Đề tài chuyển gen vào lục lạp

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẰNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
MÔN: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
ĐỀ TÀI: CHUYỂN NẠP GEN VÀO LỤC LẠP
GVHD: TRẦN THỊ DUNG
Thành viên nhóm: Phạm Xuân Khả 61003209
Nguyễn Quốc Duy 61103029
Phan Mỹ Hoàng Mai 61003080
PHỤ LỤC
A: BỘ GEN LỤC LẠP
I: GIỚI THIỆU
II: TIỀM NĂNG
B: CÔNG NGHỆ GEN LỤC LẠP
I: ƯU ĐIỂM VÀ THÀNH TỰU
II: CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO LỤC LẠP
C: KẾT LUẬN
D: TÀI LIỆU THAM KHẢO
A: GIỚI THIỆU
I: Bộ gen của lạp thể lục lạp:
Tế bào thực vật bậccao chứa 3 cơ quan di truyền đó là: nhân, ty thể và lạp thể. Mỗi
cơ quan tử chứ bộ gen riêng của nó. Di truyền gen ty thể và lục lạp không tuân theo
quy luật mendel và thường di truyên theo kiểu đơn bố mẹ cho thế hệ sau.
Hiện tại các nhà khoa học tập trung nghiên cứu lạp thể nhất là lục lạp. Ris và
Plaut(1962) là những người đầu tiên khám phá ra sự hiện dienj của DNA của lục lạp
bằng quan sát dưới kính hiển vi tảo xanh Chlamydomonas moewusii. Bộ gen lạp thể
của thực vật bậc cao là phân tử DNA mach vòng có kích thước khoảng 120-165
kilobases(kb) và chứa khoảng 130gen phụ thuộc vào từng giống, trung bình khoàng
150kb( Dyer, 1985). ở trường hợp thuốc lábộ gen lục lạp có kích thước khoảng 160kb
chia ra làm 2 vùng lớn và nhỏ . các bản sao của bộ gen hiện diện ở tất cả tế bào và ở
các loại plastis khac nhau như tiền-plastid biệt hóa, lục lạp quang hợp, sắc lạp chứa

cảotenoidbottj lạp. đặt tính nổi trội của bộ gen plastid là mức bội thể cực cao: tế nào
ddwo lá thuốc lá có thể chứ 100 lục lạp, mỗi lục lạp chứa khoảng 100 bản sao của bộ
gen plastid. Như vậy có khoảng 10.000 bộ gen plastid/ tế bào. Lạp thể có chứ diệp lục
còn gọi là lục lạp làm cho cây có màu xanh. Lục lạp có cấu trúc phức tạp và giữ vai trò
quan trong trong quang hợp. lạp thể có màu đỏ or màu vàng gọi là sắc lạp tạo màu ở
vỏ hoa và quả, lạp thể không mau hay còn gọi là vô sắc lạp nơi hình thành tinh bột.
lục lạp là 1 trong ba dạng lạp thể chỉ có trong các tế bào có chức năng quang hợp ở
thực vật. lục lạp thường có hình bầu dục. mỗi lục lạp được bao bọc bởi màng kép,
bên trong là khối ơ chất không màu- gọi là chất nên chưa protein ưa nước và các hạt
nhỏ. Số lượng lục lạp trong mỗi tế bào không giống nhau, phụ thuộc vào điều kiện
chiếu sáng của môi trường và loài. Lục lạp là nơi thwucj hiện chức năng quang hợp
quan hợp của tế nào thực vật, tạo ra năng lượng cho tế bào thực vật.
Dưới kính hiển vi điện tử ta thấy mỗi hạt grana nhỏ có dạng như 1 chồng tiền xu gồm
các túi dẹp( gọi là tilacoit). TRên bề mặt của màng có hệ saccws tố và các hệ ez sắp
xếp 1 cách trật tự tạo thành vô số các đơn vị cơ swor dnagj hạt hình cầu, kích thước
từ 10-20nm gọi là đơn vị quang hợp.trong lục lạp có chứa nhiều AND và riboxom nên
có khả năng tổng hợp protein cần thiết cho mình. Lục lạp chứa nhiều ez chứng tỏ có
nhiều phản ứng trao đổi chất khac nhau xảy ra trong đó. Những ez này là: invectaza,
amilaza, proteaza, catalaza,… cũng như những phức hợp ez thực hiện phản ứng Hill
fotforin hóa hợp, sự tổng hợp lien kết peptit, những lien kết axit béo và sự tổng hợp
photpho, lipit…
Lục lạp không chỉ là bộ máy quang hợp hoàn chỉnh mà có cả hệ thống tổng hợp
pr0tein riêng. Màng lục lạp trao đổi chất và chuyên hóa sinh chất giữa chất nền với
tế bào chất, và ngay cả những thông tin di truyền dưới dạng DNA lạp thể.
Hiện nay, các nhà khoa học đã giãi maz trình tự DNA bộ gen plastid của khoảng hơn
100 giống cây. Ví dụ: giống địa tiền( liverwort) 121.024bp, thuốc lá 155.939bp, ngô
140.387 bp, khoai tây 155.371bp, bèo tấm 165.955bp…
Hình: cấu trúc hoàn chỉnh bộ gen lục lạp thuốc lá ( Shinozaki et al., 1986)
Bộ gen có kích thước 155,939 bp bao gồm 1 đoạn bản sao lớn (LSC) có kích thước
86,684 bp và 1 đoạn bảo sao nhở kích thước 18,482 bp( SSC) và có đoạn lặp lại kích

thước của mỗi đoạn 25,339 bp và bao gồm các gen
II: Tiềm năng công nghệ gen lục lạp:
Công nghệ gen lục lạp đã trên 20 năm nghiên cứu và phát triển. thành công ban đầu
chủ yếu thu nhận được những dòng thuốc lá chuyển gen lục lạp và cây họ cà. Ngày
nay, công nghệ gen lục lạp được nghiên cứu thành công ở nhiều cây trồng quan
trọng khác.
Cùng với những ưu điểm như mức độ biểu hiện gen cao dẫn đến biểu hiện protein
tái tổ hợp cao, tính di truyền theo mẹ( thân thiện với môi trường), ddnhj hướng
chính xác gen chuyển nạp, có thể loại bỏ được gen chọn lọc kháng kháng sinh, có thể
chuyển các gen có nguồn gốc tiền nhân, và có khả năng chuyển đồng thời nhiều
gen( cassette gến). vì vậy, công nghệ gen lục lạp có nhiều triển vọng trong việc khắc
phục nguy cơ lan truyền gen từ các cây chuyển gen sang cây trồng ngoài tự nhiên,
tạo ra giống cây trồng có các tính trạng nông học quan trọng như kháng sâu, côn
trùng, kháng chất diệt cỏ và chống chịu ngoại cảnh bất lợi
Những năm gần đây công nghệ gen vào lục lạp đã thu được nhiều kết quả quan trọng
trong chuyển gen lục lạp tạo ra các kháng nguyên tái tổ hợp cho phép sản xuất vắc
xin và protein tái tổ hợp chữa bệnh cho người và động vật trong lục lạp. vì vậy, công
nghệ gen lục lạp trở thành công cụ đầy triển vọng trong sản xuất vác xin ăn được nói
riêng và trong sản suất dược liệu
B: công nghệ gen lục lạp:
Lục lạp là nơi xảy ra quá trình quang hợp của thực vật, lục lạp có hệ gen riêng và có
cấu trúc phân tử mạch vòng sợi đôi DNA. Mặc dù kích thước nhỏ hơn so với hệ gen
nhân tế nào, DNA lục lạp chiếm khoảng 10-20% tổng số DNA của tế bào và chứa
khoảng 120-130 gen.
I: Những ưu điểm và thành tựu của công nghệ gen lục lạp:
Sự phát triển của nghiên cứu di truyền gen lục lạp, trong giai đoạn đầu, ở đối tượng
tảo xanh Chlamydomonas reinhardii và thuốc lá Nicotiana tabacum dẫn đến các
nghiên cứu ở lĩnh vực chuyển gen vào lục lạp sau đó và mở ra tiềm năng vô cùng to
lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học trong tương lai.
Công nghệ lục lạp mang lại nhiều ứng dụng đặt biệt trong công tác cải thiện giống cây

trồng: tạo ra các giống cây cây kháng virus, nấm, vi khuẩn, côn trùng và kháng thuốc
diệt sâu, diệt cỏ;biến đổi các gen lien quan đến quang hợp làm tăng năng suất cây
trồng: chuyển gen cố định nitrogen vào lục lạp tạo ra lạp thể quang hợp ở ban ngày
và cố định đạm vào ban đêm: chuyển gen tạo tinh bột làm tang hàm lượng tinh bột
và giảm nồng độ đường trong cây: chuyên gen mã hóa protein vào lục lạp để tạo ra
cây chuyển gen giàu chất dinh dưỡng, vitamins. Công nghệ gen lục lạp đã và đang
được ứng dụng trong ngành dược phân tử tạo ra vắc xin và protein tái tổ hợp trong
phòng và điều trị bệnh cho người và động vật. công nghệ chuyển nạp gen lục lạp có
tiềm năng rất to lớn và có nhiều ưu điểm nổi trội hơn so với chuyển gen vào nhân tế
nào như sau:
- Có kiểu di truyền mẹ( meternal inheritance): đặc điểm di truyền gen chuyển
theo kiểu di truyền mẹ ở hầu hết thwucj vật bật cao, ngoại trừ 1 số ít loài như
có linh lăng, lúa, đậu Hà lan… ở trường hợp chuyển gen vào nhân, có thể có sự
giao phấn ở các đối tượng khác. Nhờ ưu điểm này mà từ năm 1998 các nhà
khoa học đã khuyến cáo việc ngăn chặn sự lan truyền của các gen chuyển nạp
bằng công nghệ chuyển nạp gen vào lục lạp thực vật.
- Mức độ biểu hiện gen chuyển nạp cao: trong 1 tế nào có hang trăm lục lạp,
mỗi lục lạp chứ khoảng 100 bản sao của bộ plastid, và như vậy có khoảng
10.000 bộ gen plastid/ tế bào( Maloga,1993). Chính vì vậy mà mức độ biểu
hiện của gen chuyển nạp rất cao khoảng 5% gen GFP ở các dòng khoai tây
chuyện nạp gen( Sidorov et al.,1999), 5% gen Bt. Hàm lượng protein mục tiêu
có thể lên đến
50% trên tổng số protein hòa tan ở trường hợp cây cà chua chuyển nạ gen lạp
thể ( RUf et al., 2001). Gần đây, Wurbs và đồng tác giả ( 2008) đã chuyển
thành công gen HIV-1 p24 vào cây cà chua, mức biểu hiện protein p24 là 40%.
Như vậy, công nghệ chuyển gen lục lạp cho phép san suất ra được các loại
protein tái tổ hợp có giá trị từ thực vật.
- Vị trí gắn đặt hiệu( Site-specific integration): ảnh hưởng của hiệu ứng vị trí
trên cự biểu hiện của gen chuyển nạp; không có hiệu ứng vị trí ở plastid do
gen tích hợp vào vị trí đặt hiệu thông qua hiện tượng tái tổ hợp tương

dồng( homologous recombibation event). Các dòng chuyển gen lục lạp thường
đồng nhất( homoplasmic). Sự đồng nhất thường nhận được qua sự chọn lọc
nghiêm ngặt Ở trường hợp chuyển gen vào nhân, sự tích hợp ngẫu nhiên của
gen chuyển nạp ở nhiễm sắc thể thường dẫn đến sự hình thành các mực biểu
hiện khác nhau, các dòng chuyện gen thường mang tính đồng hợp hay dị hợp
nhận được qua sự tự thụ phâns hoặc lai hữu tính. Như vậy sự biểu hiện gen
đồng nhất ở các dòng chuyển nạp gen lục lạp. Ngược lại ở trường hợp chuyển
gen vào nhân, sự biểu hiện gen chuyển có sự biến thiên cao.
- Biểu hiện đa gen( Multiple gene expression): chuyển gen vào lục lạp không ghi
nhận hiện tượng gen im lặng . sự im lặng của gen chuyển nạp thường làm
giảm hoặc lọa trừ sự biểu hiện gen chuyển nạp vào nhân tế bào.
- Độc tính protein của gen chuyển: có thể giảm thiểu bởi sự phân ngăn của lục
lạp. Ở trường hợp chuyển gen vào nhân, protein được tích lũy ở tế bào chất,
điều này có thể gây ra ảnh hưởng đa hướng. ở lục lạp, có sự hình thành nối
lien kết disulfide bond. điều này làm cho lục lạp là nơi lý tưởng sản suất các
loại vắc xin,dược phẩm, kháng thể, kháng nguyện tái tổ hợp và như vậy cây
chuyển gen lục lạp được xem như là nhà máy sinh học tương lai.
II: các phương pháp chuyển gen vào lục lạp:
Như chúng ta đã biết, cấu tạo của lục lạp có màng đôi chính cơ chế vật lý đã
làm vật cản cho sự chuyển nạp DNA vào lục lạp. Vì vậy, virus và vi khuẩn rất
khó thâm nhập vào lục lạp.
Năm 1985, De Block và đồng tác giả báo cáo lần đầu tiên về chuyển gen lục
lạp vào mô tế bào thuốc lá bằng phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn
Agrobacterrium tumefaciens. Các tác giả đã nhận được 1 số dòng chuyển gen
CAT( chloramphenicol acetyl transferase). Phân tích Southern blot cho thấy
gen CAT xâm nhập vào bộ gen lục lạp cây thuốc lá không ổn định và bền vững.
Hiện nay, các nhà khoa học nghiên cứu và phát triển nhiều phương pháp
chuyển gen vào lcuj lạp bao gồm: phương pháp bắn gen( biolistics), dung hợp
tế nào trần bằng polyethylene glycol( PEG), phương pháp vi tiêm ( sử dụng
micropipette đẻ tiêm DNA vào lục lạp.

- Phương pháp bắn gen:
Phương pháp bắn gen được gọi với nhiều thuật ngữ như biolistic,
bombardment. Đây là phương pháp chuyển gen trực tiếp vào cây trồng. kỹ
thuật biolistic do John Stanford ở đại học Cornell phát minh. Đây là phương
pháp rát hiệu quả dung để chuyển DNA là vào tế bào cây trồng( Cao etal.,
1990). Hiện nay có 2 loại thiết bị bắn gen khác nhau: thiết bị ban đầu sử dụng
là bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng, gây nổ bằng 1 kim lửa
tên thương phâm Biolistic PDS-100, Dupont Company, wilmintong, DE; thiết bị
thứ 2 hoạt động theo nguyên tắc phóng điện, DNA phủ lên các hạt vàng cực
mịn( Christou et al., 1988) với thuật ngữ” DNA- coated gold particles ). Thành
công đầu tiên trong kỉ thuật chuyển gen lục lạp được Boyuton và đồng tác giả
(1988) thwucj hiện trên đối tượng tảo xanh bằng phương pháp bắn gen. năm
1990, Svab và đồng tác giả đã nhận được các dòng thuốc lá chuyển gen 16S
ribosom RNA kháng 2 loại kháng sinh là spectinomycin và treptomycin cho
đến nay, pp bắn gen vào lục lạp đã được tiến hành thành công ở thuốc lá, cà
chua, cà tím, khoai tây,các cây họ cải…
Nguyên lý chung của pp này là sử dụng áp lực của xung khí helium đẻ đẩy các
viên đạn có kích thước nhỏ mang gen mong muốn ( thường là au, tungsten,
titanium or volfram) xuyên qua các lớp tế bào, mô để xâm nhập vào genome
thực vật
Ưu điểm + nhược điểm:
+ có thể chuyển nhiều gen vào tế bào và mô, bắn 1 lần được nhiều tế bào, quá
trình chuyển gen nhanh, thao tác đơn giản, các vector mang gen tái tổ hợp
đươn giản và chỉ cần 1 lượng vector nhỏ.
+ đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có thể gây ra sự xáo trộn trâtj tự của đối tượng
chuyển gen, tấn số biến nạp ổn định thấp.
- Phương pháp PEG:
Là pp sử dụng polyethylene glycol( PEG) đã được áp dụng làm yếu tố dung
hợp trong việc lai tế bào soma của nhiều loài động vật và thực vật.nó có hiệu
quả tương đương với kỹ thuật chuyển DNA vào tế bào trần. trong pp PEG, gen

lạ được chuyển vào tế bào trần dưới dạng plasmid DNA, cho kết quả phục hồi
tốt vs các cây tái sinh của thuốc lá. O’Neill vjà đồng tác giả đã thành công và
nhận được các dòng thuốc lá chuyển nạp gen 16S rRND kháng 2 lọa kháng
sinh Spectinomycin và streptomycin.năm 1996, koop và đồng tác giả đã
chuyển gen tổng hợp từ vi khuẩn gen aadA kháng spectinomycin và
streptomycin thành công vào lục lạp bằng pp PEG. Ưu điểm của pp PEG rẻ tiền
hơn so với pp bắn gen, nhưng thời gian chọn lọc tốn kếm nhiều hơn và tần số
chuyển gen thường thấp hơn pp bắn gen./
Ưu nhược điểm:
+: Hiểu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công,
không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
+: tấn số chuyển gen rất thấp do ko kiểm soát được quá trình chuyển gen, dễ
xảy ra hiện tượng dung hợp TB trần, gây khó khan trong việc phân tích biểu
hiện gen, tái sinh tế bào trận sau chuyển thì khó khăn.
- Phương pháp vi tiêm( microinjection) :
Sử dụng micropopette để tiêm dung dịch DNA là vào tế bào trần dưới áp lực
cao, tạo ra cây chuyển gen. Phương pháp này đơn giản nhưng còn nhiểu vấn
đề tranh luận, cần tiếp tục hoàn thiện.
Nguyên tắc: dung 1 lượng nhỏ DNA tiêm trực tiếp vào nhân của tế bào 1 cách
cơ học dưới kính hiển vi. Cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng
tế bào với hiệu quá tương đối cao.
Ưu nhược điểm:
+: có thể tối ưu lượng DNA đưa vào tế bào, quyết định được đưa DNA vào loại
tế bào nào, có thể đưa 1 cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan
sát được, có thể nuôi riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp được vào mọi
giống cây
+: mỗi lần tiêm chỉ dc 1 phát tiêm và chỉ 1 tế bào, cần dung các thiết bị có độ
chính xác cao và cần kỹ năng phức tạp của người sử dụng
Hình: mô tả phương pháp vi tiêm chuyển gen vào lục lạp.
C: KẾT LUẬN

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN NÀY VÀO LỤC LẠP NHẰM TẠO RA 1 GIỐNG MỚI
CÓ NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG TỐT HƠN ĐỂ PHỤC VỤ NHU CẦU CỦA CON
NGƯỜI VÀ ĐỒNG THỜI LÀM HOÀN THIỆN HƠN CÁC LOẠI GIỐNG CÂY TRỒNG ĐÓ
D: TÀI LIỆU THAM KHẢO
- Giáo trình: công nghệ gen trong nông nghiệp- Trần Thị Lệ ( chủ biên)
- Biểu hiện gen HIV-1 p24 ở cây thuốc lá chuyển gen lục lạp- Phan Tường Lộc,
Nguyễn Hữu Hổ, ( Viện sinh học nhiệt đới, viện khoa học và công nghệ Việt
Nam)