thiết kế vector mang cấu trúc rnai chứa đoạn gen mã hóa protein vỏ nhằm phục vụ chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm lá ở cây đậu tương

Số hóa bởi trung tâm học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




NGUYỄN THỊ MINH



THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN
MÃ HÓA PROTEIN VỎ NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN KHÁNG
VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG


Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC




Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu
i
LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn này là do tôi
tìm hiểu, nghiên cứu dƣới sự hƣớng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự cộng
tác, giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu. Các số liệu và kết quả
trình bày trong luận án đã đƣợc sự đồng ý của cán bộ hƣớng dẫn và nhóm
nghiên cứu, các tài liệu trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.


Tác giả




Nguyễn Thị Minh

Số hóa bởi trung tâm học liệu
ii
LỜI CẢM ƠN

Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận
tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn
thành Bản luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lò Thị Mai Thu, cảm ơn nghiên cứu viên

Phạm Thanh Tùng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành các thí
nghiệm trong luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Khoa
Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên; Tôi xin cảm ơn
PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh và các Thầy, Cô khoa Khoa học Sự sống,
Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè
và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.



Tác giả




Nguyễn Thị Minh

Số hóa bởi trung tâm học liệu
iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. BỆNH HẠI CÂY ĐẬU TƢƠNG 3
1.1.1. Cây đậu tƣơng, đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng 3
1.1.2. Phân loại bệnh hại ở cây đậu tƣơng 4
1.1.3. Bệnh khảm lá do virus SMV và BYMV trên cây đậu tƣơng 11
1.2. HỆ GEN CỦA SMV VÀ BYMV 13
1.2.1. Đặc điểm của hệ gen ở SMV và BYMV 13
1.2.2. Gen CP của SMV và BYMV 15
1.3. KỸ THUẬT RNAi VÀ ỨNG DỤNG TẠO CÂY CHUYỂN GEN
KHÁNG VIRUS 16
1.3.1. Các RNA ức chế nhỏ (siRNA và miRNA) 17
1.3.2. Cơ chế can thiệp RNAi 21
1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen
kháng virus 23


Số hóa bởi trung tâm học liệu
iv
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Vật liệu nghiên cứu 25
2.1.1. Vật liệu 25
2.1.2. Hoá chất 26
2.1.3. Máy móc, thiết bị 26
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu 26
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 26
2.2.1. PCR khuếch đại vùng CPi (SMV, BYMV) 27

2.2.2. Phƣơng pháp tách dòng gen 28
2.2.3. Phản ứng lai ghép gen CPi với vector pENTR
TM
/D-TOPO
®
33
2.2.4. Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi bằng kỹ
thuật Gateway 34
2.2.5. Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens mang vector chuyển gen 36
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38
3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV . 38
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA
VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV 39
3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pENTR
TM
/D-TOPO
®
39
3.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi(SMV-BYMV)]
bằng kỹ thuật Gateway 42
3.3. KẾT QUẢ TẠO VI KHUẨN A.TUMEFACIENS MANG VECTOR
CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN CPi [pGW –CPi(SMV-BYMV)] . 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48



Số hóa bởi trung tâm học liệu
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bp Cặp base
BYMV Bean yellow mosaic virus (Virus khảm vàng đậu tƣơng)
CS Cộng sự
CP Coat protein (protein vỏ)
cDNA Complementary DNA
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid
E.coli Escherichia coli
IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside
IhpRNA Intron hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc mang intron)
Kb Kilo base
kDa KiloDalton
LB Luria Bertani
miRNA Micro - RNA
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
RISC RNA – inducing silencing complex
RNA Ribonucleic Acid
RNAi RNA interference
siRNA Short interfering RNA
SMV Soybean mosaic virus (Virus khảm lá ở đậu tƣơng)
TAE Tris acetat EDTA
X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-D-galactosidase
WB Washing buffer (dung dịch rửa)

Số hóa bởi trung tâm học liệu
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 2.1
Thành phần phản ứng PCR
28
Bảng 2.2
Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT
30
Bảng 2.3
Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector
pENTR
TM
/D-TOPO
®

33
Bảng 2.4
Thành phần phản ứng LR
35




Số hóa bởi trung tâm học liệu
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
Hình 1.1
Hình ảnh lá và quả đậu tƣơng bị bệnh khảm lá đậu tƣơng
(Soybean mosaic virus-SMV)
13
Hình 1.2
Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV
14
Hình 1.3
Sự tạo thành miRNA từ gen trong nhân tế bào
20
Hình 2.1
Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng trong nghiên cứu
25
Hình 2.2
Sơ đồ mô tả các bƣớc thiết kế vector mang cấu trúc
RNAi bằng kỹ thuật Gateway(Karimi et al., 2002)
27
Hình 3.1
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vùng CPi của SMV và
BYMV
38
Hình 3.2
Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR kiểm tra dòng tế
bào E.coli mang vùng gen CPi với cặp mồi SMV-CPi-
F/BYMV-CPi-R
39
Hình 3.3

Sơ đồ mô tả phản ứng lai ghép đoạn gen CPi vào vector
pENTR
TM
/D-TOPO
®
tạo vector tái tổ hợp pEN-CPi
(SMV-BYMV)
41
Hình 3.4.
Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc với
cặp mồi M13-F/M13-R
42
Hình 3.5.
Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid pEN-CPi (SMV-
BYMV)
43
Hình 3.6
Sơ đồ mô tả phản ứng LR tạo vector pGW –CPi(SMV-
BYMV
45
Hình 3.7
Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
47
Hình 3.8.
Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ
khuẩn lạc A. tumefaciens
50

Số hóa bởi trung tâm học liệu

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có
giá trị kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng cao. Cây đậu tƣơng là có nốt sần ở rễ
có khả năng cố định nitơ không khí, vì vậy trồng đậu tƣơng không những
mang lại hiệu quả kinh tế mà còn góp phần cải tạo đất trồng trọt.
Hiện nay, năng suất và sản lƣợng đậu tƣơng ở mức thấp là do nhiều
nguyên nhân, trong đó có các bệnh do côn trùng, vi khuẩn và virus gây ra.
Hiện nay ngƣời ta đã xác định đƣợc khoảng 20 loài bệnh hại ở cây đậu tƣơng,
trong đó có các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất
đậu tƣơng. Virus gây bệnh bệnh khảm lá Soybean mosaic virus (SMV) và
bệnh khảm vàng lá Bean yellow mosaic virus (BYMV) đƣợc lan truyền từ cây
bệnh sang cây khoẻ do rệp muội ở ngoài đồng là chủ yếu. Khi bị bệnh lá đậu
tƣơng có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn
khảm mạnh và biến dạng, đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại,
phát triển chậm, quả ít và biến dạng, thƣờng lép. Hiện nay mới dừng ở biện
pháp phòng mà chƣa có thuốc trị hai loại virus SMV và BYMV. Các biện
pháp phòng bệnh theo truyền thống thƣờng phức tạp, tốn thời gian, hiệu quả
không cao và kém bền vững. Phƣơng pháp công nghệ sinh học hiện đại tạo
cây chuyển gen kháng virus tỏ ra có hiệu quả cho các loài thực vật mà trong
tự nhiên không có nguồn kháng bệnh hoặc nếu có sẵn. Ứng dụng kỹ thuật
RNAi có thể tạo cây chuyển gen kháng lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật
bằng cách chuyển các gen có nguồn gốc từ chính virus gây bệnh dựa trên
nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã - RNA interference (RNAi). Xuất phát
từ lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Thiết kế

Số hóa bởi trung tâm học liệu
2
vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen mã hóa protein vỏ nhằm phục

vụ chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm lá ở cây đậu tương".
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi
phục vụ chuyển gen kháng bệnh khảm lá do virus SMV và BYMV ở cây
đậu tƣơng.
- Tạo đƣợc chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi chứa vùng
CPi (SMV+BYMV)
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thu thập thông tin về gen CP của hai loài virus SMV và BYMV gây bệnh
khảm lá trên cây đậu tƣơng;
3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen
CPi(SMV-BYMV) bằng kỹ thuật Gateway.
3.3. Biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen
CPi(SMV-BYMV) vào vi khuẩn A. tumefaciens. Kiểm tra kết quả biến nạp
bằng colony-PCR.








Số hóa bởi trung tâm học liệu
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. BỆNH HẠI CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.1.1. Cây đậu tƣơng, đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng

Đậu tƣơng có tên khoa học là (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ
đậu(Fabaceae), họ phụ cánh bƣớm (Papilionoidace) thuộc thân thảo có bộ
NST 2n = 40, có nguồn gốc từ các tỉnh phía Bắc và Đông Bắc Trung Quốc là
loại cây trồng hàng năm không thấy xuất hiện ở loài hoang dại. Các giống
đậu tƣơng địa phƣơng của nƣớc ta hiện nay đƣợc du nhập từ Trung Quốc đã
từ lâu [4]. Cây đậu tƣơng là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ,
thân, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tƣơng là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên
rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định
đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu [4].Cây đậu tƣơng có ba loại lá: Lá
mầm, lá đơn và lá kép. Mỗi lá kép thƣờng có ba lá chét. Lá kép mọc so le,
trên phiến lá có nhiều lông tơ. Hoa đậu tƣơng đƣợc phát sinh từ nách lá, đầu
cành hoạc đầu thân. Hoa đậu tƣơng mọc thành chùm, mỗi chùm thƣờng có từ
3 -5 hoa. Hoa lƣỡng tính nên đậu tƣơng là cây tự thu phấn, tỷ lệ giao phấn rất
thấp chỉ chiếm 0.51%. Thời gian bắt đầu ra hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn
phụ thuộc vào từng giống đậu tƣơng. Căn cứ vào phƣơng thức ra hoa ngƣời ta
chia đậu tƣơng ra làm nhóm: Nhóm ra hoa hữu hạn, hƣớng ra hoa từ trên
xuống dƣới, từ ngoài vào trong. Nhóm ra hoa vô hạn, hƣớng ra hoa từ dƣới
lên trên và từ trong ra ngoài [9].
Quả đậu tƣơng thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông khi
chín có màu vàng hoặc xám. Hạt đậu tƣơng không có nội nhũ mà chỉ có một
lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Hạt có hình tròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn

Số hóa bởi trung tâm học liệu
4
dẹt, ovan vỏ hạt thƣờng nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu,
đen đa số là hạt màu vàng. Khối lƣợng hạt rất đa dạng dao động từ 20-400
mg/ hạt. Màu sắc rốn hạt ở các giống là khác nhau, đây là một biểu hiện đặc
trƣng của giống.Bộ rễ đậu tƣơng gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều
nốt sần. Các công trình nghiên cứu cho thấy những giống có khả năng cộng
sinh và có đủ nốt sần thƣờng làm cho hàm lƣợng protein cao, cho nên trồng

cây đậu tƣơng có tác dụng cải tạo đất [4].
Dựa vào thời gian sinh trƣởng, đậu tƣơng đƣợc chia thành các loại:
Chín rất sớm: Thu hoạch sau 89 – 90 ngày, chín sớm thu hoạch sau 90 –
100 ngày.
Chín trung bình: Thu hoạch sau 100 – 110 ngày, chín muộn trung bình thu
hoạch sau 110 – 120 ngày.
Chín muộn cho thu hoạch sau 130 – 140 ngày, chín rất muộn cho thu
hoạch sau 140 – 150 ngày [9].
1.1.2. Phân loại bệnh hại ở cây đậu tƣơng
Việc phân loại theo triệu chứng bệnh virus hại thực vật có ý nghĩa
quan trọng trong chẩn đoán, phòng trừ và nghiên cứu bệnh hại. Tuy nhiên, sự
phân loại bệnh chỉ có tính chất tƣơng đối vì diễn biến triệu chứng bệnh rất
phức tạp và cách phân loại còn tuỳ thuộc vào quan điểm của mỗi tác giả khác
nhau.
Bệnh khảm lá đậu tương
Khi bị bệnh lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ,
cây chậm phát triển. Lá non ở ngọn khảm lá mạnh và biến dạng. Quả thƣờng
lép. Cây bị bệnh đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại, phát
triển chậm, quả ít và biến dạng, sần sùi, có vị đắng. Bệnh do virus SMV

Số hóa bởi trung tâm học liệu
5
(Soybean mosaic virus ) gây nên. Virus lan truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới. Sự
lan truyền cây bệnh sang cây khoẻ do rệp muội ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu,
bệnh còn truyền qua hạt. Bọ trĩ, rệp càng nhiều tỉ lệ nhiễm bệnh càng lớn.
Bệnh gỉ sắt hại đậu tương
Lúc đầu trên lá xuất hiện những điểm nhỏ màu hơi vàng nổi gờ, sau đó
vết bệnh to dần, ở giữa màu vàng nâu xung quanh có quầng vàng hẹp, vết
bệnh mở rộng đƣờng kính tới 2 mm. Điểm gờ nhỏ là khối bào tử, thƣờng ở
mặt dƣới lá, còn mặt trên lá chỗ vết bệnh có màu vàng nâu, nhƣng cũng có

khi khối bào tử hạ xuất hiện cả hai mặt. Bệnh thƣờng xuất hiện trên những lá
tƣơng đối già và lá bánh tẻ, bệnh có thể hại thân và quả. Bệnh nặng làm lá
khô cháy, rụng sớm, quả nhỏ khô và lép. Bệnh gỉ sắt do nấm Uromyces
appendiculatus gây ra. Nấm tồn tại bằng bào tử và sợi nấm. Bào tử hạ của
nấm lan truyền theo gió. Con ngƣời, súc vật và công cụ là môi giới truyền
bệnh. Bào tử hạ nẩy mầm ở nhiệt độ 10 – 30
o
C nhƣng thích hợp nhất 16 –
22
o
C. Nấm thích hợp nhất trong điều kiện ẩm độ cao trên 95 %. Giọt nƣớc ƣớt
trên bề mặt lá là điều kiện cho nấm nẩy mầm và xâm nhập, do đó giọt sƣơng
đêm, sƣơng mù rất có tác dụng đối với sự phát triển của bệnh gỉ sắt. Khi trời
âm u, độ ẩm không khí cao hoặc bị mƣa kéo dài thì bệnh sẽ phát triển nhanh
nhƣng khi gặp mƣa to thì lại giảm đi.
Bệnh Sương mai (đốm phấn)
Bệnh thƣờng xuất hiện trên những lá còn non (khoảng 5-6 ngày tuổi), ở
mặt trên của lá ban đầu vết bệnh chỉ là những chấm nhỏ, mầu xanh nhạt hay
vàng nhạt, sau đó lớn dần thành hình đa giác, bất định, mầu vàng nhạt, mầu
xám hay mầu nâu sậm có viền mầu xanh vàng , khô cháy. Vết bệnh nằm rải
rác trên lá, nhƣng thƣờng tập trung nhiều nhất ở dọc các gân lá.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
6
Vào những lúc sáng sớm trời ẩm ƣớt thì ở mặt dƣới của lá tại những chỗ có
vết này thấy có một đám bông xôm xốp mầu trắng xám, hiện tƣợng này đã
làm cho lá bị vàng rồi rụng dần.
Bóc vỏ những quả bị bệnh ra ở bên trong cũng có lớp nấm mốc trắng xám.
Hạt của những quả bị bệnh nhìn xù xì, nhỏ, nhẹ và thƣờng bị nứt, nếu bệnh
nặng hạt sẽ bị lép. Bệnh do nấm Peronospora manshurica gây ra. Chúng có

thể gây hại trên nhiều bộ phận nhƣ lá, thân, hoa, quả nhƣng chủ yếu là gây
hại trên lá. Bệnh truyền qua hạt giống và tàn dƣ của cây bị bệnh từ vụ trƣớc.
Nếu hạt giống trƣớc khi đem gieo đã có sẵn mầm bệnh thì khi gieo xuống
khoảng nửa tháng lá sẽ có đốm vàng, mép lá cong xuống phía dƣới, mặt dƣới
lá có nhiều khuẩn ty bao phủ, cây con bị lùn.
Bệnh này xuất hiện và gây hại tƣơng đối phổ biến ở các vùng, nhất là ở
những nơi có ấm độ không khí trong ruộng cao, nhiệt độ không khí thấp, trời
hơi lạnh, có sƣơng mù nhiều, tạo cho ruộng đậu ẩm thấp, vì thế bệnh thƣờng
gây hại trong vụ Đông xuân nhiều hơn.
Bệnh lở cổ rễ
Bệnh phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới. Đây là bệnh chính trên cây
lúa và cây họ đậu. Mức độ nhiễm nấm Rhizoctonia solani ở khu vực nhiệt đới
là 40%. Ở nƣớc ta, bệnh gây hại ở các vùng trồng đậu đỗ thuộc đồng bằng,
trung du và miền núi. Bệnh có thể phá hoại trong suốt thời kỳ sinh trƣởng của
cây nhƣng chủ yếu vào thời kỳ cây con. Bệnh nặng làm cây con chết hàng
loạt nên còn đƣợc gọi là bệnh chết rạp cây con. Nấm gây bệnh có thể phá hại
cùng với loại nấm khác nhƣ Fusarium solani fsp. phaseoly.
Bệnh hại vào thời kỳ cây con mới mọc gây héo và chết cây con. Vết
bệnh lúc đầu chỉ là một chấm nhỏ, màu đen ở phần gốc sau đó lan nhanh bao
bọc xung quanh cổ rễ làm cổ rễ khô tóp lại, cây gục xuống và chết nhƣng thân

Số hóa bởi trung tâm học liệu
7
lá vẫn còn màu xanh. Trên vết bệnh có lớp nấm màu trắng xám. Vết bệnh thối
mục, có màu nâu đen ủng và lan nhanh khi gặp trời mƣa. Nấm Rhizoctonia
solani thuộc nhóm Mycelia sterilia. Nấm R. solani là nguyên nhân ngăn cản
sự nảy mầm và gây bệnh ở cây con. Sợi nấm kí sinh có màu vàng và khi già
chuyển dần sang màu nâu. Sợi nấm mảnh 4 – 12 µm tỷ số chiều dài trên rộng
là 5/1. Sợi nấm phân nhánh góc bên phải và có ngăn ở cuối cùng. Hạch nấm
dạng hạt dẻ màu nâu đến đen.

Nấm Fusarium solani (Mart) Appel & Wollned - Emened Snyder &
Hansen thuộc lớp Nấm Bất toàn. Tản nấm có màu trắng đến màu kem, sợi
nấm mảnh và xốp, đặc biệt loài nấm này có các giọt nƣớc chứa đầy các bào tử
phân sinh trên các nhánh dài của cành bào tử phân sinh. Bào tử nhỏ gồm 1 - 2
tế bào hình oval, hoặc elip, hoặc bầu dục, không màu có kích thƣớc 8 - 16 x 2
- 4 µm. Bào tử lớn không màu có vỏ dày gồm 3 đến 4 ngăn,kích thƣớc 4 - 100
x 5 – 8 µm đƣợc hình thành nhiều trên các cụm cành bào tử phân sinh màu
kem. Tế bào trên đỉnh thƣờng ngắn, tròn hoặc cong. Bệnh phát triển thuận lợi
trong điều kiện nhiệt độ 25 - 28
0
C, độ ẩm đất cao, nóng lạnh thất thƣờng. Đặc
biệt trong điều kiện nhà kính bệnh phát triển mạnh. Bệnh cũng phá hại mạnh
trên những chân ruộng trũng, ứ đọng nƣớc, đất trồng bị đóng váng sau khi
mƣa. Nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trong đất và trên tàn dƣ cây trồng dƣới dạng
hạch nấm, sợi nấm và bào tử phân sinh, nấm Fusarium solani có thể tồn tại
trên hạt giống từ đó lan truyền sang cây con. Tỷ lệ hạt nhiễm nấm gây bệnh
có thể lên tới 29%. Nấm gây bệnh có phạm vi ký chủ rộng gây hại trên nhiều
loại cây trồng có ý nghĩa kinh tế nhƣ các loại đậu đỗ, cà chua, khoai tây, ngô,
lúa, cây dƣợc liệu Nấm gây bệnh có thể sống hoại sinh trong đất trên các tàn
dƣ cây trồng.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
8
Bệnh thán thư đậu tương
Bệnh thán thƣ đậu tƣơng đƣợc công bố đầu tiên năm 1917 tại Hàn Quốc.
Hiện nay, bệnh phổ biến ở khắp các vùng trồng đậu tƣơng trên thế giới. Nấm
gây bệnh có phổ ký chủ rộng, gây hại trên các cây trồng thuộc họ đậu nhƣ đậu
xanh, đậu đen, lạc, đậu trạch,…. làm giảm chất lƣợng hạt, hạt bị nhiễm bệnh
hàm lƣợng các amino acid giảm.
Cây có thể nhiễm bệnh từ giai đoạn cây con đến khi thu hoạch. Nấm gây

hại ở các bộ phận của cây nhƣ lá, thân, cành, quả và hạt. Giai đoạn cây con
vết bệnh là các vết đốm màu nâu ƣớt, hơi lõm trên lá mầm và phát triển xuống
thân, lá mầm bị bệnh thƣờng rụng sớm. Bệnh nặng thƣờng gây chết cây con.
Vết bệnh trên lá thƣờng biểu hiện các vết chết hoại có màu nâu đỏ trên gân
lá, gây thối gân. Bệnh có thể gây hại trên phiến lá là các vết bệnh hình bầu
dục, màu nâu, hơi lõm, xung quanh có viền nâu đỏ, trên bề mặt vết bệnh có
các chấm đen nhỏ là các đĩa cành của nấm gây bệnh. Lá bị bệnh thƣờng quăn
lại dễ bị rụng. Trên thân cành, cuống lá và vỏ quả vết bệnh có màu nâu, vết
bệnh thƣờng bị bao phủ bởi các đĩa cành có màu nâu. Hạt nhiễm bệnh thƣờng
nhỏ, nhăn nheo, trên bề mặt hạt có các vết xám, sau chuyển sang màu nâu
hoặc nâu đen. Cây bệnh phát triển kém, nếu nhiễm ở giai đoạn sớm cây đậu
không có khả năng phát triển quả. Một số cây bệnh trên thân và hạt có thể
không mang triệu chứng nhƣng nấm nhiễm hệ thống ở bên trong. Bệnh hại do
nấm Colletotrichum truncatum, bộ Melanconiales, lớp Nấm Bất toàn. Tản
nấm hầu nhƣ không xuất hiện, nếu có thƣờng rất mỏng màu sáng hoặc trắng
hồng. Sợi nấm đa bào, không màu. Đĩa cành mọc đơn lẻ hoặc tập trung thành
từng đám. Lông bám trên đĩa cành màu nâu hoặc màu đen, thƣờng dài hơn
cụm bào tử phân sinh. Bào tử phân sinh tập trung thành cụm, có màu trắng,
trắng đục hoặc vàng nhạt đến vàng da cam. Bào tử phân sinh không màu, thon
dài hơi cong và nhọn ở hai đầu, kích thƣớc 15 – 27 x 2 – 5 µm. Lông của đĩa

Số hóa bởi trung tâm học liệu
9
cành màu nâu hoặc màu đen, có từ 0 – 9 ngăn ngang, kích thƣớc 50 – 468 x 2
– 7 µm. Nấm gây bệnh có thể nhiễm hệ thống và biểu hiện triệu chứng sau
khi cây đã thuần thục. Sợi nấm có thể tồn tại trong nội nhũ và phôi hạt. Bào tử
nấm nảy mầm hình thành 1- 2 ống mầm ngắn, từ đó sinh ra các giác bám xâm
nhập qua biểu bì của cây. Gặp điều kiện thuận lợi nhiệt độ 20 – 25
0
C, có giọt

nƣớc, nấm có thể nảy mầm và hình thành giác bám trong vòng 6 giờ, thời kỳ
tiềm dục 60 – 65 giờ. Nguồn bệnh tồn tại chủ yếu ở dạng sợi nấm trên hạt
giống và tàn dƣ cây bệnh. Trên hạt giống, sợi nấm giữ đƣợc mức sống từ 1 –
2 năm. Bệnh thán thƣ đậu tƣơng phát triển mạnh trong điều kiện ẩm độ cao,
nhiệt độ khoảng 28
0
C. Ở điều kiện miền Bắc nƣớc ta, bệnh thƣờng phát triển
từ tháng 4 đến tháng 6, gây hại mạnh trên cây đậu tƣơng đang ở giai đoạn
phát triển quả cho đến khi thu hoạch. Sợi nấm trên hạt giống có thể lan truyền
gây bệnh cho cây con mới mọc. Bào tử phân sinh lan truyền qua gió, mƣa,
nƣớc tƣới và côn trùng gây hại trên đồng ruộng. Bệnh phát triển mạnh trên
những ruộng đậu tƣơng trồng với mật độ dày, trồng liên tiếp nhiều vụ. Tỷ lệ
nhiễm bệnh trên đồng ruộng phụ thuộc vào mức độ nhiễm bệnh của hạt giống
và độ ẩm trên đồng ruộng. Bệnh phát triển mạnh ở những vùng trồng đậu
tƣơng có mƣa nhiều, bón phân không hợp lý. Giống đậu tƣơng nhiễm bệnh
cao là các giống AK 03, DT 84. Các giống đậu tƣơng DT 22, DT 90, DT 93
nhiễm bệnh ở mức thấp hơn.
Bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương
Bệnh đốm gỉ: Trên lá, triệu chứng bệnh xuất hiện ở dạng đốm nhỏ nổi
trên mặt lá nhƣ các mụn loét nên trông rất dễ nhầm lẫn với bệnh gỉ sắt đậu
tƣơng do nấm gây ra. Vi khuẩn gây bệnh phân lập từ đậu tƣơng có dạng hình
gậy, kích thƣớc từ 0,5 - 0,9 x 1,4 - 2 µm có hai lông roi, không có vỏ nhờn,
gram âm. Các đặc tính sinh hoá của nó tƣơng tự nhƣ của loài Xanthomonas
phaseoli hại trên các cây họ đậu khác (Phaseolus). Vi khuẩn xâm nhập qua lỗ

Số hóa bởi trung tâm học liệu
10
khí, tiến hành quá trình lan truyền trong nhu mô lá và gây hại cho cây. Bệnh
đốm gỉ do vi khuẩn Xanthomonas phaseoli pv. Sojense.
Bệnh đốm góc:Triệu chứng bệnh thể hiện ở trên lá là những vết đốm nhỏ

(3mm) lúc đầu ngậm nƣớc trong giọt dầu, vàng nhạt, về sau chuyển sang màu
nâu đen, vết bệnh có góc cạnh, không đều đặn. Nhiều vết bệnh liền nhau, chi
chít trên phiến lá. Khi ẩm ƣớt từ vi khuẩn có thể tiết ra màng dịch vi khuẩn.
Bệnh có thể hiện trên thân và quả. Vi khuẩn gây bệnh có dạng hình gậy, kích
thƣớc từ 1,2 - 1,5 x 2,3 – 3 µm có lông roi ở một đầu, có vỏ nhờn, gram âm,
chịu axit kém. Khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng xám, nhẵn bóng. Vi
khuẩn có khả năng phân giải sữa, tạo NH3, có khả năng rất yếu hoặc không
tạo ra khí indol, không khử nitrat, không phân giải gelatin. Nhiệt độ thích hợp
cho vi khuẩn sinh trƣởng phát triển là 24 - 26
0
C, nhiệt độ tối đa là 35
0
C và tối
thiểu là 2
0
C. Nhiệt độ làm cho vi khuẩn chết là 48 - 49
0
C trong 10 phút. bệnh
đốm góc do vi khuẩn Pseudomonas glycinea.
Nguồn bệnh của hai loài vi khuẩn gây bệnh đốm lá đậu tƣơng tồn tại chủ
yếu trên hạt giống, trên tàn dƣ cây bệnh. Vi khuẩn không truyền qua đất vì nó
rất nhanh bị chết ở trong đất khi tàn dƣ đã mục. Bệnh đốm lá vi khuẩn phát
sinh phát triển thuận lợi trong điều kiện thời tiết nóng ẩm. Nhiệt độ thích hợp
nhất để bệnh phát triển 26 -30
0
C. Bệnh phát sinh gây hại ở tất cả các thời vụ
trồng đậu tƣơng, mức độ nhiễm bệnh ở mỗi thời vụ có khác nhau. Vụ đậu
tƣơng xuân và hè thu, bệnh thƣờng phát sinh gây hại nặng. Còn ở vụ đậu
tƣơng đông thì bệnh thƣờng phát sinh gây hại nhẹ hơn. Hầu hết các giống đậu
tƣơng đang gieo trồng ngoài sản xuất đều có thể nhiễm bệnh, bệnh có xu thế

phát sinh gây hại nặng trên những giống đậu tƣơng nhập nội, lai tạo, có năng
suất cao.


Số hóa bởi trung tâm học liệu
11
1.1.3. Bệnh khảm lá do virus SMV và BYMV trên cây đậu tƣơng
Virus gây bệnh trên thực vật rất đa dạng về chủng loại, phần lớn chúng
là virus RNA sợi đơn hoặc kép (Cucumber mosaic virus - CMV, Tobaco
mosaic virus - TMV, Tomato spotted wilt virus - TSWV ) nhƣng cũng có
một số ít là virus DNA (Tomato yellow leaf curl virus - TYLCV, Cauliflower
mosaic virus - CaMV). Các virus này thƣờng có phổ gây bệnh rộng, có loài
gây hại tới trên 900 loại thực vật khác nhau với những biểu hiện bệnh phức
tạp, khó nhận biết.
Bệnh virus thực vật gây thiệt hại lớn nhất không phải là làm cho cây
trồng bị chết nhanh chóng mà chính là làm cho cây bị thoái hoá, giảm sức
sống, dần tàn lụi. Virus cũng có thể gây nên những thiệt hại nặng nề và
nhanh chóng ngay trong vụ trồng của các cây thƣờng năm nhƣ virus gây
bệnh lúa vàng lụi, bệnh vàng lá lúa, bệnh xoăn lá cà chua, bệnh virus khoai
tây, bệnh khảm sọc lá hành tây. Bệnh virus hại lúa, virus hại sắn đã từng
huỷ diệt hàng chục vạn ha ở châu Á và châu Phi trong một thời gian ngắn
chƣa tới 30 ngày từ một cánh đồng xanh tƣơi trở thành vàng úa, chết lụi.
Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hƣởng của bệnh tới phẩm chất
của các sản phẩm nông nghiệp.
Virus khảm lá đậu tƣơng ( SMV ) gây ra là một trong những bệnh virus
phổ biến nhất của đậu tƣơng và đƣợc tìm thấy ở hầu hết các vùng sản xuất
đậu tƣơng trên thế giới. Khi nhiễm SMV cây thể hiện một loạt các triệu chứng
khác nhau, có khi không thể phát hiện một cách trực quan cho đến việc sử
dụng các kỹ thuật cao. Các triệu chứng có thể không đƣợc phát hiện ở nhiệt
độ trên 27

0
C, mặc dù nhiều giống đậu tƣơng không thể hiện rõ rệt triệu chứng
ở bất kể nhiệt độ [30].

Số hóa bởi trung tâm học liệu
12
Đây là một trong những bệnh quan trọng nhất ở nhiều nơi trên thế giới.
Mức độ của bệnh tùy thuộc vào giống và khí hậu. Năng suất có thể giảm trên
25%. Bệnh đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Mỹ vào những năm đầu của thập niên
1900. Bệnh hiện diện ở khắp các vùng trồng đậu tƣơng trên thế giới. Khi bệnh
xuất hiện sớm sẽ dẫn đến thất thu nặng.
Ở những vùng sản xuất đậu tƣơng chính của miền Bắc Hoa Kỳ , nguồn
lây bệnh SMV có nguồn gốc từ hạt bị nhiễm SMV. Lây lan thứ cấp có thể xảy
ra trong và giữa các vùng trồng đậu tƣơng thông qua các hoạt động của hơn
30 loài rệp khác nhau, chúng có thể nhiễm và lan truyền SMV [30].
Ở ĐBSCL, từ vụ đông xuân 79-80, bệnh tỏ ra khá phổ biến. Bệnh có thể
xuất hiện khá sớm (vào 4 tuần sau khi gieo) và gây thiệt hại nặng ở những
ruộng không đƣợc trị bệnh kịp lúc.
Nhiễm SMV có thể dẫn đến thiệt hại năng suất nghiêm trọng do dị dạng
hoa , làm giảm lớp vỏ , giảm bớt số lƣợng và trọng lƣợng của hạt, và những
cây nhiễm bệnh sớm thƣờng dẫn tới tổn thất lớn hơn. Chất lƣợng hạt giảm
cũng là một kết quả của sự biễn đổi màu hạt do SMV gây ra (hạt đậu bị nhiễm
bệnh có các vết màu nâu đỏ hoặc những vết lốm đốm trên vỏ hạt ). Những vết
lốm đốm này làm giảm hiệu quả kinh tế của hạt đậu tƣơng vì chúng sẽ bị loại
ra khi đƣợc đƣa vào sử dụng [30].
Lá bị mất màu, loang lổ giống nhƣ tấm khảm. Lá nhỏ lại, phát triển
không đều, bìa lá cong xuống làm lá biến dạng. Phiến lá bị xếp nếp nhăn
nhúm, có màu loang lổ xanh nhạt và xanh đậm và thƣờng dày hơn lá bình
thƣờng. Dọc gân lá, mô tế bào nổi rộp lên những mụn màu xanh đậm. Triệu
chứng bệnh trên lá trông gần giống triệu chứng bệnh đậu tƣơng bị ngộ độc

thuốc diệt cỏ 2,4 D. Việc sử dụng bất cẩn thuốc diệt cỏ cho ruộng đậu hoặc ở

Số hóa bởi trung tâm học liệu
13
gần ruộng đậu, nhất là vào những ngày có gió mạnh có thể gây hại cho các
ruộng đậu ở cách xa đó 30-60m.

Hình 1.1: Hình ảnh lá và quả đậu tƣơng bị bệnh khảm lá đậu tƣơng
(Soybean mosaic virus-SMV)

Cây lùn do các lóng thân phát triển kém. Trái và hạt phát triển chậm lại,
nhất là các trái ở phần trên của cây. Trái chín chậm, hạt nhỏ, vỏ hạt bị đổi
thành màu nâu nhạt và đậm không đều, từ tễ hạt lan ra. Triệu chứng bệnh
đƣợc biểu hiện rõ ở 18,5
0
C. Trên 29,5
0
C triệu chứng bệnh sẽ ở dạng tiềm ẩn.
Bệnh do virus SMV (soybean mosaic virus). Bệnh đƣợc truyền qua hạt giống,
qua côn trùng mang truyền bệnh và có thể truyền bằng cơ học. Virus lan
truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới. Sự lan truyền cây bệnh sang cây khoẻ do
rệp muội ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu, bệnh còn truyền qua hạt. Bọ trĩ, rệp
càng nhiều tỉ lệ nhiễm bệnh càng lớn.
1.2. HỆ GEN CỦA SMV VÀ BYMV
1.2.1. Đặc điểm của hệ gen ở SMV và BYMV
Hệ gen của SMV và BYMV gồm các gen trên sợi RNA (+). Bệnh khảm lá
do SMV và BYMV là một trong những bệnh virus điển hình nhất ở đậu
tƣơng, làm giảm năng suất và chất lƣợng của hạt đậu tƣơng. SMV và BYMV

Số hóa bởi trung tâm học liệu

14
lan truyền do rệp làm môi giới và sự lan truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ do
rệp ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu.
Soybean mosaic virus (SMV) thuộc Chi Potyvirus, Họ Potyviridae, là
một trong những loại virus gây bệnh quan trọng nhất ở cây đậu tƣơng
(Glycine max [L.] Merr). và bệnh khảm lá đậu tƣơng do SMV gây ra gặp ở
hầu hết các quốc gia trên thế giới. SMV có thể gây ra thiệt hại đáng kể về sản
lƣợng, làm suy giảm năng suất đậu tƣơng tới 40% khi các cây bị nhiễm hoặc
trƣớc khi ra hoa [17] và 91% hạt đậu có vết lốm đốm; ở một số trƣờng hợp có
thể gây thiệt hại lên tới 94% tổng sản lƣợng. Sau khi nhiễm SMV, đậu tƣơng
sẽ giảm năng suất và chất lƣợng hạt [17]. Họ Potyviridae có số lƣợng lớn nhất
trong số các loại virus thực vật đƣợc biết đến [24].
Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa cho 3066 amino acid, gồm 10
chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-
pro), Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein
(CI), 6 kDa protein 2 (6K2), Viral genome-linked protein (VPg), Nuclear
inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Capsid
protein (CP) (Hình 1.2).
Hệ gen của BYMV gồm các gen mã hóa 3056 amino acid, và cũng gồm
10 chuỗi polypeptid giống nhƣ hệ gen của SMV.



Hình 1.2: Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV



Số hóa bởi trung tâm học liệu
15
Won-Seok Lim và đtg (2003) đã phân tích trình tự nucleotide hoàn

chỉnh của RNA genome của SMV chủng G5 (SMV-G5) và G7H (SMV-G7H)
và so sánh với trình tự của các chủng SMV khác. Mỗi RNA virus SMV dài
9588 nucleotides (chƣa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã
hóa cho một polyprotein mà sau đó đƣợc phân cắt thành 10 protein chức
năng. So sánh trình tự amino acid của 2 chủng này với các chủng SMV khác
cho thấy có tỉ lệ lớn trình tự amino acid tƣơng đồng. Hệ số tƣơng đồng về
trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn giữa chủng SMV-G5 và
SMV-G7H là 99%. Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của các chủng này có thể
cung cấp những gợi ý để xác định các yếu tố quyết định đến triệu chứng bệnh
khảm lá ở cây đậu tƣơng, từ đó có các biện pháp hiệu quả để phòng trừ SMV
cho đậu tƣơng.
1.2.2. Gen CP của SMV và BYMV
Cấu trúc gen CP
Hệ gen của BYMV có kích thƣớc 9530 nucleotide, còn kích thƣớc của
hệ gen ở SMV là 9588 nucleotide. Gen CP của SMV có khoảng 798
nucleotide, mã hóa cho 265 amino acid; còn gen CP của BYMV có 830
nucleotide, mã hóa 276 aminoacid.
Một đặc điểm chính của tiểu đơn vị CP đó là nó bao gồm ba vùng: N-
terminal, protein nhân , và C- terminal. N- và C- terminal là bề mặt tiếp xúc
có khả năng bị loại bỏ khi phân hủy trypsin (enzym tiếp tục phân hủy protein
bằng cách phá vỡ peptone thành các chuỗi peptide nhỏ hơn), trong khi lõi
protein là kháng trypsin (Allisonet al, 1985; Shukla et al, 1988).
Các gen CP của các potyvirus có kích thƣớc khác nhau mã hóa từ 251
đến 332 amino acid (Shukla and Ward, 1989a; Shukla et al., 1994). Sự khác
biệt lớn về kích thƣớc nhƣ vậy là do sự thay đổi ở N-terminal, dao động từ

Số hóa bởi trung tâm học liệu
16
19-97 residues. Ngoài ra, khu vực này thay đổi đáng kể theo thứ tự giữa các
potyviruses khác nhau. Ngƣợc lại, khu vực C - terminal thay đổi chiều dài là

do hai residues (18-20) và có sự giống nhau rõ rệt về trình tự. Khu vực protein
nhân cũng diễn ra sự đồng nhất trong cả hai trình tự (65%) và độ dài (214 –
217 residues).
Trình tự CP của bốn dòng SMV đã đƣợc xác định rõ. Đó là các SMV -
VA, -N, -G2, và G7. Hạt potyvirus đƣợc tạo thành từ khoảng 2000 tiểu đơn vị
CP sắp xếp theo hình xoắn ốc xung quanh một bản sao đơn của virus RNA
(Shukla et al, 1994). Mỗi nucleocapsid dài khoảng 3.3 nm với 7-8 tiểu đơn vị
CP mỗi vòng xoắn. Ƣớc tính có 6 nucleotide liên kết với mỗi tiểu đơn vị CP.
Những nghiên cứu cho thấy các gen CP có thể dễ dàng phân ly thành
các tiểu đơn vị cấu thành trong môi trƣờng có nồng độ muối cao hoặc độ pH
nhỏ hơn 6 hoặc lớn hơn 9. Bằng cách điều chỉnh các nhân tố này, các tiểu đơn
vị CP dễ dàng hình thành các hạt xoắn khúc dài mà không cần đến RNA .
Các tiểu đơn vị lần đầu tổ hợp tạo thành những vòng xoắn xếp chồng lên
nhau, mỗi vòng dài khoảng 40 nm sau đó sẽ tổ hợp thêm tạo thành các hạt
mảnh có đƣờng kính 11 nm và độ dài khác nhau , có thể dài đến vài micromet
(McDonald và Bancroft , 1977; Shukla et al, 1994). Ngoài ra, virus có thể
hình thành trực tiếp từ các monomers của tổ hợp lắp ráp nhỏ, các hạt kiểu
stacked-ring tách rời bởi RNA xung quang trƣớc khi tổ hợp lại.
1.3. KỸ THUẬT RNAi VÀ ỨNG DỤNG TẠO CÂY CHUYỂN GEN
KHÁNG VIRUS
Các loại bệnh virus là một trong những nguyên nhân chính ảnh hƣởng đến
năng suất, chất lƣợng, do vậy hạn chế sự tăng trƣởng về diện tích và sản
lƣợng. Cho đến nay chƣa có một loại thuốc bảo vệ thực vật nào có khả năng
chống lại bệnh do virus gây ra, có nhiều biện pháp khác nhau đang đƣợc sử

Số hóa bởi trung tâm học liệu
17
dụng để kiểm soát bệnh virus trên cây trồng tuy vậy mỗi biện pháp đều có
những hạn chế nhất định. RNAi (RNA interference) đƣợc xem là một trong
những kỹ thuật đem lại nhiều kết quả khả quan và bắt đầu đƣợc ứng dụng

rộng rãi trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh
virus.Tuy vậy, phƣơng pháp này cũng có một số hạn chế nhất định mà một
trong số đó là tính kháng của cây chuyển gen đối với một dòng virus phụ
thuộc vào độ tƣơng đồng của vật liệu gen đƣợc sử dụng để chuyển vào cây và
trình tự gen tƣơng ứng của virus đó.
Hiện nay, RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả chống
lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Các bƣớc chính trong kỹ thuật này bao
gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp
vector chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3)
sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng
virus của các cây chuyển gen.
1.3.1. Các RNA ức chế nhỏ (siRNA và miRNA)
siRNA đƣợc tạo thành do sự phân cắt các dsRNA bởi Dicer, đây là
phần tử mấu chốt của cơ chế bất hoạt gen RNAi. Cấu trúc nguyên vẹn của
phân tử siRNA rất quan trọng cho tính đặc hiệu của quá trình RNAi. Hai
mạch của sợi kép siRNA khác nhau về độ bền với nhiệt độ cuối cùng, một
thuộc tính để nhận biết sợi đơn cần thiết trong siRNA sẽ đi vào phức hệ
RISC. Sự giãn xoắn của siRNA tạo ra sợi dẫn đầu (guide strand) sẽ đi vào
phức hệ RISC và liên kết với mRNA đích đặc hiệu bởi sự bổ sung trình tự
tƣơng đồng. Sợi còn lại của đƣợc gọi là “sợi chờ” (passenger strand) và sẽ bị
phân hủy sau đó. Do đó sợi dẫn đầu siRNA phải tƣơng tác với một số protein