Phương pháp phân biệt giữa salmonella có khả năng gây bệnh với salmonella lành tính

1


Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Theo dõi và tổng kết trong nhiều năm các nhà khoa học trên thế giới đều xác
định nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm trong ăn uống là do nhiễm vi khuẩn
gây bệnh trong thực phẩm, như vi khuẩn gây bệnh lao, sốt thương hàn và dịch tả… Ở
Canada hàng năm có khoảng trên 2 triệu người bị ngộ độc do thức ăn, nếu tính trung
bình theo dân số thì cứ 11 người có 1 người mắc bệnh. Ở Mỹ có khoảng 13 triệu người
ngộ độc thức ăn trong năm và cứ 18 người có 1 người mắc bệnh do thực phẩm, trong
đó 85% số ca ngộ độc thức ăn là do nguyên nhân vi sinh. [16]
Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vẫn ngày càng gia tăng ở nhiều nước, trong đó
Salmonella là tác nhân đứng hàng thứ hai chỉ sau Campylobacter. Do đó, các quy định
về an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam và hầu hết các nước trên thế giới đều
không cho phép có sự hiện diện bất kỳ chủng Salmonella nào có mặt trong thực phẩm
mà không phân biệt chủng đó độc lực hay không đối với con người. [13, 14]
Đến nay có khoảng 2500 kiểu huyết thanh của Salmonella đã được xác định
nhưng chỉ một số ít có khả năng gây bệnh cho người. Thực vậy, Salmonella là vi
khuẩn phân bố rất rộng trong tự nhiên. Chúng có khả năng nhiễm vào bất cứ công
đoạn nào của quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm, nhất là thực phẩm tươi sống.
Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy không phải tất cả các dòng Salmonella nhiễm
trong thực phẩm đều có khả năng gây nguy hiểm cho con người. Ngược lại chỉ có một
tỉ lệ rất ít các Salmonella trong thực phẩm có khả năng gây ngộ độc, các dòng này tập
trung chủ yếu trong các loài phụ S. enterica I. Nhưng các phương pháp để phân tích
Salmonella trong thực phẩm hiện nay chỉ xác định đến giống không phân biệt loài hay
kiểu huyết thanh đã tạo ra một hàng rào cản thương mại cho các nhà sản xuất, kinh
doanh thực phẩm và làm hạn chế việc trao đổi thực phẩm giữa các quốc gia và khu
vực.
Tuy nhiên, để phân biệt Salmonella có khả năng gây bệnh với các Salmonella

khác là một việc làm khó khăn, cho đến nay vẫn chưa có một phương pháp hay chuẩn
mực nào để phân biệt các nhóm này với nhau. Hướng đến mục tiêu nghiên cứu tìm ra
phương pháp phân biệt giữa Salmonella có khả năng gây bệnh với Salmonella lành
tính, trong khóa luận này tập trung vào nội dung khảo sát, đánh giá tỉ lệ lây nhiễm

2


tương đối giữa các loài phụ và kiểu huyết thanh của Salmonella nhiễm trong thực
phẩm.
1.2 Mục đích
Nhằm khảo sát thành phần loài phụ và thành phần kiểu huyết thanh của các
chủng Salmonella nhiễm trong các nhóm thực phẩm như thịt gia súc, thịt gia cầm,
trứng, thủy hải sản và các loại rau.
1.3 Nội dung
Khảo sát tỉ lệ hiện diện các chủng Salmonella trên các nhóm thực phẩm và tỉ lệ
xuất hiện tương đối của Salmonella enterica I và Salmonella spp. trong thực phẩm
bằng phương pháp nuôi cấy và phân lập truyền thống.
Xác định các thành phần loài phụ của Salmonella phân bố trong các nhóm thực
phẩm.
Xác định thành phần kiểu huyết thanh của Salmonella trong các nhóm thực
phẩm.
Đề tài có ý nghĩa đóng góp một phần nhỏ vào việc giúp các nhà khoa học và
các cơ quan quản lý thực phẩm đánh giá về vấn đề chất lượng thực phẩm trên địa bàn
thành phố Hồ Chí Minh và nhìn nhận khách quan về mối nguy hiểm thật sự của
Salmonella.
Do thời gian và kinh phí thực hiện đề tài có hạn nên đây chỉ là những đánh giá
khởi đầu tỉ lệ nhiễm và định ra các kiểu huyết thanh của các loài phụ Salmonella giúp
ngăn ngừa một cách hiệu quả ngộ độc thực phẩm. Các kết quả thu được cũng là thành
quả bước đầu tiếp cận với công tác nghiên cứu trong phòng thí nghiệm nên nội dung

chắc chắn còn rất nhiều thiếu sót do đó khóa luận không thể tránh khỏi những khiếm
khuyết. Rất mong nhận được sự nhận xét, đánh giá quý báu và sự đóng góp chân thành
của quý thầy cô, các anh chị và các bạn để khóa luận được xúc tích hơn, hoàn thiện
hơn.






3


Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đại cƣơng về Salmonella
2.1.1 Giới thiệu chung về Salmonella
Cho đến nay đã phát hiện có khoảng 500 loài vi sinh vật khác nhau có thể gây
bệnh thương hàn và phó thương hàn cho người và gia súc. Salmonella có thể gây nhiều
bệnh truyền nhiễm cho động vật như phó thương hàn lợn, bệnh sẩy thai cừu và ngựa,
bệnh bạch lỵ gà, bệnh thương hàn chuột, bệnh viêm ruột bò. Những bệnh kể trên do
Salmonella gây ra người ta gọi là bệnh truyền nhiễm nguyên phát, ngoài ra có thể phát
hiện được Salmonella trong chất bài tiết của động vật lành. [8, 11, 16]
Những Salmonella thường gây ngộ độc thường gặp là S. typhimurium, S.
choleraesuis và S. enteritidis. [12, 22]. Do đó việc chuẩn đoán chính xác các loại trực
khuẩn này ở động vật có một ý nghĩa rất quan trọng về mặt bảo vệ sức khỏe, vệ sinh
công cộng, dự phòng bệnh truyền nhiễm. [11, 16]
2.1.1.1 Đặc điểm hình thái
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Salmonelleae và giống
Salmonella. Salmonella là vi khuẩn hình gậy, mập, ngắn, trực khuẩn gram âm, hai đầu
hơi tròn, kích thước 0,4 – 0,6 x 1 – 3 m, sống kị khí tùy nghi, không hình thành giáp

mô và nha bào, có khả năng di động nhờ lông mao có khoảng 7 đến 12 lông mao
chung quanh thân, trừ S. gallinarum và S. pullorum gây bệnh cho gia cầm. Salmonella
dễ dàng nuôi cấy ở 37
o
C trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển các
khuẩn lạc có đường kính 2 – 4 mm, trơn, sáng và đồng nhất. [1, 11, 13]








Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella

4


2.1.1.2 Phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh
Hiện nay theo phân loại của hệ thống Viện Pasteur thế giới, Trung tâm Kiểm
soát và ngăn ngừa dịch bệnh của Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center),
giống Salmonella được chia làm hai loài: S. enterica và S. bongori. Trong đó S.
bongori gồm tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V, và S. enterica
được chia làm 6 loài phụ đánh số: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI (Bảng 2.1). Các loài và loài
phụ này có thể phân biệt được bằng phản ứng sinh hóa. Trong mỗi loài phụ có nhiều
kiểu huyết thanh. [7, 18, 29]
Cho đến nay đã xác định được trên 2463 kiểu huyết thanh thuộc giống
Salmonella. Theo hệ thống của Kauffman White, các kiểu huyết thanh này được chia
dựa trên kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H và kháng nguyên bề mặt Vi.

Phần lớn các kiểu huyết thanh được đặt tên theo công thức kháng nguyên, một số khác
được đặt tên riêng như Enteritidis (S. enteritidis), Typhi (S. typhi), Paratyphi (S.
paratyphi), Typhimurium (S. typhimurium)…[1, 15, 21, 32]
Bảng 2.1 Phân loại Salmonella theo loài và theo kiểu huyết thanh [28 ]
Loài
Loài phụ
Số kiểu huyết thanh
S. enterica





S. bongori
S. enterica enterica (I)
S. enterica salamae (II)
S. enterica arizonae (IIIa)
S. enterica diarizonae (IIIb)
S. enterica houtenae (IV)
S. enterica indica (VI)
(V)
1454
489
94
324
70
12
20
Loài phụ S. enterica I hầu như chiếm đa số (99%), nó được tìm thấy ở hầu hết
các động vật máu nóng. Loài phụ này chiếm 59% (1454/2463) trong tổng số kiểu

huyết thanh của Salmonella có khả năng xâm nhập và gây nhiễm cao cho người và
động vật máu nóng, trong khi đó các loài phụ khác hầu như ở động vật máu lạnh và
môi trường. Như vậy có tới 41% (1009/2463) số kiểu huyết thanh không được phân
lập từ bệnh phẩm của người, đây là một tỉ lệ rất có ý nghĩa để các cơ quan chức năng

5


xem xét và sữa đổi các tiêu chuẩn hiện hành về Salmonella trong thực phẩm tạo điều
kiện thuận lợi cho các nhà sản xuất tiêu thụ thực phẩm. [3, 28, 33]
2.1.1.3 Sự phân bố của Salmonella
Salmonella phân bố rộng rãi trong tự nhiên và thường xuyên phân lập được từ
ống tiêu hóa của động vật và người bị nhiễm trùng. Ngoài ra, chúng cũng được phân
lập từ đất, không khí, nước sông hồ, nước biển và trong thực phẩm. [13, 15]
2.1.1.4 Đặc điểm nuôi cấy
Salmonella có thể phát triển ở nhiệt độ 5
o
C – 45
o
C, điều kiện tối thích cho sự
sinh trưởng của chúng là 37
o
C và ở điều kiện cực đoan như nhiệt độ quá thấp hoặc quá
cao Salmonella mất khả năng di động. Ở dưới 5
o
C chúng ngừng phát triển, ở 60
o
C chỉ
sống được trong khoảng 1 giờ, ở 70
o

C bị chết sau 10 phút, ở độ sôi của nước bị chết
tức thì. [10]
pH thích hợp cho sự tăng trưởng nằm trong khoảng trung tính là 6,8 – 7,2.
Khoảng pH dành cho sự phát triển của vi khuẩn là 4,1 – 9 trong thực phẩm acid thấp,
nhưng trong rau cải vi khuẩn không phát triển được ở pH từ 5,5 – 5,7. Độ ẩm dưới
0,94% hay nồng độ muối vượt quá 8% có thể ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của
Salmonella. [17, 25]
2.1.1.5 Đặc điểm sinh hóa
Salmonella có những đặc tính sinh hóa chủ yếu mà dựa vào đó người ta có thể
định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác. Các chủng Salmonella sinh
acid do lên men glucose, mannitol, dulcitol nhưng không lên men lactose (trừ S.
arizona) và sucrose, không có khả năng tách amine từ trytophan. Chúng không sinh
indol hoặc acetoin và phân giải urea. Phần lớn các chủng sinh hydrogen sulfide (H
2
S)
và tách carboxyl (de-carboxylate) từ ornithine và lysine. Chúng kém chịu nhiệt nhưng
chịu đuợc một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfite, selenite, sodium
tetrathionate. Những chất này được dùng để chọn lọc chúng từ mẫu thực phẩm và
nước. [1, 21].
2.1.1.6 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
a. Cấu trúc kháng nguyên
Khi nghiên cứu về huyết thanh học của vi khuẩn Salmonella, người ta đặc biệt
chú ý đến đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn này. Salmonella có 3 loại kháng nguyên

6


là kháng nguyên O (kháng nguyên thân – somatic), kháng nguyên H (kháng nguyên
tiêm mao – flagella) và kháng nguyên Vi (kháng nguyên bề mặt – capsule). [11, 31,
37]

Kháng nguyên O: có hơn 60 loại được ký hiệu bằng số 1, 2, …12, được bao bọc
bởi bề mặt của vi khuẩn tạo thành một lớp không đều. Chia kháng nguyên O thành 34
nhóm A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, L, M, N, O, P, Q,
R, S, T,U, V, W, X, Y, Z, 49, 50. Mỗi nhóm huyết thanh gồm một số loại vi khuẩn có
kháng nguyên O cấu tạo bởi một thành phần nhất định. Ví dụ trong nhóm A, S.
paratyphi A, kháng nguyên O gồm 3 phần (1), 2, 12 trong đó thành phần 1 khi có khi
không, thành phần 2 là thành phần đặc biệt dùng để phân biệt về mặt huyết thanh học
với các nhóm khác. Kháng nguyên O gồm chuỗi lipoplysaccharide-protein trên bề mặt
tế bào. Loại kháng nguyên này được coi là nội độc tố của vi khuẩn, nó có đặc tính ổn
định đối với nhiệt 100
o
C trong 2 giờ, alcol. Ngoài ra kháng nguyên O còn có tác dụng
ngăn cản bạch huyết cầu đi qua mao mạch làm thay đổi tạm thời sự thẩm thấu của mao
quản. [3, 7, 11]
Kháng nguyên H: có bản chất là protein, rất kém bền vững so với kháng nguyên
O. Là loại protein không bền nhiệt, bị diệt ở 70
o
C hay dưới tác dụng của cồn, các
enzyme tiêu hủy protein, nhưng chịu được formol. Kháng nguyên H gắn liền với roi
của vi khuẩn nên kháng nguyên này chỉ hiện diện trên các chủng có tiêm mao. Kháng
nguyên tiêm mao H có thành phần khác nhau tùy vào kiểu huyết thanh. Kháng nguyên
H có chứa 2 pha:
Pha 1 là pha đặc hiệu do chất kháng nguyên đặc hiệu của loài vi khuẩn tạo
thành, bao gồm 28 loại kháng nguyên tiêm mao, biểu thị bằng chữ La tinh: a, b, c, g,
m…[11, 31]
Pha 2 là pha không đặc hiệu: nhiều loại Salmonella chứa pha này, gồm hơn 6
loại biểu thị bằng số Ả rập 1, 2, 3, 4, 5, 6 hay chữ La tinh e, n, x… Đến nay người ta
có khuynh hướng không đặt tên các chủng Salmonella nữa, mà chỉ biểu thị bằng công
thức kháng nguyên O và kháng nguyên H, ví dụ S. 6, 8: r – 1, 5. [11, 31]
Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn bởi các roi của chúng. Sự

ngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có
khả năng cắt roi của vi khuẩn.

7


Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, nó đặc
hiệu cho các loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp
huyết thanh. [7]
Kháng nguyên Vi: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu
hiện độc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp
với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ. Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O
khi nó phát triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn và HCl.
Kháng nguyên này chỉ được xác định trên 3 kiểu huyết thanh: S. typhi, S.
paratyphi và S. dublin. Kháng nguyên Vi của một số chủng S. typhi đặc biệt có sức đề
kháng tốt đối với nhiệt độ cao hơn các chủng Salmonella thông thường khác (Heyns và
ctv 1959; Euzeby, 1997) [18]. Khi kháng nguyên Vi bị mất thì ngay lập tức S. typhi
cũng chết.







Hình 2.2 Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella
Tất cả 3 loại kháng nguyên này đều được sử dụng để chuẩn đoán bệnh thương
hàn trong phòng xét nghiệm cận lâm sàng.
Kháng nguyên O biểu hiện chủ yếu lúc bệnh mới khởi phát.
Kháng nguyên H biểu hiện mạnh lúc bệnh sắp kết thúc.

Kháng nguyên Vi biểu hiện mạnh ở những người mang vi khuẩn mãn tính.




Pili

8


Bảng 2.2 Cấu trúc kháng nguyên của một số loài Salmonella [19, 21]
Nhóm vi
khuẩn
Loại vi khuẩn
Kháng nguyên thân O
Kháng nguyên tiêm mao H
Pha 1
Pha 2
A …
B …


C1 . . .

D . . .



S. paratyphi A
S. typhimurium

S. abortivo equina
S. choleraesuis
S. typhi suis
S. typhosa
S. enteritidis
S. dublin
S. gallinarum
S. pullorum
S. typhi
1, 2, 12
1, 4, (5), 12
1, 4, 5, 12
6, 7
6, 7
6, 7
1, 9, 12, Vi
1, 9, 12
1, 9, 12
1, 9, 12
9, 12, (Vi)
a
i
. . . . .
(c)
c
d
g, m
g, p
-
. . . . .

d
(1, 5)
1, 2
e, n, x
1, 5
1, 5
. . . . .
(1, 7)
. . . . .
-
. . . . .
1, 2
( ): có thể biến đổi, -: hiện diện từ sự biến đổi của trực khuẩn thể
b. Độc tố đƣờng ruột
Salmonella sản sinh hai loại nội độc tố là độc tố ruột gây xung huyết, mụn loét
và độc tố thần kinh gây ra các triệu chứng thần kinh. [5, 17]
2.1.1.7 Sức đề kháng của vi khuẩn
Salmonella có sức đề kháng tốt, có thể sống ngoài cơ thể trong thời gian lâu
Trong đất hoặc nước có thể tồn tại từ 1 – 5 tuần, trong phân 1 – 2 tháng, trong
nước đá hay thực phẩm đông lạnh có thể tồn tại 2 – 3 tháng. [11]
Ở môi trường bên ngoài vi khuẩn Salmonella sống được khá lâu, trong ruột
bánh mì sống được 25 đến 30 ngày, trong bơ từ 3 – 7 ngày, ở pho mát 36 ngày, ở mỡ
đến 3 tháng, trong thực phẩm bảo quản lạnh ở nhiệt độ - 18
o
C chúng có thể sống được
vài tháng. [10]
Tuy nhiên lại khá mẫn cảm với các thuốc sát trùng như: phenol 5%, cloramin
1%, clorua thủy ngân 0,2% chúng bị chết sau vài phút. [10]

9


2.1.2 Các đặc điểm gây bệnh của Salmonella
2.1.2.1 Điều kiện gây bệnh
Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Salmonella đều bị
ngộ độc. Bởi vì Salmonella gây ngộ độc cho người phải có các điều kiện:
Thức ăn phải nhiễm một lượng lớn vi khuẩn sống, khoảng 10
6
– 10
7
để có thể
vượt qua được tính acid cao của dạ dày và cạnh tranh với quần thể vi sinh vật tự nhiên
trong ruột mới có khả năng biệu hiện bệnh. Còn nếu lượng tế bào không đủ lớn thì sẽ
bị cơ thể thải ra ngoài và không gây biểu hiện bệnh. [15, 17]
Vi khuẩn trong thức ăn đi vào cơ thể sẽ phát triển và khi chết sẽ tiết ra một
lượng lớn độc tố. [17, 30]
Tùy thuộc vào sức chống đỡ của cơ thể chủ. Trẻ em và người già, người ốm
yếu, chức năng gan suy yếu và các bệnh về máu đều làm giảm sức đề kháng bệnh. [
17, 30]
Chủng Salmonella: không phải mọi chủng Salmonella nhiễm vào đều có biểu
hiện bệnh mà chỉ một số như: S. typhi, S. paratyphi, S. enteritidis… mới gây bệnh cho
người, biểu hiện của bệnh cũng khác nhau tùy từng kiểu huyết thanh. [15, 26, 28]
2.1.2.2 Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, sau đó theo hệ thống bạch huyết và tuần
hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết. Do đó trong thời kỳ đầu, lấy máu người
bệnh truyền cấy sẽ phát hiện vi khuẩn. Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm
mạc ruột, tiết ra độc tố. Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu. Ngoài ra, vi khuẩn
trong hệ tuần hoàn cũng tiết ra nội độc tố. Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần
kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền của thành mao quản và giảm chức

năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể. Như vậy, Salmonella gây bệnh là do độc tố ruột
(enterotoxin) và có lẽ còn do cytotoxin và neurotoxin. [17]
2.1.2.3 Các kiểu bệnh chính do vi khuẩn Salmonella
Các kiểu huyết thanh Salmonella thường có biểu hiện bệnh với những triệu
chứng lâm sàng không giống nhau được tóm tắt ở Hình 2.3.
Viêm ruột: S. enteritidis và S. typhimurium thường gây bệnh viêm dạ dày, viêm
ruột, bệnh gây ra do tình trạng vệ sinh thực phẩm kém. Biểu hiện bệnh đặc trưng là
buồn nôn, đau bụng và tiêu chảy. Vi khuẩn không vào máu. Bệnh thường khu trú ở
ruột. [1, 2, 10, 34]

10


Nhiễm trùng máu: S. choleraesuis là nguyên nhân gây nhiễm trùng máu, vi
khuẩn vào cơ thể bằng đường miệng, xâm nhập vào máu gây bệnh, khu trú ở phổi,
xương, màng não. Ví dụ như xương, gây biến chứng là bệnh viêm khớp kinh niên, xảy
ra vào 3 – 4 tuần sau khi bắt đầu phát bệnh mạnh mẽ. [1, 2, 6]
Các bệnh gây ngộ độc bằng độc tố của S. enteritidis, S. typhimurium, S.
choleraesuis không sốt, gây ói mửa. Cơ thể trở lại bình thường khi được điều trị,
không gây thành dịch.[2, 34]
Bệnh thương hàn: S. typhi gây ra bệnh sốt thương hàn, S. paratyphi A, S.
paratyphi B (S. schottmuleri) gây bệnh phó thương hàn. Triệu chứng bệnh cũng giống
như sốt thương hàn, nhưng ở mức độ nhẹ hơn. Bệnh phát triển thành dịch và người
bệnh nằm viện lâu. [2, 6, 18].
Hình 2.3 Các chủng Salmonella và các biểu hiện bệnh thƣờng gặp
2.1.2.4 Nguồn lây nhiễm
Thực phẩm bị nhiễm bệnh là nguồn gây bệnh dễ dàng và nhanh nhất do vi
khuẩn có thể phát triển nhanh trong thực phẩm, nhất là thực phẩm chưa nấu chín, rau
tươi, quả, rau salát, bánh bao, bánh rán, sữa chưa thanh trùng, nhuyễn thể, tôm, cua
sống trong khu vực có nguồn nước thải ô nhiễm cao do nguồn phân người và động vật.

Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt,
trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy hải sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm
này thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. [13, 15, 16]

Enterobacteriacea
e
Salmonella
S. choleraesuis
S. enteritidis
S. typhimurium
S. paratyphi A, B, C
S. typhi
Nhiễm trùng máu
Viêm dạ dày
Phó thương hàn
Thương hàn

11


2.1.2.5 Triệu chứng gây bệnh
Triệu chứng bệnh do Salmonella biểu hiện phụ thuộc vào số lượng và tỉ lệ vi
khuẩn nhiễm vào thực phẩm. Thời gian ủ bệnh khoảng 12 – 24 giờ, có khi vài giờ
nhưng cũng có khi vài ngày. Các dấu hiệu đầu tiên là bệnh nhân thấy nhức đầu, chán
ăn, mặt tái nhạt, toát mồ hôi, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy. Thân nhiệt tăng lên 38 –
40
o
C trong vòng 2 – 4 ngày sau khi phát bệnh và tùy thuộc mức độ nặng nhẹ mà kéo
dài 3 – 7 ngày. Bệnh nặng gây ra viêm dạ dày , ruột. Vi khuẩn tồn tại trong ống tiêu
hóa từ 6 – 8 tháng và tiếp tục bài thải ra môi trường bên ngoài. Vi khuẩn thải giảm

50% ở tuần thứ hai và còn 15% vào tuần thứ 4. [17]
2.1.2.6 Phòng ngừa
Đối với gia súc, phải nuôi dưỡng tốt, thú được kiểm tra tình trạng sức khỏe
trước khi giết, và tách phủ tạng trắng cẩn thận để tránh vấy nhiễm cho các phần khác.
Đối với thực phẩm, phải tránh sự vấy nhiễm Salmonella từ người và động vật bị
bệnh thương hàn, nước, côn trùng, động vật mang trùng bị nhiễm bệnh. Tuân thủ triệt
để quy trình vệ sinh thực phẩm và cải thiện vệ sinh môi trường trong quá trình sản
xuất. Xử lý nhiệt độ hoặc các phương pháp khác để diệt vi khuẩn như nấu nướng kỹ
hoặc thanh trùng pasteur. Ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn trong thực phẩm bằng
cách bảo quản đông lạnh thích hợp hoặc các phương pháp khác.
Đối với công nghiệp thực phẩm và thương nghiệp: áp dụng quy chế vệ sinh
thực phẩm trong sản xuất, bảo quản, vận chuyển, phân phối và phục vụ người tiêu thụ.
Định kỳ khám sức khỏe cho người làm công tác tiếp xúc với thức ăn, phát hiện kịp
thời những người lành mang vi khuẩn.
2.2 Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm đối với Salmonella
2.2.1 Salmonella trong thực phẩm
Thực phẩm có giá trị dinh dưỡng càng cao càng dễ bị nhiễm vi sinh vật phân
giải. Đồng thời với sự phân giải thực phẩm do Salmonella bao giờ cũng kèm theo sự
xuất hiện các sản phẩm gây ngộ độc cho người sử dụng.
Thực phẩm gây ngộ độc thường là thức ăn có nguồn gốc động vật như thịt gia
súc gia cầm. Thịt là nguyên nhân gây ngộ độc chiếm 68% ở Anh và 88% ở Pháp.
Ngoài ra có thể ngộ độc do ăn trứng, cá, sữa nhưng tỉ lệ ít hơn nhiều. Thực phẩm bị

12


nhiễm Salmonella thường không làm thay đổi tính chất lý hóa và trạng thái cảm quan
của thực phẩm, vì thế rất khó bị phát hiện. Nhìn chung, thực phẩm gây ngộ độc thường
có độ ẩm cao, pH không acid, đặc biệt là thức ăn đã nấu chín dùng làm thức ăn nguội
như món đông, patê, xúc xích, dồi tiết thường là nguyên nhân của những vụ ngộ độc

thức ăn do Salmonella. [25, 36]
Ngoài ra, hoa quả và các loại rau ăn sống mặc dù có rửa sạch trước khi ăn
nhưng không thể hết nguy cơ nhiễm Salmonella do chúng có thể phát triển thành số
lượng lớn hơn nhiều nếu không qua chế biến, nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng phân
bón hữu cơ cho rau quả và sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm. [16]
2.2.2 Tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm
Theo CDC, mỗi năm nước Mỹ có khoảng 40 000 người là nạn nhân của vi
khuẩn Salmonella, tuy nhiên con số này có thể còn cao hơn 30 lần. Số người tử vong
vì nhiễm Salmonella hằng năm vào khoảng 600 người. Hầu hết số người bị vi khuẩn
này tấn công đều có biểu hiện tiêu chảy, sốt và chuột rút ở bụng. Bệnh kéo dài 4 – 7
ngày.[23]
Ở Hà Lan, từ năm 1996 đến năm 2001, có 13 970 trường hợp bị ngộ độc do
Salmonella, trong đó S. enteritidis chiếm tới 43,6%, S. typhimurium chiếm 32%, S.
typhi chiếm 0,8%. Ở các loài động vật được dùng làm thực phẩm thấy tỉ lệ nhiễm S.
typhimurium cũng khá cao như ở bò là 32,9%, lợn chiếm 66,4%, riêng gia cầm chỉ có
5,3% nhưng có tỉ lệ nhiễm S. enteritidis tới 20,3%. [27]
Ở Việt Nam, theo thống kê năm 2001 của Bộ Y tế thì trong quý III có 1684
trường hợp mắc bệnh thương hàn làm chết người.
2.2.3 Các chỉ tiêu về Salmonella trong thực phẩm
Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các
nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm. Vì
vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu
thực phẩm nhất định. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan
chức năng.
Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế
4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml
đối với tất cả các loại thực phẩm. Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT

13

của Bộ Y tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc
phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm như Bảng 2.3. Ủy Ban Châu Âu quy
định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào.
Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những
bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là
thử nghiệm huyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả. Hiện nay đã có
nhiều nỗ lực để rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như
thử nghiệm ELISA, và thử nghiệm DNA. Việc khẳng định kết quả âm tính trong vòng
48 giờ đã là chuyện bình thường. Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần
tiến hành các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella. [1]
Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc
biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella.
Bảng 2.3 Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại
thực phẩm theo Thông tƣ 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế
Nhóm thực phẩm
Phƣơng pháp kiểm tra
Thịt và các cơ quan nội tạng dùng làm thực phẩm
muối, sấy khô, hun khói
TCVN 5153:90
Sữa và kem chưa cô đặc, chưa pha thêm đường
hoặc chất ngọt khác
TCVN 6402:98
Sữa nước tách bơ, sữa chua và sữa kem khác để lên
men hoặc acid hóa
TCVN 6402:98
Xúc xích và các sản phẩm tương tự làm từ thịt, cá
làm từ bộ phận nội tạng hoặc tiết động vật; các chế
phẩm thức ăn từ các sản phẩm đó
TCVN 5153:90

Điều đáng lưu ý là chỉ tiêu Salmonella không phân biệt chủng có gây bệnh hay
không. Trong thực tế các phòng phân tích vi sinh thực phẩm chỉ thực hiện các xét
nghiệm để phát hiện Salmonella spp., không làm xét nghiệm để phân biệt loài hay định
danh chủng gây bệnh. Đây là một rào cản lớn cho các nhà sản xuất và xuất nhập khẩu
thực phẩm.


14



2.3 Phát hiện Salmonella bằng phƣơng pháp nuôi cấy
Đây là phương pháp định tính và kết quả được báo cáo là có hay không phát
hiện Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Do quy định không cho phép có
mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện, cho nên mẫu lấy tối thiểu phải 25 g và
quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng sinh để đạt
hiệu quả cao. Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng
nhỏ, bị tổn thương nặng qua quá trình bảo quản chế biến và sự tồn tại một số lượng lớn
các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay
ức chế sự phát triển của Salmonella. [5, 9,15]
Để phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh
chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm
sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp.
2.3.1 Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment)
Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với
mẫu kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm. Người ta thường sử dụng môi trường
tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu
tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiện diện
trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm. Ví dụ:
nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi trường tiền tăng sinh được

khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc
họ Enterobacteriaceae; riêng FDA của Mỹ thì thường sử dụng Lactose broth cho một
số nhóm thực phẩm. [4, 13]
Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh
phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuy nhiên
tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi. [9]
2.3.2 Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment)
Giai đoạn này làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng
cách ức chế hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo
thuận lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập.

15


Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng là
Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT), Selenite
Cystein Broth (SC) [15, 24]…Thông thường môi trường TT được dùng để phân tích
các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các mẫu có mật độ
nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại thực phẩm khác. Một vài
nghiên cứu gần đây của AOAC (Association of Official Analytical Communities -
Hiệp hội các nhà phân tích của Mỹ) cho rằng mặc dù môi trường Selenite Cystein
Broth có chứa selenite ức chế mạnh các vi khuẩn khác ngoại trừ Salmonella nhưng
muối sodium biselenite có thể gây ưng thư khi tiếp xúc với cơ thể người nên hạn chế
sử dụng và thấy rằng môi trường RV có thể thay thế cho các loại môi trường trên để
phân tích mẫu. Canh RV có tác dụng ức chế vi khuẩn khác nhờ vào MgCl
2
bằng cách
tác động lên thành tế bào vi khuẩn và nhờ vào màu xanh malachite ức chế các vi khuẩn
Gram dương [14].
Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi trường tối ưu

chung cho tất cả các dòng Salmonella. Mỗi loại môi trường tăng sinh chọn lọc được
thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của Salmonella, một số dòng
Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được
trong môi trường khác. Ví dụ: S. typhi không phát triển được trong môi trường RV và
TT; S. dublin không phát triển được trong môi trường RV. Ngoài ra, mỗi môi trường
chọn lọc được ủ ở một nhiệt nuôi cấy khác nhau như môi trường RV được ủ ở 42
o
C,
môi trường TT và SC được ủ ở 37
o
C trong 22 – 24 giờ. [5, 15, 24]
Ngày nay, các yêu cầu về vệ sinh thực phẩm đều khuyếch khích các phòng thí
nghiệm sử dụng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc Salmonella để tăng
cường khả năng phát hiện tất cả các serotype Salmonella trong mẫu. [19, 22]
2.3.3 Giai đoạn phân lập (isolation)
Đây là bước tách biệt Salmonella trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng.
Một số môi trường phân lập như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth
Suffite Agar (BSA), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS),
Hektoen Entric Agar (HE)…Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình
thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. [8, 15, 16, 24]

16


Một số đặc điểm chính của các môi trường trên là với sự hiện diện của nấm
men, đường, peptone tạo thuận lợi cho sự tăng trưởng Salmonella và Shigella yếu ớt.
Sự sản sinh ra H
2
S cũng có thể xảy ra nhờ sự hiện diện của sắt thiosufate và sắt citrate
đã thể hiện bởi những khuẩn lạc có tâm đen do sự tạo nên sulfua sắt. Trên các môi

trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu khuẩn lạc đặc trưng khác nhau.
Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng tròn, trong suốt, có hay không có
tâm đen. Một số dòng Salmonella có khả năng sinh H
2
S, trừ S. typhi thì khuẩn lạc
trong suốt và không có tâm đen. [19, 20]
Trên môi trường BSA: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay đen, có hay
không có ánh kim tím trên bề mặt khuẩn lạc, môi trường xung quanh có màu nâu
chuyển sang đen khi tăng thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho việc nhận biết khuẩn lạc
vi khuẩn Salmonella. Một số chủng có thể sinh khuẩn lạc màu lục với môi trường
xung quanh ít nhiều có màu đen. [16, 20]
Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong suốt và hơi đỏ
trong môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc. Một số Salmonella xuất hiện
khuẩn lạc màu lục trong suốt nếu bao quanh là vi khuẩn lên men lactose hoặc glucose
gây ra vùng đó màu vàng xanh hoặc xanh; dưới 1% Salmonella không điển hình,
chúng lên men đường lactose và xuất hiện khuẩn lạc vàng lục hoặc lục. [9, 37]
Trên môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu xanh
lục, có hay không có tâm đen. Một số loài Salmonella có thể phát triển thành khuẩn lạc
có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc hoàn toàn có màu đen.
Một cách điển hình, có mộ số ít loài Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu vàng có hoặc
không có tâm đen. [9, 20]
Cũng như bước tăng sinh chọn lọc, việc sử dụng hai hay nhiều môi trường phân
lập sẽ cho phép gia tăng sự phát hiện số lượng các kiểu huyết thanh khác nhau trong
mẫu, trong đó môi trường XLD được khuyến khích sử dụng.
Hơn nữa, qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập thì tế bào
Salmonella bị già và suy thoái, vì vậy cần phải phục hồi chúng bằng một trong các môi
trường như Tryticase Soya Agar (TSA) hay Brain Heart Infusion (BHI) để nhân sinh
khối và được dùng tiếp cho các phản ứng sinh hóa và phản ứng ngưng kết kháng huyết
thanh về sau.

17




2.3.4 Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa
Đây là bước xác nhận các dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường
phân lập bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng. Các biểu hiện sinh
hóa của Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase
(+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+). Nếu các biểu hiện
sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các thử nghiệm ngưng kết
với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá.
Vi khuẩn sau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm
sinh hóa nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella.
Thử nghiệm trên môi trường Triple Sugar Iron agar (TSI) hay Kligler Iron Agar
(KIA) để phân biệt các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Môi trường TSI hay
KIA thường dùng để khảo sát sự lên men đường glucose, lactose và khả năng sinh khí
H
2
S, khí H
2
và CO
2
của vi khuẩn. Trong môi trường có chất chỉ thị màu phenol red
dùng để phát hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn. Đây là môi trường rắn, được
chuẩn bị trong ống nghiệm ở thể nghiêng sâu. Về cơ chế, đường glucose luôn được vi
sinh vật sử dụng trong điều kiện yếm khí tương đối, vì vậy ở phần đáy ở ống nghiệm
nuôi cấy luôn tạo ra nhiều acid và làm thay đổi màu của môi trường từ đỏ sang vàng,
đồng thời sản sinh ra gas. Đối với Salmonella do không sử dụng đường lactose và
sucrose nên sự phân hủy các acid amin rất mạnh trong điều kiện hiếu khí, sau 24 giờ ủ,

làm trung hòa hay chuyển kiềm mặt thạch nghiêng làm chúng có màu đỏ. Khi có màu
đen xuất hiện ở vùng nối hai phần nghiêng và sâu là do Salmonella có khả năng khử
sulfate có trong môi trường, tạo thành khí H
2
S. Chất này phản ứng với Fe
2+
(ferrous
sulfate) để tạo thành kết tủa sulfua sắt màu đen. Nếu có sinh hơi thì có những bọt khí
xuất hiện sâu trong ống thạch. [5, 29]
Thử nghiệm lên men đường mannitol: Salmonella có khả năng lên men đường
mannitol sinh acid sẽ làm giảm pH, do môi trường có chất chỉ thị màu phenol red nên
chuyển từ màu đỏ thành màu vàng. [5]
Thử nghiệm Lysine Decarboxylase (LDC): với phản ứng tím LDC, các vi
khuẩn Salmonella có khả năng tạo enzyme lysine decarboxylase trong môi trường có

18


lysine, ngoại trừ một vài chủng của S. gallinarum và S. choleraesuis. Vì cơ chế lên
men decarboxylase có thể tác động lên nhóm carboxyl (-COOH) của acid amin sinh ra
amin và khí CO
2
. Do trong môi trường LDC broth có chứa các thành phần như chất
chỉ thị màu bromocresol purple, chất pyridoxal, lysine monohydrochloride và 1%
glucose. Các sản phẩm cuối cùng của hệ enzyme này sẽ chuyển pH sang kiềm, môi
trường có màu tím hoặc xanh và có sinh khối. Phản ứng âm tính được thể hiện ở màu
vàng của môi trường. [20]
Thử nghiệm Urea phenol red broth: Salmonella không phân giải được urea
thành NH
3

nên không làm thay đổi pH, môi trường sau khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên
màu tím ban đầu. Phản ứng dương tính môi trường có màu đỏ hồng. [5, 20, 29]
Khi các phản ứng sinh hóa phù hợp với Salmonella thì có thể kết luận các
khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella spp. Bất kỳ một trong bốn phản ứng sinh hóa trên
không phù hợp thì không phải là Salmonella.
2.3.5 Phản ứng huyết thanh ngƣng kết trên phiến kính để định nhóm hay loại
vi khuẩn
Salmonella có 3 loại kháng nguyên: kháng nguyên O bền với nhiệt, được dùng
để chia thành nhóm, kháng nguyên H không bền với nhiệt dùng để định loại, kháng
nguyên Vi không bền với nhiệt thường che lấp ngăn chặn phản ứng kháng nguyên O.
Từ những mẫu phân lập dương tính Salmonella, tiến hành định serotype để xác định
những nhóm nào thường hiện diện trong các loại nhóm thực phẩm cũng như cung cấp
thêm những thông tin đánh giá về tình hình vệ sinh do những nhóm vi khuẩn
Salmonella nào nhiễm nhiều nhất từ đó có ý nghĩa trong vấn đề vệ sinh an toàn thực
phẩm.
Vì có hàng ngàn serotype Salmonella, nên việc xác định Salmonella không phải
là đơn giản. Người ta đi vào các nhóm hỗn hợp, rồi đến các nhóm đơn giản dần. Có
những nhóm hỗn hợp O như OMA, OMB, OMC, OMD… Nhóm OMA gồm các nhóm
thường gặp nhất: A, B, E, L. Nhóm OMB gồm C, F, G, H. Nhóm OMC gồm I, J, K,
M, N, O, P… Kháng huyết thanh sản xuất tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh có
kháng huyết thanh O đa giá, OMA, OMB, kháng huyết thanh O đơn giá như các nhóm
A, B, D, E, và C. Muốn xác định serotype nào cần phải thử ngưng kết với kháng huyết

19


thanh H. Ví dụ: S. typhi và S. enteritidis đều có thể gây nhiễm trùng máu, nên khi
ngưng kết với kháng huyết thanh O nhóm D xong chúng ta phải làm
thêm kháng huyết thanh H: nếu ngưng kết với H : d kết luận là S. typhi, nếu ngưng kết
với H : g, m thì kết luận là S. enteritidis. [14]

Trước hết ta dùng huyết thanh ngưng kết đa giá (Polyvalent O antiserum), loại
này chứa tất cả kháng thể O của Salmonella từ A đến F, ngưng kết nhanh, hoàn toàn
hầu hết vi khuẩn thuộc giống Salmonella. Nếu dương tính, sau đó tiếp tục làm phản
ứng gốc vi khuẩn đó với huyết thanh ngưng kết nhóm (grouping antiserum) từ A đến
F, sự ngưng kết này sẽ xảy ra nhanh và hoàn toàn nếu huyết thanh ngưng kết và gốc vi
khuẩn cùng nhóm. [2]
Nếu làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết đa giá vô nghiệm ta phải thực
hiện phản ứng với huyết thanh ngưng kết Vi. Trường hợp kết quả phản ứng dương tính
với huyết thanh ngưng kết Vi, chứng tỏ gốc vi khuẩn có kháng nguyên Vi che lấp phản
ứng của kháng nguyên O với kháng thể O, do đó ta phải đun cách thủy huyền trọc vi
khuẩn ở nhiệt độ 100
o
C trong 30 phút để loại bỏ kháng nguyên Vi khỏi bề mặt tế bào.
Sau khi để nguội, làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết đa giá và huyết thanh
ngưng kết nhóm C và D. Nếu kết quả âm tính với cả hai loại huyết thanh ngưng kết đa
giá và Vi, gốc vi khuẩn không phải là Salmonella. [2]
2.3.6 Các phản ứng sinh hóa xác định các loài phụ Salmonella
Để xác định các loài phụ Salmonella phải tiến hành các phản ứng sinh hóa được
trình bày trong Bảng 2.4.

20





Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa các loài và loài phụ của Salmonella [35]

(*) : Typhimurium, Dublin -, + : 90% hay hơn cho phản ứng dương, -: 90% hay hơn cho phản
ứng âm tính; d: các kiểu huyết thanh khác nhau cho phản ứng khác nhau
Có bốn thử nghiệm sinh hóa chính để xác định các loài phụ của Salmonella:
Thử nghiệm lên men đường sorbitol và dulcitol: Vi sinh vật lên men hai nguồn
carbonhydrate sinh ra acid hữu cơ làm pH môi trường giảm và môi trường thay đổi từ
màu đỏ sang màu vàng. Các loài phụ của Salmonella có hay không có khả năng lên
men hai loại đường này. Hầu hết các loài Salmonella cho phản ứng dương tính thể
hiện ở sự hình thành khí bên trong ống nghiệm và pH acid (màu vàng) của môi trường.
Sự hình thành acid được kết luận là test dương tính. Test âm tính thể hiện ở chỗ không
Loài
S. enterica
S. bongori
Loài phụ
I
II
IIIa
IIIb

IV
VI
V

Đặc điểm sinh hóa
Dulcitol
O.N.P.G (4h)
Malonate
Gelatinase
Sorbitol
Nuôi cấy với KCN
Galacturonate
- glutamyltransferase
- glucuronidase
Salicine
Lactose


+
-
-
-
+
-
-
+(*)
d
-
-

+
-
+
+
+
-
+
+
d
-
-

-
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-(75%)

-
+
+
+
+

-
+
+
+
-
+(75%)

-
-
-
+
+
+
+
+
-
+
-

d
d
-
+
-
-
+
+
d
-
d

+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
-

21


có khí tạo thành và môi trường có màu đỏ hồng. Tất cả các kiểu huyết thanh thuộc loài
S. enterica I đều lên men hai loại đường này. [9]
Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate: dùng để khảo sát khả năng sử dụng
sodium malonate làm nguồn carbon duy nhất. Khi vi khuẩn sử dụng malonate sẽ
phóng thích NH
3
làm sinh ra phản ứng kiềm, biến đổi môi trường từ màu xanh lá cây
sang màu xanh dương với chất chỉ thị màu là bromothymol blue. Các loài phụ của
Salmonella đều có hoặc không có khả năng sử dụng malonate, riêng S. enterica I
không có khả năng này. [5, 9]
Thử nghiệm ONPG (o – Nitrophenyl - - D – Glucoside): xác định sự có mặt
hay không có mặt enzyme - galactosidase nhờ vào sử dụng một chất hữu cơ tổng
hợp o – Nitrophenyl - - D – galactopyranoside (gọi tắt ONPG) được xem như là cơ
chất đối với enzyme - galactosidase. Khi vi khuẩn giải phóng enzyme -

galactosidase thì chúng sẽ phân cắt cơ chất này để giải phóng orthonitrophenyl làm
môi trường xuất hiện màu vàng. Mục đích của phản ứng để phân biệt các vi khuẩn có
khả năng sử dụng đường lactose hay vi khuẩn không sử dụng được lactose (không có
- galactosidase). S. enterica I do không có gen mã hóa enzyme - galactosidase nên
phản ứng ONPG âm tính. [2, 13]

22


2.4 Một số phƣơng pháp kiểm tra nhanh Salmonella
Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới vẫn đang áp dụng phương pháp
nuôi cấy để phát hiện Salmonella trong thực phẩm. Đây được coi là phương pháp tiêu
chuẩn được chấp nhận rộng rãi. Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và
công sức lao động cho các công việc như: chuẩn bị môi trường, dụng cụ, thực hiện quy
trình… Thời gian để có kết quả phân tích phải mất từ 4 – 6 ngày. Với thời gian này đã
không đáp ứng được các yêu cầu cho kết quả nhanh trong việc phục vụ các chương
trình giám sát chất lượng thực phẩm trên dây chuyền sản xuất như hiện nay, hoặc gây
thiệt hại cho các nhà quản lí doanh nghiệp vì các chi phí lưu kho để chờ kết quả phân
tích…Thay vì phải tiến hành các test sinh hóa truyền thống trong ống nghiệm, có thể
sử dụng bất kỳ một trong bốn hệ thống test sinh hóa có bán sẵn trên thị trường (API
20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, hay MICRO-ID) để định danh các vi khuẩn
Salmonella nói chung trong thực phẩm.[1, 9, 27]
Ngoài phương pháp truyền thống để phân lập và định danh Salmonella, còn có
một số phương pháp kiểm tra nhanh Salmonella có thể thực hiện việc kiểm tra trên
nhiều mẫu trong thời gian ngắn:


2.4.1 Phƣơng pháp dựa trên DNA
2.4.1.1 Phƣơng pháp PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật dùng để khuyếch đại

một trình tự DNA xác định trong điều kiện in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát
minh năm 1985. Phản ứng dùng men DNA polymerase chiết từ vi khuẩn Thermus
aquaticus để nhân bản một đoạn DNA lên 200 000 lần. Phương pháp PCR hiện đang
được áp dụng rộng rãi trên thế giới và trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Phương pháp định tính Salmonella trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR dựa vào
việc xác định đoạn DNA đích có hiện diện hay không. Kỹ thuật này bao gồm các bước
như sau: tiền tăng sinh trong môi trường BPW, xử lý tế bào để thu nhận khuôn DNA,
thực hiện phản ứng PCR, phân tích kết quả.
Ưu điểm của PCR: (1) thời gian cho kết quả nhanh. (2) có thể phát hiện được
những vi sinh vật khó nuôi cấy. (3) hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ

23


lưu trữ hơn phương pháp huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi tường chuẩn
đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường. (4) Ít tốn kém công lao động. Có thể
được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực
phẩm. [15]
2.4.1.2 Phƣơng pháp Realtime – PCR
Phương pháp Realtime PCR cũng dựa trên cơ sở PCR nhưng trong quá trình
phản ứng tổng hợp sẽ gắn vào một tác nhân phát hiện, thông thường là một chất phát
huỳnh quang được gắn vào một mẫu dò như chất Silber green II. Cơ chế của Realtime
– PCR là mỗi một sản phẩm tạo ra sẽ gắn với một chất huỳnh quang. Cường độ huỳnh
quang tỉ lệ thuận với số lượng sản phẩm tạo thành. Số lượng bản đích ban đầu càng
cao thì số chu kỳ để phát hiện sản phẩm khuyếch đại càng ít.
2.4.1.3 Phƣơng pháp lai phân tử
Phương pháp này được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi
sinh vật. Cũng như phương pháp PCR, phương pháp này hiện nay cũng được thương
mại hóa dưới dạng những bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.

2.4.2 Phƣơng pháp dựa trên kháng nguyên – kháng thể
2.4.2.1 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi trong ngành y tế, ngoài việc định tính vi
sinh vật gây bệnh, ELISA còn được sử dụng trong việc chuẩn đoán bệnh AIDS, sốt
xuất huyết, viêm gan… Phương pháp có ưu điểm là cho kết quả nhanh chỉ trong vài
giờ sau giai đoạn tăng sinh, có độ nhạy rất cao nhưng có độ đặc hiệu thấp, số mẫu cho
kết quả dương tính giả cao. Vì thế phương pháp này được dùng để sàng lọc, tất cả các
mẫu cho kết quả dương tính đều cần phải được xác nhận bằng phương pháp nuôi cấy.
2.4.2.2 Phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang
Dựa vào kháng thể được nhuộm huỳnh quang để phát hiện Salmonella. Kỹ
thuật kháng thể huỳnh quang gồm: chuẩn bị kháng nguyên và cố định vết bôi kháng
nguyên trên lam kính, nhuộm vết bôi bằng cách dùng chất ngưng kết có gắn chất phát
huỳnh quang, kết quả được chụp qua kính hiển vi. Trên các các lam kính, Salmonella

24


phát quang vàng xanh trên nền đen, các vật khác hiện diện trên vết bôi phân biệt dễ
dàng với Salmonella do chúng bắt thuốc nhuộm yếu hay không nhuộm và thiếu hình
dạng phù hợp. Phương pháp này linh động, nhanh, kết quả được phát hiện sau vài giờ.

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1 Thời gian thực hiện
Thời gian thực hiện đề tài từ 01/03/2005 đến 01/08/2005.
3.1.2 Địa điểm thực hiện
Nơi lấy mẫu: Mẫu được lấy tại các chợ trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh
như chợ Bà Chiểu và chợ Nguyễn Đình Chiểu quận Phú Nhuận, chợ Tân Phú quận
Thủ Đức…
Nơi tiến hành phân tích thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Môi
trường tại Trung tâm Phân tích Hóa sinh – Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ
Chí Minh.
3.2 Vật liệu
3.2.1 Dụng cụ và thiết bị

25


3.2.1.1 Dụng cụ
Bình tam giác, cốc, ống đong hình trụ 50, 100, 500 ml, pipetman, ống nghiệm,
hộp đĩa petri, que cấy vòng, que cấy thẳng, đèn cồn, bao PE vô trùng, kéo cắt, pince
kim loại, khay kim loại, lame, màng lọc có kích thước lỗ lọc là 0,45 m, và bơm hút
chân không.
3.2.1.2 Thiết bị
Cân phân tích, máy đo pH, máy dập mẫu, kính hiển vi, nồi hấp autoclave, tủ
sấy, tủ cấy an toàn sinh học, tủ ấm 37
o
C, bể điều nhiệt 42

o
C, và tủ lạnh.
3.2.2 Hóa chất và môi trƣờng
3.2.2.1 Hóa chất
Các loại kháng huyết thanh O đa giá, hỗn hợp OMA, OMB và kháng huyết
thanh đơn giá như nhóm A, B, C, D, E. Các loại kháng huyết thanh này do Viện
Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất.
Các loại carbonhydrate như sorbitol, dulcitol.
Cồn 70
o
, cồn 96
o
và nước cất.
3.2.2.2 Môi trƣờng
Bao gồm những loại môi trường thông dụng để nuôi cấy, phân lập và khẳng
định Salmonella trong thực phẩm.
Môi trường Buffered Pepton Water (BPW): được sử dụng để tiền tăng sinh
Salmonella hiện diện trong mẫu. Thành phần môi trường gồm: peptone 10 g/l, NaCl 5
g/l, Na
2
HPO
4
.12H
2
O 9 g/l, KH
2
PO
4
1,5 g/l, hấp khử trùng ở 121
o

C trong 15 phút, pH
sau khi khử trùng là 7.
Môi trường Saline Peptone Water (SPW): peptone 1 g/l, NaCl 8,5 g/l, hấp khử
trùng ở 121
o
C trong 15 phút, pH sau khi khử trùng là 7,0 0,2.
Môi trường Rapparport Vassiliadis broth (RV): được sử dụng để tăng sinh chọn
lọc cho Salmonella. Thành phần môi trường như sau: peptone đậu nành 4,5 g/l,
MgCl
2
.6H
2
O 29 g/l, NaCl 8 g/l, K
2
HPO
4
0,6 g/l, malachite green oxalate 0,036 g/l, pH
5,5 0,2. Phân phối 10ml môi trường vào ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 115
o
C trong
15 phút.
Môi trường Xylose Lysine Desoxycholate agar (XLD): được dùng để phân lập
Salmonella. Thành phần XLD bao gồm: cao nấm men 3 g/l, L – Lysine HCl 5 g/l,