sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (mas) chọn lọc các dòng lúa triển vọng cho năng suất cao mang qtl gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC








ĐỖ NGỌC TUYỀN


SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ
PHÂN TỬ (MAS) CHỌN LỌC CÁC DÒNG LÚA TRIỂN VỌNG
CHO NĂNG SUẤT CAO MANG QTL/GEN QUY ĐỊNH
TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG




LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC








ĐỖ NGỌC TUYỀN


SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG NHỜ CHỈ THỊ
PHÂN TỬ (MAS) CHỌN LỌC CÁC DÒNG LÚA TRIỂN VỌNG
CHO NĂNG SUẤT CAO MANG QTL/GEN QUY ĐỊNH
TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG



CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60.42.02.01

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN ĐĂNG KHÁNH



THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện hầu hết các nghiên cứu trong
luận văn này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao
chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này
chưa từng được công bố.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Tác giải luận văn


Đỗ Ngọc Tuyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học này, tôi xin bày tỏ
sự biết ơn vô cùng sâu sắc tới TS.Trần Đăng Khánh – Phòng sinh học phân
tử - Viện di truyên Nông Nghiệp về những hướng dẫn tận tình, chu đáo bên
cạnh những kiến thức sinh học bổ ích khác.
Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn, giúp đỡ
quý báu, nhiệt tình của tập thể cán bộ thuộc:
1. Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp
2. Khoa Khoa học sự sống, Đại học Khoa học Thái Nguyên
là những nơi tôi đã tiến hành luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học của mình.
Luận văn này được thực hiện với nguồn kinh phí từ Quỹ phát triển
Khoa học và Công nghệ Quốc gia.



Tác giả luận văn


Đỗ Ngọc Tuyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv
Danh mục bảng v
Danh mục hình vi
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Nguồn gốc, phân loại, ý nghĩa của cây lúa 4
1.2. Chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống 6
1.2.1. Chỉ thị phân tử 6
1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống ( Phương
pháp Marker assisted selection- MAS) 11
1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu 15
1.3.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu quốc tế 15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 21
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Vật liệu nghiên cứu 24
2.1.1.Giống lúa nghiên cứu 24
2.1.2.Các chỉ thị phân tử và hóa chất thí nghiệm 24
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.2. Phương pháp nghiên cứu 25
2.2.1. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng 25
2.2.2. Các phương pháp thí nghiệm trong phòng 25
2.2.3. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu. 30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


iv
Chƣơng 3: KẾT QỦA NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen Yd7 giữa
giống Khang Dân 18 và giống KC25 31
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 31
3.1.2. Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen Yd7 31
3.2. Kết quả lai tạo thế hệ F1 của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25 32
3.3. Kết quả xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F1 của tổ
hợp lai Khang Dân 18 và KC25 33
3.4. Kết quả xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F2 của tổ
hợp lai Khang Dân 18 và KC25 34
3.5. Kết quả xác định các cá thể trong quần thể F3 của tổ hợp Khang Dân
18 và KC25 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt/bông 37
3.6. Kết quả xác định dòng lúa triển vọng mang QTL/gen Yd7 cho năng
suất cao 40
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
4.1. Kết luận 42
4.2. Kiến nghị 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
PHỤ LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA
:
Deoxyribonucleic Acid
AFLP
:
Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình
chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc
Bp
:
Base pair – Cặp bazơ nitơ
Cs
:
Cộng sự
dNTP
:
Deoxynucleotide triphosphate
MAS
:
Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử
PCR
:
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp
QTL/QTLs
:
Quantitative Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số

lượng
RAPD
:
Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình
ADN được nhân bản ngẫu nhiên
RFLP
:
Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình
chiều dài mảnh phân cắt giới hạn
SSR
:
Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản
TBE
:
Tris-Boric Acid-EDTA



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

v
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Thông tin những cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu 24
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 27
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 27
Bảng 3.1: Bảng thống kê kết quả thí nghiệm 40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

vi
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Minh họa QTL/gen Yd7………….………………………………. 26
Hình 3.1: Kết quả tách DNA tổng số trên gel agarose 0,8% …… ….… . …31
Hình 3.2: Sản phẩm điện di với các chỉ thị trên gel agarose 2,5% … . …32
Hình 3.3: Kết quả lai tổ hợp Khang dân 18 và KC25……………….……… . 33
Hình 3.4: Kết quả điện di trên gel agarose 2,5% với chị thị RM500 33
Hình 3.5: Kết quả điện di trên gel agarose 2,5% với chị thị RM21615 34
Hình 3.6 : Kết quả điện di kiểm tra quần thể F2 với chỉ thị RM21615 35
Hình 3.7: Kết quả điện di kiểm tra quần thể F2 với chỉ thị RM500 36
Hình 3.8: Kết quả điện di kiểm tra quần thể F3 với chỉ thị RM500 38
Hình 3.9: Kết quả điện di kiểm tra quần thể F3 với chỉ thị RM445 39


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Lúa (Oryza sativa) là cây lương thực quan trọng, với diện tích trồng
khoảng 148,4 triệu hecta trên toàn thế giới (trong đó châu Á chiếm 135 triệu
hecta). Lúa gạo là một trong những cây trồng cung cấp nguồn lương thực
quan trọng nhất, lúa có ảnh hưởng đến đời sống của ít nhất 65% dân số thế
giới. Châu Á chiếm 90% diện tích đất trồng lúa của thế giới với sản lượng
651 triệu tấn chiếm 92% tổng sản lượng lúa gạo thế giới (Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn, 2010), trong đó khoảng 75% diện tích lúa được trồng
trong điều kiện ruộng ngập nước, 19% diện tích lúa trồng trong điều kiện
ruộng thấp nhờ nước trời và khoảng 4% diện tích lúa trồng trong điều kiện
ruộng cạn, không chủ động nước.
Việt Nam có 4,36 triệu hecta trồng lúa, sản lượng đạt 34,4 triệu tấn,
năng suất bình quân 4,67tấn/hecta, xuất khẩu 44 triệu tấn gạo.Ở Việt Nam lúa
gạo là một trong những sản phẩm xuất khẩu chủ lực của nền nông nghiệp và
cũng là nguồn lương thực chính của hơn 86 triệu dân trong nước. Do quá trình
đô thị hóa, công nghiêp hóa diễn ra nhanh chóng, diện tích đất dành cho việc
trồng lúa ngày càng bị thu hẹp, và chịu những ảnh hưởng tiêu cực từ biến đổi
khí hậu làm năng suất lúa bị sụt giảm rõ rệt, cùng với áp lực dân số ngày càng
tăng đòi hỏi nguồn cung lương thực ngày càng lớn. Vì vậy, đáp ứng sản lượng
lương thực là rất cần thiết. Việc phát triển nguồn giống đã được cải tiến cho
năng suất cao, chất lượng tốt là yếu tố quan trọng cho việc đảm bảo hệ thống
sản lượng lúa. Chọn tạo giống lúa có khả năng năng suất cao là hết sức cần
thiết, cấp bách và có ý nghĩa cho an toàn lương thực và tăng thu nhập của
nông dân.Trong công tác chọn giống cây trồng, các tính trạng được khảo
nghiệm là những tính trạng liên quan đến năng suất, phẩm chất của sản phẩm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

2

và chủ yếu liên quan tới việc tăng cường tính chống chịu đối với sâu bệnh và
điều kiện ngoại cảnh bất lợi, những đặc điểm mong muốn về hình thái luôn bị
ảnh hưởng từ điều kiện môi trường hoặc không biểu hiện khi điều kiện ngoại
cảnh không phù hợp.
Xuất phát từ những thực tế trên tôi thực hiện đề tài: “Sử dụng phương
pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) chọn lọc các dòng lúa triển
vọng cho năng suất caomang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên
bông”với mục tiêu thông qua phương pháp MAS (Marker - Assisted
Selection) xác định được các dòng lúa triển vọng cho năng suất cao.
2. Mục đích nghiên cứu
Chọn được cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên
bông ở thế hệ F1, F2, F3 của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25.
Ứng dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử chọn lọc dòng
lúa mang QTL/gen và cho năng suất triển vọng.
3. Ý nghĩa của đề tài
Xác định kiểu gen ở cả quần thể F1, F2, F3, khẳng định sự có mặt của
QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông trong quần thể.
Đánh giá nhanh và chính xác các dòng lúa mang QTL/gen làm tăng
năng suất.
Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử làm giảm thời gian, công sức và vật
chất nhiều lần so với chon giống bằng phương pháp truyền thống.
Tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về các tính trạng tăng năng suất.
4. Nội dung nghiên cứu
4.1. Xác định chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen Yd7 giữa giống Khang
Dân 18 và giống KC25.
4.2. Lai tạo thế hệ F1 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3

4.3. Xác định con lai F1 của tổ hợp lai Khang Dân 18 và KC25.
4.4. Xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F2 của tổ hợp lai
Khang Dân 18 và KC25.
4.5. Xác định cá thể mang QTL/gen Yd7 trong quần thể F3 của tổ hợp lai
Khang Dân 18 và KC25.
4.6. Xác định dòng lúa triển vọng mang QTL/gen Yd7 cho năng suất cao.












Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, phân loại, ý nghĩa của cây lúa
Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Poaceae, trước đây là họ Gramineae) thân
bụi, lá mềm. Lúa trồng thuộc chi Oryza với nhiều loài khác nhau. Hai loài được
quan tâm nhiều hơn cả là Oryza sativa L. và Oryza glaberrima L. có nguồn gốc
ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khu vực đông nam châu Á và châu Phi. Hai
loài này cung cấp hơn 1/5 toàn bộ lương thực mà con người sử dụng.
Loài Oryza sativa L. có ba loài phụ là Indica, Japonica, và Javanica.
Trong đó, Indica là loại lúa được trồng nhiều ở các vùng nhiệt đới, Japonica

được trồng ở vùng ôn đới. Loài Oryza sativa L. có số nhiễm sắc thể đơn bội n
= 12. Tám trong số 23 loài lúa dại có bộ gen tứ bội, đại đa số các loài lúa dại
và lúa trồng hiện nay có bộ gen lưỡng bội (2n). Hiện có khoảng 83.000 mẫu
lúa được lưu giữ ở ngân hàng gen quốc tế tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế
(IRRI), ngân hàng gen quốc gia Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia,
Việt Nam, Trong đó, có khoảng 9700 mẫu giống lúa đặc thù cho tính chịu
hạn, úng, nóng, lạnh, sâu bệnh.
Cây lúa Việt Nam (Oryza sativa L.) còn được gọi là lúa châu Á vì nó
được thuần hóa từ lúa dại từ ba trung tâm đầu tiên ở châu Á. Theo đặc điểm
lúa trồng Việt Nam thì chủ yếu là các giống Indica.
Lúa là cây lương thực quan trọng trong đời sống của con người. Lúa
cung cấp lương thực cho hơn 1/2 dân số thế giới. Trên 2/3 lượng calo cho 3 tỷ
dân ở châu Á, 1/3 lượng calo cho 1,5 tỷ dân ở châu Phi và châu Mỹ La Tinh
là do lúa cung cấp. Trong cơ cấu sản xuất lương thực của thế giới lúa mì
chiếm 30,5%, lúa gạo 26,5%, ngô 24%, còn lại là các loại ngũ cốc khác.
Cây lúa đem lại hiệu quả kinh tế cao. Ngoài việc sử dụng làm lương
thực, các sản phẩm phụ, cây lúa còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

5
nhau như: Làm nguyên liệu sản xuất rượu, bia, sản xuất tinh bột, cồn, phấn
mịn, cám gạo có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc; trong công nghệp dược
dùng để sản xuất vitamin B1, dầu cám có chất lượng cao dùng chữa bệnh, chế
tạo sơn cao cấp, làm mỹ phẩm, xà phòng; trấu dùng để sản xuất nấm men…;
rơm rạ có thể dùng làm chất đốt, sản xuất giấy, sản xuất nấm.
Châu Á vốn là vùng đông dân cư và cũng là vùng sản xuất lúa gạo chủ
yếu của thế giới, trong thập kỷ qua cũng có những tiến bộ đáng kể trong việc
năng cao năng suất và sản lượng lúa gạo. Châu Á sản xuất khoảng 92% tổng
sản lượng lúa gạo của thế giới, châu Mỹ 4,7%, châu Phi 2,7%, châu Đại

dương sản xuất khoảng 0,2% tổng sản lượng lúa gạo của thế giới. Những
nước sản xuất lúa gạo lớn nhất thế giới đều tập trung ở các nước châu Á như
Bangladet, Myanma, Việt Nam, Trung Quốc, Indonexia, Ấn Độ, Triều Tiên,
Thái Lan và Nhật Bản, sản xuất khoảng 90% sản lượng lúa gạo của Châu Á
và khoảng 88,6% sản lượng lúa gạo thế giới. Riêng hai nước Trung Quốc và
Ấn Độ sản lượng chiếm 67% tổng sản lượng lúa gạo của châu Á và khoảng
57% tổng sản lượng của thế giới.
Việt Nam nằm ở vùng Đông nam châu Á, khí hậu nhiệt đới gió mùa rất
thích hợp với sự phát triển của cây lúa. Có nhiều đồng bằng châu thổ rộng lớn
được bồi đắp thường xuyên như đồng bằng châu thổ sông Hồng và đồng bằng
sông Cửu Long cùng hàng loạt các châu thổ nhỏ hẹp ở ven các dòng sông, và
ven biển miền trung khác. Các đồng bằng châu thổ đều được sử dụng trong
sản xuất nông nghiệp, chủ yếu là nghề trồng lúa. Sản xuất lúa gắn liền với sự
phát triển của nền nông nghiệp nước ta. Đến nay, nghề trồng lúa của Việt
Nam không ngừng phát triển. Năm 2006, tổng diện tích trồng lúa là 7,32
triệu hécta với sản lượng đạt 35,83 triệu tấn, trong đó đồng bằng sông Cửu
Long và đồng bằng sông Hồng chiếm khoảng 66,8% diện tích gieo trồng và
69% tổng sản lượng cả nước. Từ một nước thiếu đói triền miên, Việt Nam đã

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

6
vươn lên cung cấp đủ gạo cho người dân và trở thành nước xuất khẩu gạo
đứng thứ hai trên thế giới.
Để nâng cao hiệu quả sản xuất lúa gạo thì việc tạo ra các giống lúa có
năng suất cao có vai trò quan trọng
1.2. Chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống
1.2.1. Chỉ thị phân tử
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử,
các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn đến vấn đề chọn giống nhờ

chỉ thị phân tử. Trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, quá trình chọn lọc
được dựa trên cơ sở các chỉ thị phân tử liên kết với các gen quy định tính
trạng cần quan tâm.
Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử trong chọn giống đã trở nên hữu hiệu
không chỉ đối với các tính trạng được điều khiển bởi các gen chính mà đối với
cả những tính trạng số lượng được điều khiển bởi các gen phụ hay các QTLs.
Hiệu quả cải tiến cây trồng sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với chọn giống cổ
điển, nhờ thực hiện chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn,
mà thông qua chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng đó. Phương pháp này cho
phép thanh lọc kiểu hình với một khối lượng quần thể lớn. Thông qua chọn
lọc nhờ chỉ thị phân tử, người ta có thể xác định được cây mang gen ngay thế
hệ phân ly đầu tiên ở F2, F3. Như vậy các nhà chọn giống có thể rút ngắn thời
gian đánh giá kiểu hình, tập trung chọn lọc những mục tiêu quan trọng khác có giá
trị về mặt kinh tế. Nếu so sánh với chọn lọc kiểu hình, MAS có thể giúp các nhà
chọn giống tiết kiệm từ 1 đến 16,7 lần trong chọn lọc quần thể [35].
Một chỉ thị phân tử ADN đạt tiêu chuẩn cần có những yêu cầu như: bản
chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội (cho phép phân biệt cá thể đồng
hợp tử - dị hợp tử), phân biệt rõ ràng giữa các alen, xuất hiện nhiều trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

7
genôm (tần suất xuất hiện trong hệ genôm cao), phân bố đều trên hệ
genôm, dễ dàng tiếp cận đánh giá, trạng thái trung tính (không chịu tác
động đa gen), phân tích nhanh và dễ dàng, khả năng tái lập cao, kết quả
trao đổi dễ dàng giữa các cơ sở nghiên cứu, chi phí thấp [33], [55]. Trong
thực tế, không có một chỉ thị phân tử ADN nào lý tưởng, đạt được đầy đủ
những yêu cầu này; tùy từng mục đích nghiên cứu mà người ta sử dụng hệ
thống các chỉ thị phân tử DNA thỏa mãn một số điều kiện chính [1].
Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử còn là phương tiện hữu ích trợ giúp đắc

lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác
chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ chọn lọc loại bỏ được các tác
nhân gây nhiễu do các tương tác trong cùng aloen hay giữa các alen gây ra
những này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình.
Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn
hoặc thậm chí đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt.
Các chỉ thị phân tử DNA bao gồm:
Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sởphép lai DNA hay chỉ thị RFLP
Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như AFLP,
RAPD, STS, SSR
a. Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism - Đa hình
chiều dài mảnh phân cắt giới hạn ).
Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong
nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người [20]. Trong chỉ thị
RFLP, enzym giới hạn được sử dụng để cắt DNAgenome thành nhiều mảnh
DNA có độ dài khác nhau. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự
nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong DNA bộ gen như đảo đoạn,
thêm hoặc mất đoạn DNA tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

8
thể. Mỗi loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy khi sử
dụng những enzym giới hạn để cắt phân tửDNA của hệ gen, các đoạn cắt ra
của DNA với kích thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các
dấu hiệu di truyền để xem xét các mẫu nhiễm sắc thể. Sự nhận biết các đoạn
cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật lai với các DNA mẫu dò. Chỉ thị RFLP là chỉ
thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locus
gen. Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các
cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị RFLP. Hạn chế của

phương pháp này là tốn nhiều thời gian và công sức, đòi hỏi có phòng thí
nghiệm với nhiều trang thiết bị kỹ thuật cao, đặc biệt là tiêu hao một lượng
lớn DNA mà số lượng đa hình thu được khá ít, thậm chí ở một số loài khó
nhận được đa hình
b. Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs – Đa hình
các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên).
Đây là loại chỉ thị di truyền được tạo ra trên cơ sở của phản ứng PCR,
sử dụng một loại mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit và quá trinh nhân bội ngẫu
nhiên. Sản phẩm nhân bội có thể được phân tách bằng điện di trên gel agarose
hoặc polyacrylamide và có thể được quan sát sau khi nhuộm gel với các hoá
chất đặc trưng. Nó là loại chỉ thị di truyền trội. Sự khác biệt giữa hai cá thể có
thẻ nhận biết bằng sự có mặt hay vắng mặt của những băng RAPD đặc trưng.
Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền, dễ sử dụng.
c. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình
chiều dài các đoạn DNA nhân bản chọn lọc).
Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn và PCR
[54]. Để thiết kế được các mồi đặc trưng trước hết cắt các mẫu nghiên cứu
bằng enzym giới hạn. Khi xử lý enzym giới hạn DNA sẽ bị cắt thành vô số
mảnh có kích thước khác nhau. Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

9
nucleotide của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các
đoạn gắn (adaptor). Sau đó dùng enzym ligase để nối các đoạn DNA thích
ứng vào hai đầu DNA đã cắt. Dựa vào trình tự adaptor ta thiết kế mồi PCR.
Mồi PCR gồm hai phần: Một phần có trình tự bổ sung với adaptor và phần kia
là những nucleotide được thêm vào tùy ý, thường từ 1 – 3 nucleotide. Với mồi
thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn DNA có trình tự ở hai đầu bổ sung với
trình tự mồi mới được nhân bản.Ưu điểm của phương pháp này là lượng DNA

sử dụng cho nghiên cứu ít, băng DNA ổn định, khả năng ứng dụng rộng rãi
và do có thể bổ sung các nucleotide khác nhau khi thiết kế mồi nên số lượng
mồi có thể thiết kế được và tiềm năng ứng dụng rất lớn. AFLP còn cung cấp
một lượng đa hình DNA lý tưởng từ DNA của bất kỳ nguồn gốc nào từ đơn
giản đến phức tạp. AFLP cũng được coi là công cụ hiệu quả nghiên cứu tính
đa hình di truyền, tìm chỉ thị liên kết, xây dựng bản đồ di truyền mật độ cao.
Đặc biệt được dùng trong phân tích DNA từ nhiều nguồn gốc với mức độ
phức tạp khác nhau.
d. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được
đánh dấu).
Chỉ thị STS do M. Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một
đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật
PCR. Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng
các trình tự nucleotide đã biết trước của DNA trong genome. STS là chỉ thị
nhân bản trực tiếp những locut đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được
thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locut đặc trưng này.
Chỉ thị này được đưa ra từ việc xác định trình tự hai đầu của mẫu dò RFLP,
trên cơ sở đó người ta thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR. Sử dụng trong
lĩnh vực chọn giống dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

10
tâm trong quần thể và phân tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng
giữa các loài [48].
e. Chỉ thị SSR (Simple sequence repeats)
Chỉ thị SSR lần đầu tiên được thiết kế và ứng dụng trong nghiên cứu ở
người vào năm 1989 và ứng dụng chọn tạo giống cây trồng vào cuối năm
1992. SSR là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị
có chiều dài từ 1 – 6 nucleotide lặp lại được gọi là Microsatellites. SSR có

trong khắp hệ gen của sinh vật. Bản chất đa hình của Microsatellites có thể
được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn
mồi bổ sung với trình tự gần kề hai đầu đoạn lặp lại. Giá trị của SSR ở chỗ nó
sinh ra đa hình từ nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản
chât đồng trội, nên dễ dàng phát hiện bởi các phản ứng PCR.
Nguyên lý của kỹ thuật SSR dựa trên những đoạn DNA lặp lại một
cách có trật tự, hiện tượng này phổ biến với các sinh vật nhân chuẩn, tuỳ
thuộc vài từng loài mà số lượng các nuleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể
thay đổi. Các đoạn SSR thường nằm ở vùng gần tâm động hoặc ở đầu mút của
nhiễm sắc thể và có vai trò điều hoà hoạt động của gen. SSR là kỹ thuật dựa
trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các tình tự lặp
đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp
theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi. Các trình tự gần kề và các
trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. Các mồi SSR sau đó được sử dụng tương tự
như các mồi RAPD.
f. Chỉ thị ISSR
ISSR là kỹ thuật dựa trên PCR, nhân bản các đoạn DNA nằm giữa hai
vùng lặp SSR hướng ngược chiều nhau sử dụng một loại mồi duy nhất (dài
khoảng 15 – 25 nucleotit) có trình tự lặp giống như chỉ thị SSR. Các mồi
ISSR có thể được bổ sung thêm từ một đến bốn nucleotit “neo” ở đầu 3’ [63]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

11
hoặc đầu 5’ [68] nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng nhân gen. Hầu hết chỉ
thị ISSR là chỉ thị trội và có tính ổn định cao hơn chỉ thị RAPD. Dựa trên các
trình tự lặp và số nucleotit làm “neo” để thiết kế mồi ISSR thì số lượng chỉ thị
ISSR gần như là không giới hạn [33]. Chỉ thị ISSR có tính đa hình cao và rất
hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền.
Bên cạnh SSR và ISSR còn có nhiều chỉ thị khác được phát triển dựa

trên các trình tự lặp nhưng không được sử dụng rộng rãi như STMS và
DAMD-PCR [33].
1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo giống ( Phƣơng
pháp Marker assisted selection- MAS)
Chỉ thị phân tử là các gen hoặc trình tự nucleotide đặc hiệu trong hệ
gen của sinh vật, nó có khả năng định lượng và di truyền như nhân tố
Menden. Có thể hiểu đơn giản chúng như các cột mốc nằm trên trình tự DNA
trong hệ gen. Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối giữa
chúng phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống hay một loài trong quần
thể. Sinh vật có khả năng nhân bản DNA của chúng với độ chính xác cao
nhưng có nhiều cơ chế xảy ra có thể làm biến đổi cấu trúc DNA, đơn giản như
các cặp bazơ hay phức tạp như đảo đoạn, chuyển đoạn hoặc mất đoạn Do
đó với sự ra đời của chị thị phân tử, phương pháp chọn lọc bằng chỉ thị phân
tử là một cách tiếp cận mới giúp tránh được những vấn đề gặp phải ở chọn
giống truyền thống, bằng cách thay đổi hình thức chọn lọc từ kiểu hình sang
chọn lọc kiểu gen một cách trực tiếp hay gián tiếp.
a. Ưu điểm của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái
Chỉ thị phân tử rõ ràng không bị ảnh hưởng tác động của môi trường và
điêu kiện sống của cây trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng. So với chỉ thị
hình thái, chọn lọc bằng chỉ thị phân tử có các ưu thế sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

12
Kiểu gen của các locut chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ
giai đoạn nào và ở bất kì mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể.
Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kì lớn, trong khi chỉ thị hình thái là
hạn chế.
Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với
những hiệu ứng có hại, trong khi sự đánh giá của các chỉ thị hình thái thường

hay đi kèm với các hiệu ứng phụ không mong muốn.
Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép
phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của chị thị
hình thái tương tác theo kiểu trội lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ
hợp lai.
Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc
đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ
thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp.
b. Điều kiện để ứng dụng MAS
Sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào ba
yếu tố chính:
Bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các
vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm.
Mỗi liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs.
Sự tái tổ hợp thích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen.
Khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một thời gian và
thành hiệu quả.
Thành công của MAS còn phụ thuộc vào vị trí của chỉ thị so với gen
quan tâm. Có ba kiểu quan hệ giữa chỉ thị và gen quan tâm :

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

13
Chỉ thị phân tử được định vị ngay trong phạm vi gen quan tâm. Đây là
trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này.
Chỉ thị phân tử Linkage disequilibrium với gen quan tâm. Đây là nhóm
chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng nhau. Mối quan hệ này tìm thấy khi
gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau. Chọn lọc dựa trên chỉ thị này
gọi là LD-MAS.
Chỉ thị có mối cân bằng liên kết với các gen quan tâm. Đây là tường

hợp khó tiến hành ứng dụng trong MAS.
Khi đề cập đến ứng dụng chỉ thị PCR trong chọn giống, Kangle Zheng
(1995) cũng cho rằng mức chính xác của MAS phụ thuộc vào mối liên kết
chặt giữa gen quan tâm và chỉ thị phân tử. Mặc dù chỉ thị và gen có mối liên
hệ về di truyền, nhưng mối liên hệ này có thể bị phá vỡ do có sự tái tổ hợp
giữa chúng. Khoảng cách di truyền phản ánh tỷ lệ tái tổ hợp giữa gen quan
tâm và chỉ thị. Vì thế, để có độ tin cậy cao, làm giảm sự tái tổ hợp giữa gen
quan tâm và chỉ thị là điều cần thiết. Điều này có thể thực hiện khi áp dụng
MAS với những chỉ thị cách gen quan tâm không quá 5cM và với những
nhóm marker nằm về cả hai phía của gen. Theo lý thuyết, với những chỉ thị
cách gen trong khoảng 5cM, độ chính xác thu được khi sử dụng MAS là
99,75% hoặc có thể coa hơn [67].
Tuy nhiên, trong đa số các trường hợp, đặc biệt đối với tính trạng đa
gen, các gen hay các QTL quan tâm đa phần chưa được nhận dạng chi tiết ở
mức độ phân tử. Vì thế những vùng gen được chọn để ứng dụng MAS thường
là các đoạn nhiễm sắc thể chứa gen hay QTL. Hiệu quả chọn lọc sẽ tốt hơn
nếu có 2 chỉ thị đa hình flanking với gen quan tâm, hoặc chỉ thị nằm trong
QTL để hạn chế khả năng tái tổ hợp hai lần giữa hai chỉ thị liên kết.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

14
c. Ứng dụng của MAS
Cả ba lĩnh vực này chỉ thị di truyền và bản đồ di truyền đều có khả
năng hỗ trợ một cách đắc lực. Những chỉ thị di truyền liên kết chặt với những
gen sẽ được sử dụng để chọn lọc các cá thể ngay ở giai đoạn rất sớm mà
không phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Quá trình này là quá trình chọn
lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS) hay còn gọi là chọn giống phân tử.
Chỉ thị di truyền và bản đồ di tuyền cho phép nhà chọn giống thấy rõ

mối quan hệ: “Tính trạng - Gen (QTLs) - Môi trường”. Do vậy ứng dụng quan
trọng nhất của MAS là sử dụng những chỉ thị phân tử cho ba mục đích sau:
Tìm kiếm phát hiện những biến dị di truyền, các gen quan tâm trong số
các cá thể, giữa các giống, loài.
Phân lập nhanh các cá thể cần quan tâm trong quần thể dựa trên thành phần
của gen hay các chỉ thị liên kết với các alen quan tâm đối với các locut mong muốn.
Chuyển một vùng gen, đối với những tính trạng quan tâm được quy
định bởi đơn gen hay một gen chịu trách nhiệm phần lớn việc biểu hiện kiểu
hình của tính trạng.
Trong chọn giống lúa, MAS ngày càng được sử dụng rộng rãi để rút
ngắn các quá trình phục hồi các dòng bố mẹ trong các chương trình lai lại.
MAS sẽ giúp cho quá trình những gen quan tâm vào các giống có cấu trúc hệ
gen khác nhau một cách nhanh chóng do MAS cho phép tối ưu hoá số cây cần
chọn, số lần lai trở lại, hoặc loại bỏ các cá thể không liên quan đến những gen
quan tâm. Khi so sánh với chọn giống truyền thống, vai trò trợ giúp của chỉ
thị phân tử có thể cải thiện hiệu quả chọn giống ở ba điểm:
Đối với tính trạng khó đánh giá kiểu hình, chọn lọc đối với một chỉ thị
alen cây bố mẹ cho gen tại vị trí locut gần với gen quan tâm có thể làm tăng
hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

15
Sử dụng chỉ thị để chọn lọc quần thể lai trở lại nhằm hạn chế số lượng
gen nằm ngoài vùng quan tâm và để chọn lọc quần thể lại hiếm tạo ra từ việc
tái tổ hợp gần gen quan tâm, vì thế hạn chế đối đa tác động của các yếu tố
cản trở có liên quan.
Chuyển các gen lặn bằng phương pháp truyền thống và chọn lọc trong
các quần thể tự phối sau mỗi lần lai trở lại. (Chuyển các gen lặn trong phương
pháp truyền thống đòi hỏi phải có các thế hệ tự phối sau mỗi lần lai trở lại,

quá trình này làm kéo dài thời gian chọn giống và ảnh hưởng đến mục đích
thương mại của chọn giống. Với sự trợ giúp của MAS, quá trình này đã được
rút ngắn lịa nhờ kiểm tra sự có mặt của alen lặn trong con lai).
Như vậy chọn giống với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử là một hướng
nghiên cứu đầy triển vọng, nó nhưu một nhịp cầu gắn kết giữa công nghệ sinh
học với phương pháp chọn giống cổ điển. Nó đã trở thành một hợp phần phổ
biến của các quá trình lai trở lại, quá tình lập bản đồ cũng như quá trình chọn
lọc các tính trạng đơn gen, đa gen có giá trị cao về mặt di truyền và kinh tế.
1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu
1.3.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu quốc tế
Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là xác định
chỉ thị phân tử liên kết QTL/gen và lập bản đồ QTL/gen. Với sự ra đời của
hàng loạt các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép xác định những QTL liên
kết đến các tính trạng nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất. Trong
nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử và lập bản đồ QTL/gen điều khiển một
tính trạng năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất. Đây là một việc làm khó
vì năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất là tính trạng di truyền số lượng,
nó là tổ hợp tính trạng như: số hạt chắc trên bông, số bống trên khóm, khối
lượng nghìn hạt. Những nằm gần đây, nhiều QTL/gen quy định tính trạng cấu
thành năng suất đã được xác định trên rất nhiều các quần thể từ các tổ hợp lai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

16
giữa giống hay các loài phụ. QTL/gen năng suất và yếu tố cấu thành năng suất
được xác định trên tất cả các nhiễm sắc thể của lúa. Ở đây chúng tôi tập hợp
lại những kết quả xác định QTL/gen liên kết năng suất và yếu tố cấu thành
năng suất trên cây lúa.
Trên nhiễm sắc thể số 1 các nhà khoa học trên thế giới đã xác định
được nhiều tính trạng liên quan đến năng suất trên nhiễm sắc thể số 1 như: Ba

QTLs quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt tại vị trí gần chỉ thị phân tử
RM283-RM259 của các tác giả [29], [53], [70], RG690-RM212 của các tác
giả [28], [20], [39], và RG810-RG331 xác định bởi các tác giả [28], [50]. Một
QTL liên kết tính trạng số hoa trên bông tại vị trí chỉ thị phân tử RM1-RM490
của các tác giả [22], [53], [58], [70] và một QTL liên kết tính trạng số hạt
chắc trên bông đã được xác định bởi các tác giả [22], [29], [53], [58], [70] tại
vị trí giống QTLs liên kết tính trạng khối lượng nghìn hạt RM283-RM259.
Một QTL liên kết tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM265-RM315 được xác
định bới các tác giả [50], [53], [58].
Nhiễm sắc thể số 2: QTL quy định khối lượng nghìn hạt được xác
định từ năm tác giả khác nhau với cùng vị trí chỉ thị phân tử RM240-
RM266 được xác định từ các tác giả [39], [50], [53], [70]. Ba QTL liên kết
tính trạng tổng số hạt trên khóm, tại các vị trí gần tâm động bởi các tác giả
[25], [53], vị trí chỉ thị RM263 do các tác giả [22], [70] và vị trí chỉ thị
RZ123-RZ446 [58], [59]. Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt được
xác định từ ba tác giả tại vị trí chỉ thị phân tử RZ123-RZ446 trên vai dài
của nhiễm sắc thể số 2 [50], [58], [59]. Hai QTLs quy định tính trạng số
bông trên khóm được xác định tại vị trí gần tâm động được xác định bởi
năm tác giả [39], [41], [50], [59], [69].
Nhiễm sắc thể số 3: Một số tác giả đã xác định QTL liên kết tính trạng
khối lượng nghìn hạt trên nhiễm sắc thể số 3. Một trong số đó là QTL được