ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình tạo củ in Vitro ở một số giống khoai môn sọ địa phương (Colocasia Esculenta)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.65 MB, 68 trang )
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
PHẦN I: MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Khoai môn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) là loại cây trồng thích
nghi cao với vùng nhiệt đới, là nguồn lương thực an toàn ở nhiều quốc gia
trên thế giới. Đây là loại cây trồng lấy củ quan trọng, khơng chỉ là nguồn
cây lương thực chính của các nước ở quần đảo Thái Bình Dương mà cịn là
nguồn lương thực, thực phẩm tại nhiều quốc gia trên thế giới tập trung ở
Châu Phi, Tây Ấn Độ, Nam Mỹ và Châu Á [2][11].
Cả củ, thân và lá khoai môn sọ đều được sử dụng làm lương thực,thức
ăn chăn nuôi và cơng nghiệp chế biến. Trong đó củ khoai mơn sọ chứa hàm
lượng hydratcacbon cao, hàm lượng chất béo thấp và nhiều chất khoáng. .
Củ dùng để chế biến thành nhiều món ăn ngon như: khoai chiên, khoai hầm
xương, bánh khoai…Củ khoai mơn cịn dùng trong cơng nghiệp chế biến bột
dinh dưỡng trẻ em [11]. Có thể sử dụng tinh bột khoai môn sọ thay thế một
số tinh bột phải nhập khẩu từ nước ngoài để chế biến các loại bánh tươi, xúc
xích, giị, chả… Tinh bột khoai mơn sọ có kích thước nhỏ nhất trong các
loại tinh bột được biết cho đến nay nên chúng có thể thay thế tinh bột ngơ
trong sản xuất plastic sinh học, có khả năng chống thấm khí cao trong bao
gói thực phẩm và bảo vệ môi trường. Lá và dọc lá chứa hàm lượng caroten
và khoáng chất canxi, photpho, kali được sử dụng làm thực phẩm hoặc thức
ăn chăn nuôi[7].
Khoai môn sọ được trồng ở khắp nơi trên đất nước ta, từ những vùng
đất thấp có nước đến nơi có địa hình cao 5 m đến 1800 m so với mặt biển và
ở những điều kiện môi trường khác nhau. Những năm gần đây, diện tích
trồng khoai mơn sọ hàng năm đã lên tới khoảng 15.000 ha, xếp thứ tư về
diện tích trồng sau cà chua, sắn và khoai lang. Các tỉnh trồng nhiều khoai
môn sọ như Sơn La, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Thanh Hóa, Bắc Giang,
Quảng Ninh và Hịa Bình [2].
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
1
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
Đặc biệt trồng khoai mơn sọ có ưu điểm là có thể tận dụng đất ở ven
suối, chân đồi, đất lầy thụt. Hơn nữa cây khoai mơn sọ lại rất ít bị sâu bệnh
nhờ đó mà tiết kiệm được chi phí và nâng cao được hiệu quả kinh tế. Nếu
trồng đúng kĩ thuật cho hiệu quả kinh tế cao gấp 5 lần trồng lúa. Vì thế
phương hướng và mục tiêu trong những năm tới là tập trung đầu tư cho cây
khoai môn sọ phát triển ở những vùng khó khăn nhưng có điều kiện thích
hợp thuộc vùng Trung du, miền núi và Tây Nguyên. Để thực hiện được mục
tiêu trên phải tăng diện tích đi đôi với việc nâng cao sản xuất, xác định cơ
cấu giống thích hợp với từng vùng sinh thái, tập trung nghiên cứu tốt đồng
thời nhanh chóng ứng dụng các tiến bộ khoa học mới[2].
Tuy nhiên cây khoai môn sọ chủ yếu được trồng bằng củ con hoặc các
chồi mắt được ủ nảy mầm từ củ do đó có hệ số nhân giống thấp, lượng củ
làm giống cần nhiều mà chất lượng giống không đồng đều. Hơn nữa cây
khoai môn sọ có thời gian ngủ nghỉ ngắn, dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện
ngoại cảnh rất khó để giữ giống. Việc nhân giống và bảo tồn nguồn gen các
giống khoai mơn sọ đặc sản gặp rất nhiều khó khăn vì các giống địa phương
cho năng suất không cao,thời gian sinh trưởng dài và dễ bị sâu bệnh[11][2].
Nguồn giống thiếu là một trong những hạn chế lớn nhất để có thể trồng đại
trà với quy mơ lớn. Vì vậy u cầu đặt ra là phải xây dựng quy trình kĩ thuật
sản xuất giống đảm bảo chất lượng cung cấp đủ nguồn cây giống sạch bệnh,
có độ đồng đều cao đáp ứng yêu cầu sản xuất.
Hiện nay công nghệ sinh học ngày càng phát triển,để bảo tồn và cung
cấp đủ nguồn giống sạch bệnh nhiều nước đã áp dụng phương pháp nhân
giống in vitro. Phương pháp vi nhân giống bằng tạo củ in vitro đã được tiến
hành và đạt kết quả tốt trên nhiều đối tượng. Tạo củ in vitro có rất nhiều ưu
điểm, có thể tạo được một số lượng giống sạch bệnh,có độ đồng đều cao
trong thời gian ngắn, các củ in vitro cũng dễ dàng vận chuyển và bảo quản
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
2
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
trong thời gian dài[8][10]. Tuy vậy trên thế giới và ở Việt Nam có rất ít báo
cáo về tạo củ khoai môn sọ.
Xuất phát từ những lý do trên và hướng tới mục đích có thể tạo được
một số lượng lớn cây giống khoai môn sọ sạch bệnh phục vụ cho sản xuất,
cung cấp nguyên liệu cho công tác bảo tồn, chúng tôi tiến hành đề tài “
Nghiên cứu quy trình tạo củ in vitro ở một số giống khoai môn sọ địa
phương (Colocasia esculenta (L.) Schott) ”
2. Mục đích và mục tiêu
2.1. Mục đích
Xác lập quy trình tạo củ in vitro từ chồi đỉnh của một số giống khoai
môn sọ nhằm tạo ra nguồn củ giống chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh
phục vụ cho sản xuất đại trà.
2.2. Mục tiêu
- Xác lập điều kiện khử trùng mẫu thích hợp, cơng thức tái sinh và
nhân nhanh chồi, công thức ra rễ nhằm tạo cây in vitro hồn chỉnh.
- Xác định mơi trường tạo củ in vitro của các giống khoai môn sọ
nghiên cứu.
3. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu trên 4 giống khoai môn sọ quý của nước ta:Khoai sọ
Cụ Cang (Sơn La), khoai sọ núi (Bắc Giang), khoai Mán và khoai sọ thơm
(Lạng Sơn).
Các giống khoai môn sọ này được thu thập từ các tỉnh Sơn La, Bắc
Giang và Lạng Sơn.
4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm:
+ Phịng ni cấy mô – Bộ môn Công nghệ vi sinh. Trường ĐHSP
Hà Nội
+ Phịng thí nghiệm Bộ mơn Di truyền học – ĐHSP Hà Nội
- Thời gian: từ tháng 3/2010 – 5/2011
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
3
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
- Cung cấp một số cơ sở lý thuyết cho điều khiển tạo củ.
- Đặt cơ sở để hồn thiện qui trình tạo củ giống in vitro cung cấp
nguồn củ giống chất lượng cao và số lượng lớn cho sản xuất đại trà.
PHẦN II: NỘI DUNG
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Đặc điểm chung của cây khoai môn sọ(Colocasia esculenta (L.)
Schott)
1.1. Phân loại cây khoai mơn sọ
Trong hệ thống phân loại thực vât , lồi khoai mơn sọ có vị trí phân
loại sau
Giới (Kingdom)
:
Thực vât (Plantae)
Ngành (division)
:
Thực vât hạt kín (Magnoliophyta)
Lớp (class)
:
Một lá mầm ( Monocotyledoneae )
Phân lớp
:
Cau (Araceace)
Bộ (oder)
:
Trạch tả (Alismatales)
Họ (family)
:
Ráy (Araceace)
Phân họ (subfamily) :
Aroideae
Chi (genus)
:
Khoai mơn (Colocasia)
Lồi (species)
:
Colocasia esculenta
Cây khoai mơn sọ thuộc chi Colocasia là một trong những loài được
trồng phổ biến vì có giá trị kinh tế hơn cả. Hai lồi đầu tiên của chi
Colocasia được Linnes mơ tả năm 1753 là Arum Colocasia và Arum
esculentum (Hill, 1952). Năm 1789, hệ thống phân loại học các cây họ Ráy
mới được Heinrich Wilhelm Schott chính thức đưa ra, ơng cũng đặt tên cho
hai loài trên là Colocasia esculenta và Colocasia antiquorum. Cho đến thế
kỉ XX đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu phân loại các lồi trong chi
khoai mơn sọ dựa trên đặc điểm hình thái hoa và cơ quan sinh dưỡng nhưng
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
4
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
vì có lịch sử lâu dài trong nhân giống vơ tính nên vấn đề phân loại thực vật
trong chi này còn nhiều điểm chưa thống nhất.
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, thực hiện quyết định của Thủ
tướng Chính phủ về “Kế hoạch hành động đa dạng sinh học Việt Nam”, dự
án “Thành lập ngân hàng gen quốc gia những loài thực vật hữu ích” của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã và đang được triển khai tại Viện
Khoa học và Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam. Kết quả thu thập các lồi cây
trồng lấy củ bước đầu đã có được một tập đoàn giống khá lớn, đáng chú ý là
tập đoàn giống khoai môn sọ (Colocasia esculenta) với hơn 290 mẫu giống
(chiếm 2/3 trong tập đoàn giống đã thu thập đang được bảo tồn và nghiên
cứu tại Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam) [5].
Hiện nay theo điều tra của viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
Việt Nam thì họ Ráy ở Việt Nam có 23 chi và 120 lồi, trong chi Khoai
mơn (Colocasia) có 2 lồi. Tuy nhiên, các nghiên cứu phân loại chủ yếu
sử dụng các tài liệu đã có từ trước hay chỉ mới dừng lại ở mức độ nhận
dạng của các chi. Cho đến nay, vẫn chưa có một khóa định loại các lồi
trong họ Ráy nói chung và trong chi Khoai mơn (Colocasia) nói riêng [2].
Số lượng NST trong bộ NST lưỡng bội của giống khoai môn sọ
nghiên cứu được là: 2n = 22, 26, 28, 38, 42, trong đó phổ biến nhất là hai
dạng 2n = 28 và 2n = 42. Sự sai lệch số lượng NST của giống khoai môn sọ
có thể do sự phát sinh đột biến đa bội và được duy trì thuân lợi nhờ sinh sản
sinh dưỡng[9].
1.2. Nguồn gốc và phân bố
Các bằng chứng phân loại thực vật cho thấy rằng khoai mơn sọ có
nguồn gốc ở Nam Trung Á, có lẽ ở Ấn Độ hoặc bán đảo Mã Lai. Dạng
hoang dại phát sinh ở các vùng khác nhau của Đông Nam Á (Purseglove,
1972). Từ cái nôi này khoai mơn sọ lan về phía đơng, tới phần cịn lại của
Đơng Nam Á và Trung Quốc, Nhật Bản, quần đảo Thái Bình Dương.
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
5
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
Một số tác giả đã cho rằng các hịn đảo của New Guinea có thể là một
trung tâm phát sinh của khoai môn sọ, khác biệt với trung tâm châu Á.
Từ châu Á, khoai môn sọ lan rộng về phía tây tới Ả Rập Saudi và
vùng Địa Trung Hải.
Hơn 100 năm trước công nguyên, cây khoai môn sọ bắt đầu được
trồng ở Trung quốc và Ai cập. Cây khoai môn sọ được du nhập đến châu Phi
khoảng 2000 năm trước, bắt đầu ở Tây Phi và sau đó theo tàu nơ lệ đến
Caribe.
Ngày nay khoai môn sọ được phân bố và trồng chủ yếu ở các vùng
nhiệt đới. Tỉ lệ canh tác cao và đóng góp của khoai mơn sọ vào chế độ ăn
của người dân cao nhất tại quần đảo Thái Bình Dương. Tuy nhiên, diện tích
canh tác lớn nhất lại là tại vùng Tây Phi, do đó chiếm sản lượng lớn nhất.
Cây khoai môn sọ được trồng chủ yếu ở những vùng ẩm ướt của châu Á.
1.3. Đặc điểm hình thái
Cây khoai mơn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) là cây thân thảo,
cao từ 0,5- 2,0m. Cây có một củ cái ở giữa, lá phát triển lên trên, rễ phát
triển xuống dưới, các củ con (cormels), củ nách (daughter corms) và các dải
bò (stolons) phát triển sang ngang. Rễ chùm, ngắn mọc từ đốt mầm xung
quanh thân củ, có nhiều tầng phụ thuộc vào số lá của cây. Phần gốc phình to
thành củ hoặc thân củ chứa tinh bột. Củ cái là cấu trúc thân chính của cây,
có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm phát triển thành nhánh. Mỗi dọc lá lụi đi thì
thân củ có thêm một đốt. Đỉnh củ cái là điểm sinh trưởng của cây, kích
thước và hình dạng củ rất khác nhau và phụ thuộc vào kiểu gen giống và các
yếu tố sinh thái.
Lá là phần duy nhất nhìn thấy trên mặt đất, toàn bộ phần dọc lá tạo nên
thân giả của cây. Mỗi lá cấu tạo bởi một cuống lá thẳng và một phiến lá.
Phiến lá hình khiên, gốc hình tim, có rốn gần giữa (điểm nối giữa
cuống và phiến lá). Trên phiến lá có 3 tia gân chính, một gân chạy từ rốn lá
6
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Trường ĐHSP Hà
Nội
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
đến đỉnh phiến lá, hai gân còn lại chạy ngang về 2 đỉnh của thùy lá. Từ 3 gân
chính có nhiều gân nhỏ tỏa ra tạo thành hình mắt lưới. Cuống lá (dọc lá) xốp,
trong nhu mơ có nhiều khoảng trống. Dọc lá mập có bẹ ơm chặt phía gốc tạo
nên thân giả. Bẹ của dọc lá có chiều dài khoảng 1/3 chiều dài của dọc.
Hoa thuộc loại đơn tính, hoa đực và hoa cái thuộc trên cùng một trục.
Cụm hoa cấu tạo bởi một cuống ngắn, một trục hoa và một bao mo
dài khoảng 20 cm. Hoa khơng có bao, hoa đực màu vàng có nhị tụ nhiều
cánh, hạt phấn trịn, bao phấn nứt rãnh. Hoa cái có bầu một ơ, vịi rất ngắn.
Hình thức thụ phần của khoai môn sọ chủ yếu là nhờ gió. Quả mọng có
đường kính khoảng 3-5cm và chứa nhiều hạt. Hạt thuộc loại có nội nhũ. Tuy
nhiên trong tự nhiện sinh sản bằng hạt ở khoai môn sọ rất hiếm xảy ra[4].
1.4. Sinh trưởng và phát triển
Từ khi trồng đến khi thu hoạch cây khoai môn sọ trải qua 3 thời kỳ
sinh trưởng: ra rễ mọc mầm, sinh trưởng thân lá, phình to của thân củ.
* Giai đoạn ra rễ mọc mầm: Ngay sau khi mọc mầm, rễ hình thành
và phát triển nhanh chóng, tiếp đó là sự phát triển nhanh của chồi (mầm) củ.
Chồi mầm ra khỏi mặt đất thì rễ dài khoảng 3-5 cm. Sự phát triển của rễ tỷ
lệ thuận với sự phát triển của lá: cứ ra một lá thì lại sinh thêm một lớp rễ.
* Giai đoạn sinh trưởng thân lá: Sự hình thành của củ cái bắt đầu
sau trồng khoảng 3 tháng, ngay sau đó là sự hình thành của củ con. Trong
giai đoạn này cây cũng đẻ nhánh phụ. Sự phát triển của lá và chồi giảm
mạnh sau trồng khoảng 5-6 tháng.
* Giai đoạn phình to của thân củ: Khi phát triển của chồi giảm
thì củ cái và củ con phát triển rất nhanh. Cuối vụ (đầu vụ khô) bộ rễ và
các chồi chính chết là thời điểm thu hoạch củ. Nếu củ khơng được thu
hoạch thì củ cái và củ con cho phép cây tồn tại qua mùa khô và mọc thành
cây mới vào vụ tiếp theo. Nhữnxg vùng không có mùa khơ, sau khi thân
tàn củ lại mọc mầm mới và tiếp tục phát triển.
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
7
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
* Q trình ra hoa và kết hạt ở khoai môn sọ là rất hiếm thấy trong
tự nhiên, chỉ xảy ra đối với một số kiểu gen. Hoa quan sát thấy khá sớm
cùng với sự hình thành của củ, hoa được thụ phấn nhờ cơn trùng. Tuy
nhiên, các giống đều kết thúc vòng đời trên đồng ruộng mà khơng có thời
kì ra hoa. Ở Việt Nam trong điều kiện tự nhiên chỉ có các giống khoai
nước thường ra hoa, còn khoai sọ rất hiếm. Từ khi bắt đầu ra hoa đến khi
hoa bắt đầu lụi mất khoảng 20- 25 ngày.
1.5. Điều kiện sinh thái
Cây khoai mơn sọ u cầu nhiệt độ trung bình ngày trên 21 0C.
Điều kiện nhiệt độ thấp và sương mù làm cây giảm sinh trưởng và cho
năng suất thấp.
Cây có bề mặt thốt hơi nước lớn nên có u cầu về độ ẩm cao, cần
lượng mưa hoặc nước tưới khoảng 1500 – 2000mm để cho năng suất tối ưu.
Cây khoai môn sọ đạt năng suất cao nhất trong điều kiện cường độ ánh
sáng cao và năng suất giảm rõ rệt ở điều kiện khơ hạn. Nhưng nó lại là loại
cây chịu được bóng râm hơn hầu hết các loại cây khác. Sự hình thành củ được
kích thích bởi điều kiện ngày ngắn, trong khi đó sự ra hoa được kích thích bởi
điều kiện ngày dài. Cây có thể cho năng suất hợp lý ngay trong điều kiện che
bóng, nơi những cây trồng khác không thể phát triển được. Đây là đặc tính ưu
việt,vì thế cây khoai mơn sọ được coi là cây trồng xen lý tưởng.
Cây khoai mơn sọ thích ứng được với nhiều loại đất khác nhau, được
trồng nhiều ở loại đất chua (pH 5,5 – 6,5), thành phần đất nhẹ và nhiều mùn.
Tuy nhiên, cây môn sọ phát triển tốt nhất trên đất tương đối chua, ngoài ra
một số giống có tính chịu mặn cao. Có lẽ vì thế ở Nhật Bản và Ai Cập,
khoai môn đã được sử dụng tốt như một cây trồng tiên phong trong cải tạo
đất mặn (Kay, 1973). Đây chắc chắn sẽ mở ra khả năng cho việc sử dụng
khoai môn để khai thác một số nơi có điều kiện sinh thái khó khăn mà các
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
8
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
cây trồng khác khơng thể phát triển.
Cũng như các loại cây trồng lấy củ khác, cây môn sọ yêu cầu đất tốt đầy
đủ NPK và các nguyên tố vi lượng để cho năng suất cao. Như vậy, cây khoai
môn sọ là loại cây chịu được hạn, chịu đất chua, đất mặn, đất nghèo dinh
dưỡng, phù hợp để khai thác tại những vùng sinh thái khó khăn, nơi những cây
trồng khác không thể trồng được hoặc kém phát triển. Khoai môn sọ là loại cây
dài ngày, yêu cầu độ ẩm khá cao cho sinh trưởng và phát triển[11].
1.6. Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế và sử dụng
* Thành phần dinh dưỡng: Phần có giá trị kinh tế chính của khoai
mơn sọ là củ cái, củ con và một số giống là dọc lá. Trong củ tươi, nước
chiếm 63 - 65% , hydratcacbon chiếm 13 - 29%, protein chiếm 1,4 - 3,0%
với rất nhiều axit amin cần thiết cho cơ thể. Tinh bột chiếm tới 77,9% lượng
hydratcacbon với 4/5 là amylopectin và 1/5 là amylose. Hạt tinh bột của
khoai môn sọ rất nhỏ, dễ tiêu hố. Chính yếu tố này đã khiến khoai mơn sọ
có thể thay thế các loại cây lương thực khác, là món ăn đặc biệt dành cho trẻ
nhỏ bị dị ứng, những người rối loạn dinh dưỡng và người ăn chay. Lá khoai
môn sọ rất giàu protein, chứa khoảng 23% khối lượng khơ, ngồi ra lá chứa
nhiều Ca, P, Fe, Vitamin C, thiamin, riboflavin.
* Giá trị kinh tế: Cây khoai môn sọ được sử dụng làm lương thực và
thực phẩm khá phổ biến trên thế giới. Các bộ phận của cây là củ cái, củ con,
dọc lá và dải bò đều có thể chế biến thành các món ăn. Trồng khoai sọ lãi hơn
trồng lúa nếu được chăm sóc đúng kĩ thuật, năng suất trung bình đạt 5 - 6 tấn/ ha,
có nơi đạt đến 12 - 13 tấn/ ha với giá trung bình 5000 – 7000VNĐ/kg.
Mặt khác, người dân có thể trồng cây khoai môn sọ tại những vùng
đất xấu hoặc trồng xen với các loại cây khác để tăng thu nhập. Ngồi ra, một
số giống khoai mơn sọ được dùng làm thuốc để chữa bệnh đau đầu, kiết lỵ,
tê phù,…và một số giống lại được trồng để làm cảnh[7].
1.7. Kĩ thuật trồng và chăm sóc
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
9
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
Giống: Có nhiều giống khoai mơn nổi tiếng như khoai ruột đỏ, ruột
tím ở Bắc Kạn; khoai sáp ruột vàng ở Ninh Bình, Lục Yên (Yên Bái), Văn
Lâm, Khoái Châu (Hưng Yên), khoai sọ núi Lai Châu, Hịa Bình, khoai Chũ
(Bắc Giang),… Ở miền Bắc khoai môn chủ yếu được trồng ở các tỉnh miền
núi và trung du, ít trồng ở vùng đồng bằng đất thấp bị ngập nước vì dễ
sượng và ngứa. Giống khoai sọ núi củ to, nhiều tinh bột, ăn ngon được trồng
chủ yếu ở các tỉnh miền núi như Yên Bái, Lai Châu, Thái Ngun, Bắc Kạn,
Hịa Bình… Ngược lại các tỉnh phía Nam như An Giang, Bến Tre, Cần
Thơ… khoai môn được trồng nhiều ở vùng đất bãi, đồng bằng để bán cho
các cơ sở xuất khẩu. Tuy nhiên, các giống khoai mơn miền núi vẫn có thể
trồng được ở đồng bằng nhưng nên chọn các vùng đất cao, tơi xốp, dễ thoát
nước và đặc biệt là lên luống cao như trồng khoai lang mới không bị sượng
và ngứa.
Cách nhân giống: Trước khi trồng 1 tháng nên chọn những củ nhánh
nhỏ, đều nhau đem giâm trong cát ẩm nơi góc nhà ít ánh sáng cho mọc mầm
rồi đem trồng ra ruộng thì tỷ lệ sống mới cao.
Thời vụ: Khoai mơn là loại cây nhiệt đới nên có thể trồng được quanh
năm. Tuy nhiên thích hợp và cho năng suất cao nhất ở vụ đơng xn. Với
các tỉnh phía Nam nên xuống giống từ tháng 10-12, thu hoạch từ tháng 4
đến tháng 6 năm sau. Các tỉnh miền Bắc do nhiều giống có thời gian sinh
trưởng dài hơn (thường từ 8-12 tháng), đặc biệt vùng ĐBSH có 2 vụ trồng
khoai mơn: vụ xuân trồng tháng 3-4, vụ thu trồng tháng 8-9. Khoai sọ có thể
trồng tháng 11-12 và tháng 7 hàng năm.
Chuẩn bị đất trồng: Chọn đất tốt, tơi xốp, giàu mùn, cao ráo, dễ thốt
nước để trồng khoai mơn, khoai sọ. Các loại đất thịt nhẹ, cát pha, đất vườn
miền núi, trung du mới khai hoang thường cho năng suất cao, củ to và chất
lượng tốt, ăn không sượng, không ngứa. Ngược lại nếu đất thấp, dễ bị ngập
nước, nhất là thời gian sắp cho thu hoạch mà bị mưa nhiều hoặc đất ướt thì
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
10
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
củ khơng hình thành bột được, ăn sượng và rất ngứa. Đất được cày sâu, để ải
ít nhất 15-20 ngày rồi bừa kỹ, bón nhiều phân hữu cơ và lên luống cao. Nếu
trồng khoai sọ nên lên luống rộng 2-3m để trồng thành băng; với khoai môn
tốt nhất là trồng luống hẹp hơn: luống đôi 1,2-1,4m hoặc luống đơn 60cm,
cao 50-60cm.
Trồng và chăm sóc: Trên mặt luống trồng các cây cách nhau 3040cm, nếu là luống đơi thì hàng cách hàng 60cm. Trộn đều phân với đất và
trồng thấp hơn mặt đất 3-4cm. Tủ rơm rạ dày 7-10cm rồi tưới nhẹ đủ ẩm.
Nếu có điều kiện trước khi trồng 1 ngày nên phun thuốc trừ cỏ tiền nảy mầm
Ronstar (100cc/1000m2) để hạn chế cỏ mọc. Những ngày đầu tưới nước 1
lần, sau khi khoai đã lên cao có thể tưới rãnh nhưng khơng để ngập mặt
luống. Lượng phân bón được tính cho 1 sào (360m2) bao gồm: 1 tấn phân
chuồng hoai mục + 8 kg đạm urê + 30 kg supe lân + 8 kg kali. Bón lót tồn
bộ phân chuồng và 2/3 lân. Bón lót lần 1 khi cây được 3 lá với 1/2 lượng
đạm, 1/3 kali kết hợp làm cỏ và vun xới. Bón thúc lần 2 sau trồng 60-70
ngày với lượng đạm và lân cịn lại và 1/3 lượng kali. Bón thúc lần 3 sau khi
trồng 150 ngày với số phân kali còn lại kết hợp vun gốc cao cho khoai làm
củ. Trước khi thu hoạch 1-2 tháng hạn chế tưới nước và ngừng hẳn để củ
chuyển hóa tinh bột hồn tồn. Chú ý phát hiện và phòng trừ một số dịch hại
như rệp, nhện đỏ và bệnh thối củ do nấm gây nên.
Thu hoạch: Khi thấy cây khoai đã héo rũ, các tàu lá đã lụi dần, đất ở
gốc đã nứt nẻ nhiều thì tiến hành dỡ khoai nhẹ nhàng, tránh xây xước, dập
nát. Tách củ phân loại theo kích cỡ để tiêu thụ hoặc để làm giống. Bảo quản
khoai thương phẩm và khoai giống nơi thống mát, cao ráo[1][13].
2. Cơng nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật trong công tác giống
cây trồng
2.1. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1. Định nghĩa
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
11
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
Ni cấy mơ, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả
các loại ni cấy ngun liệu thực vật hồn tồn sạch các vi sinh vật, trên
môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật cịn gọi là ni cấy thực vật in vitro
(trong ống nghiệm) để phân biệt với các quá trình ni cấy trong điều kiện
tự nhiên ngồi ống nghiệm gọi là nuôi cấy in vivo.
2.1.2. Khả năng sử dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào công tác
giống cây trồng
* Các loại nuôi cấy mô, tế bào thực vật:
- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.
- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, nỗn chưa thụ tinh.
- Ni cấy phơi: phơi non và phôi trưởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus).
- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
- Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong tế bào thực vật sau khi
đã tách vỏ, cịn gọi là ni cấy tế bào trần.
2.1.3. Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mơ, tế bào thực vật
2.1.3.1.Tính tồn năng của tế bào
Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ
của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để có thể phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân
hóa đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể
sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển
thành một cá thể hồn chỉnh. Đó là tính tồn năng của tế bào.
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
12
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
Tính tồn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra chính là chính là cơ
sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Cho đến nay con
người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật
hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ[4].
2.1.3.2. Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào
* Sự phân hóa tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm
nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào
khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào
đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia
hình thành niều tế bào phơi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên
hóa). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành
các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mơ, cơ quan có chức năng khác nhau.
Khái niệm: Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phơi sinh
thành các tế bào mơ chun hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.
* Sự phản phân hóa
Khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chun biệt
chúng khơng hồn tồn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp
cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phơi sinh
và phân chia mạnh mẽ. Q trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại
với sự phân hóa tế bào.
Phân hóa tế bào
Tế bào phơi sinh
Tế bào dãn
Tế bào chun hóa
Phản phân hóa tế bào
Ví dụ: Khi nuôi cấy mô thuốc lá, các tế bào đã phân hóa của lá gặp
điều kiện thích hợp của mơi trường sẽ phản phân hóa và liên tục phân chia
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
13
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
tạo thành các mơ sẹo (callus). Các tế bào của mơ sẹo khơng cịn có chức
năng như tế bào lá nữa. Nếu chuyển mô sẹo này sang môi trường khác, tùy
theo thành phần môi trường mà tế bào mơ sẹo lại có thể phân hóa theo
hướng hình thành chồi, rễ và có thể hình thành nên cây hồn chỉnh.
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình hoạt
hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển cá
thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra
tính trạng mới, cịn một số gen khác lại bị “đình chỉ” hoạt động. Điều này
xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử
ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực
vật luôn được hài hịa.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mơ của cơ thể thường bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng các tế bào hoặc giảm kích thước
của khối mơ sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ và tế bào thực vật
thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào.
Kỹ thuật ni cấy mô, tế bào thực vật xét cho đến cùng là kỹ thuật điều
khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong
điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và
phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính tồn năng của tế bào thực vật.
Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường
bổ sung vào môi trường ni cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực
vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi
trường khác nhau sẽ tạo sự phát sinh hình thái khác nhau.
Tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là IAA)/cytokinin (đại diện là kinetin)
trong môi trường nuôi cấy thấp thì sự sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
14
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
theo hướng tạo chồi, cao thì mơ ni cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng
tạo rễ, cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mơ sẹo (callus).
Một số đường hướng phát sinh hình thái của mơ ni cấy: Bảng 1
(Phụ lục) [4].
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
15
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
2.2. Nhân giống vơ tính in vitro
2.2.1. Ý nghĩa
Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu
quả kinh tế to lớn thực sự.
Một trong những ưu việt của phương pháp nhân in vitro là việc sử
dụng các mơ ni cấy ở kích thước nhỏ:
- Sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn.
- Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn.
- Mơ ni cấy dễ phân hóa và sau đó dễ tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp
khác khơng có được đó là:
- Có thể nhân giống cây trồng ở quy mơ cơng nghiệp (kể cả trên các
đối tượng khó nhân bằng phương pháp thơng thường).
- Có hệ số nhân cao.
- Tính đồng nhất về mặt di truyền của các cá thể tạo ra cao.
Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng vào các mục đích sau:
- Duy trì và nhân nhanh các các kiểu gen q làm vật liệu cho cơng
tác giống.
- Nhân nhanh các lồi hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.
- Duy trì nhân nhanh các dịng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống
cây rau, cây hoa và cây trồng khác.
- Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.
- Bảo quản tập đoàn gen.
Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng,
đồng tiền, lily, cúc,…), cây lương thực, thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng
tây, cọ dầu, mía, cà phê, cải dầu,…), cây ăn quả(chuối, dứa, dâu tây,…), cây
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
16
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, thông, tùng, dứa sợi,…) đã được phổ biến rất
nhanh vào trong sản xuất.
2.2.2. Quy trình nhân giống vơ tính in vitro
Theo Georger (1993) q trình nhân giống vơ tính in vitro gồm các
bước sau:
- Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
+ Chọn cây mẹ để lấy mẫu: thường là cây ưu việt, sạch bệnh, ở giai đoạn
sinh trưởng mạnh
+Chọn cơ quan để lấy mẫu: thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ,
hoa non hoặc lá non
+Mơ chọn để ni cấy thường là mơ có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh
giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ. Thường sử dụng mô phân
sinh của chồi đỉnh.
Việc chọn lọc và chuẩn bị vật liệu khởi đầu tốt sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu
nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro
- Bước 1: Nuôi cấy khởi động là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi
cấy in vitro.
Giai đoạn này cần đảm bảo tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ mẫu sống cao, mô
tồn tại và sinh trưởng tốt.
- Chuẩn bị mơi trường có các chất dinh dưỡng cần thiết và các chất
điều hịa sinh trưởng thích hợp sau đó được hấp khử trùng.
- Khử trùng bề mặt mẫu vật.
- Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo (ống nghiệm, bình tam
giác), giai đoạn này gọi là cấy mẫu in vitro
Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được
lưu giữ trong phòng với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Sau một thời
gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
17
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc phơi vơ tính có đặc điểm gần như phơi hữu
tính. Giai đoạn này cần ít nhất 4 lần cấy chuyển
- Bước 2: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng số
lượng thơng qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo
phơi vơ tính.
Vấn đề là phải xác định được môi trường nuôi cấy và điều kiện
ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất.
+ Theo ngun tắc chung mơi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích
tạo chồi.
+ Chế độ nuôi cấy thường là: 25-270C;16h chiếu sáng/ngày, cường độ
ánh sáng 2000-4000 lux
Tuy nhiên đối với mỗi đối tượng ni cấy địi hỏi chế độ ni cấy
khác nhau. Chẳng hạn
+ Nhân nhanh súp lơ cần quang chu kỳ 9h chiếu sáng/ ngày.
+ Nhân nhanh phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối,…
Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1 - 2 tháng tùy loại
cây. Hệ số nhân nhanh là 2 - 8 lần/ lần cấy chuyển.
- Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh
sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ
auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân
nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng.
Giai đoạn này thường kéo dài từ 2-4 tuần
- Bước 4: Thích ứng cây in vitro ngồi điều kiện tự nhiên
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
18
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh
trưởng tốt cần đảm bảo một số yếu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định
(số lá, số rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp,
thoát nước.
+ Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm
cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.
2.2.3. Các phương thức nhân giống in vitro
Dựa trên sự phát sinh hình thái của mẫu mà có các phương thức nhân
giống vơ tính in vitro sau đây:
* Hoạt hóa chồi nách.
Sự phát triển của chồi nách được kích thích bằng cách loại bỏ ưu thế
ngọn khi nuôi cấy các đỉnh sinh trưởng và các đoạn thân mang mắt ngủ.
Theo phương pháp này sự phát triển của chồi nách diễn ra theo 2 cách:
- Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (thường gặp khi
nuôi cấy cây hai lá mầm)
- Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (thường gặp khi nuôi cấy
cây một lá mầm)
* Tạo chồi bất định:
Khi mẫu cấy không phải chồi đỉnh mà là các bộ phận khác như: thân, lá,
mảnh lá, cuống hoa,….Trong trường hợp này các tế bào soma hình thành chồi
trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. Trong trường hợp
mô nuôi cấy không tái sinh trực tiếp thành cây mà phát triển thành mơ sẹo thì
mơ sẹo phải qua cấy chuyển mới tạo thành cây. Trường hợp này dễ có sự khơng
ổn định di truyền. Để khắc phục người ta chỉ sử dụng mơ sẹo vừa hình thành để
tái sinh cây vì mơ sẹo qua nhiều lần cấy chuyển sẽ phát sinh biến dị.
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
19
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
Ở cây một lá mầm thường gặp sự phát triển qua giai đoạn dẻ hành
(protocorm) cùng một lúc mẫu cấy tạo hàng loạt protocorm, các cá thể này
hoặc tiếp tục sinh protocorm mới hoặc phát triển thành cây, phương pháp
này cho hệ số nhân giống rất cao.
* Tạo phơi vơ tính:
Phơi là sản phẩm tự nhiên của q trình thụ tinh trong sinh sản hữu
tính. Tuy nhiên trong ni cấy in vitro, phơi có thể hình thành từ các tế bào
soma và gọi là phơi vơ tính. Phơi vơ tính có thể tái sinh cây hoàn chỉnh hoặc
sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo.
2.3. Môi trường nuôi cấy
2.3.1.Thành phần cơ bản của mơi trường ni cấy
Thành phần hóa học của mơi trường đóng vai trị quyết định thành cơng
cho ni cấy mơ và tế bào thực vật. Mỗi lồi cây, kiểu gen giống, kiểu nuôi cấy
khác nhau (mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào trần, hạt phấn) có những địi hỏi
khác nhau về thành phần môi trường. Khi bắt đầu ni cấy mơ một lồi mới
hoặc một giống mới, cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi
trường cơ bản phù hợp.
Hiện nay, các nhà khoa học đã tạo ra một số lượng rất lớn các môi
trường thích hợp với từng đối tượng và mục tiêu nghiên cứu trong đó có một số
mơi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến. Các mơi trường khống cơ bản
được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là: môi trường
MS (Murashige and Skoog, 1962) ; môi trường B5 (Gamborg cs., 1968) ; môi
trường White (1963).
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật gồm một số thành phần
cơ bản như: muối khoáng (đa lượng và vi lượng), các vitamin, các amino
axit, nguồn cacbon (một số loại đường), các phytohoocmon, các chất
hữu cơ bổ sung (nước dừa, dịch chiết nấm men…), chất làm thay đổi
trạng thái mơi trường (các loại thạch).
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
20
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
* Các chất khống
Muối khống là các vật liệu (nguồn N, S, P…) cho sự tổng hợp các chất
hữu cơ. Các muối khống trong mơi trường bao gồm các nguyên tố đa lượng
và các nguyên tố vi lượng.
Nhóm các nguyên tố đa lượng gồm các nguyên tố: Mg, Ca, P, S, N và
K. Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng lớn với nồng độ trên
0,5 mM. Nitơ được sử dụng dưới dạng nitrat (NO3 )ֿ־hoặc amonium (NH4+),
các muối được dùng phổ biến là KNO3, NH4NO3 và Ca(NO3)2.4H2O. Photpho
thường dùng ở dạng HPO42-, các muối được dùng phổ biến là NaH2PO4.7H2O
và KH2PO4. Kali là nguyên tố có mặt trong tế bào với nồng độ cao. Dạng muối
chứa K sử dụng trong môi trường nuôi cấy là KNO3, KCl, KH2PO4. Canxi là
thành phần quan trọng của thành tế bào và tế bào, được đưa vào môi trường
nuôi cấy dưới dạng Ca(NO3)2, CaCl2.2H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2. Lưu huỳnh
được sử dụng chủ yếu và tốt nhất là muối SO2. Magiê được sử dụng dưới dạng
MgSO4.7H2O.
Các nguyên tố vi lượng gồm: Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Co, B, I, Ni, Cl,
Al,...Nhu cầu của thực vật đối với nguyên tố vi lượng ở nồng độ dưới 0,5 mM.
Một số nguyên tố vi lượng có nhu cầu nhỏ có thể thay thế dễ dàng sự lẫn tạp
ngẫu nhiên của chúng trong các thành phần của môi trường như agar, các chất
bổ sung như nước dừa, các muối và nước. Sắt thường tạo phức hợp với các
thành phần khác khi pH môi trường thay đổi. Tốt nhất là sử dụng Fe ở dạng
phức chelat với citrat hoặc với EDTA. Đồng được hấp thu vào cây dưới dạng
Cu2+ hay dưới dạng các phức chất của nó. Mangan tồn tại trong thực vật ở
dạng ion Mn2+ không liên kết. Zn được hệ rễ hấp thu dưới dạng Zn2+. Cl được
hấp thu dưới dạng Cl‾.
* Nguồn Cacbon
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức
dị dưỡng. Vì vậy, việc đưa vào mơi trường ni cấy nguồn cacbon hữu cơ là
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
21
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
bắt buộc. Nguồn cacbon thơng dụng nhất đã được kiểm chứng là sucrose với
nồng độ thích hợp phổ biến là 2 – 3%. Khi khử trùng, đường sucrose bị thủy
phân một phần thuận lợi cho cây hấp thụ. Ngồi ra cịn sử dụng đường glucose
(ni cấy protoplast), maltose (nuôi cấy bao phấn). Các loại đường khác và các
dạng polysaccharide cũng đã được thí nghiệm song tỏ ra kém hiệu quả và chỉ
dùng trong một số trường hợp đặc biệt.
* Vitamin
Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả
năng tổng hợp được hầu hết các loại vitamin thường khơng đủ về lượng vì vậy
cần bổ sung thêm, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B như: B1 (Thiamin HCl
hoặc Aneurin), B2 (Riboflavin, Lactoflavin), B6 (Pyridoxin, Adermin), Myo
inositol (Bios I), Biotin (Bios II). Trong số đó Myo inositol có vai trị trong
sinh tổng hợp thành tế bào, thường được sử dụng ở nồng độ cao 100 ppm.
* Các hoocmon sinh trưởng (phytohoocmon)
Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần quan trọng
nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các hoocmon sinh trưởng. Các hoocmon đó
thuộc các nhóm: Auxin, Cytokinin, axit Gibberelin và axit Abscisic (ABA).
Auxin là hoocmon sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện ra.
Tác dụng chủ yếu là kích thích sinh trưởng của tế bào, làm tăng phân bào. Có 4
loại auxin thường sử dụng trong nuôi cấy in vitro là:
IAA (Indolylacetic axit): tồn tại trong tự nhiên
NAA (Naphthylacetic axit): tổng hợp nhân tạo
2,4 D (2,4- Dichlorphenoxyacetic axit): tổng hợp nhân tạo
IBA (Indolylbutyric axit): tổng hợp nhân tạo
Các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn do đặc điểm phân tử của
chúng khơng bị các enzim oxi hóa auxin (auxinoxidase) tác động. Kinh nghiệm
sử dụng auxin trong môi trường nuôi cấy mô là lúc đầu dùng nồng độ cao sau
thấp hơn để tránh nhiễm độc mơ.
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
22
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
Cytokinin có tác dụng kích thích q trình phân chia tế bào, có 3 loại
chính thường dùng trong nuôi cấy mô là: kinetin, zeatin và BAP (6Benzylaminopurin). Kinetin là dẫn xuất của adenin và đây là một chất nhân
tạo. Sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi nhưng nếu xử lý cùng auxin ở
tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích q trình phân chia tế bào. Zeatin cũng
là một dẫn xuất của adenin nhưng đây là một hoocmon phân bào tự nhiên được
chiết xuất thành công đầu tiên từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô. Zeatin
chỉ được dùng trong trường hợp đặc biệt vì quá đắt. BAP là một sản phẩm tổng
hợp nhân tạo nhưng hoạt lực cao hơn nhiều so với kinetin và bền vững hơn
zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao.
Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy khơng phải
các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh
trưởng nội sinh. Phân chia tế bào phân hóa và biệt hóa được điều khiển bằng sự
tác động tương hỗ giữa các loại hoocmon ngoại sinh và nội sinh.
Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến
sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu của
Skoog cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho hình thành rễ,
thấp sẽ kích thích q trình phát sinh chồi, ở mức cân bằng thì thuận lợi cho
phát triển mơ sẹo (callus). Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ
khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ
sự tổng hợp ADN, dẫn đến quá trình nguyên phân và cảm ứng cho sự phân
chia tế bào. Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào
được cảm ứng bởi auxin, cịn trong các giai đoạn tiếp theo thì cần tác động
đồng thời của cả hai chất kích thích.
* Abcisic axit (ABA): thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng. Nó có
tác dụng làm tăng cường khả năng chống chịu của tế bào với điều kiện ngoại
cảnh bất lợi. Vì vậy, ABA được đưa vào môi trường tái sinh cây và đem lại
hiệu quả nhất định.
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
23
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
* Chất làm thay đổi trạng thái môi trường (agar)
Là một loại polysaccharide thu được từ một số tảo biển, agar được sử
dụng để làm chất đệm cho môi trường dinh dưỡng rắn lại. Ở 800C, thạch ngậm
nước chuyển sang trạng thái sol và ở 400C trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm
nước của thạch là 6 -12g thạch/l nước.
* Các chất hữu cơ bổ sung
Để thành phần môi trường dinh dưỡng ngày càng phong phú, đầy đủ
hơn người ta đã sử dụng một số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên như: nước dừa,
dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mì...
* Nước
Ni cấy mơ sử dụng loại nước hồn tồn sạch ion, thơng thường sử
dụng nước cất hai lần và tốt nhất là sử dụng hệ thống cất nước thủy tinh.
* Độ pH của môi trường
Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu
nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Khi điều chỉnh pH cho
thích hợp với các loại cây thì phải dùng NaOH để điều chỉnh tăng hoặc dung
dịch HCl loãng để làm giảm pH của môi trường về 5,5 – 6,5.
2.3.2 Chuẩn bị môi trường
Như trên đã thấy, môi trường dinh dưỡng dùng cho ni cấy mơ và tế
bào có thành phần phức tạp bao gồm: muối khoáng (đa lượng và vi lượng),
nguồn cacbon, vitamin, axitamin, các chất điều hòa sinh trưởng,…Để tiết
kiệm thời gian và hóa chất người ta thường chuẩn bị các dung dịch mẹ có
nồng độ cao (10-100 lần), sau đó chuẩn bị mơi trường ni cấy từ các dung
dịch mẹ này. Ngày nay nhiều hãng hóa chất đã chuẩn bị sẵn các dung dịch
mẹ, khi mua về chỉ cần pha loãng ra để dùng.
- Đối với các muối đa lượng, thường pha dung dịch mẹ có nồng độ
gấp 10 lần giữ ở 20C – 40C có thể sử dụng trong vòng 1-2 tháng.
- Các muối vi lượng và các vitamin dung dịch mẹ có thể gấp 100 lần.
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
24
Trường ĐHSP Hà
Khóa luận tốt nghiệp
Hà
Phạm Thị Thu
- Các chất điều hịa sinh trưởng pha dung dịch 1 – 2mg/ml và giữ ở 200C để dùng dần.
* Chuẩn bị môi trường lỏng từ các dung dịch mẹ
a. Đong khoảng 500ml nước cất hai lần.
b. Cho thêm các dung dịch từ các dung dịch mẹ dựa trên số lượng
định chuẩn bị.
c. Cho thêm đường, chất kích thích sinh trưởng.
d. Cho thêm nước cất hai lần cho đủ số lượng định chuẩn bị.
e. Chỉnh pH của mơi trường.
f. Đổ mơi trường vào bình ni cấy.
g. Khử trùng môi trường.
* Chuẩn bị môi trường thạch
a. Đong lượng nước cất hai lần bằng khoảng 1/3 số lượng môi trường
định chuẩn bị.
b. Cho thêm thạch (từ 6-8g/l tùy theo loại thạch) sau đó đun cho
thạch tan đều.
c. Đong nước cất hai lần bằng 1/3 số lượng môi trường định chuẩn bị.
d. Làm tiếp các bước giống như các bước b, c, g của chuẩn bị môi
trường lỏng từ các dung dịch mẹ.
e. Trộn thạch đã tan với môi trường vừa chuẩn bị ở bước 4 cho thêm
nước cất hai lần cho đủ môi trường cần chuẩn bị.
f. Đổ mơi trường vào các bình ni cấy.
g. Khử trùng mơi trường.
* Khử trùng mơi trường
Líp: K57A - Khoa Sinh học
Nội
25
Trường ĐHSP Hà
