BÁO CÁO SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ BA ĐỊNH DẠNG ELISA PHÁT HIỆN RICIN TRONG SỮA VÀ HUYẾT THANH

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC-THỰC PHẨM
MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
BÁO CÁO:
SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ BA ĐỊNH DẠNG
ELISA PHÁT HIỆN RICIN TRONG SỮA VÀ
HUYẾT THANH
GVHD: ThS. Nguyễn Minh Hải
Nhóm 11:
Ngô Thị Quỳnh Anh 11116002
Lê Thị Chiến 11116008
Phạm Đình Hà 11116024
Phan Văn Luật 11116036
Vanxay phimphone 111160L2
TP HCM, 2014
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU 3
LỜI MỞ ĐẦU
Ricin là một loại protein thực vật không mùi, không vị, có độc tính cao được tìm thấy
trong tự nhiên, có nhiều trong các hạt thầu dầu. Nó được hình thành từ chất thải bị bỏ trong
quá trình chế biến dầu từ hạt thầu dầu. Ricin phóng thích trong cơ thể ra có thể gây nguy
hiểm. Nhưng cho đến bây giờ vẫn không có phương thuốc nào có thể giải được độc Ricin. Vì
độc tính cao và dễ dàng lấy được từ cây thầu dầu, Ricin là một tác nhân sinh học nguy hiểm
và được liệt kê là một trong những chất cực độc gây bênh. Ở Mỹ, việc khủng bố đã sử dụng
Ricin nên nguy cơ chất này nhiễm vào thực phẩm là rất lớn và đang trở thành mối quan tâm
của cộng đồng. Vì vậy cần phải có phương pháp nhanh và chính xác để xác định Ricin trong
thực phẩm hay các dịch sinh học. Người ta đã đưa ra hàng loạt các phương pháp nhưng khá
phức tạp và chi phí cao.
Phương pháp xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) đã được sử dụng để phát
hiện Ricin trong thực phẩm và dịch sinh học. Tuy không phải là phương pháp nhạy nhất

nhưng nó được ứng dụng phổ biến và cung cấp được nhiều thông tin quan trọng.
Nhóm 11 Trang 2
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
Để hiểu rõ hơn về vấn đề này, bài báo mà nhóm đã dịch nói về việc so sánh và đánh giá
xét nghiệm ELISA phát hiện Ricin trong sữa và huyết thanh sẽ cung cấp thêm các thông tin cụ
thể.
Trong quá trình dịch có thể có nhiều sai sót mong thầy và các bạn thông cảm.
So sánh và đánh giá ba định dạng xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)
để phát hiện chất ricin trong sữa và huyết thanh.
Tóm tắt
Khi áp dụng để phát hiện ra độc tố protein cụ thể trong thực phẩm hay một chất
dịch sinh học nào đó có khả năng mắc một nguy cơ ô nhiễm, điều quan trọng là phải
xét nghiệm được độ nhạy và tính chất đặc trưng riêng biệt của nó. Để xác định một xét
nghiệm miễn dịch là nhạy, đơn giản và chính xác trong việc phát hiện ra chất ricin
trong sữa và huyết thanh, người ta sử dụng ba định dạng của sandwich ELISA (xét
nghiệm miễn dịch liên kết enzyme) đã được so sánh và sử dụng cùng cặp kháng thể.
ELISA sử dụng biotin kết hợp với kháng thể phát hiện chính và streptavidin liên kết hệ
enzyme peroxidase trong cây cải ngựa (HRP) cho thấy đây là xét nghiệm có độ nhạy
lớn nhất với giới hạn phát hiện (LOD) của 25pg/ml trong dung dịch phosphate
Nhóm 11 Trang 3
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
buffered saline (PBS), 50pg/ml trong sữa không béo, huyết thanh chuột, và 100pg/ml
trong sữa nguyên kem. Hiệu quả tốt thứ hai là ELISA sử dụng streptavidin kết hợp với
kháng thể phát hiện chính và hệ thống biotin-HRP, giới hạn phát hiện (LOD) cho ricin
là 100pg/ml trong PBS và sữa, 1ng/ml trong huyết thanh. ELISA sử dụng kháng thể
phát hiện chính không được gắn thẻ và phức hợp HRP-kháng thể thứ cấp được gắn
nhãn thực hiện với độ nhạy thấp nhất trong tất cả các định dạng và LOD của nó là
1ng/mL ở các lần xét nghiệm. So với xét nghiệm ELISA trực tiếp (không sử dụng
kháng thể bắt giữ), các xét nghiệm sandwich ELISA nhạy hơn 50-500 lần trong dung
dịch đệm PBS. Ước tính chính xác của các xét nghiệm miễn dịch là việc sử dụng hệ số

biến thiên (CV) cho thấy rằng định dạng ELISA nhạy nhất có hệ số biến thiên thấp
nhất trong liên khảo nghiệm CV (inter-assay CV) (4,28%) và trong nội khảo nghiệm
CV (intra-assay CV) (2,15%) mặc dù liên và nội khảo nghiệm CV đối với hai ELISA
khác tương ứng thấp hơn 10% và 6%, thấp hơn mức chấp nhận được tối đa. Vậy kết
luận, ELISA sử dụng biotin kết hợp kháng thể phát hiện chính và hệ thống
streptavidin-HRP là xét nghiệm tốt nhất trong ba định dạng ELISA cho việc phát hiện
chất ricin trong dung dịch PBS, sữa và huyết thanh và việc áp dụng xét nghiệm này sẽ
có giá trị để nghiên cứu an toàn thực phẩm và chẩn đoán lâm sàng.
1. Giới thiệu
Ricin là một loại protein bậc II khử hoạt tính ribosome có nguồn gốc từ hạt của
cây thầu dầu (Ricinus communis). Nó bao gồm hai chuỗi polypeptide A và B, với
trọng lượng phân tử là 32 và 34 kDa. Ricin A là một chuỗi N-glycosidase dài nó ức
chế việc tổng hợp protein làm bất hoạt ribosome kết quả là làm cho tế bào bị chết.
Ricin B là một chuỗi lectin gắn với glycoprotein hoặc glycolipid ở trên bề mặt tế bào
giúp cho giúp cho ricin đi vào trong tế bào thông qua thụ thể trung gian endocytosis.
Ricin là một trong những độc tố mạnh nhất với liều lượng gây chết là 30 mg/kg ở
chuột, 1-20 mg/kg trọng lượng cơ thể trong con người. Vì độc tính cao và dễ dàng lấy
Nhóm 11 Trang 4
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
được từ cây thầu dầu, ricin là một tác nhân sinh học nguy hiểm và được liệt kê là một
trong những chất cực độc gây bệnh. Ở Mỹ, việc khủng bố đã có sử dụng ricin nên khả
năng chất này nhiễm vào lương thực là rất lớn và đây đang là mối quan tâm của công
cộng. Vì vậy cần phải có một phương pháp xác định nhanh và chính xác ricin trong
thực phẩm hay các dịch sinh học. Người ta đã đưa ra hàng loạt phương pháp để phát
hiện chất ricin này nhưng khá phức tạp. Năm 2008 Garber, các cộng sự Halter đã xét
nghiệm trên chuột. Năm 2010 Halter và các cộng sự đã dùng phương pháp miễn dịch-
PCR để nghiên cứu. Năm 2011 McGrath và các cộng sự đã dùng quang phổ để nghiên
cứu. Nhưng hầu hết các phương pháp đều yêu cầu các thiết bị đắt tiền mà các thiết bị
này thì có rất ít hoặc không có trong phòng thí nghiệm.
Phương pháp xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme ELISA đã và đang được sử

dụng phổ biến để định lượng các chất như: peptide, protein, kháng thể và hormone.
Mặc dù đây không phải là phương pháp nhạy nhất nhưng nó cung cấp một số thông tin
quan trọng. Đáng chú ý là nó chỉ đòi hỏi khối lượng mẫu nhỏ và một ít thuốc thử. Nó
dễ dàng lắp vào 96 giếng của tấm vi chuẩn và sử dụng với nhiều hệ thống phát hiện
khác nhau. Do đó, nó trở thành một kỹ thuật phổ biến ứng dụng cho nhiều nghiên cứu
cơ bản, ứng dụng cao. Nó có thể cố định chất phản ứng với bề mặt vi đĩa, tạo điều kiện
tách khỏi sự phụ thuộc nguyên liệu trong quá trình xét nghiệm .
Khả năng rửa trôi một cách không đặc hiệu với liên kết vật liệu làm cho ELISA
trở thành công cụ hữu hiệu để đo chất phân tích trong ma trận phức tạp. Hơn thế nữa,
tất cả các hoá chất và thiết bị cần thiết cho ELISA đều sẵn có ở hầu hết các phòng thí
nghiệm.
Các ELISA có thể thể hiện bằng những con số sửa đổi từ những quy trình cơ bản.
Bước quan trọng là sự cố định của kháng nguyên có thể thực hiện bằng cách hấp thu
trực tiếp với đĩa thí nghiệm hoặc gián tiếp thông qua một kháng thể bắt giữ đã được
gắn vào đĩa. Sau đó kháng nguyên được phát hiện trực tiếp (có gắn kháng thể chính)
hoặc gián tiếp (gắn kháng thể thứ cấp).
Nhóm 11 Trang 5
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
ELISA mạnh nhất là sandwich ELISA. Trong xét nghiệm này, kháng nguyên
được kẹp giữa hai kháng thể chính, kháng thể bắt và kháng thể phát hiện. Đây là
phương pháp phổ biến do nó rất nhạy và phản ứng mạnh hơn so với xét nghiệm trực
tiếp cố định kháng nguyên trên đĩa. Một số định dạng sandwich ELISA đã được phát
triển để phát hiện chất ricin (Brandon 2011;Guglielmo-Viret et al., 2007), nhưng
không có tài liệu báo cáo việc thực hiện các ELISA trong các định dạng đĩa khác nhau
thông qua so sánh trực tiếp.
Trong nghiên cứu này, mục đích chính là nhận biết và xác định ELISA đó là đơn
giản, nhạy và có tính lặp lại trong việc phát hiện chất ricin có trong sữa và huyết thanh.
Thông qua nghiên cứu, việc đánh giá và so sánh ba định dạng ELISA đã được thực
hiện. Kháng thể bắt trong ba xét nghiệm không bị điều chỉnh, nhưng kháng thể phát
hiện chính được biến đổi theo các dạng khác nhau (Hình 1).

Hình 1. Sơ đồ biểu diễn ba định dạng ELISA mô tả các phân tích những vùng phức
hợp trên bề mặt của một giếng được xét nghiệm. ELISA-1: sandwich ELISA gián tiếp
sử dụng kháng thể phát hiện chính không có nhãn và phức hợp kháng thể thứ cấp-
HRP; ELISA-2: sandwich ELISA gián tiếp sử dụng kháng thể phát hiện chính có gắn
Nhóm 11 Trang 6
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
streptavidin (SA) và biotin (B)-HRP; ELISA-3: sandwich ELISA gián tiếp sử dụng
kháng thể phát hiện chính có gắn biotin và SA-HRP.
ELISA-1. Sử dụng một kháng thể phát hiện chính không có nhãn và phức hợp
HRP-kháng thể thứ cấp. ELISA-2. Sử dụng biotin kết hợp kháng thể phát hiện chính
và HRP-streptavidin để khuếch đại tín hiệu. ELISA-3. Sử dụng streptavidin kết hợp
kháng thể phát hiện chính và HRP-biotin để khuếch đại tín hiệu. Sử dụng cùng cặp
kháng thể bắt và phát hiện trong tất cả các định dạng ELISA để đảm bảo rằng sự khác
biệt hiệu suất quan sát thấy là hoàn toàn do khả năng phát hiện, không phụ thuộc tính
chất của các kháng thể. Tất cả ba định dạng ELISA được tối ưu hóa kỹ lưỡng trước khi
được sử dụng trong nghiên cứu này.
2. Phương pháp thực hiện
2.1. Ricin và kháng thể
Ricin và kháng thể đa dòng kháng ricin (PAB) ở dê được mua từ Vector
Laboratories (Burlingame, CA). Kháng thể đơn dòng ở chuột, mAb1642 (chống lại
chuỗi ricin A), đã được cung cấp bởi David Brandon (USDA-ARS-WRRC) (Brandon
et al., 2009). Phức hợp Streptavidin-kháng thể (SA-PAB) đã được chuẩn bị. Trong một
thời gian ngắn, 100µl kháng thể (1µg/µl) được gắn nhãn và trộn với 10µl LL-Modifier
thuốc thử (1µg/µl) và sau đó cho vào một lọ chứa 100µg của lyophilized L-
streptavidin. Sau khi ủ hỗn hợp trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng, 10µl LL-thuốc thử đã
được thêm vào. (SA-PAB) có thể được sử dụng sau khi 30 phút hoặc được bảo quản ở
4
0
C. (Biotin-PAB) được thực hiện bằng cách sử dụng LC-NHS-(+)-Biotin (Pierce,
Rockford, IL) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Phức hợp Biotin-HRP và streptavidin

được mua từ Invitrogen (Carlsba, CA).
Nhóm 11 Trang 7
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
2.2. Chuẩn bị mẫu
Sữa không béo và sữa nguyên kem được mua từ các cửa hàng tạp hóa địa phương
và bảo quản ở 4
0
C đến khi sử dụng. Huyết thanh chuột được thu thập từ 1 con chuột
(chuột cái 4.5 tuần tuổi, nặng 19-20g) được lấy từ Charles River Laboratories
(Hollister, California).
Huyết thanh được pha loãng 1:9 trong dung dịch đệm PBS có pH = 7.3 trước khi
cố định với ricin. Các mẫu sữa được spiked (đinh mấu) với chất ricin và xét nghiệm
trực tiếp không cần pha loãng.
2.3. ELISA trực tiếp và sandwich ELISA
Đối với ELISA trực tiếp, một tấm vi chuẩn NUNC MaxiSorp (Cat No. 12-565-
136 Fisher Scientific) được tráng bằng một tập hợp các độ pha loãng theo thứ tự ricin
tinh khiết trong PBS, 100µl/giếng để qua đêm ở 4
0
C. Các giếng được đổ đầy với 300µl
BSA 3% trong PBS ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau khi được đổ đầy, các tấm nhựa
được rửa sạch 6 lần bằng nước và 100µL/giếng kháng thể phát hiện chính được thêm
vào (ELISA-1: thêm pAb; ELISA-2: thêm streptavidin–pAb và ủ ở nhiệt độ phòng
trong 1 giờ. Các đĩa được rửa sạch như ở trên sau đó được ủ 1 giờ với phức hợp HRP
thích hợp (ELISA-1: thêm donkey-anti-goat IgG-HRP ; ELISA-2: thêm biotin-HRP).
Sau được rửa sạch, 100µl cơ chất K-Blue (NeogenCorp.,Lexington, KY) được thêm
vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Phản ứng dừng lại ở 100µl HCL
0.3N và đo ở bước sóng hấp thụ 450nm.
Phương thức sandwich ELISA cũng thực hiện tương tự như trên, ngoại trừ các vi
đĩa được tráng và để qua đêm với mAb1642 (một loại kháng thể đơn dòng) ở nồng độ
4µg/ml trong dung dịch đệm PBS. Tiếp theo sau giai đoạn đổ đầy và rửa là giai đoạn

pha loãng theo thứ tự ricin tinh khiết đã được thêm vào trong dung dịch đệm PBS và ủ
Nhóm 11 Trang 8
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau khi phát hiện ra các kháng thể khác nhau, HRP
(enzyme peroxidase trong cây cải ngựa) liên hợp đã được sử dụng để gắn vào các
kháng thể này (ELISA-1: non-tagged goat pAb/ donkey-anti-goat IgG–HRP; ELISA-2:
SA-pAb/biotin–HRP; ELISA-3: biotin–pAb/SA–HRP). Để xác định thiết lập cho phép
độ nhạy lớn nhất, cơ chất sử dụng ít nhất, và sai số tối thiểu, một số sự kết hợp của
kháng thể được so sánh như các thiết bị bắt giữ và thiết bị dò tìm. Một số pha loãng
của HRP liên hợp kháng thể phát hiện và Bio-HRP và SA-HRP cũng đã được xét
nghiệm để xác định nồng độ tối ưu. Dựa trên kết quả tối ưu hóa thu được từ chất ricin
trong dung dịch đệm PBS, chúng tôi tiếp tục thực hiện các xét nghiệm với chất ricin
tăng vọt trong sữa và huyết thanh.
Giới hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất được sử dụng
cho các đường cong tiêu chuẩn mà tại đó độ hấp thu trung bình đọc tại bước sóng
450nm là cao hơn so với đối chứng âm cộng với ba lần độ lệch chuẩn. LOD là ma trận,
phương pháp, và phân tích cụ thể. Các hệ số biến thiên (CV) được định nghĩa là giá trị
thu được bằng cách lấy độ lệch chuẩn chia cho giá trị trung bình của một tập hợp các
phép đo. The intra-assay CV là thước đo độ chính xác của một xét nghiệm và báo cáo
trong nghiên cứu này là một giá trị trung bình tính từ các CV riêng tại mỗi nồng độ
chất ricin được biết đến. CV% cho mỗi nồng độ chất ricin được tính toán bằng cách lấy
độ lệch chuẩn chia cho giá trị trung bình của 3 lần xét nghiệm và nhân với 100. Điều
quan trọng cần lưu ý là độ chính xác của mỗi xét nghiệm có thể khác nhau trên phạm
vi tập trung khảo nghiệm.
The inter-assay CV là một biểu hiện tính kiên định ngày này qua ngày khác.
Trong thí nghiệm này, bộ mẫu tương tự được chạy ba lần mỗi ngày và lặp đi lặp lại
trên ba ngày khác nhau để theo dõi sự thay đổi theo từng ngày. Giá trị trung bình cho
mỗi nồng độ xét nghiệm được tính toán và sau đó được sử dụng để tính toán giá trị
trung bình chung, độ lệch chuẩn, và CV% của3 ngày. Giá trị CV% = độ lệch chuẩn
trung bình /trung bình chung x100. Mức trung bình của CV% từ tất cả các nồng độ xét

nghiệm được báo cáo là the inter-assay CV.
Nhóm 11 Trang 9
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
3. Kết quả
3.1. Ước lượng của ba định dạng ELISA trong việc phát hiện chất ricin
Nhóm 11 Trang 10
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
Độ nhạy của ba định dạng ELISA trong việc phát hiện chất ricin đã được ước
lượng bằng cách lần lượt pha loãng một lượng chất ricin đã biết trong dung dịch đệm
PBS và xác định LOD (xem định nghĩa trong Vật liệu và phương pháp). Mỗi độ pha
loãng theo thứ tự của ricin được đo 3 lần (khoảng nồng độ: 25-100,000pg/l) cộng với
một đối chứng âm chưa tăng vọt. Bảng1 cho thấy LOD cho ELISA-1 là1000pg/ml (tại
1000pg/ml A450 đọc là 0,62, >A450 tại 0 pg/ml+3 x 0,008) và phạm vi tuyến tính của
tín hiệu hấp thu với lượng chất phân tích là từ 10.000 đến 200.000pg/ml (R
2
= 0,97);
LOD cho ELISA-2 là 100pg/ml và phạm vi tuyến tính là 1000 đến 100.000pg/ml (R
2
=
0,98); LOD cho ELISA-3 là 25pg/ml và phạm vi tuyến tính là 100 đến 5000pg/ml (R
2
= 0,99) (Hình 2).
Hình 2. So sánh quá trình thực hiện ba định dạng ELISA. Tín hiệu hiển thị đọc ở bước
sóng hấp thụ trung bình ở 450nm cho ba lần đo lặp lại của chất ricin trong dung dịch
đệm PBS với độ lệch chuẩn. Quy mô bán logarit đã được sử dụng để hiển thị dốc của
đường thẳng.
Nhóm 11 Trang 11
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
Bảng 1. Phát hiện ricin trong PBS bằng ba định dạng sandwich ELISA gián tiếp
LOD cho ELISA-1 là 1000pg/ml, LOD cho ELISA-2 là 100pg/ml, LOD cho ELISA-3

là25pg/ml. ND, không xác định.
Bảng 2. Phát hiện ricin trong PBS bằng hai định dạng ELISA bắt giữ trực tiếp.
LOD cho ELISA-1 và ELISA-2 trực tiếp là 50000pg/mL.
Cố định trực tiếp ricin trên vi đĩa mà không sử dụng một kháng thể bắt có thể
cung cấp lợi thế. Rất nhanh chóng bởi vì sử dụng ít thao tác thực hiện và nó có thể có ít
bị nhiễu vì phản ứng chéo của kháng thể bắt giữ được loại bỏ. Vì vậy, người ta tiến
hành đo độ nhạy của ELISA-1 và ELISA-2 bằng cách hấp thụ trực tiếp chất ricin trên
các đĩa mà không sử dụng một kháng thể bắt giữ. Bảng 2 cho thấy LOD cho cả hai
ELISA là 50 ng/ml, nó cao hơn 50-500 lần so với những kết quả thu được từ xét
nghiệm sandwich. Không có khác biệt đáng kể trong độ nhạy khi sử dụng kháng thể
Nhóm 11 Trang 12
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
đơn dòng và đa dòng cho sự phát hiện (dữ liệu không hiển thị) . Những kết quả này
cho thấy rằng ELISA bắt giữ trực tiếp ít nhạy hơn nhiều so với sandwich ELISA trong
điều kiện thí nghiệm này. Hơn nữa, những kết quả này cũng thu được từ chất ricin
trong dung dịch đệm PBS, tin rằng nó ít thực tế để phát hiện chất ricin trong ma trận
phức tạp như sữa và huyết thanh bằng ELISA bắt giữ trực tiếp vì các mẫu này có chứa
nhiều protein và các thành phần có thể liên kết với khác tấm bề mặt vi đĩa và do đó làm
giảm độ nhạy, và có thể gây cản trở cho việc xét nghiệm chúng. Bằng cách tráng đĩa
với một lớp mAbs ngăn chặn việc không tráng thêm trước khi thêm mẫu, cơ hội ràng
buộc không cụ thể trong các giếng bởi các protein không liên quan nên được giảm
đáng kể.
3.2. So sánh sự biến đổi intra- and inter- assay của ba định dạng ELISA
Để so sánh độ chính xác và tính lặp lại của ba định dạng ELISA, người ta đã pha
loãng 10 lần liên tiếp trong một bộ bao gồm bốn nồng độ của chất ricin (0, 100, 1000,
và 10.000 pg/mL) trong dung dịch đệm PBS.
Bảng 3. Hệ số biến thiên CV% của chất ricin trong ba intra- and inter assay ELISA
Nhóm 11 Trang 13
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
Thực hiện pha loãng liên tiếp ricin trong dung dịch đệm PBS. Mỗi nồng độ được

thử nghiệm trong ba ngày. CV (%) trong ngày (intra-day CV%) cho mỗi nồng độ ricin
được tính bằng cách tìm độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại chia cho trung bình ba lần
lặp lại và nhân với 100.
CV (%) của các ngày (Inter-day CV (%)) được tính bằng cách tìm giá trị trung
bình cho mỗi nồng độ, sau đó sử dụng để tính toán giá trị trung bình chung, độ lệch
chuẩn, và CV% của 3 ngày. Nhìn chung CV% = độ lệch chuẩn trung bình chia cho
trung bình chung và nhân 100.
Bảng 4: Giới hạn phát hiện (ng/ml) chất ricin trong sữa và huyết thanh bằng ba định
dạng ELISA.
Giới hạn phát hiện (LOD) đã được đánh giá trong một ngày thí nghiệm với các
ma trận khác nhau, và nó thể hiện nồng độ chất ricin (ng/ml) hoặc là tỷ lệ LOD của
ELISA-1 hoặc ELISA-2 đối với ELISA-3.
Trong 3 ngày riêng biệt, một bộ mẫu đã được thử nghiệm lặp lại 3 lần và được đo
lường đánh giá hệ số biến thiên (CV) bằng hai phương pháp Intra- and Inter-Assay
CV. Kết quả được hiển thị trong Bảng 3. Giá trị trung bình của Intra- and Inter-Assay
CV lần lượt là 3,47% và 5,00% cho ELISA-1, 5,43% và 9,09% cho ELISA-2, và
2,15% và 4,28% cho ELISA-3 trong phạm vi nồng độ 0-10,000 pg/ml. Có thể thấy
rằng CV thu được từ tất cả các định dạng xét nghiệm khác nhau trên phạm vi khảo sát,
và độ chính xác thường kém hơn khi được quan sát ở nồng độ thấp, ngoại trừ có những
điều chỉnh tiêu cực. Dựa trên các dữ liệu cho thấy ở bảng 3, có thể kết luận rằng
Nhóm 11 Trang 14
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
ELISA-3 thực hiện tốt nhất. Độ lặp lại của ELISA-1 và ELISA-2 không tốt bằng,
nhưng vẫn ở mức chấp nhận được (khi khảo sát dưới 10 và liên khảo sát dưới 15)
(McLaren et al, 1981.)
3.3. Độ nhạy của ba ELISA phát hiện chất ricin trong sữa và huyết thanh.
Để xác định độ nhạy của ba phương pháp ELISA cho việc phát hiện chất ricin
trong sữa và huyết thanh, với các độ pha loãng nối tiếp chất ricin đã tăng vọt trong sữa
không béo và sữa nguyên kem không pha loãng. Đối với huyết thanh, pha loãng với tỉ
lệ 1:9 trong dung dịch đêm PBS trước khi ricin tăng vọt nhằm mục đích giữa nguyên

chúng trong huyết thanh chuột.
Bảng 4 cho thấy LOD của chất ricin trong sữa và huyết thanh giống như trong
dung dịch đệm PBS (1 ng/ml) khi sử dụng ELISA-1 và không có ảnh hưởng đến kết
quả đã được quan sát. LOD đo bằng ELISA-2 là 0,1 ng/ml trong dung dịch đệm PBS
và sữa (sữa không béo và sữa nguyên kem), nhưng độ nhạy đã giảm 10 lần khi có sự
hiện diện của huyết thanh. LOD của chất ricin đo bằng ELISA-3 là 25 pg/ml trong
dung dịch đệm PBS, 50 pg/ml trong sữa không béo và huyết thanh, và 100 pg/ml trong
sữa nguyên kem. Những kết quả này cho thấy ELISA-3 có độ nhạy nhất trong số ba
ELISA được đánh giá mặc dù độ nhạy đã bị ảnh hưởng một chút khi có sự hiện diện
của sữa và huyết thanh.
4. Bàn luận và đưa ra kết luận
Một trong những điều quan trọng nhất khi đánh giá chất lượng của xét nghiệm là
độ nhạy. Đây là một thước đo có khả năng phát hiện hàm lượng rất thấp của kháng
nguyên được quan tâm. Đôi khi sẽ có sự cân bằng trong các xét nghiệm có độ nhạy cao
hơn với các xét nghiệm có độ nhạy thấp hơn đặc trưng cho nó. Đó là thực tế phổ biến
để áp dụng cho các kỹ thuật có độ nhạy cao như xét nghiệm sàng lọc để xác định các
vấn đề của mẫu và sau đó áp dụng các xét nghiệm chi tiết hơn chỉ để xác nhận mẫu.
Nhóm 11 Trang 15
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
Trong nghiên cứu này, người ta đã chọn ra 3 tiêu chuẩn của các định dạng ELISA gián
tiếp và đánh giá việc sử dụng chúng để phát hiện chất ricin trong các ma trận chất lỏng
khác nhau. Để phản ánh sự khác biệt thực sự trong công nghệ phát hiện, người ta sử
dụng cùng cặp kháng thể bắt và phát hiện, điều kiện đổ đầy, ủ, và rửa cho ba xét
nghiệm. ELISA-1 sử dụng kháng thể phát hiện chính không có nhãn, vì vậy khả năng
miễn dịch của kháng thể được giữ lại. Trong khi các kháng thể phát hiện ở ELISA-2 và
ELISA-3 lần lượt được gắn streptavidin và biotin, khả năng miễn dịch của các kháng
thể chính này có thể bị ảnh hưởng bất lợi. Mặt khác, độ nhạy của các định dạng ELISA
có thể được tăng lên bởi vì mỗi kháng thể chính có khả năng kết hợp với nhiều phân tử
streptavidin hoặc biotin, cho phép khuếch đại tín hiệu lớn hơn. Kết quả thu được cho
thấy rằng ELISA-3 đáng tin cậy, LOD của nó là 25 pg/ml chất ricin trong PBS và cho

thấy độ nhạy được cải thiện gấp 4 lần so với ELISA-2 và gấp 40 lần so với ELISA-1.
Với độ nhạy cao quan sát được ở ELISA-3 cho thấy rằng sự kết hợp với biotin của
pAb không ảnh hưởng đến khả năng miễn dịch của kháng thể. Điều này là hợp lý vì sự
kết hợp với biotin của một kháng thể chỉ làm tăng trọng lượng phân tử tối thiểu, do đó
nó có thể không có ảnh hưởng xấu đến các mối liên kết giữa kháng nguyên và kháng
thể. Ngoài ra, việc sử dụng một miếng đệm dài giữa vị trí gắn kết protein và biotin làm
giảm cản trở về không gian của phản ứng streptavidin-biotin (Kobayashi et al., 1994).
So với ELISA-3, ELISA-2 có độ nhạy thấp hơn 4 lần, có thể là do khối lượng phân tử
của streptavidin lớn. Streptavidin nặng 60-kD, trong khi biotin chỉ có 244-D. Phức hợp
streptavidin với pAb cho thấy khối lượng phân tử lớn hơn 40%, so với các kháng thể
tự nhiên có thể ảnh hưởng đến các mối liên kết (Sung et al., 1995). Trong nghiên cứu
này, người ta nhận thấy rằng ELISA-3 bị nhiễu cao hơn 3-4 lần so với ELISA-2, cho
thấy độ nhạy của xét nghiệm có thể được tăng thêm để giảm đi ảnh hưởng của việc
nhiễu trong ELISA-3. ELISA-1 có độ nhạy thấp nó đồng nghĩa độ nhiễu xung quanh
cao, cho thấy phản ứng chéo giữa các kháng thể thứ cấp và các kháng thể bắt có thể
xảy ra mặc dù việc bắt và phát hiện các kháng thể chính đã được thực hiện trong động
vật khác loài. Ngược lại, việc sử dụng các hệ thống khuếch đại streptavidin-biotin
Nhóm 11 Trang 16
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
trong ELISA-2 và ELISA-3 thì làm giảm độ nhiễu và cải thiện độ nhạy. Điều này có
thể là do sự tương tác mạnh mẽ giữa streptavidin và biotin, phân ly liên tục K
d
khoảng
10
-15
(Green, 1963). Mặc dù cả ELISA-2 và ELISA-3 nhạy hơn ELISA-1, ELISA-2 có
tỷ lệ lặp lại thấp hơn so với ELISA-1 và ELISA-3. Điều này đã được phản ánh trên
CV, CV trong intra- and inter-assay của ELISA-2 là 5.43 và 9.09, lớn hơn hai lần CV
của ELISA-3. Điều này có thể được giải thích theo hai cách: một là liên hợp kháng thể-
streptavidin có thể gây trở ngại tới liên kết của các kháng thể, dẫn đến sự gia tăng của

các giá trị của các xét nghiệm và các xét nghiệm thực hiện trong nhiều ngày. Hai là
streptavidin được tạo thành bốn tiểu đơn vị giống hệt nhau, chỉ có một trong số đó
được cho là gắn với các kháng thể và do đó trong mỗi thí nghiệm có thể có các tiểu
đơn vị không phù hợp liên kết phản ứng với biotin.
ELISA-1 và ELISA-2 không thể hiện độ nhạy trong hầu hết các ma trận mẫu,
ngoại trừ trong huyết thanh (LOD tăng gấp 10 lần). Tuy nhiên, độ nhạy trong việc phát
hiện của ELISA-3 giảm 2 lần trong sữa không béo và huyết thanh, giảm 4 lần trong
sữa nguyên so với trong dung dịch đệm PBS. Điều này có lẽ là do sự hiện diện của
nhiều protein và chất béo trong các ma trận ảnh hưởng đến tính đặc hiệu kháng
nguyên-kháng thể, đặc biệt là khi mức độ kháng nguyên rất thấp. Tóm lại, độ nhạy của
ELISA-3 trong các ma trận khác nhau được thử nghiệm vẫn tốt hơn so với hai ELISA
còn lại.
Trong nghiên cứu này, người ta đã so sánh ba phương pháp sandwich ELISA
gián tiếp để phát hiện chất ricin. So sánh chặt chẽ và tất cả các xét nghiệm đã được tối
ưu hóa hoàn toàn, sử dụng cùng cặp kháng thể và điều kiện xét nghiệm như nhau.
ELISA-3 sử dụng biotin kết hợp kháng thể phát hiện chính và hệ thống SA-HRP cho
thấy đây là phương pháp nhạy cảm nhất và có thể tái sử dụng để phát hiện chất ricin
trong tất cả các ma trận thử nghiệm trong ba xét nghiệm ELISA, và LOD thấp hơn liều
gây chết cho con người.
Cũng như hai ELISA còn lại, xét nghiệm này có thể được thực hiện trong khoảng
3 giờ sử dụng các đĩa được tráng lại lần nữa, đòi hỏi ít thiết bị chuyên dụng, và có thể
Nhóm 11 Trang 17
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
được áp dụng cho một xét nghiệm kiểm tra với lượng vật chất lớn. Phòng thí nghiệm
đã khẳng định thành công cùng một kết quả để phát hiện độc tố Shiga bằng cách sử
dụng ba định dạng ELISA này. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cho những hiểu biết và
hướng đến việc phát hiện các chất độc khác như độc tố botulinum, độc tố cholera và
nội độc tố B staphyloccus. Các dữ liệu thu được ở đây xác nhận cho việc sử dụng
sandwich ELISA trong việc phát hiện chất ricin trong huyết thanh chuột, nó cung cấp
cho ta một khuôn khổ cho tương lai việc sử dụng xét nghiệm này trong các mẫu sinh

học của con người trong tương lai và vấn ngộ độc chất ricin.
Lời cảm ơn
Các tác giả xin cảm ơn Dr. David Brandon đã cung cấp các kháng thể đơn dòng
ởchuột, mAb1642; Dr.Sui Sheng Hua và Dr. Bradley Hernlem cho ý kiến hữu ích.
Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Chương trình Quốc gia USDA-ARS dự án
NP108, CRIS5325-42.000-027-00D. Bộ Nông nghiệp Mỹ là một nhà cung cấp cơ hội
bình đẳng và sử dụng lao động.
Bài dịch
“Evaluation and comparison of three enzyme-linked immunosorbent assay
formats for the detection of ricin in milk and serum” . Tác giả Xiaohua Hen
, Stephanie McMahon, Reuven Rasooly. Western Regional Research Center,
Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Albany, CA 94710,
USA. Article history:Received 29 August 2011. Accepted 29 August 2011.Available
online 9 January 2012.
Nhóm 11 Trang 18