Báo cáo phương pháp southern blot

GVHD: Trần Thị Dung
SVTH: Nguyễn Thị Hoàng Yến 61103239
Nguyễn Văn Cư 61103020
Huỳnh Thị Mai Thy 61103315
MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀN
PHƯƠNG PHÁP
SOUTHERN BLOT
Mục lục:

I. Giới thiệu về phương pháp Southern blot.

II. Nguyên lý và nguyên tắc.
•
1.Nguyên lý.
•
2.Nguyên tắc.

III. Tạo mẫu dò.
•
1.Tạo mẫu dò nhờ Plasmid
•
2.Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR
•
3.Đánh dấu Probe

IV. Quy trình của phương pháp Southern Blot.
•
1.Giai đoạn 1.
•
2.Giai đoạn 2.
•

3.Giai đoạn 3.

V. Ứng dụng.
I. Giới thiệu về phương pháp
Southern blot
Phương pháp lai Southern blot là phương pháp lai giữa DNA của tế
bào với mẫu dò DNA. Phương pháp này cho phép nghiên cứu DNA của
bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một
gen nào đó trong bộ gen của tế bào.
Southern blot - một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu
trúc của gene, được phát triển vào giữa thập niên 1970 do
Edwin Southern ở MRC một bộ phân của genome động vật hữu
nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975).
Edwin Southern
Phương pháp Southern Blot được triển khai nhờ một số kỹ thuật nền
tảng của công nghệ sinh học phân tử như:

Tách chiết gen

PCR

Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai

Lai phân tử (lai với mẫu dò đặc hiệu)

…
Đến nay, kỹ thuật lai Southern đã được cải tiến đi rất nhiều, chủ yếu
bao gồm:

Tăng độ nhạy


Giảm một số bước trong quá trình lai

Giảm thời gian thực hiện

Vẽ kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn rất nhiều.
Nguyên lý
Dựa trên nguyên
tắc biến tính và
hồi tính của phân
tử DNA.
Dựa vào nguyên
tắc bổ sung giữa
các cặp
nucleotide: A-T,
G-C ( các đoạn
polynucleotide
mạch đơn có
trình tự bổ
sung).
Màng lai
nitrocellulose
hay nylon có khả
năng tiếp nhận
DNA
II. Nguyên lý và Nguyên tắc
Nguyên tắc
Phản ứng lai
cần nhiệt độ
cao hoặc hóa

chất gây biến
tính DNA
( NaOH,
Formandehyt)
Đòi hỏi một
đọan DNA
(RNA) đã biết
trình tự để
làm mồi
“Probe”,
Probe được
đánh dấu.
Các vật liệu,
trang thiết bị
máy móc
chính xác:
màng lai, máy
Blotting,
buồng lai, máy
PCR
III. Tạo mẫu dò (probe)
Tạo mẫu dò nhờ Plasmid

Cắt plasmid và DNA đã
tách chiết từ tế bào bởi
cùng một loại enzyme.

Gắn DNA vào plasmid
trong điều kiện môi
trường phù hợp.


Thực hiện biến nạp vào
trong tề bào vi khuẩn.

Nhân các tế bào vi kuẩn và
chọn lọc.

Tách plasmid từ các tế bào
chọn lọc.

Tách mẫu dò (đoạn DNA).

Đánh dấu mẫu dò.
Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR

Thiết lập mồi và đánh
dấu phóng xạ vào các
mồi.

Biến tính mẫu DNA
thành các sợi đơn.

Gắn mồi vào các sợi
đơn.

Tổng hợp các sợi DNA
mới.

Biến tính để tách các
chuỗi mới vừa tổng hợp

thành các sợi đơn.

tiếp tục quay về gắn mồi
vào các sợi đơn.
Đánh dấu mẫu dò
Gồm có 4 phương pháp:
1. Phương pháp Nick-translation
2. Phương pháp random priming
3. Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide
4. Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe)
1. Phương pháp Nick-translation
.
DNAse I tạo các khía trên DNA ở nhiều vị trí ngẫu nhiên
khác nhau.
.
DNA polymerase với hoạt tính exonuclease 5’-3’, cắt mạch
DNA theo chiều 5’-3’ theo các khía đã tạo sẵn, đồng thời, tổng
hợp bù đoạn thiếu với sự tham gia của nucleotide đánh dấu
(thường là dATP)
.
Kết quả là DNA được đánh dấu.
2. Phương pháp random priming
.
DNA kép được biến tính bằng nhiệt thành 2 mạch đơn.
.
Hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp được thêm vào, trở thành
mồi (primer) cho DNA polymerase tổng hợp mạch bổ sung.
.
Một trong 4 loại nucleotide bổ sung vào được đánh dấu, nên 2
mạch mới tổng hợp cũng được đánh dấu.

3. Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide
Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch đơn rồi được
đánh dấu ở đầu 5’ nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase với sự hiện
diện của một nucleotide đánh dấu. Sau phản ứng các nuclotide tự do
cũng được loại bỏ bằng sắc kí lọc gel, sắc kí lỏng cao áp (HPLC),…
4. Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe)

Trước hết, trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA phải
được đưa vào một vector có mang các promoter.

Vector này được cắt ra thành dạng mạch thẳng; sau đó, RNA
polymerase thích hợp được thêm vào phản ứng cùng với các
nucleotide đánh dấu.

RNA polymerase sẽ phiên mã trình tự DNA bắt đầu từ
promoter, tạo ra một lượng lớn RNA đánh dấu.

Sau phản ứng, vector có mang trình tự DNA gốc bị DNase I
phân hủy, các enzyme được loại bỏ qua tách chiết bằng
phenol và RNA được tinh sạch trên sắc kí lọc gel.
Giai đoạn 1
•
Tách chiết và làm biến tính các DNA thành sợi đơn
Giai đoạn 2
•
Chuyển DNA từ gel agarose lên màn lai (nylon hoặc
nitrocellulose)
Giai đoạn 3
•
Lai với mẫu dò và kiểm tra bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi

IV. Quy trình của phương pháp
Southern blot
Tách chiết
DNA cần
nghiên cứu
DNA được cắt
bởi các
enzyme giới
hạn (RE) thành
các đoạn kích
thước khác
nhau
Sản phẩm
cắt được
điện di trên
gel agarose
DNA kép được xử lý với kiềm
(NaOH 0.4M), biến tính thành
DNA mạch đơn ngay trên gel.
•
Kiềm giúp cho cực âm của gốc thymine
trong DNA gắn kết với cực dương của
gốc amino có trong màng, biến tính DNA
mạch kép thành DNA mạch đơn, đồng
thời, loại tất cả các RNA còn sót lại.
•
Chỉ có DNA đơn mới có thể được chuyển
lên màng lai.
Giai đoạn 1
Giai đoạn 2

Chuyển DNA vừa biến tính lên màng lai (màng nylon hoặc
nitrocellulose).
Nguyên tắc của quá trình:
Là sự mao dẫn của dung môi (thường là NaOH/NaCl)qua lớp gel từ
nơi có thế nước cao sang nơi có thế nước thấp, mang theo DNA
đính lên màng lai được sắp xếp ngay trên lớp gel.
Quá trình này diễn ra trong vài giờ hoặc có thể dùng thiết bị thấm
hút chân không.
Tương tác ion giữa màng lai (tích điện dương) và DNA (tích điện âm)
tạo lực hút, gắn kết các DNA lên màng lai.
Trong quá trình chuyển, vị trí các DNA không thay đổi.
Màng lai sau quá trình trên, được xử lý nhiệt (800 trong 2 giờ)
hoặc chiếu tia UV (vài phút) để cố định DNA trên màng.
Cách tiến hành:

Đặt gel lên giá chuyển máy Bloting để chuyển nguyên
vẹn các sợi DNA biến tính

Dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0.4M

Màng lai sẽ giữ cố dịnh các đoạn DNA được chuyển lên
từ gel điện li
Lai các DNA cố định trên màng lai với các mẫu
dò (probe) có đánh dấu phóng xạ (32P), biotin
hoặc mẫu dò phát quang sinh học. Quá trình
này dựa trên nguyên tắc bổ sung của các probe
với DNA cố định
Sau quá trình lai, màng lai
được rửa để loại các probe
không bắt cặp chuyên biệt với

DNA trên màng
Cuối cùng, nhờ kĩ thuật phóng xạ
tự ghi (đối với probe đánh dấu
phóng xạ), phương pháp so màu
(với probe đánh dấu bằng biotin)
hay dựa vào sự phát quang (với các
probe phát quang sinh học) để
định vị DNA-probe
Giai đoạn 3
IV. Ứng dụng

Southern blot được sử dụng để đánh giá bản copy của gen trong
genome, xác định các intron, exon, các đoạn bị đột biến thêm
hoặc mất đoạn…

Khi sử dụng các DNA marker khác nhau làm mẫu dò, có thể phân
biệt được các loài, các loài đồng hình.

Southern blot – RFLP : giúp phát hiện sự đa dạng chiều dài các
đoạn cắt bởi RE, qua đó, nhận biết sai biệt di truyền ở vị trí nhận
biết của các RE dẫ đến sai biệt trong chiều dài của các đoạn DNA
tạo ra từ RE đó. Đòng thời RFLP còn sử dụng để xác định huyết
thống, lập bản đồ giới hạn gene.

Truy tìm tội phạm dựa vào dấu vết hiện trường.

Chuẩn đoán bệnh thai nhi.
Tài liệu tham khảo:

•
Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương
•
www.Wikipedia.org
THE END
THANKS FOR
WATCHING !