nghiên cứu hạt nano chitosan làm tá chất cho vacxin cúm a h1n1 và thử nghiệm đáp ứng miễn dihcj trên chuột nhắt trắng mus musculus swiss

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN





NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ


NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO
VACXIN CÚM A/H1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus Swiss)





LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC









BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN



NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ


NGHIÊN CỨU HẠT NANO CHITOSAN LÀM TÁ CHẤT CHO
VACXIN CÚM A/H1N1 VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus Swiss)



Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 604230


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC


Người hướng dẫn khoa học: GS TS. Lê Văn Hiệp
PGS TS. Nguyễn Anh Dũng



BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất
kỳ một công trình nào khác.
Người cam ñoan


Nguyễn Thị Ngọc Hà











LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:
GS.TS Lê Văn Hiệp – Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang, Người
thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, truyền ñạt kiến thức cho tôi trong quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tại Viện Vacxin Nha Trang.
PGS.TS Nguyễn Anh Dũng - Trường Đại học Tây Nguyên, Người thầy
trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, truyền ñạt kiến thức và ñóng góp nhiều ý kiến quý

báu cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Lãnh ñạo Trường Đại học Tây Nguyên, tập thể các Thầy Cô giáo Phòng
Đào tạo Sau ñại học, Khoa KHTN và CN.
Các thầy Cô giáo ñã tận tâm giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý
báu trong quá trình học tập.
Các cán bộ nhân viên Phòng Nghiên cứu và Phòng Kiểm ñịnh Viện
Vacxin Nha Trang.
Lãnh ñạo và tập thể cán bộ giáo viên trường Trường THPT Trần Phú, TP
Buôn Ma Thuột.
Cuối cùng xin gửi những tình cảm thân thương tới gia ñình, bạn bè và
ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ và ñộng viên tôi hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APC : Antigen- presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên)
CS : Chitosan
DNA : Deoxyribo nucleic Acid
FCA : Freund’s complete adjuvant
FIA : Freund’s incomplete adjuvant
HA: : Haemagglutinin
HAU : Haemagglutination Unit (Đơn vị kháng nguyên)
HI test : Haemagglutination Inhibition test
(Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu)
HIU : Haemagglutination Inhibition Unit
(Đơn vị hiệu giá kháng thể kháng HA)
IgG : Immunoglobulin
IVAC : Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang
kDa : Kilo Dalton
KN : Kháng Nguyên

MIC : Nồng ñộ ức chế tối thiểu
RNA : Ribonucleic Acid
TPP : Tripolyphosphate
WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)





DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Protein của virus cúm 18
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano CS ñến hiệu suất hấp phụ
(LE) và khả năng hấp phụ (LC) kháng nguyên cúm A H1N1 43
Bảng 3.2: So sánh kết quả tăng trọng chuột ở các nhóm vacxin hấp phụ tá chất
khác nhau (n=5) 46
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các loại tá chất khác nhau ñến tỷ lệ ñáp ứng miễn dịch
trên chuột với vacxin cúm A/H1N1. 48
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các loại tá chất ñến hiệu giá kháng thể trung bình của
chuột (n = 9) 50
Bảng 3.5: So sánh kết quả tăng trọng chuột ở các nhóm vacxin hấp phụ tá chất
nano chiotsan có khối lượng phân tử khác nhau (n=5) 54
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử tá chất nano CS cho vacxin cúm
A/H1N1 ñến tỉ lệ ñáp ứng miễn dịch trên chuột 56
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử tá chất nano CS của vacxin cúm
A/H1N1 ñến hiệu giá kháng thể trung bình (HIU) 57
Bảng 3.8: So sánh kết quả tăng trọng chuột ở các nhóm vacxin hấp phụ tá chất
nano CS có khối lượng phân tử khác nhau (n=5) 60
Bảng 3.9 ảnh hưởng của liều lượng vacxin cúm A/H1N1 khi sử dụng tá chất
nano chitosan ñến ñáp ứng miễn dịch trên chuột 62

Bảng 3.10: ảnh hưởng của liều lượng vacxin cúm A/H1N1 khi sử dụng tá chất
nano CS ñến ñáp ứng miễn dịch trên chuột 63
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian bảo quản vacxin hấp phụ trên hạt nano CS
ñến ñáp ứng miễn dịch trên chuột .66
Bảng 3.12: Kết quả kháng thể kháng HA trên chuột sau khi tiêm vacxin chứa tá
chất nano CS ñược bảo quản trong khoảng thời gian khác nhau 67


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của nano chitosan 3
Hình 1.2: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion. 7
Hình 1.3: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp kết tủa. 8
Hình 1.4: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp sấy phun. 9
Hình 1.5 : Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp mixel ngược pha 10
Hình 1.6 : Cấu tạo của Virus cúm typ A 16
Hình 3.1: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến hiệu suất
hấp phụ (LE) kháng nguyên cúm A/H1N1 44
Hình 3.2: Ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến khả năng
hấp phụ (LC) kháng nguyên cúm A H1N1. 44
Hình 3.3: Tăng trọng chuột của các lô vacxin cúm A/H1N1 hấp phụ các loại tá
chất khác nhau 47
Hình 3.4 : Tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch của vacxin cúm A/H1N1 với tá chất
nano chitosan và các tá chất khác. 49
Hình 3.5: Ảnh hưởng của các nhóm tá chất ñến hiệu giá kháng thể trung bình
trên chuột nhắt. 51
Hình 3.6: Kết quả tăng trọng của chuột ở các nhóm vacxin có tá chất nao
chitosan khác nhau. 55

Hình 3.7: Tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch ñối với các nhóm vacxin sử dụng tá
chất nano chitosan với khối lượng phân tử khác nhau 57
Hình 3.8: Hiệu giá kháng thể trung bình ở các nhóm vacxin sử dụng tá chất nano
chitosan với khối lượng phân tử khác nhau 58
Hình 3.9: Tăng trọng trung bình của chuột ở các nhóm vacxin có hàm lượng
kháng nguyên khác nhau 61
Hình 3.10: Tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch ở các nhóm vacxin có hàm lượng
kháng nguyên khác nhau 62
Hình 3.11: Hiệu giá kháng thể trung bình ở các nhóm vacxin có hàm lượng
kháng nguyên khác nhau 64
Hình 3.12: Tỉ lệ chuột có ñáp ứng miễn dịch ở các nhóm vacxin có thời gian bảo
quản sau hấp phụ khác nhau 66
Hình 3.13: Hiệu giá kháng thể trung bình ở các nhóm vacxin có thời gian bảo
quản sau hấp phụ khác nhau 68

1
PHẦN MỞ ĐẦU

Những năm 1918-1919, thế giới ñã xảy ra ñại dịch cúm “Tây Ban Nha” do
virus cúm týp A/H1N1 gây ra. Đây thực sự là cơn ác mộng cho loài người vì chỉ
trong vài tháng ñã có hơn 1 tỉ người mắc bệnh (chiếm 1/2 dân số thế giới thời kì
bấy giờ) và cướp ñi sinh mạng của hơn 20 triệu người, gấp ñôi số tử vong trong
chiến tranh thế giới thứ nhất. Mới ñây nhất ñại dịch cúm 2009 là dịch cúm do
một loại virus thuộc chủng A/H1N1, lần ñầu tiên ñược các cơ quan y tế phát hiện
vào tháng 3 năm 2009. Sự bùng phát căn bệnh giống như bệnh cúm ñã ñược phát
hiện lần ñầu ở ba khu vực thuộc Mexico và lây lan rất nhanh. Theo tổ chức Y tế
thế giới, tính ñến ngày 12 tháng 6 năm 2009 ñã có 29669 trường hợp ñược xác
ñịnh nhiễm cúm A/H1N1 tại 74 quốc gia và ñã có hàng trăm người chết. Tính
ñến ngày 10/02/2010, Việt Nam cũng ñã ghi nhận 11.186 trường hợp dương tính
với cúm A/H1N1 và 58 trường hợp tử vong.

Đại dịch cúm xảy ra tác ñộng rất lớn ñến nền kinh tế, sức khoẻ, tính mạng
của con người cũng như các hoạt ñộng xã hội khác nên việc nghiên cứu, sản xuất
vacxin và thuốc kháng virus là hai mục tiêu lớn mà nhiều quốc gia ñang hướng
tới.
Vacxin là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất ñể phòng ngừa, kiểm
soát và ñẩy lùi bệnh dịch nói chung và bệnh cúm nói riêng. Hiện nay, trên thế
giới năng lực sản xuất vacxin phòng cúm chỉ ñáp ứng 10% dân số khi ñại dịch
xảy ra. Vì thế mục tiêu nghiên cứu hiện nay là sản xuất loại vacxin có hiệu giá
cao, rẻ và an toàn khi sử dụng. Hiệu quả miễn dịch và giá thành của vacxin lại
phụ thuộc rất lớn vào tá chất. Một số tá chất thường ñược sử dụng cho người
Al(OH)
3
, MF59, chitosan,….Vì vậy, việc nghiên cứu loại tá chất cho vacxin là
rất cần thiết trong sản xuất vacxin.
2
Hạt nano chitosan an toàn sinh học, tương hợp sinh học, có kích thước
nanomet, mang ñiện tích dương và dễ dàng ñi qua màng tế bào nên có thể mang
vacxin, nhất là vacxin qua niêm mạc mũi với tính an toàn, hiệu quả và ñáp ứng
miễn dịch cao, kéo dài. Hạt nano chitosan với những ñặc tính ưu việt như: khả
năng tương hợp sinh học, hỗ trợ ñiều hoà miễn dịch, ñược enzyme trong cơ thể
phân hủy Vì vậy trong y học, hạt nano chitosan ñược sử dụng phổ biến ñể
mang thuốc, protein, vacxin, kháng khuẩn, làm vector chuyển gen
Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi sử dụng hạt nano chitosan làm ñối tượng
nghiên cứu với tên ñề tài “Nghiên cứu hạt nano chitosan làm tá chất cho
vacxin cúm A/H1N1 và thử nghiệm ñáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng
(Mus musculus Swiss)”
Mục tiêu của ñề tài
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến khả
năng hấp phụ kháng nguyên cúm A/H1N1.
2. Đánh giá tính an toàn và ñáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt trắng của vacxin

cúm A/H1N1 có tá chất là nano chitosan.
3
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chitosan

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của nano chitosan
Chitosan là một biopolymer (polyglucosamine), là sản phẩm deacetyl của
chitin, một polysaccharide có trong thành phần cấu trúc của các loài giáp xác
như tôm, cua, côn trùng và vách tế bào nấm. Chitin có cấu tạo tương tự cellulose,
nhưng có sự khác biệt là ñơn vị cấu tạo nên chitin là N-acetyl-D-glucosamine,
các ñơn vị này nối với nhau bằng liên kết β-1-4-glycoside. Tính chất và hoạt tính
sinh học của chitin và chitosan phụ thuộc rất nhiều vào khối lượng phân tử (Mw)
và mức ñộ deacetyl hóa (DD: degree of deacetyllation). Mức ñộ deacetyl hóa
dùng ñể chỉ % số nhóm acetyl trong phân tử chitin, chitosan bị khử. Mức ñộ
deacetyl hóa tỉ lệ thuận với mật ñộ của nhóm NH
3
+
trong phân tử do ñó ảnh
hưởng tới tính chất ña ñiện và ñộ tan của chitin, chitosan. Mức ñộ deacetyl trung
bình của chitin nằm trong khoảng 10-15%. Có sản phẩm chitin deacetyl hóa một
4
phần (partially deacetyl chitin) có mức ñộ deacetyl hóa từ 30-40%. Trong khi ñó
chitosan phải có mức ñộ deacetyl hóa >50%. Nhờ ñó chitosan mới dễ tan trong
một số axit hữu cơ loãng như axit acetic, axit lactic, axit glutamic, axit
chlohydric. Khi hoà tan chitosan trong môi trường axit, nhóm amine của chuỗi
nhận proton và chuyển sang mang ñiện tích dương.
Khối lượng phân tử của chitin, chitosan có thể ñược xác ñịnh bằng HPLC.
Tuy nhiên phương pháp nhanh nhất và ñơn giản nhất là ño ñộ nhớt dựa vào các
hằng số và K trong phương trình Mark- Houwink:
MK.][

=
η
a
= 1.81x10
-3
M
0.93
Trong ñó:
η
là ñộ nhớt biểu kiến của chitin, M là khối lượng phân tử
Chitosan có trọng lượng phân tử khác nhau từ 50-2000kDa, ñộ nhớt khác
nhau (1% chitosan trong axit acetic 1% có ñộ nhớt <2000mPaS) và mức ñộ khử
acetyl khác nhau (từ 40-98%)
Chitosan có nguồn gốc tự nhiên, không ñộc, có khả năng phân hủy sinh học
(biodegradation), có tính tương hợp sinh học cao (biocompatible) nên có nhiều
nghiên cứu, ứng dụng trong sinh y học.
Chitosan có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y
dược, thực phẩm nhờ vào các ñặc tính như:
- Tính chất ña ñiện li mang ñiện tích dương (cationic polyelectrolyte) cho
phép gắn kết với các thành phần sinh học mang ñiện tích âm.
- Có khả năng phân huỷ sinh học bằng enzyme trong cơ thể.
- Có khả năng tương hợp sinh học với cơ quan, mô và tế bào ñộng, thực vật.
- Có khả năng kích thích quá trình làm lành viết thương và ñông máu.
- Có khả năng tương tác chuyên biệt với các receptor trên màng.
- Giảm chlolesterol do liên kết có chọn lọc với các axit béo.
5
- Không gây ñộc do các sản phẩm sau thuỷ phân ñều là các chất chuyển hoá
tự nhiên.
- Có tác dụng hỗ trợ trong ñiều hoà miễn dịch.
- Có thể sử dụng dưới nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, bột mịn, hạt,

màng, tấm xốp (scaffolds), bông, sợi và gel [3], [26].
1.2. Tổng quan về nano chitosan
Chitosan nanoparticles là các hạt chitosan có kích thước nanomet. Chitosan
nanoparticles do có kích thước siêu nhỏ nên dễ dàng ñi qua màng tế bào, có diện
tích bề mặt lớn và mang ñiện nên ñược ứng dụng nhiều trong sinh y học như
mang thuốc, mang vacxin, trong công nghệ sinh học ñược dùng làm vector
chuyển gen.
1.2.1 Các phương pháp tạo hạt nano chitosan
Hiện nay, có nhiều phương pháp tạo chitosan nanoparticles. Theo Sulnin
(2004) có 5 phương pháp chủ yếu ñể tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp
khâu mạch nhũ tương (emulsion cross linking), phương pháp tạo giọt
(coacervation) trong NaOH-methanol, phương pháp sấy phun (dry spraying),
phương pháp tạo gel ionic (ionic gel) trong tripolyphosphate (TPP) và phương
pháp rây (sieving method). Trong ñó phổ biến nhất là phương pháp tạo hạt gel
trong tripolyphosphate [29].
Quan Gan (2005) nghiên cứu các yếu tố ảnh huởng ñến kích thước hạt nano
chitosan như nồng ñộ chitosan, pH dung dịch, tỷ lệ chitosan: tripolyphosphate,
[25]. Anna Vila (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan
ñến kích thước hạt nano [34].
Ngoài ra, còn nhiều nghiên cứu khác của Ming Lang Tsai (2008), Yavuz
(2007), Jing Mou Ju (2008),

6
1.2.1.1. Phương pháp tạo hạt nano chitosan bằng liên kết cộng hoá trị
Ohya ñã nghiên cứu tạo hạt nano chitosan ñể nhốt thuốc chống ung thư 5-
FU bằng cách cho dung dich chitosan khâu mạch cộng hóa trị với
glutaraldehyde. Nhóm kép –CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –
NH
2
của chitosan ñể khâu mạch (cross – linking) tạo hạt nano chitosan. Phương

pháp này có ưu ñiểm là kích thước và tính chất hạt nano rất ổn ñịnh [14].
1.2.1.2. Phương pháp tạo gel ion
Phương pháp này dựa trên khả năng tạo gel ion giữa chitosan ñiện tích
dương và TPP, polyacrylic axit, polyaspartic, plasmid DNA (pDNA) mang ñiện
tích âm. Để tạo hạt nano chitosan – TPP : dung dich chitosan ñược hỗn hợp với
TPP sau ñó khuấy từ 10 – 60 phút sẽ thu ñược hạt nano chitosan. Có thể li tâm
15000 vòng/ phút trong 1 giờ ñể thu ñược hạt nano chitosan nanoparticles.
Quan Gan (2005) nghiên cứu tạo hạt chitosan nanoparticles trong TPP với
nồng ñộ chitosan khác nhau, khối lượng phân tử chitosan khác nhau và tỉ lệ
chitosan/TPP khác nhau. Kết quả cho thấy khối lượng phân tử và nồng ñộ
chitosan càng lớn thì kích thước hạt chitosan nanoparticles cáng lớn. Thí nghiệm
cho thấy tỉ lệ chitosan/TPP càng lớn thì kích thước hạt chitosan nanoparticles
càng lớn. pH cũng có những ảnh hưởng nhất ñịnh ñến kích thước hạt, pH thích
hợp nhất ñể tạo hạt là 5,5 [25].
7

Hình 1.2: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion.
1.2.1.3. Phương pháp tạo giọt coasecva ( phương pháp kết tủa )
Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung
dịch có pH kiềm tính. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt coasecva ngay khi
dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có thể là
NaOH, NaOH – Methanol ethanediamine. Dung dịch chitosan sẽ ñược một thiết
bị nén phun vào dung dịch kiềm ñể tạo hạt nano như hình .
Phương pháp này có thể ñược cải tiến hơn bằng cách nhỏ giọt dung dịch
sodium sulfate vào dung dịch chitosan (pH axit) trong ñiều kiện khuấy nhẹ có tác
ñộng của sóng siêu âm (ultrasonic). Hạt nano ñược thu bằng cách li tâm, sau ñó
tiếp tục bước làm cho cứng và bền hơn bằng cách khâu mạch với glutaraldehyde.
8

Hình 1.3: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp kết tủa.

1.2.1.4. Phương pháp sấy phun (Spray- drying)
Sấy phun là kĩ thuật thường ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm ñể tạo
bột, tạo hạt thực phẩm như sữa, tạo bột thuốc với tá dược. Kĩ thuật này dựa trên
nguyên tắc huyền phù ñược làm khô khi ñược phun trong dòng khí nóng.
Chitosan ñược hòa tan thành dung dịch, dược phẩm ñược hòa tan vào
dung dịch chitosan, sau ñó ñược bổ sung hoạt chất khâu mạch và ñược phun vào
dòng khí nóng như sơ ñồ hình 1.4 [25].
9


Hình 1.4: Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp sấy phun
1.2.1.5. Phương pháp tạo mixel ngược pha
Trong phương pháp này, các chất hoạt ñộng bề mặt ñược hòa tan trong
dung môi hữu cơ ñể tạo hệ mixel ngược pha. Sau ñó, dung dịch chitosan ñược
thêm vào và khuấy ñều ñể tránh bị ñục, thêm dung dịch chất khâu mạch. Tiếp tục
khuấy ñều qua ñêm. Sau ñó cho bay hơi dung môi hữu cơ và chất hoạt ñộng bề
mặt ñược kết tủa bằng muối, cuối cùng hỗn hợp ñược li tâm và thu ñược hạt
nano như trong hình 1.5[25].
10

Hình 1.5 : Sơ ñồ tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp mixel ngược pha
Ngoài ra hạt nano chitosan khi phối hợp với polyethylene glycon (PEG)
hoặc ñược phủ một lớp alginate sẽ tăng hiệu quả vacxin viêm gan B qua ñường
uống (Boges, 2007) [11]. Kích thước hạt nano nằm trong khoảng 100nm.
Sarmento (2006) cũng sử dụng phương pháp này ñể nhốt hormone insulin.
1.3. Một số ứng dụng của chitosan, nano chitosan trong y học
Chitosan với những ñặc tính ưu việt, là sản phẩm tự nhiên, không ñộc, có
khả năng phân hủy sinh học. Đồng thời Chitosan còn có các hoạt tính sinh học
cao như kích thích hệ thống miễn dịch của tế bào, giảm cholesterol trong máu,
ức chế khối u phát triển, kháng vi sinh vật Hayashi nghiên cứu sử dụng

chitosan khối lượng phân tử thấp ứng dụng ñiều trị béo phì và tiểu ñường typ 2.
[13]. Trong những năm gần ñây nhiều nghiên cứu chế tạo vật liệu chitosan
microparticles, nanoparticles, chitosan microspheres ñể làm tăng hoạt tính thuốc,
ly giải chậm thuốc, mang thuốc ñến tế bào ñích, tăng hoạt tính kháng ung thư,
11
tăng hoạt tính kháng khuẩn, làm vật liệu chuyển gen và làm tá chất vacxin tăng
kích thích miễn dịch.
1.3.1. Ứng dụng trong li giải chậm thuốc
Xinge Zhang (2008) nghiên cứu làm tăng khả năng hấp thụ insulin qua
niêm mạc mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-hạt nano chitosan, kích thước hạt
nano là 150-300 nm. Hiệu quả hấp thụ insulin qua niêm mạc mũi thỏ ở mẫu
PEG-hạt nano chitosan cao hơn so với PEG-chitosan là 30-40%. Kích thước hạt
nano càng nhỏ, diện tích bề mặt càng lớn và ñiện tích dương trên bề mặt càng
cao là nguyên nhân ảnh hưởng ñến khả năng hấp thu insulin vào máu qua niêm
mạc mũi [33].
Sedaghi (2008) nghiên cứu chế tạo trimethyl hạt nano chitosan làm vật liệu
ly giải chậm insulin. Kết quả cho thấy ñộng học ly giải của insulin nhốt trong
trimethyl hạt nano chitosan ổn ñịnh và kéo dài hơn [28].
1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn
Chitosan là một polycation (poly – NH
4
+
), tương tác với thành phần
polyanion trên vách tế bào vi sinh vật, dễ hấp thu trên bề mặt màng tế bào làm
rối loạn quá trình trao ñổi chất qua màng hoặc ñi vào trong tế bào chất liên kết
với DNA, ức chế quá trình phiên mã, sinh tổng hợp protein, ñó là cơ chế kháng
vi sinh vật của chitosan. Tuy nhiên, vật liệu hạt nano chitosan có diện tích tiếp
xúc và ñiện tích dương lớn hơn chitosan thông thường nên hiệu quả kháng khuẩn
cao hơn so với chitosan oligomer [26].
Lifeng Qi et al (2005) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan ñể tăng hoạt

tính kháng khuẩn. Hạt nano chitosan ñược chuẩn bị bằng phương pháp tạo gel
trong tripolyphosphate (TPP), kích thước hạt khoảng 30-50nm. Các thử nghiệm
trên 4 loại vi khuẩn E.coli, S. typhimurium, S. choleraesuis và S. aureus cho thấy
hoạt tính kháng khuẩn tăng lên nhiều lần so với chitosan polymer. MIC (nồng ñộ
tối thiểu ức chế) của hạt nano chitosan là 1/8-1/32 microgam/ml so với chitosan
12
polymer là 8-16 microgam/ml và kháng sinh doxycycline là 1-4 microgam/ml
[20].
Tikhonov (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của
chitosan khối lượng phân tử thấp (4,7kDa) và chitosan cải biến. Kết quả cho thấy
chitosan có khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn thấp. Ở nồng ñộ
1% chitosan (4,7kDa) tỉ lệ chết của E.coli là 91.6% [32].
Nguyễn Anh Dũng (2004) nghiên cứu khả năng kháng E.coli của chitosan,
chitosan oligomer và chitosan oligomer cải biến bằng cách gắn salicylic
aldehyde ñã làm gia tăng hoạt tính kháng khuẩn lên nhiều lần. Chỉ số MIC của
chitosan ñối với E.coli khoảng 250ppm, oligoglucosamine khoảng 80-100ppm
và salicyden oligoglucosamine (SO) chỉ còn 30-40ppm [2].
1.3.3.Hoạt tính kháng ung thư
Hạt nano chitosan ñang ñược nghiên cứu ñể chống ung thư hiệu quả hơn.
Mitra (2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thư doxorubicine làm giảm tác
dụng phụ của thuốc tăng hiệu quả ñiều trị ñể ức chế khối u trên chuột. Kết quả
cho thấy nếu tiêm doxorubicine ñộc lập thì khối u ở chuột vẫn tăng lên 900 mm
3

sau 50 ngày và chết, trong khi ñó ở thí nghiệm ly giải chậm doxorubicine trong
hạt nano chitosan kích thước khối u giảm chỉ còn 170 mm
3
và chuột vẫn sống
khi 90 ngày thí nghiệm [22].
Lifeng Qi (2004) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư trực tiếp của hạt nano

chitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và hoạt tính
cảm ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thư là sarcoma S180 và hepatoma
H22. Kết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượng tế bào ung thư với liều
uống 2.5 mg/kg hạt nano chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59% và liều
0.5mg/kg là 43-53%, trong khi ñó chitosan chỉ là 30% [20].
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy kích thước hạt nano càng nhỏ thì hiệu
quả kháng ung thư càng cao. Hoyoung (2008) nghiên cứu PEG-hạt nano
13
chitosan làm tá chất cho thuốc chống lại tế bào ñích ung thư. Kích thước hạt
nano khoảng 350 nm. Hiệu quả chống ung thư khi sử dụng hạt nano chitosan rất
cao trên tế bào gây ung thư phổi ở chuột A549 ñồng thời làm giảm ñộc tính của
thuốc chống ung thư [3].
1.3.4. Ứng dụng làm tá chất cho vacxin
Nhờ ñặc tính không ñộc, không gây phản ứng phụ, có khả năng kích thích
hệ thống miễn dịch của tế bào mà chitosan và ñặc biệt là hạt nano chitosan ñược
tập trung nghiên cứu làm tá chất cho vacxin. Shibata (1996) chứng minh các hạt
chitin và chitosan có khả năng cảm ứng tăng tổng hợp interferon và ñại thực bào.
Nhiều tác giả ñã khẳng ñịnh khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể
phụ thuộc rất nhiều vào mức ñộ deacetyl hóa, khối lượng phân tử và nhóm thế
trên chitin, chitosan [3].
Van der Lubben (2001) nghiên cứu sử dụng chitosan và dẫn xuất của nó
làm tá chất cho vacxin qua niêm mạc mũi. Nhờ có kích thước nanomet và tích
ñiện tích dương nên chitosan dễ dàng ñi qua tế bào biểu mô vào trong tế bào và
thải chậm vacxin ñể kích thích miễn dịch. Do có khả năng thải chậm (slow
release) nên ñáp ứng miễn dịch sẽ kéo dài và ổn ñịnh hơn [15].

Maletter (1984) ñã chứng minh trong invivo một số dẫn xuất của chitin có
khả năng tăng cường hoạt ñộng của hệ thống miễn dịch. Nghiên cứu cho thấy
14
chitin có mức ñộ deacetyl hóa 70% kích thích miễn dịch trung gian tế bào và

tăng cường hình thành kháng thể ñặc hệu ở các thí nghiệm trên chuột nhắt và
trên chuột lang [21].
Illum (2001) nghiên cứu cho thấy chitosan như là một tá chất mới cho
vacxin. Kết quả ñáp ứng miễn dịch ở lô thí nghiệm kháng nguyên cúm là rất
thấp, chỉ số IgG chỉ là 10
2
trong khi ở tá chất chitosan là 10
3
ở lần chủng thứ
nhất. Ở lần nhắc hai, ñối chứng antigen là 10
2
và tá chất chitosan là 10
5
[18].
Ana Vila (2004) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan làm tá chất cho
vacxin uốn ván qua niêm mạc mũi. Kích thước hạt nano là 350 nm, ñiện tích là
+40mV, có hiệu suất mang vacxin là 50-60%. Kháng thể IgG ở thí nghiệm sử
dụng hạt nano chitosan cao gấp 5 lần so với sử dụng kháng nguyên uốn ván tự
do sau 2 tuần, tăng gấp 15 lần sau 12 tuần và 25 lần sau 24 tuần. Kháng thể ñặc
hiệu ở thí nghiệm sử dụng hạt nano chitosan cao hơn so với ñối chứng gấp 2.5
lần và tăng lên theo thời gian từ 2-24 tuần [34].
Maryan Amadi (2007) nghiên cứu sử dụng Trimethyl hạt nano chitosan làm
tá chất cho vacxin cúm A/H3N2. Kết quả là các chỉ số miễn dịch HI, IgG ở thí
nghiệm Trimethyl hạt nano chitosanlà 10
3
và 10
5
cao hơn kháng nguyên trong
ñệm PBS là 0.8.10
2

và 10
3
, và chỉ số IgG trong thí nghiệm sử dụng Trimethyl hạt
nano chitosan cao hơn 10
2
lần so với tá chất là dung dịch Trimethylchitosan [10].
Olga Borges (2007) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan- alginate ñể bọc
vacxin viêm gan siêu vi B qua ñường uống. Đáp ứng miễn dịch trên chuột ở các
lô thí nghiệm sử dụng hạt nano chitosan- alginate thể hiện qua các chỉ tiêu IL2,
CD4, CD8, tế bào B cao hơn so với các nhóm ñối chứng [23].
Kapil Khatri (2007) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan làm tá chất hấp
phụ Plasmid DNA gây miễn dịch theo ñường niêm mạc mũi chống lại viêm gan
siêu vi B. Kết quả cho thấy vacxin pDNA hấp phụ hạt nano chitosan ñược bảo
vệ chống lại sự phân hủy của nuclease và tăng hiệu quả truyền nhiễm của nó.
15
Huyết thanh kháng HbsAg và kháng thể IgA trong các nhóm chuột sử dụng
vacxin có tá chất hạt nano chitosan cao hơn các nhóm chuột không có tá chất và
sử dụng tá chất nhôm [17].
Worawan Boonyo (2007) nghiên cứu sử dụng chiotosan với các khối lượng
phân tử khác nhau và triethyl chitosan chloric (TMC) làm tá chất cho ovalbumin
gây ñáp ứng miễn dịch trên chuột theo ñường mũi. Kết quả cho thấy ở ngày thứ
13 sau tiêm, chitosan với khối lượng phân tử lớn có khả năng tạo kháng thể IgG
cao hơn chitosan có khối lượng phân tử nhỏ. Mức ñộ DQ cũng ảnh hưởng ñến
khả năng ñáp ứng miễn dịch, TMC-40 (DQ=40%) tạo IgG cao hơn TMC-
20(DQ=20%) và TMC-60(DQ=60%) [37].
Peter G. Seferian (2000) nghiên cứu các công thức tá chất có chứa chitosan
cho vacxin tái tổ hợp. Kết quả cho thấy gây miễn dịch với các công thức tá chất
có chứa chitosan ( ZCP và ECC) kháng thể IgG tạo thành gấp 10
2
lần so với việc

tiêm chủng không sử dụng tá chất (trong dung dịch PBS). Đồng thời ñáp ứng
miễn dịch kéo dài tới 181 ngày [24].
S. Rajesh kumar (2007) nghiên cứu hạt nano chitosan mang vacxin DNA
theo ñường uống chống lại vi khuẩn V. anguillarum ứng dụng trong ngành nuôi
trồng thủy sản. Kết quả cho thấy sau khi sử dụng vacxin bao bọc bằng hạt
chitosan cho cá ăn thì ở nhóm này khi thử thách với vi khuẩn V. anguillarum tỉ
lệ sống là 46% [30].
Lê Văn Hiệp, Nguyễn Anh Dũng (2008) nghiên cứu sử dụng chitosan
oligomer (dp=8-16) làm tá chất cho vacxin cúm A/H5N1 kết quả cho thấy rằng
chitosan oligomer ñã kích thích ñáp ứng miễn dịch sớm và tăng cường kháng thể
ñặc hiệu cúm A/H5N1 [19].
Hiện nay, trên thế giới cũng như Việt Nam chưa có các nghiên cứu sử dụng
hạt nano chitosan làm tá chất cho kháng nguyên cúm A/ H1N1.
1.4. Virus cúm và vacxin [1],[6],[8],[43],[7]