thẩm định quy trình xác định hàm lượng kháng nguyên vi trong vắc xin thương hàn vi tại viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vắc xin là chế phẩm sinh học có tính kháng nguyên, dùng để tạo miễn dịch
đặc hiệu, chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một tác nhân
gây bệnh cụ thể nào đó. Việc sử dụng vắc xin đã đẩy lùi nhiều bệnh: Loại trừ
bệnh đậu mùa trên toàn cầu, thanh toán gần như hoàn toàn bệnh bại liệt, giảm
đáng kể các bệnh sởi, bạch hầu, ho gà, uốn ván và thương hàn v.v…
Thương hàn là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, chủ yếu do trực khuẩn Salmonella typhi gây
nên. Bệnh lây qua đường tiêu hóa, nếu không được điều trị kịp thời, bệnh có nhiều diễn biến phức
tạp, có thể gây nhiều biến chứng nguy hiểm như: thủng ruột, viêm cơ tim, có nguy cơ dẫn đến tử
vong.
Vắc xin thương hàn ra đời (vắc xin thương hàn uống, vắc xin thương hàn
Vi Polysaccharide, vắc xin thương hàn Vi cộng hợp…) đã góp phần làm giảm
tỷ lệ mắc và tử vong do bệnh thương hàn.
Hiệu quả của vắc xin thương hàn Vi được đánh giá trong phòng thí nghiệm
chủ yếu thông qua kiểm định hàm lượng kháng nguyên Vi. Theo WHO, tất cả
các quy trình kiểm định đều phải được xây dựng dựa trên tính khả thi và tính
khoa học, nghĩa là phải thẩm định quy trình trước khi áp dụng chính thức
[44]. Trong quá trình áp dụng, khi có sự thay đổi của các yếu tố tham gia vào
quy trình (thay đổi kỹ thuật, thay đổi nguyên liệu đầu vào, thay đổi trang thiết
bị, dụng cụ…), thì quy trình phải được tiến hành thẩm định lại. Việc thẩm
định lại có thể là thẩm định toàn phần hay thẩm định một phần.
Quy trình xác định hàm lượng kháng nguyên Vi có trong vắc xin thương
hàn Vi được tiến hành dựa trên kỹ thuật điện di miễn dịch tên lửa (Rocket
immunoelectrophoresis), đây là phương pháp đã có trong dược điển Việt Nam
xuất bản lần thứ IV (DĐVN IV) [18]. Quy trình này đã được thẩm định và
thực hiện tại khoa Kiểm định vắc xin Vi khuẩn, Viện Kiểm định Quốc gia Vắc
xin và Sinh phẩm Y tế từ năm 2000 [28]. Tuy vậy, việc thẩm định quy trình
này trước đây chưa đầy đủ, chưa đánh giá độ mạnh và độ đặc hiệu của quy
trình. Mặt khác, bộ nguồn sử dụng trong quy trình điện di được xác lập qua
1
thẩm định quy trình trước đây có hiệu điện thế đầu ra được cài đặt bằng nút

điện tử, luôn ổn định ở mức 86 V, bộ nguồn này nay đã hỏng. Bộ nguồn thay
thế mới có hiệu điện thế đầu ra được cài đặt bằng nấc cơ học nên chỉ số vôn
kế đầu ra luôn giao động, nằm ngoài khoảng hiệu điện thế đã thẩm định trước.
Hoạt động của bộ nguồn mới này có đáp ứng với quy trình, cho kết quả kiểm
định có độ tin cậy cao hay không thì phải được thẩm định, nên nhóm nghiên
cứu thực hiện thẩm định lại quy trình trên bộ nguồn mới, với tất cả các thông
số cần thiết của quy trình.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài:
Thẩm định quy trình xác định hàm lượng kháng nguyên Vi trong vắc
xin thương hàn Vi tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y
tế.
Với mục tiêu cụ thể như sau:
- Đánh giá độ tuyến tính và vùng tuyến tính (Linearity & Range);
- Đánh giá độ đúng (Accuracy);
- Đánh giá độ chính xác (Precision);
- Đánh giá độ mạnh (Robustness);
- Đánh giá độ đặc hiệu (Specificity).
2
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 Thẩm định quy trình
1.1.1 Khái niệm về phương pháp, quy trình
1.1.1.1 Phương pháp
* Khái niệm: Phương pháp là trình tự logic của các thao tác được mô tả một
cách tổng quát để thực hiện phép đo [1].
* Phân loại phương pháp: Phòng thí nghiệm thường sử dụng nhiều phương
pháp khác nhau, dựa vào nguồn gốc có thể phân loại phương pháp như sau
[10]:
+ Phương pháp tiêu chuẩn: Được ban hành bởi các tổ chức tiêu chuẩn quốc
gia hoặc quốc tế, khu vực, bộ, ngành, hiệp hội khoa học có uy tín. Phương
pháp tiêu chuẩn được thừa nhận và chấp nhận ở phạm vi quốc gia hoặc quốc

tế.
Để xây dựng phương pháp tiêu chuẩn, tổ chức viết tiêu chuẩn cần thu thập,
thống kê, phân tích các kết quả thu được từ các phòng thử nghiệm khác nhau
để thiết lập các dữ liệu về độ đúng, độ chính xác, độ không đảm bảo đo Các
dữ liệu này được soát xét và cập nhật dựa trên cơ sở các ý kiến phản ánh của
những người thực hiện.
Phương pháp tiêu chuẩn còn được sử dụng để so sánh các kết quả thử
nghiệm trên mẫu thử đồng nhất từ các phòng thí nghiệm khác nhau.
Do sự cẩn thận trong việc xây dựng và sửa đổi cho tiêu chuẩn của tổ chức
viết tiêu chuẩn hoặc chậm chễ trong quá trình xem xét nên đôi khi phương
pháp tiêu chuẩn bị lỗi thời.
+ Phương pháp đã được công bố: Được ban hành bởi cơ sở, nhà sản xuất
thiết bị. Thường xây dựng trong các phòng thí nghiệm riêng lẻ.
Phương pháp đã được công bố thường gần với công nghệ hiện đại, gần với
nhu cầu của phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, các bước thực hiện đôi khi thiếu sự
3
thảo luận kỹ lưỡng từ nhiều phòng thí nghiệm khác nhau, nên dữ liệu về độ
đúng, độ chính xác thường không có sẵn hoặc không đủ độ tin cậy.
+ Phương pháp nội bộ: Do phòng thí nghiệm tự xây dựng, đáp ứng nhu cầu
của phòng thí nghiệm và sử dụng các nguồn lực hiện có, phù hợp nhiệm vụ
hoặc loại mẫu cụ thể.
Phương pháp nội bộ thường ít tốn kém, dễ xem xét và cập nhật. Tuy nhiên,
phương pháp này thường không được so sánh kết quả thử nghiệm giữa các
phòng thí nghiệm, nên ít được chấp nhận trên bình diện quốc gia cũng như
quốc tế.
Trong quá trình sử dụng, ưu tiên sử dụng phương pháp đã được ban hành
dưới hình thức là tiêu chuẩn quốc tế, quốc gia hoặc khu vực.
1.1.1.2 Quy trình
* Khái niệm: Quy trình là các thao tác được mô tả chi tiết để thực hiện một
phép đo cụ thể theo một phương pháp đã chọn [1].

Thực hiện theo quy trình nhằm thực hiện một việc gì đó theo một trình tự
nhất quán. Để xây dựng quy trình, người ta cần liệt kê các bước thực hiện chi
tiết, theo trình tự nhất định, đặc biệt là các yếu tố gây ảnh hưởng đến kết quả
cần được quy định rõ ràng.
Thẩm định quy trình phân tích (Validation of Analytical Procedures) là
một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy,
được công nhận. Hiện nay có nhiều thuật ngữ khác nhau sử dụng để chỉ khái
niệm trên như: định trị quy trình, đánh giá quy trình, xác nhận giá trị sử dụng
của quy trình, phê duyệt quy trình. Tất cả thuật ngữ này đều là cách gọi khác
nhau của “thẩm định quy trình”.
1.1.2 Khái niệm về thẩm định và các loại thẩm định
1.1.2.1 Khái niệm về thẩm định quy trình
Thẩm định quy trình là đánh giá các yếu tố tham gia vào quy trình để xem
có phù hợp với mục đích đặt ra và thích hợp trong điều kiện hiện có hay
4
không. Thẩm định quy trình được thực hiện trong các điều kiện thực, nghĩa là
các hoạt động diễn ra tương tự các hoạt động thường xuyên trong quá trình
làm việc hàng ngày.
Thẩm định một quy trình phải được khẳng định bằng việc kiểm tra và cung
cấp các bằng chứng khách quan xem các yêu cầu sử dụng quy trình đó đã
được thực hiện và cho kết quả tin cậy hay không.
Trước khi thẩm định, cần xác nhận các yếu tố tham gia vào quy trình có
theo nguyên tắc của GMP (các yếu tố này là các thủ tục, con người, mẫu
chuẩn, hóa chất, chất thử, máy móc…) hay không. Các yếu tố tham gia vào
quá trình thẩm định quy trình đều phải đạt tính ổn định cao.
Có rất nhiều loại quy trình trong các hoạt động sản xuất, kiểm định chất
lượng vắc xin cần được thẩm định: thẩm định quy trình vệ sinh, thẩm định
quy trình tiệt trùng, thẩm định quy trình đóng ống, thẩm định quy trình xét
nghiệm,…
Theo ISO/IEC 17025: Thẩm định qui trình xét nghiệm là việc khẳng định

bằng kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan rằng các thông số cần xác
định cho việc sử dụng một qui trình cụ thể đã đạt yêu cầu hay chưa [10], [2].
Theo WHO: Thẩm định qui trình xét nghiệm là quá trình thiết lập một hoặc
nhiều hơn các đặc tính: Độ đúng (Accuracy), độ chính xác (Precision), độ tuyến
tính (Linearity), vùng tuyến tính (Range), độ đặc hiệu (Specificity), giới hạn phát
hiện (Limit of Detection), giới hạn định lượng (Limit of Quantitation), độ mạnh
(Robustness) phù hợp với từng qui trình [42].
1.1.2.2 Các loại thẩm định [22], [30], [38], [40].
* Tiền thẩm định
Trong một số trường hợp cần phải thẩm định trước (tiền thẩm định) để xác
định các điều kiện phù hợp nhất cho quá trình thẩm định.
5
* Thẩm định toàn phần (Full Validation)
Thẩm định toàn phần là xem xét và đánh giá một cách khoa học tất cả các
thông số phù hợp của quy trình.
Loại thẩm định này được áp dụng khi:
- Quy trình thực hiện theo phương pháp thử nội bộ hoặc phương pháp
cũ nhưng có một số thay đổi.
- Phát hiện sự không ổn định của quy trình đã phê duyệt.
- Quy trình có thay đổi hoặc sử dụng ngoài phạm vi so với phương
pháp tiêu chuẩn.
- Quy trình thực hiện theo phương pháp do nhà sản xuất cung cấp hoặc
đăng trong tạp chí khoa học.
- Quy trình thực hiện theo phương pháp do các bộ, ngành, tổ chức kỹ
thuật ban hành mà chưa có thông tin chi tiết về tính khoa học của phương
pháp.
* Thẩm định một phần (Partial Validation)
Thẩm định một phần là xem xét và đánh giá một hay nhiều thông số cần
xác định phù hợp với quy trình.
Loại thẩm định này được áp dụng khi:

- Quy trình thực hiện theo phương pháp đã có trong Dược điển.
- Quy trình thực hiện theo phương pháp đã có trong tiêu chuẩn quốc gia.
* Tái thẩm định (Revalidation)
Loại thẩm định này được áp dụng khi quy trình đã được thẩm định có sự
thay đổi:
- Thay đổi phần mềm.
- Thay đổi vị trí đặt máy.
- Thay đổi nguyên liệu đầu vào.
- Thay đổi kỹ thuật.
- Thay đổi trang thiết bị, dụng cụ.
6
Quá trình tái thẩm định có thể là toàn phần hay một phần tùy theo sự đánh
giá mức độ ảnh hưởng của sự thay đổi.
Quy trình sau khi được thẩm định được viết thành SOP (quy trình chuẩn)
để thực hiện thường quy.
1.1.3 Các thông số cần xác định trong thẩm định quy trình xét nghiệm
Quy trình xét nghiệm mà trong đó thực hiện các phép thử phân tích gọi là
quy trình phân tích (Analytical Procedures). Thẩm định quy trình phân tích là
việc xác định, đánh giá một hoặc nhiều chỉ tiêu: độ đúng, độ chính xác, độ
tuyến tính và vùng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ đặc
hiệu và độ mạnh phù hợp với từng quy trình và từng loại thẩm định [10], [22],
[32], [35], [36], [38], [39], [40], [42].
1.1.3.1 Độ đúng (Accuracy)
Độ đúng của một quy trình biểu diễn mức độ gần gũi giữa giá trị tìm thấy
sau thử nghiệm với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận. Để xác
định được độ đúng của phương pháp, mẫu thử phải là mẫu chuẩn đã biết trước
giá trị.
Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm (%) của chất chuẩn (thu được
sau thử nghiệm) hoặc độ chệch (bias) giữa kết quả thu được với giá trị thực
hoặc sự khác biệt giữa giá trị trung bình thu được và giá trị thực được chấp

nhận cùng với khoảng tin cậy cho phép. Giá trị % càng lớn thì độ đúng của
quy trình càng cao. Ngược lại, độ chệch càng bé thì độ đúng của quy trình
càng cao.
1.1.3.2 Độ chính xác (Precision)
Trong nhiều trường hợp, các phép thử nghiệm trên những đối tượng giống
nhau với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau,
điều này do sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, người ta không thể
kiểm soát được hoàn toàn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử
7
nghiệm, do đó cần đánh giá độ chính xác. Độ chính xác chỉ phụ thuộc vào sai
số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực.
Độ chính xác là giá trị gần nhất giữa nhiều lần đo khi được thực hiện trên
các mẫu thử đồng nhất với cùng phương pháp.
Độ chính xác bao gồm:
+ Độ lặp lại (Repeatability)
Thực hiện thử nghiệm trong cùng một phòng xét nghiệm, cùng người thao
tác và sử dụng cùng một thiết bị, hóa chất trong khoảng thời gian ngắn.
+ Độ chính xác trung gian (Intermediate precision)
Diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng xét nghiệm được
thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau hoặc các thiết
bị, hóa chất khác nhau.
+ Độ tái lặp (Reproducibility)
Thực hiện thử nghiệm trong các phòng xét nghiệm khác nhau, thường
được áp dụng để tiêu chuẩn hóa phương pháp hoặc đánh giá năng lực một
phòng thí nghiệm.
Độ chính xác là khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ
lệch chuẩn (Standard Deviation/ SD) hay hệ số biến thiên (Coefficient of
Variation/ CV). Độ chính xác càng cao thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên
càng nhỏ.
Như vậy, độ chính xác có thể coi là độ “chụm” các kết quả tìm được của

mẫu thử, tâm hình tròn là giá trị đúng với giá trị thật của mẫu. Ta có sơ đồ
minh họa độ đúng và độ chính xác như sau:
8

Không đúng, không chính xác Không đúng nhưng chính xác

Tương đối đúng, không chính xác Đúng và chính xác
Hình 1.1: Minh họa độ đúng và độ chính xác
1.1.3.3 Độ tuyến tính và vùng tuyến tính
* Độ tuyến tính (Linearity): Là đường thẳng biểu diễn sự tương quan giữa
giá trị trực tiếp đo được và nồng độ chất phân tích trong mẫu. Chúng tương
quan với nhau theo dạng phương trình y = ax + b, thông thường biến độc lập
(nồng độ chất phân tích trong mẫu) được ký hiệu bằng chữ “x”, biến phụ
thuộc (giá trị trực tiếp đo được) được ký hiệu bằng chữ “y”. Đến một nồng độ
(thấp nhất và cao nhất) nào đó, giá trị đo được này không tuân theo phương
trình trên nữa, nghĩa là nồng độ chất phân tích và giá trị trực tiếp đo được
không còn mối tương quan tuyến tính với nhau và nằm ngoài vùng tuyến tính.
* Vùng tuyến tính (Range): Là khoảng giữa nồng độ thấp nhất và cao nhất
của chất phân tích được xác định với mức độ chấp nhận về độ đúng, độ chính
xác, mà vẫn còn có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ của chất phân tích
với giá trị trực tiếp đo được. Việc xác định vùng tuyến tính thường bắt đầu từ
giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm
cao nhất). Trong thực tế, không nhất thiết phải xác định toàn bộ vùng tuyến
9
tính mà có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, phủ được vùng nồng độ
thường dùng của mẫu. Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn
cao nhất hoặc thấp nhất của đường chuẩn, tốt nhất nằm ở khoảng giữa đường
chuẩn.
Độ tuyến tính và vùng tuyến tính cần đưa ra các dữ liệu sau: Phương trình
hồi quy đơn biến (y = ax + b) và hệ số tương quan (r).

1.1.3.4 Độ đặc hiệu (Specificity/Selectivity)
Có nhiều định nghĩa khác nhau về độ đặc hiệu. Theo WHO, áp dụng trong
kiểm định vắc xin, độ đặc hiệu là khả năng xác định được chất cần tìm có
trong mẫu thử khi có mặt các thành phần khác: tá dược, tạp chất,… [42].
1.1.3.5 Độ mạnh (Robustness)
Là khả năng duy trì được các thông số phù hợp mà cho kết quả đạt yêu
cầu, cung cấp những dấu hiệu ở mức tin cậy trong quá trình sử dụng bình
thường. Độ mạnh đánh giá qua sự tái lặp kết quả thu được bằng cách phân
tích các mẫu giống nhau với nhiều thay đổi nhỏ, nhưng có chủ ý so với điều
kiện chuẩn của các thành phần tham gia vào thử nghiệm (phòng thí nghiệm
khác nhau, kỹ thuật viên khác nhau, dụng cụ, trang thiết bị khác nhau, thuốc
thử khác lô, khác nhau về nhiệt độ, thời gian thử…).
Nếu điều kiện trong quá trình đo dễ bị biến đổi trong quá trình thực
nghiệm ảnh hưởng đến kết quả đo, thì các điều kiện này cần được kiểm soát
phù hợp và có biện pháp phòng ngừa.
1.1.3.6 Giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection)
Là lượng mẫu nhỏ nhất mà một quy trình kỹ thuật có thể phát hiện được
nhưng không định lượng được giá trị thực của nó. Giá trị này càng nhỏ thì
quy trình (phương pháp) càng “nhạy”.
1.1.3.7. Giới hạn định lượng (LOQ – Limit of Quantitation)
Là lượng mẫu nhỏ nhất mà một quy trình kỹ thuật có thể định lượng được
với điều kiện thỏa mãn độ đúng, độ chính xác thích hợp. Xác định LOQ bằng
10
cách pha loãng mẫu chuẩn thành nhiều nồng độ khác nhau, sau đó xác định
nồng độ tối thiểu mà quy trình này có thể định lượng được với độ đúng và độ
chính xác theo yêu cầu. Cũng giống như giới hạn phát hiện, giá trị này càng
nhỏ thì quy trình (phương pháp) càng “chính xác”.
y
Vùng tuyến tính (y = ax + b)

LOQ

LOD
0 x
Hình 1.2: Sơ đồ minh họa LOD, LOQ và vùng tuyến tính
Trong đó:
x: Nồng độ chất cần phân tích
y: Giá trị trực tiếp đo được
Theo WHO/VSQ/97.02 (2004), những quy trình và các chỉ số tương
ứng cần thực hiện trong thẩm định quy trình như sau:
Thử nghiệm
Nhận dạng
Xác định độ tinh khiết
Xác định
công hiệu
Xác định
thành phần
Định lượng Định tính
Độ đúng - + - + +
Độ chính xác - + - + +
Độ mạnh + + + + +
Đường/vùng tuyến tính - + - + +
Độ đặc hiệu + + + + +
LOD +
-
+
-
-
LOQ - + - - -
Bảng 1.1: Các thông số cần xác định trong thẩm định quy trình

(-): Các chỉ tiêu này thông thường không cần phải đánh giá.
(+): Các chỉ tiêu này cần phải đánh giá.
11
Tùy vào từng loại quy trình mà áp dụng bảng hướng dẫn trên để thiết lập
các thông số phù hợp cho một mục đích thẩm định cụ thể.
1.2 Bệnh thương hàn và vắc xin thương hàn Vi
1.2.1 Bệnh thương hàn
1.2.1.1 Tình hình bệnh thương hàn trên thế giới và Việt Nam
Thương hàn là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây thành dịch, phát tán rầm rộ,
do vi khuẩn S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C gây ra. Vi
khuẩn này được Eberth (Đức) phân lập vào năm 1880 khi ông tìm thấy chúng
trong lách và tủy xương các tử thi chết vì thương hàn. Do đó nó còn có tên
khác là trực khuẩn Eberth [16].
Trước thế kỷ 19, thương hàn bị nhầm lẫn với bệnh sốt do Rickettsia. Năm
1779, Hauxhmann nhận thấy ở một số người mắc bệnh về đường tiêu hóa có
biểu hiện sốt kéo dài và ảnh hưởng đến hệ thần kinh. Năm 1804, Prost và
Retit Serres phát hiện vết loét ở ruột non những bệnh nhân có biểu hiện sốt
như trên [6].
Năm 1829, Louis tách bệnh thương hàn khỏi những người bị sốt do
nguyên nhân khác trên cơ sở tổn thương giải phẫu bệnh ở ruột, hạch mạc treo
và lách. Đồng thời ông cũng mô tả bệnh cảnh lâm sàng với các dấu hiệu đặc
trưng: thủng ruột, xuất huyết tiêu hóa [6], [17].
Năm 1850, Jenner phân biệt thương hàn qua tổn thương giải phẫu bệnh lý
mảng Peyer và hạch lympho mạc treo. Năm 1873, Budd chứng minh thương
hàn có thể lây theo đường thức ăn, nước uống, các sản phẩm bơ, sữa… Đến
năm 1896, Pfeiffer và Kalle lần đầu tiên sản xuất được vắc xin chết từ vi
khuẩn thương hàn bất hoạt bằng nhiệt độ. Vắc xin này được sử dụng cho
người, đồng thời được đánh giá hiệu lực và khả năng bảo vệ bằng đáp ứng
miễn dịch chủ động trên lợn rừng [6].
Từ năm 1930, Reilly cho rằng bệnh thương hàn là một tình trạng nhiễm

độc – nhiễm khuẩn và nội độc tố đóng vai trò quyết định các dấu hiệu lâm
12
sàng và biến chứng [5], [17]. Ông cùng với một cộng sự người Việt Nam -
bác sĩ Phạm Hữu Chí, năm 1935 chứng minh vai trò của hệ thần kinh thực vật
dưới tác động của nội độc tố trực khuẩn thương hàn, trong cơ chế hình thành
một số tổn thương bệnh lý của bệnh thương hàn như loét mảng Peyer, thủng
và chảy máu ruột, nhiễm trùng mật… [9], [16].
Năm 1948, Theodore Woodward là người đầu tiên điều trị thành công
bệnh thương hàn ở Malaysia bằng Chloramphenicol, đánh dấu bước ngoặt lớn
trong điều trị bệnh thương hàn [3], [4].
Thương hàn là bệnh lây qua đường tiêu hóa. Người bị nhiễm bệnh do ăn,
uống phải thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. WHO ước tính, hằng năm trên
toàn cầu có khoảng 21 triệu trường hợp mắc bệnh thương hàn, trong đó 1 –
4% chết vì bệnh thương hàn (216.000 – 600.000 người), chủ yếu là trẻ em độ
tuổi đi học, 90% ca tử vong là ở châu Á. Tổ chức Y tế thế giới đặt thương hàn
vào loại bệnh truyền nhiễm quan trọng, bệnh lây lan nhiều nhất ở độ tuổi từ 5
- 19 tuổi [29], [41]. Các hiện tượng như sự gia tăng dân số, thiên tai cùng với
hệ thống y tế thấp kém ở những nước chậm phát triển, đang phát triển,… đặc
biệt là tình trạng vi khuẩn Salmonella typhi kháng kháng sinh là nguyên nhân
gia tăng số người mắc bệnh thương hàn trong phần lớn các dịch thương hàn.
Chủng S. typhi đề kháng với Ciprofloxacin lần đầu tiên được báo cáo năm
2005 tại Karachi (Pakistan) sau đó ở India và các nước châu Phi [41].
Sự đa kháng thuốc (Multidrug-resistant/MDR) của S. typhi góp phần gây
ra dịch bệnh và đại dịch. Hơn 80% các chủng Salmonella typhi từ đồng bằng
sông Cửu Long của Việt Nam đề kháng với ampicillin, chloramphenicol, acid
nalidixic, ciprofloxacin [45]. Trong những năm đầu thập niên 90 của thế kỷ
XX, sự bùng phát dịch bệnh thương hàn gây ra do những chủng vi khuẩn
kháng fluoroquinolones đã xảy ra ở Tajikistan và Việt Nam [29].
Ở Việt Nam, trong “Luật phòng, chống bệnh truyền nhiễm”, bệnh thương
hàn xếp vào nhóm bệnh lây truyền nhóm B, lấy phòng bệnh là chính trong đó

13
có thông tin, giáo dục, truyền thông, giám sát bệnh truyền nhiễm, tiêm phòng
vắc xin kết hợp các biện pháp chuyên môn kỹ thuật y tế trong phòng, chống
bệnh truyền nhiễm [14].
Theo thống kê của Bộ Y tế, số mắc thương hàn ở trẻ em năm 2008 là
1.316 trẻ, năm 2009 con số này có giảm, còn 823 trẻ mắc thương hàn, nhưng
tỷ lệ chết không thay đổi. Theo số liệu tổng hợp của Tổng cục Thống kê, năm
2011, cả nước có 664 trường hợp mắc bệnh thương hàn [8].
1.2.1.2 Tác nhân gây bệnh
* Đặc điểm sinh học của Salmonella
Salmonella là một trong những chi quan trọng, thuộc họ vi khuẩn đường
ruột (Enterobacteriaceae), là trực khuẩn Gram âm, không sinh nha bào, có
nhiều lông xung quanh thân (trừ S. gallinarum và S. pullorum). Trực khuẩn
thương hàn có kích thước trung bình dài 2 - 3 µm, đường kính 0,5 – 1,0 µm,
là vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy ngộ, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy
thông thường và có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc
như DCA (deoxycholate) và XLD (xylose lysine deoxycholate), dùng trong
phân lập vi khuẩn.
Trên tiêu bản nhuộm từ nuôi cấy thuần, Salmonella thường đứng rời rạc,
riêng rẽ, hay từng đôi, ít khi từng đám. Trong môi trường nuôi cấy ở 37
0
C
chúng đứng gần nhau. Ở giai đoạn phân chia, chúng xếp thành chuỗi ngắn từ
3 đến 4 tế bào hay xếp thành từng cặp một cách ngẫu nhiên.
Hình 1.3: S. typhi chụp qua kính hiển vi điện tử (2.450X)
(nguồn Sciencephotolibrary)
14
* Đặc điểm sinh hóa của Salmonella
Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose thường sinh
hơi và sử dụng được citrat ở môi trường Simmons. Phản ứng catalase (+),

oxidase (-), lysin decarboxylase (+), urease (-), H
2
S thường (+).
Tuy nhiên không phải bất kỳ loài Salmonella nào cũng có đầy đủ các tính
chất trên. Những ngoại lệ đã được xác định và có giá trị phân biệt cao là: S.
typhi lên men đường glucose không sinh hơi và citrat Simmons (-) [16].
* Kháng nguyên [13], [16], [26]
Salmonella có ba loại kháng nguyên chính, bao gồm:
+ Kháng nguyên thân (KN O), có ở tất cả các Salmonella.
+ Kháng nguyên lông (KN H), có ở đa số các Salmonella, trừ một số ít
Salmonella không di động.
+ Kháng nguyên vỏ (KN Vi), chỉ có ở S. typhi và S. paratyphi C.
Hình 1.4: Minh họa cấu trúc kháng nguyên của Salmonella
Màng nguyên sinh chất
15
•
Kháng nguyên O
Kháng nguyên O (Ohne Hauck – tiếng Đức), có bản chất là
lipopolysaccharide (LPS). Đây chính là nội độc tố của vi khuẩn, chỉ được giải
phóng ra khi vi khuẩn bị phá hủy. LPS bao gồm 3 phần: chuỗi bên đặc hiệu
O, nhân cơ bản polysaccharide và lipid A. Hàm lượng lipid và polysaccharide
tương đương nhau [7].
Kháng nguyên O mang tính đặc hiệu nhóm. Tính chất đặc hiệu nhóm
của nó dựa trên cấu trúc của đường trong thành phần polysaccharide của
liposaccharide thành tế bào: phần đa đường có hoạt tính kháng nguyên cao do
có chứa các nhóm quyết định kháng nguyên, thành phần protein trong cấu
trúc làm cho phức hợp có tính kháng nguyên và lipid A đóng vai trò nội độc
tố, ức chế bổ thể
Kháng nguyên O có tính bền vững cao, không bị phá huỷ dưới tác dụng
của cồn, acid phenic và cả ở nhiệt độ 100

0
C /2 giờ 30 phút [7], [13].
•
Kháng nguyên H
Kháng nguyên H (Hauck – tiếng Đức), có bản chất là protein, được
cấu tạo từ 14 loại axít amin khác nhau (không chứa tryptophan, histidin,
cystein).
Các Salmonella có lông đều có kháng nguyên H. Các Salmonella
không có lông (S. gallinarum và S. pullorum) thì không có kháng nguyên H
[16], [26].
Kháng nguyên H có thể có hai pha [16]:
+ Pha 1 (pha đặc hiệu) có các týp huyết thanh được kí hiệu bằng các
chữ cái a, b, c, d…
+ Pha 2 (pha không đặc hiệu) có thể ở một số týp huyết thanh, được
đánh dấu bằng các chữ số nguyên: 1, 2, 3, 4.
Kháng nguyên H dễ bị phá hủy ở 100
0
C trong 150 phút, cồn 50% và
phenol, bền với formol 0,5% [13].
16
•
Kháng nguyên Vi
Kháng nguyên Vi (Virulence) là kháng nguyên bề mặt hay còn gọi là
kháng nguyên K (Kapsul – tiếng Đức), là lớp rất mỏng ngoài cùng (lớp vỏ)
của vi khuẩn Salmonella, bao bọc xung quanh kháng nguyên O. Kháng
nguyên Vi không tham gia vào việc gây bệnh và chỉ có ở S. typhi và S.
paratyphi C [16], [26].
Kháng nguyên Vi của S. typhi có khối lượng phân tử từ 100 – 3000
kDa [37], bản chất hóa học là polysaccharide (PS), một polyme mạch thẳng
với đơn phân là 1, 4 (2 deoxy)-2-N-acetyl galactouronic acid có nhóm O-

acetyl ở C
3
[33], [37],

[43].
Hình 1.5: Sơ đồ minh họa cấu trúc hóa học của kháng nguyên Vi
Trong đó:
. : Nhóm CH
3
Ac: nhóm Acetyl (CO – CH
3
)
Nhóm O-acetyl (mũi tên)
Kháng nguyên Vi cản trở quá trình thực bào, có khả năng chống lại tác
động của bổ thể trong huyết thanh. Kháng nguyên Vi được coi là một trong
các yếu tố độc lực và là chất sinh miễn dịch có tính bảo vệ [13], [16], [26].
O
O
CO
O
H
A
c
O
NH ˗ Ac
)
n
•
•
•

O
O
COOH
AcO
N
H ˗ Ac
(
•
•
•
17
Đối với S. typhi, kháng nguyên Vi là một trong các yếu tố bám dính, đó là
bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và
vật chủ. Kháng nguyên Vi còn bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào bằng
cách không cho các kháng thể tạo hiện tượng opsonin hóa trên vách vi khuẩn.
Do không có hiện tượng opsonin hóa nên các đại thực bào và bạch cầu trung
tính tiếp cận kém hoặc không thể tiếp cận được vi khuẩn.
Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên Vi liên quan đến kích thước phân
tử O-acetyl, kích thước phân tử càng lớn, tính sinh miễn dịch càng cao. O–
acetyl là phần quyết định kháng nguyên (epitope) quan trọng của kháng
nguyên Vi, nhóm O-acetyl kết hợp đặc hiệu với kháng thể kháng Vi trong
phản ứng KN-KT [34].
Ngoài ra, khả năng sinh miễn dịch còn tuỳ thuộc vào mức độ O–acetyl
hoá. Trong trường hợp kháng nguyên là polysaccharide, các nhánh chuỗi O
– acetyl thông qua cầu glycosit sẽ tạo ra cấu trúc không gian ba chiều của
epitope. Việc loại từng phần nhóm O-acetyl làm giảm khả năng sinh miễn
dịch. Khi loại hoàn toàn nhóm này thì kháng nguyên Vi mất khả năng sinh
miễn dịch [13], [34], [37].
1.2.1.3 Dịch tễ học
Thương hàn là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây bằng đường tiêu hóa.

Người bị bệnh do ăn uống phải thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn, nên dễ
tạo thành dịch. Biểu hiện lâm sàng là hội chứng nhiễm khuẩn, nhiễm độc toàn
thân, kèm theo tổn thương bệnh lý đặc hiệu ở đường tiêu hóa [9].
Bệnh xảy ra quanh năm, không phân bố theo mùa hay theo tháng. Tuy
nhiên trong thực tế, bệnh thương hàn thường xảy ra vào mùa hè (khoảng từ
tháng 6 đến tháng 9).
Bệnh có thể xảy ra ở bất kỳ ai vào bất kỳ độ tuổi nào. Một số, số liệu
thống kê cho thấy bệnh thường xảy ra ở những người trong khoảng tuổi từ 15
đến 30 tuổi. Nguyên nhân là những người ở độ tuổi này thường là những
18
người đi làm, sống và lao động trong những nơi có điều kiện vệ sinh bất lợi:
uống nước lã, ngâm mình dưới ao, hồ nước bẩn,…[15].
Người bệnh là nguồn bệnh quan trọng. Người bệnh có thể lây cho người
khác ngay trong thời kỳ ủ bệnh từ chất thải: phân, chất nôn, nước tiểu,
Người khỏi bệnh mang vi khuẩn, sau khi hết các triệu chứng lâm sàng, đa số
người khỏi bệnh vẫn đào thải vi khuẩn ra môi trường bên ngoài trong 2 - 3
tuần. Khoảng 2% - 20% người bệnh vẫn có thể thải vi khuẩn ra môi trường 2
đến 3 tháng sau khi hết các triệu chứng lâm sàng.
S. typhi có thể sống vài tuần trong nước, nước đá, bụi, nước thải khô và
trên đồ vải nhưng sống trong nước thải chưa đến 1 tuần. Vi khuẩn cũng có thể
sống và nhân lên trong sữa và các sản phẩm sữa mà không thay đổi tính chất
sữa. Đồ ăn có thể bị nhiễm trực tiếp qua nước rửa hoặc khi chế biến do người
mang vi khuẩn, qua bụi và có thể qua ruồi [11].
Do ăn phải thực phẩm, uống nước bị nhiễm khuẩn không được nấu chín
dẫn đến nhiễm bệnh, đây là đường lây quan trọng và thường gây dịch lớn. Do
tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân, người mang vi khuẩn qua chất thải, chân,
tay, đồ dùng bị nhiễm khuẩn,… đường lây này thường gây dịch nhỏ, tản phát
[9], [15].
1.2.1.4 Bệnh sinh
Bệnh thương hàn xuất hiện phụ thuộc vào số lượng, độc lực của vi khuẩn

và đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ. Hàm lượng vi khuẩn Salmonella từ 10
6
-
10
9
CFU/ml mới gây bệnh.
19
Hình 1.6: Minh họa con đường xâm nhập của S. typhi
S. typhi gây bệnh thương hàn qua 3 giai đoạn [9]:
* Giai đoạn 1 (thời kỳ nung bệnh)
Vi khuẩn thương hàn qua đường tiêu hóa đến dạ dày. Tại đây một số vi
khuẩn bị tiêu diệt bởi độ toan của dịch vị, số còn lại xuống ruột non. Tại ruột
non một phần vi khuẩn tiếp tục bị tiêu diệt bởi IgA tiết, số còn lại bám vào vi
nhung mao của thành ruột, sau 24 – 72 giờ chui qua niêm mạc ruột vào các
hạch mạc treo, theo đường bạch huyết đến mảng Payer và phát triển ở đó
khoảng 15 ngày. Từ đó, vi khuẩn đi vào các nang lympho ruột và hệ thống
hạch mạc treo rồi theo đường máu (vào máu lần thứ nhất) và đi khắp cơ thể.
Trong quá trình này, vi khuẩn có thể xâm nhập vào bất cứ các cơ quan tổ chức
nào, hay gặp nhất là ở gan, lách, tủy xương, túi mật. Tại đây chúng bị các đại
thực bào bắt giữ và nhân lên tại đó, nhưng chưa gây ra bệnh cảnh lâm sàng
cũng như biến đổi rõ rệt chức năng của các cơ quan.
* Giai đoạn 2 (thời kỳ khởi phát)
Sau thời gian phát triển ở hạch mạc treo và vào máu lần thứ nhất, một
số vi khuẩn đã lan truyền khắp cơ thể theo đường máu. Từ trong máu vi
khuẩn xâm nhập vào gan, theo đường mật tới túi mật và tăng sinh tại đó, sau
20
đó xuống hệ tiêu hóa, rồi lại xâm nhập vào máu lần 2. Khi số lượng đủ lớn, vi
khuẩn vào máu gây ra triệu chứng lâm sàng ở giai đoạn khởi phát.
* Giai đoạn 3 (giai đoạn toàn phát)
Các vi khuẩn bị tiêu diệt giải phóng nội độc tố. Chính nội độc tố của vi

khuẩn thương hàn đóng vai trò quyết định các dấu hiệu lâm sàng như: li bì,
rối loạn nhiệt độ và một số tổn thương ở ruột…Nặng hơn bệnh nhân có thể
hôn mê, trụy tim mạch, thủng ruột non, đây là biến chứng nặng thường gây tử
vong.
1.2.1.5 Phòng bệnh
* Không đặc hiệu
Đảm bảo vệ sinh môi trường, bảo vệ nguồn nước, xử lý phân, rác triệt để,
hợp vệ sinh.
Đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm trong chế biến, sản xuất, kinh doanh
thực phẩm.
* Đặc hiệu
Bệnh thương hàn có thể phòng ngừa bằng cách gây miễn dịch chủ động.
Có 3 loại vắc xin được xác định có hiệu quả và được dùng để phòng bệnh,
hiệu quả bảo vệ đạt được từ 50 – 80% và kéo dài trong nhiều năm [13]:
+ Vắc xin sống giảm độc lực (sản xuất từ chủng S. typhi Ty21a).
+ Vắc xin Vi-capsulepolysaccharide (Vi-CPS) (sản xuất từ KN thương
hàn Vi).
+ Vắc xin cộng hợp (sản xuất từ kháng nguyên thương hàn Vi cộng hợp
protein tái tổ hợp).
1.2.2 Vắc xin thương hàn Vi
1.2.2.1 Vai trò của vắc xin thương hàn Vi
Bệnh thương hàn lây qua đường tiêu hóa, vì vậy miễn dịch tại chỗ đóng
vai trò quan trọng chống lại mầm bệnh ở ruột. Lớp IgA tiết có vai trò quan
21
trọng trong miễn dịch ruột, mảng Payer là nơi chứa nhiều các tế bào tiền thân
của IgA.
Vắc xin thương hàn sống dùng theo đường uống có khả năng gây miễn
dịch mạnh do có sự hiện diện thường xuyên và lặp lại của kháng nguyên. Tuy
nhiên cần phải uống nhắc lại nhiều lần nên khó có thể áp dụng rộng rãi trong
cộng đồng. Mặt khác, trong quá trình sản xuất vi khuẩn thương hàn phải qua

các khâu lên men, đông khô nên dễ thay đổi về mặt di truyền thường dẫn đến
giảm khả năng tổng hợp kháng nguyên Vi nên chất lượng vắc xin khó đảm
bảo.
Kháng nguyên Vi được cho là một yếu tố độc và là chất sinh miễn dịch, vì
vậy ngày nay người ta đã sử dụng những chủng giàu kháng nguyên Vi trong
sản xuất vắc xin. Việc tạo miễn dịch thành công bằng polysaccharid vỏ Vi tinh
chế tạo ra hướng sản xuất mới cho việc sản xuất vắc xin thương hàn Vi. Hiệu
quả bảo vệ của vắc xin thương hàn Vi dựa trên miễn dịch dịch thể.
Khi nghiên cứu với hàm lượng kháng nguyên Vi ở mức 25 µg ViPs/liều và
50 µg ViPs/liều, người ta thấy ở cả hai hàm lượng đều có sự tăng lượng kháng
thể trong huyết thanh gấp 4 lần hoặc cao hơn ở 95% người lớn ở Pháp và Hoa
Kỳ [13]. Năm 1985, người ta tiến hành thực địa bằng phương pháp mù kép và
ngẫu nhiên, có đối chứng, dùng vắc xin thương hàn Vi của Viện Pasteur
Merieux, ở Nepan, đông Transvaal, Nam Phi với liều kháng nguyên Vi 25 µg
ViPs. Kết quả cho thấy kháng thể Vi trong huyết thanh tăng gấp 4 lần hoặc
cao hơn so với trước khi tiêm ở khoảng 75% người nhận. Vì thế, các nhà sản
xuất đã lấy hàm lượng này là tiêu chuẩn cho một liều vắc xin thương hàn Vi.
1.2.2.2 Sản xuất vắc xin thương hàn Vi
Hiện nay, vắc xin thương hàn Vi polysaccharide được sản xuất trên dây
chuyền công nghệ sinh học hoàn chỉnh, tinh chế từ vỏ của Salmonella typhi
Ty2, có độ tinh khiết cao. Vắc xin thương hàn dùng để gây miễn dịch chủ
22
động phòng bệnh thương hàn cho trẻ em từ 2 tuổi trở lên và người lớn. Quy
trình sản xuất vắc xin thương hàn Vi qua các giai đoạn sau:
•
Nhân chủng:
Mỗi loạt sản xuất dùng một ống chủng đông khô, nhân chủng qua môi
trường canh thang TSB được canh khuẩn thuần khiết.
•
Nuôi cấy và thu hoạch Vi thô

Đưa canh khuẩn chủng vào nồi lên men nuôi cấy ở nhiệt độ 32
0
C trong
thời gian từ 6 đến 8 giờ. Thu canh khuẩn, bất hoạt canh khuẩn bằng 0,5%
Formaline 35 – 38%. Tách xác vi khuẩn bằng hệ thống lọc với màng lọc 0,45
µm. Cô đặc kháng nguyên Vi thô bằng hệ thống lọc với màng lọc có lỗ lọc
các phân tử có khối lượng 10.000 Dalton.
Hình 1.7: Kháng nguyên Vi của S. typhi dưới kính hiển vi điện tử (mũi tên)
(12.000X)
•
Tinh chế
Dùng các men DNAase, RNAase, Proteinase để cắt DNA, RNA,
Protein của kháng nguyên Vi thô. Ly tâm để thu Vi tinh khiết. Đông khô
kháng nguyên Vi
•
Pha vắc xin bán thành phẩm cuối cùng
Pha kháng nguyên Vi đông khô trong dung dịch đệm, lọc vô trùng bằng
màng lọc kích thước 0,2 µm.
•
Đóng ống, dán nhãn, đóng hộp.
Thành phần trong 1 liều vắc xin
23
− Polysacchride Vi tinh khiết 0,025 mg
− Phenol 1,25 mg
− Dung dịch đệm đẳng trương 0,5 ml
Vắc xin thương hàn Vi kích thích cơ thể tạo kháng thể kháng Vi tối ưu do
tính tinh khiết cao của nó. Sau khi tiêm vắc xin, KT xuất hiện sau 2 - 3 tuần,
khả năng bảo vệ ít nhất 3 năm. Theo quy định hiện hành hàm lượng kháng
nguyên Vi thành phẩm là: 25 µg/liều ± 30% (35 – 65 µg/ml).
Liều tiêm: một liều duy nhất (0,5 ml).

Đường tiêm: dưới da hoặc bắp thịt.
1.2.2.3 Tác dụng của vắc xin thương hàn Vi
Khi tiêm hay mắc bệnh thương hàn đều xuất hiện kháng thể trong huyết
thanh và ruột. S. typhi sau khi vượt qua dạ dày xuống ruột non, IgA tiết có
khả năng ngăn cản vi khuẩn này bám vào niêm mạc ruột [6]. Chau và cộng sự
nhận thấy kháng thể kháng LPS (IgG, IgM) trong dịch tiết của ruột ở 12
người mắc bệnh thương hàn cao hơn so với nhóm đối chứng.
Sau khi tiêm vắc xin thương hàn Vi, cơ thể được miễn dịch tạo kháng thể
kháng Vi. Khi nhiễm S. typhi, kháng nguyên vỏ Vi bị ngưng kết bởi phản ứng
kết hợp KT-KN đặc hiệu, ngăn cản sự bám dính của vi sinh vật. Khi đó cơ thể
tạo ra nhiều lực cơ học khác nhau, nhu động ruột, dòng máu chảy nhằm loại
bỏ S. typhi dễ dàng hơn, bảo vệ cơ thể khỏi sự nhiễm bệnh.
1.2.2.4 Kiểm định chất lượng vắc xin thương hàn Vi
Việc kiểm định thực hiện bắt đầu ngay từ nguyên liệu đầu: Chủng gốc,
chủng sản xuất, nước, hóa chất pha môi trường, lọ, nắp, nhãn… Trong quá
trình sản xuất việc giám sát và kiểm định chất lượng ở từng giai đoạn đều
phải thực hiện thường xuyên, theo đúng SOP. Việc giám sát và kiểm tra sự
tuân thủ điều kiện bảo quản luôn được ghi nhận lại tới khi tiêm cho người.
24
Trong phòng thí nghiệm, kiểm định chất lượng vắc xin này dựa trên các
tiêu chí chính sau đây:
•
Tính chất vật lý, hóa học [18] [43]
- Dung dịch trong, không màu, không có vật thể lạ.
- pH: 6,5 – 7,5.
- Thể tích đủ theo đăng ký (nhãn).
- Hàm lượng Phenol: ≤ 0,25 g/100 ml.
•
Tính vô khuẩn [23], [43]
Cấy trực tiếp vắc xin vào môi trường nuôi cấy phù hợp với sự phát triển

của vi khuẩn và nấm. Ủ môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 30
0
C đến 35
0
C đối với
vi khuẩn, 20
0
C đến 25
0
C đối với vi nấm.
Tiêu chuẩn: Không có vi khuẩn và nấm mọc sau 14 ngày theo dõi.
•
An toàn không đặc hiệu [25], [43]
Dùng 5 chuột nhắt trắng nặng 17 - 22 g/con và 2 chuột lang nặng 250 –
350 g/con. Tiêm ổ bụng 1 liều tiêm cho người (nhưng không quá 1 ml) cho
chuột nhắt và 1 liều tiêm cho người cho chuột lang.
Tiêu chuẩn: Toàn bộ chuột tiêm vắc xin phải sống khỏe mạnh, không
có dấu hiệu bệnh lý, lên cân sau 7 ngày theo dõi.
•
Chất gây sốt [24], [43],
Chất gây sốt được xác định gián tiếp qua việc thân nhiệt thỏ tăng sau
tiêm vắc xin vào tĩnh mạch tai thỏ. Tiêm 1 ml/1 kg cân nặng thỏ dung dịch
vắc xin thương hàn Vi (pha loãng 1/2000).
Tiêu chuẩn: nhiệt độ tăng ≤ 0,6
0
C/3 thỏ.
•
Nhận dạng [19], [43]
Áp dụng kỹ thuật khuyếch tán miễn dịch kép (Ouchterlony). Cùng nhỏ
kháng thể kháng Vi và vắc xin thương hàn Vi vào hai giếng của bản thạch,

25