ki và BA đến khả năng nhân protocom. 43
Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả
năng nhân nhanh chồi. 47
Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số
rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ. 50
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của
cây con tại vƣờn ƣơm. 54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
viii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

TT
Tên biểu đồ
Trang
1
Biểu đồ 3.1a: Ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ
chất ĐHST Ki và BA đến tỷ lệ mẫu tái sinh

44
2
Biểu đồ 3.1b: Ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ
chất ĐHST Ki và BA đến hệ số nhân thể chồi

45
3
Biểu đồ 3.1c: Ảnh hƣởng của mơi trƣờng ni cấy và nồng độ
chất ĐHST Ki và BA đến chiều cao trung bình của thể chồi

45
4
Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng phối hợp của chất ĐHST BA và Ki
đến HSNC

47
5

Biểu đồ 3.3a: Ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ

50
6
Biểu đồ 3.3b: Ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến số rễ trung
bình/ cây

51
7
Biểu đồ 3.3c: Ảnh hƣởng của chất ĐHST NAA đến chiều dài
trung bình của rễ

51










Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1: Địa lan Trần Mộng Xn (Cymbidium lowianum) 9
Hình 3.1a: Mẫu quả lan khử trùng. 39
Hình 3.1b: Mẫu quả lan đã khử trùng 39

Hình 3.1c: Hạt lan đƣợc gieo vào MT 40
Hình 3.1d: Hạt gieo sống và khơng nhiễm 40
Hình 3.2: Sự nảy mầm của hạt lan trong mơi trƣờng MS*, 1,5 mg/l BA 42
Hình 3.3.Protocom phát triển trong MT MS*, 1,5 mg/l BA, 1,5 mg/l Ki 46
Hình 3.4: Cây con trong MT nhân chồi MS*, 1,5 mg/l BA, 1,5 mg/l Ki 48
Hình 3.5a: Cây con mới đƣợc đƣa vào MT ra rễ 52
Hình 3.5b: Cây con sau 4 tuần ni cấy trong MT ra rễ MS*, 0,5 mg/l NAA 53
Hình 3.6a: Những bình lan đƣợc đƣa ra huấn luyện 55
Hình 3.6b: Những cây lan đã huấn luyện đƣợc đƣa ra khỏi bình 55
Hình 3.6 c: Cây trồng và chăm sóc ở khay sau 4 tuần 55
Hình 4: Mơi trƣờng chuẩn bị cho các thí nghiệm. 56
Hình 5: Khử trùng quả lan. 56
Hình 6: Hạt lan đƣợc gieo vao mơi trƣờng ni cấy 57
Hình 7: Lan TMX trong mơi trƣờng nhân nhanh. 57
Hình 8: Lan trong mơi trƣờng ra rễ. 58
Hình 9: Cây con ngồi vƣờn huấn luyện. 58








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
x
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
IAA : Indol acetic acid.
NAA : Naphthyl acetic acid.

BA : Benzyladenine.
IBA : 3 - Indol butyric acid.
GA3 : Gibberelin acid 3.
BAP : 6-Benzyla amino purin.
Ki : Kinetin.
HgCl2 : Clorua thủy ngân.
NaOCl : Hypoclorit natri.
Ca(OCl)2 : Hypoclorit canxi.
HSNTC : Hệ số nhân thể chồi.
HSNC : Hệ số nhân chồi.
ĐHST : Điều hòa sinh trƣởng.
CTTN : Cơng thức thí nghiệm.
MS : Mơi trƣờng Murashige- Skoog, 1962.
MS* : Mơi trƣờng Murashige- Skoog cải tiến.
VW : Mơi trƣờng Vacin &Went.









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
1

Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mƣa nhiều, diện tích
rừng núi đƣợc phân bổ khá rộng tạo thành hệ thống lan

và địa lan. Trong đó địa lan (Cymbidium) là lồi thực vật đã đƣợc đƣa vào
ni trồng nhân tạo và thƣởng thức từ rất lâu. Từ thời phong kiến thú chơi địa
lan rừng chỉ phát triển chủ yếu trong giới q tộc có địa vị trong xã hội, ngày
nay phong trào này đã đƣợc phát triển cách rộng rãi cả chất lẫn lƣợng.
Chủng Lan Kiếm là một chi trong họ Lan. Hƣơng lan Kiếm đƣợc tơn là
Vƣơng giả chi hƣơng - thiên hạ đệ nhất hƣơng, hƣơng thanh, khơng hắc,
nhƣng đậm đà, khó qn, thoắt ẩn thoắt hiện, nhƣ gần nhƣ xa. Mầu sắc của
hoa lan là mầu sắc của cánh đài, của 2 cánh hoa, của cánh mơi, của họng hoa,
của lá. Thiên nhiên đã vơ cùng tỉ mỉ tuyển lựa mầu, tơ vẽ cho các phần của
hoa rất phong
có sự thống nhất cái đẹp bên ngồi của cây lan với
"cái thần" thẳm sâu bên trong, hình thành sự liên tƣởng chặt chẽ sâu sắc.
hố của ngƣời Đơng Á.
,
, nhu cầu về hoa trên Thế giới nói chung và Việt
Nam nói riêng đang ngày càng gia tăng. Hoa tƣơi, đặc biệt là hoa lan đã trở
thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao, đƣợc nhiều ngƣời ƣa
chuộng và chiếm ƣu thế trong thị trƣờng hàng hóa nơng nghiệp [15].
Trƣớc kia, khi cơng nghệ ni cấy mơ - tế bào thực vật ở nƣớc ta chƣa
phát triển thì việc nhân giống một lồi lan gặp rất nhiều khó khăn do phƣơng
pháp nhân giống sinh dƣỡng truyền thống có nhiều hạn chế nhƣ mất thời gian,
nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thối hố qua nhiều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
2
thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lƣợng cây khơng đảm bảo, việc
nhân giống mang tính thời vụ. Hơn nữa, hạt lan lại q nhỏ, chỉ có một phơi;
nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên
là rất thấp.

Ngày nay cùng sự phát triển của khoa học- cơng nghệ, kỹ thuật nhân
giống in vitro đƣợc áp dụng phổ biến và thành cơng ở nhiều đối tƣợng thì việc
nhân nhanh các lồi hoa lan đã trở nên thuận lợi. Bằng phƣơng pháp này, cây
con đƣợc tạo ra với số lƣợng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lƣợng đảm bảo,
sạch bệnh, giá thành phù hợp và khơng phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó
đáp ứng nhu cầu khơng ngừng tăng lên của thị trƣờng.
Địa lan Trần Mộng Xn Cymbidium lowianum
chùm hoa dài, thƣờng dài hơn lá với 12- 25
hoa. Hoa lớn màu vàng lục, cánh mơi chia ba thuỳ màu vàng, đỉnh mơi màu
đỏ hồng. Hiện nay, đây là một trong số ít giống lan Sapa có hoa đẹp nở đúng
dịp tết nên nó đã thực sự thu hút ngƣời tiêu dùng trong và ngồi nƣớc. Nhƣng
khả
.
Xuất phát từ u cầu thực tế trên, chúng tơi triển khai nghiên cứu đề
tài:“ Nghiên n (Cymbidium lowianum)
in vitro”.
* Mục tiêu nghiên cứu
- Tìm ra các tác nhân khử trùng và nồng độ khử trùng thích hợp
- Xác định mơi trƣờng phù hợp để nhân giống lan Trần Mộng Xn bằng
phƣơng pháp ni cấy mơ in vitro.
- Tìm hiểu ảnh hƣởng của một số yếu tố của mơi trƣờng ni cấy lên sự
tạo protocom và sự sinh trƣởng, phát triển của lan Trần Mộng Xn.
- Xây dựng hƣớng dẫn nhân giống cho lan Trần Mộng Xn bằng
phƣơng pháp ni cấy mơ in vitro.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
3
- Ứng dụng kết quả nghiên cứu để triển khai nhân giống đại trà, cung cấp
cây giống cho cơng tác bảo tồn.

* Đối tƣợng nghiên cứu
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên hạt của lan Trần Mộng Xn. Quả lan
đƣợc thu hái khi đƣợc khoảng 5 tháng tuổi (vào tháng 11 dƣơng lịch), hạt lan
lúc đó sẽ có màu vàng chanh.
* Địa điểm nghiên cứu
Bộ phận ni cấy mơ tế bào thực vật, Phòng khoa học và hợp tác quốc tế
Vƣờn quốc gia Hồng Liên – Sa Pa – Lào Cai.




















Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
4

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1 Khái niệm về nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro hay ni cấy mơ đều là thuật ngữ miêu tả các phƣơng
thức ni cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa mơi trƣờng xác
định ở điều kiện vơ trùng. Mơi trƣờng có các chất dinh dƣỡng thích hợp nhƣ
muối khống, vitamin, các hoocmon tăng trƣởng và đƣờng.
Phƣơng pháp ni cấy mơ cho phép tái sinh chồi hoặc các cơ quan từ các
mơ nhƣ: thân, lá, rễ ,hoa, quả, bao phấn, nỗn chƣa thụ tinh…
1.2 Giới thiệu về họ lan
Từ đời vua Thần Nơng (2800) trƣớc cơng ngun, cây lan đã đƣợc biết
đến đầu tiên ở phƣơng Đơng và đƣợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Sau đó,
Robut Bron (1773 – 1858) là ngƣời đầu tiên đã phân biệt rõ ràng giữa họ lan
và các họ khác [5]. Đặt nền tảng hiện đại cho mơn học về lan là Joanlind
(1979 – 1985). Năm 1836, ơng cơng bố sắp xếp các tơng họ lan (A tabuler
view of the Tribes of orchidalr) tên của họ lan do ơng đƣa ra đựơc dùng cho
đến ngày nay [5]. Theo các tài liệu tham khảo của một số tác giả cây hoa lan
Orchidaceae thuộc họ lan Orchidaceae, bộ lan Orchidales, lớp một lá mầm
Monocotyledoneae [1], [5], [3]. Họ lan có mặt ở hầu hết các vùng trên trái đất,
nhƣng có khoảng 4/5 tập trung ở những vùng nhiệt đới, nó đứng thứ hai sau
họ cúc, khoảng 15000-35000 lồi, phân bố từ 68
o
cho đến 56
o
vĩ nam. Tuy
nhiên, phân bố chính của họ này là ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt là châu
Mỹ và Đơng Nam Á (Mau – RFL 1983). Cây lan biết đến đầu tiên ở Trung
Hoa là kiến lan, đó là Cymbidium ensifonymum là một lồi bán địa lan. Ở
châu Âu bắt đầu để ý đến phong lan từ thế kỷ 18 sau Trung Quốc đến hàng
chục thế kỷ và cũng nhờ các thuỷ thủ thời bấy giờ mà phong lan đã đi khắp

các miền của địa cầu, lúc đầu là Vanny sau đó đến Bạch Cập, Hạc Đính rồi
Kiến Lan…

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
5
Ở Việt Nam, có lẽ ngƣời đầu tiên có khảo sát về lan ở Việt Nam là
Gioalas Noureiro – nhà truyền giáo Bồ Đào Nha, ơng đã mơ tả cây lan ở Việt
Nam lần đầu tiên vào năm 1789 trong cuốn “ Flora cochin chinensis” gọi tên
các cây lan trong cuộc hành trình đến Nam phần Việt Nam là Aerides, Phaius
và Sarcopodium…mà đã đƣợc Ben Tham và Hooker ghi lại trong cuốn
“Genera plante rum” (1862 – 1883) (Nguyễn Hữu Huy, Phan Ngọc Cấp –
1995), chỉ sau khi ngƣời Pháp đến Việt Nam thì mới có những cơng trình
nghiên cứu đƣợc cơng bố đáng kể là F.gagne pain và A. gui llaumin mơ tả 70
chi gồm 101 lồi cho cả 3 nƣớc Đơng Dƣơng trong bộ “Thực vật Đơng
Dƣơng chí” ( Flora Genera Indochine) do H. Leconte chủ biên xuất bản từ
những năm 1932 – 1934.
 Đặc tính thực vật học của địa lan
Lan cũng giống nhƣ các loại thực vật khác, gồm 6 bộ phận: rễ, thân, lá,
hoa, quả, hạt [5], đƣợc mơ tả nhƣ sau:
 Rễ lan
Nhìn chung, họ lan bao gồm các cây thân thảo, sống lâu năm, sống ở đất,
vách đá vơi sống phụ, sống hoại. Đối với địa lan khi sống ở đất, chúng thƣờng
có củ giả, rễ mập, xum x phụ (bì sinh) rễ bò dài hay ngắn. Chúng phát triển
thân rễ nạc dài, ngắn mập hay mảnh mai (tuỳ thuộc vào từng lồi) đƣa cơ thể
bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. Hệ rễ cũng nhỏ, đan thành búi. Ở
một số lồi lan có thân, lá kém phát triển hệ rễ phát triển dày đặc và kiêm
nhiệm ln cả vai trò quang hợp. Rễ có dạng dẹt, bò rất dài, màu xanh nhƣ lá.
 Thân cây
Thân rất ngắn hay kéo dài, đơi khi phân nhánh, mang lá hay khơng mang

lá. Theo M.E.Pfizer (1882) phong lan có 2 loại thân, mà đa số thuộc loại sinh
trƣởng hợp trụ (nhóm khơng thân) [5]. Thân này gồm hệ thống của nhiều
nhánh lâu năm, với bộ phận nằm ngang, bò dải trên giá thể hay ẩn sâu trong
lòng đất. Ngƣợc lại, rất ít khi gặp các lồi phong lan sinh trƣởng đơn trục

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
6
(nhóm có thân), cơ thể khó có khả năng duy trì đƣợc tƣ thế thẳng đứng, nó
phải nhờ đến các rễ chống đỡ để vƣơn cao, ở các lồi phong lan sống phụ, có
nhiều đoạn phình lớn, tạo thành củ giả. Đó là bộ phận dự trữ nƣớc và chất dinh
dƣỡng để ni cây trong hồn cảnh khơ hạn khi sống bán trên cao. Đa số củ giả
đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp.
 Lá lan
Có thể phân lá lan thành 3 loại: lá đứng – lá nửa đứng, lá cong rũ. Hầu hết
các loại địa lan đều là cây tự dƣỡng, là “ xƣơng” chế tạo chất dinh dƣỡng
bằng quang hợp, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá. Lá mọc đơn độc,
hoặc xếp dày đặc ở gốc, hay xếp cách đề đặn trên thân, trên củ giả. Hình dáng
lá thay đổi từ loại lá mọng nƣớc, nạc, dài hình kim, hình trụ dài, tiết diện tròn
hay có rãnh, đến loại lá hình phiến mỏng, dài, những lá dƣới sát gốc thƣờng
tiêu giảm đi chỉ còn những bẹ khơng có phiến lá hay giảm hẳn thành các vảy.
Các lồi địa lan có số lá trên nhánh biến động rất lớn: lá trên nhánh ít phải kể
đến Đơng lan (2,6 lá/ nhánh); trong khi đó Bạc lan (Cerythrostylum) có số lá/
nhánh rất lớn (9,1 lá/ nhánh). Độ dày và độ rộng của lá cũng rất khác nhau, lá
dài phải kể đến Bích ngọc (Cymbidium dayamum): 1cm; Thanh ngọc
(Cymbidiumensifolium) 40- 80 cm…
Về màu sắc, phiến lá thƣờng có màu xanh bóng nhƣ các chi Lan kiếm
(Cymbidium. SW), chi lan Bầu rƣợu (Calanthe R.Br), có lồi có màu xanh
đậm nhƣ Hạc Đính Vàng (P. Flavum).
 Hoa lan

Cấu tạo của hoa lan phong phú và đa dạng. Ta có thể gặp nhiều lồi mà
mỗi mùa chỉ có một đố hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơm
một bơng. Mặc dù mn hình mn vẻ nhƣng nếu ta quan sát hoa của bất kỳ
cây lan nào cũng có một tổ chức đồng nhất của hoa mẫu 3 là một kiểu hoa đặc
trƣng của lớp một lá mầm, nhƣng đã biến đổi rất nhiều để hoa có đối xứng
qua một mặt phẳng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
7
Mầm hoa của địa lan đƣợc hình thành từ đốt thứ 3, thứ 4 ở gần đáy của các
giả hành, hoa đứng thẳng hay cong thƣờng dài và mang nhiều hoa chồi hoa
thƣờng xuất hiện bên dƣới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già đâm ra
bên ngồi. Thơng thƣờng, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. Chồi hoa thƣờng
xuất hiện đồng thời với chồi thân, nhƣng chồi hoa no tròn hơn, còn chồi thân
hơi dẹp. Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đi cá, còn ở
chồi hoa các lá bao hoa ln ơm chặt quanh phát hoa.
Cọng phát hoa khơng phân nhánh, dựng đứng hay bng thõng. Chiều dài
của phát hoa từ 10cm đến hơn 100cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục
búp hoa xếp ln phiên nhau theo đƣờng xoắn ốc. Búp hoa khi đã đủ lớn bắt
đầu dang xa khỏi cọng hoa. Thoạt nhìn hoa địa lan có 5 cánh gần giống nhau,
thực ra chỉ có 2 cánh hoa ở bên trong, còn lại là 3 lá đài ở bên ngồi, có cấu
trúc và màu sắc giống cánh hoa. Cánh hoa thứ 3 chun hố thành cánh mơi,
màu sắc sắc sỡ hơn xẻ thành 3 thuỳ tạo ra dạng nửa hình ống. Hai thuỳ bên
ơm lấy trụ, thuỳ thứ 3 có dạng bầu hay nhọn tạo thành hình đáy thuyền, làm
chỗ đậu cho cơn trùng khi đến đậu hút mật và thụ phấn cho hoa. Giữa 2 cánh
mơi có 2 gờ dọc song song màu vàng.Tận cùng bên trong có đĩa mật và đơi
khi có tuyến tiết mồ hơi. Hoa lƣỡng tính nhị đực và nhị cái cùng gắn chung
trên một trụ nhị, nhuỵ hình hình bán trụ hơi cong về phía trƣớc. Nhị ở trên
cùng mang 2 khối phấn màu vàng có gót dính nhƣ keo. Khối phấn đƣợc đậy

bởi một nắp màu trắng ngà rễ mở dời chứa khối phấn của trục hợp nhuỵ cách
với muỗm nhuỵ bởi một cái gờ nổi lên. Cấu trúc này trong tự nhiên hoa địa
lan chỉ thụ phấn đƣợc nhờ cơn trùng. Sau khi hoa thụ phấn, hoa xoay dần về
vị trí cũ, bầu nỗn phình to lên tạo thành quả.
 Quả lan
Quả của cây địa lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đƣờng nứt dọc, có
dạng từ quả dài (Vanilla) đến dạng hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín quả
nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phần đỉnh và phía gốc. Ở một số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
8
lồi quả chín nở theo 1-2 khía dọc, thậm chí khơng nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi
vỏ quả khi vỏ này bị mục nát.
 Hạt lan
Hạt lan rất nhiều nhỏ li ti kích thƣớc hạt vơ cùng nhỏ với khối lƣợng tồn
bộ hạt trong một quả =1/10-1/1000mg trong đó khơng khí chiếm 76-96% thể
tích của quả. Do đó hạt lan hầu nhƣ khơng có khối lƣợng. Hạt chỉ cấu tạo từ
một khối chƣa phân hố, trên một mạng lƣới nhỏ xốp chứa đầy khơng khí.
Phải trải qua 2-18 tháng hạt mới chín. Phần lớn hạt thƣờng chết vì khó gặp
nấm cộng sinh cần thiết để nảy mần. Do đó hạt nhiều có thể theo gió bay rất
xa, nhƣng hạt nảy mần thành cây lại hiếm. Chỉ ở trong những khu rừng già
ẩm ƣớt, vùng nhiệt đới mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm.
1.3 n
Địa lan Trần Mộng Xn có tên khoa học Cymbidium lowianum thuộc họ
Phong lan. Lan đất, củ giả tròn. Lá hình dải hẹp dài từ 60 – 80cm, số lá trung
bình trên một nhánh là 5,1. Chùm hoa dài từ 70 – 100cm, thƣờng dài hơn lá
với 15- 30 hoa. Hoa lớn dài 12cm màu vàng lục, cánh mơi chia ba thuỳ màu
vàng, đỉnh mơi màu đỏ hồng. Hiện nay, đây là một trong số ít giống lan Sapa
có hoa đẹp nở đúng dịp tết.

Lồi địa lan này chỉ đẻ một nhánh trong một năm, đẻ 2 đợt mầm trong
một năm vào tháng 3 - 4 và tháng 9 - 10. Những mầm đẻ vào tháng 9 - 10
thƣờng là mầm sinh trƣởng, phát triển kém, còi cọc, nhũng mầm này khó có
khả năng cho hoa. Tốc độ sinh trƣởng vè chiều cao của địa lan chậm, nhanh
nhất là vào tháng 6 mới đạt chiều cao tối đa.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
9

Hình 1: Địa lan Trần Mộng Xn (Cymbidium lowianum)
1.4 Thành tựu đạt đƣợc trong ni cấy mơ hoa lan
1.4.1 Nghiên cứu trên thế giới
Năm 1899: Noel Bernard, nhà thực vật ngƣời Pháp đã tìm ra vai trò của
nấm cộng sinh trong q trình nảy mầm tự nhiên của hạt lan
Năm 1904: Noel Bernard & Burgeff ngƣời Đức cộng tác với nhau để đƣa
ra phƣơng pháp gieo hột lan có nhiễm nấm trong chai thạch. Phƣơng pháp này
đã làm gia tăng số lƣợng lớn cây con trồng từ hạt.
Năm 1922, Knudson ngƣời Mỹ lại thành cơng trong việc thay thế nấm
bằng đƣờng ở mơi trƣờng thạch để gieo hột. Từ đó phƣơng pháp của Knudson
đã đƣợc sử dụng ở khắp nơi trên thế giới.
Năm 1996, Yonco Sagaw và T.Shoji ni cấy mơ phân sinh đỉnh và mơ
phân sinh bên của Cymbidium trên cùng một lúc hai mơi trƣờng lỏng và đặc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
10
Nhƣ vậy, giống địa lan là nền tảng cho việc nhân giống bằng ni cấy mơ tế
bào thực vật. Khả năng ứng dụng rễ thấy nhất của phƣơng pháp ni cấy mơ
tế bào thực vật là nhân nhanh giống và phục tráng giống trong cây trồng.

Morel (1960) đã nhận thấy Meristem của một lồi địa lan có rất ít hoặc khơng
có virus. Đồng thời ơng cũng thành cơng trong kỹ thuật tạo protocorm, khi
ni cấy Meristem, các protocorm đƣợc cắt và ni cấy tiếp tục sẽ thu đƣợc
các protocorm mới. Nếu trong điều kiện nhất định, nó sẽ hình thành các cây
địa lan con mới và là những cây sạch virus.
Từ đó đến nay nhân giống in vitro đã thành cơng đối với nhiều chi khác
thuộc họ lan, nhƣ: Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Hồng Thảo
(Dendrobium), Kim Tuyến (Anoectochilus) và các giống lai của chúng. Đó
cũng là cơ sở cho những thành cơng của nhiều cơng trình ni cấy mơ tế bào
về sau.
1.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam
Ở nƣớc ta hiện nay đã có một số cơng trình nghiên cứu khá thành cơng về
nhân giống lan.
Năm 2002, tác giả Phạm Thị Liên đã nghiên cứu nhân giống Invitro
thành cơng cho một số lồi địa lan ở khu vực phía Bắc Việt Nam và đƣa ra
quy trình nhân giống cho lồi Địa lan Hạc đính nâu nhƣ sau: Khử trùng mẫu
bằng dd HgCl
2
0,1% trong 15 phút. Đƣa mẫu đã khử trùng vào mơi trƣờng F
+ 3% đƣờng saccaro + 0,8% Agar + BAP 1,0 mg/l + Kinetin 0,7% mg/l +
IBA 0,5mg/l. Mơi trƣờng F + 3% đƣờng saccaro + 0,8% Agar + 10% nƣớc
dừa + 0,5 mg/l NAA để tạo cây hồn chỉnh.
Năm 2003, trƣờng Đại học Nơng nghiệp I - Hà Nội đã tiến hành nghiên
cứu xây dựng quy trình nhân giống và ni trồng Lan Hồ Điệp
(Phalaenopsis) của Nguyễn Quang Thạch và cộng sự cho thấy: Mơi trƣờng
thích hợp tạo vật liệu khởi đầu từ cơ quan sinh dƣỡng là VW + 100 ml/l ND +
2 mg/l BA + 0,3 mg/l Kinetin + 10g/l đƣờng, mơi trƣờng thích hợp tạo nguồn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>

11
vật liệu khởi đầu từ hạt là VW + 100 ml/l ND+ 1g/l pepton + 10g/l đƣờng +
dịch nghiền khoai tây/cà rốt, mơi trƣờng tốt nhất cho phát sinh protocorm từ
lát mỏng tế bào là VW + 100 ml/l ND + 0,5 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l Kinetin +
10g/l đƣờng, còn mơi trƣờng VW + 100 ml/l ND + 1g/l pepton + 10 g/l đƣờng
+ 30g khoai tây+ 30g cà rốt là mơi trƣờng tốt nhất để nhân nhanh chồi.
Năm 2004: Tiến sĩ Dƣơng Tấn Nhựt đã nhân giống in vitro thành cơng lồi
lan Hài Hồng q hiếm với cách gây vết thƣơng rồi mới tiến hành ni cấy.
Năm 2005, viện Di truyền nơng nghiệp – Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu
nhân nhanh phong lan Hồ Điệp từ phát hoa và chóp rễ của Khuất Hữu Trung
và cộng sự cho thấy: Mơi trƣờng phát sinh chồi từ chồi ngủ của phát hoa là
MS + 10% nƣớc dừa + 3% đƣờng + 1g/l than hoạt tính + 1mg/l BAP +
0,1mg/l NAA; mơi trƣờng tạo cây hồn chỉnh từ chồi ngủ của phát hoa là MS +
10% nƣớc dừa + 3% đƣờng + 1g/l than hoạt tính + 0,1mg/l BAP+ 1,0 mg/l NAA.
Năm 2007, tác giả Nguyễn Thị Hồng Gấm và các cộng sự ở Trung tâm
Giống và Cơng nghệ sinh học – trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã tiến hành
Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhychostylis
gigantea) bằng phƣơng pháp ni cấy trong ống nghiệm đạt kết quả tốt. Khử
trùng quả lan trong 3 phút bởi cồn 70% + 5phút HgCl
2
0,1%. Mơi trƣờng gieo
hạt tốt nhất: Knudson + 30 g/l đƣờng+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa
+7 g/l agar + 0,3 mg/l Kinetin. Mơi trƣờng nhân nhanh thể chồi: Knudson +
30 g/l đƣờng+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa +7 g/l agar + 0,3mg/l
Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA. Hệ số nhân thể chồi: 4,25. Mơi
trƣờng tái sinh chồi: Knudson cải tiến + 30 g/l đƣờng+ 100 g/l khoai tây +
100ml/l nƣớc dừa +7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l
NAA. Mơi trƣờng kéo dài chồi: Knudson cải tiến + 30 g/l đƣờng + 100 g/l
khoai tây + 100 ml/l nƣớc dừa + 7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA +
0,3mg/l NAA + 0,2mg/l GA

3
. Mơi trƣờng ra rễ R2: Knudson cải tiến + 30g/l
đƣờng +100g/l khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa + 7 g/l agar + 0,1 mg/l NAA.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
12
1.5 Cơ sở khoa học của ni cấy mơ in vitro
1.5.1 Dựa trên tính tồn năng của tế bào
Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng mang tồn bộ lƣợng thơng tin
di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế
bào đều có thể phát triển thành một cá thể hồn chỉnh. Tuy từng tế bào, từng
loại mơ, từng thời kỳ sinh trƣởng, phát triển mà gen phù hợp hoạt động; các
gen khơng cùng hoạt động nhƣ nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể
(do cơ thể điều hòa hoạt động của gen)
1.5.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
+ Sự phân hóa tế bào: là sự chuyển các tế bào phơi sinh ban đầu hình
thành các tế bào mơ chun hóa đảm nhận các chức năng khác nhau
Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều
cơ quan chức năng khác nhau, đƣợc hình thành từ nhiều loại tế bào khác
nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên
(tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành
nhiều tế bào phơi sinh chƣa mang chức năng riêng biệt (chun hóa). Sau đó
từ các tế bào phơi sinh này chúng tiếp tục đƣợc biến đổi thành các tế bào
chun hóa đặc hiệu cho các mơ, cơ quan có chức năng khác nhau.
Tế bào phơi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hóa (có chức năng
riêng biệt)
Sơ đồ các giai đoạn phân hóa của tế bào
+ Sự phản phân hóa tế bào: khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có
chức năng chun hóa chúng vẫn khơng hồn tồn mất khả năng biến đổi của

mình. Trong những trƣờng hợp nhất định nếu chúng gặp điều kiện thích hợp
lại có thể trở về dạng tế bào phơi sinh và phân chia mạnh mẽ. Q trình này
gọi là sự phản phân hóa tế bào, nó ngƣợc lại với q trình phân hóa tế bào



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
/>
13
Phân hóa tế bào
Tế bào phơi sinh Tế bào dãn Tế bào chun hóa
Phản phân hóa tế bào
Sơ đồ mối quan hệ giữa q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình hoạt hóa,
ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển cá thể, có
một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc nay bị ức chế) để cho ra một tính
trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra
theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử AND của
mỗi tế bào khiến q trình sinh trƣởng, phát triển của cơ thể thực vật ln
đƣợc hài hòa.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mơ của cơ thể thƣờng bị ức chế
bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thƣớc
của khối mơ sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Nhƣ vậy q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ tế bào thực vật
thực chất là kết quả của q trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Vậy
kỹ thuật ni cấy mơ tế bào xét cho cùng chính là kỹ thuật điều khiển sự phát
sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hƣớng dựa vào sự phân
hóa và phản phân hóa tế bào và trên cơ sở tính tồn năng của tế bào.
Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy ngƣời ta thƣờng bổ
sung vào mơi trƣờng ni cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trƣởng thực vật là

Auxin và Xytokinin. Tỷ lệ của hai nhóm chất này trong mơi trƣờng sẽ tạo ra
sự phát sinh hình thái khác nhau
1.6 Quy trình nhân giống in vitro
1.6.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trƣớc khi nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ. Những
cây này phải khỏe mạnh, sạch bệnh đặc biệt là sạch bệnh virut và đang ở giai
đoạn sinh trƣởng mạnh.