nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây ô đầu (aconitum carmichaeli debx.) trồng ở tỉnh hà giang tóm tắt

1

A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Tính cấp thiết của luận án
Ô đầu, Phụ tử là những vị thuốc quý, đã được dùng khá phổ
biến trong Y Dược học cổ truyền. Hiện nay trên thế giới, đang có
những nghiên cứu về chi Aconitum L. nhằm phát triển các sản phẩm
theo hướng hiện đại, nâng cao hiệu quả sử dụng các loài thuộc chi
này trong phòng và điều trị bệnh.
Ở Việt Nam, cây Ô đầu được trồng nhiều ở huyện Quản Bạ, Đồng
Văn, tỉnh Hà Giang và được người dân địa phương sử dụng theo kinh
nghiệm làm thuốc chữa bệnh đau nhức xương khớp hoặc nấu cháo ăn
để tăng cường sức khoẻ. Hàng năm nước ta có nhiều vụ ngộ độc do
sử dụng nhầm lẫn, đầu độc bằng dược liệu, chế phẩm có nguồn gốc
từ cây Ô đầu. Do đó cần có tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu và
phương pháp xác định nhanh nguyên nhân gây ngộ độc cây Ô đầu.
Theo quyết định phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu
đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030 của Thủ Tướng Chính
phủ, cây Ô đầu được quy hoạch trồng tại tỉnh Hà Giang. Để phát
triển vùng trồng cây Ô đầu một cách bền vững, cần có nghiên cứu
theo hướng ứng dụng trong Y Dược học hiện đại, góp phần phát triển
sản phẩm từ cây Ô đầu, nhằm tạo đầu ra cho cây Ô đầu Hà Giang.
Để đóng góp về mặt khoa học, thực tiễn và góp phần giải quyết
những vấn đề nêu trên, luận án với tên đề tài “Nghiên cứu thành
phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Ô đầu
(Aconitum carmichaeli Debx.) trồng ở tỉnh Hà Giang” được thực
hiện.

2

2. Mục tiêu và nội dung chính của luận án

2.1. Mục tiêu luận án
+ Xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang.
+ Nghiên cứu thành phần hóa học: định tính, định lượng nhóm chất,
chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hoá học các chất phân lập
được.
+ Đánh giá độc tính cấp và thử một số tác dụng sinh học của một số
phân đoạn dịch chiết từ cây Ô đầu để gợi mở hướng sử dụng dược
liệu này.
2.2. Nội dung chính của luận án
+ Xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang bằng
phương pháp phân tích đặc điểm hình thái và phương pháp giải trình
tự gen ADN.
+ Định tính, định lượng, chiết xuất, phân lập nhóm chất alcaloid,
flavonoid, polysacharid từ cây Ô đầu.
+ Thử độc tính cấp của các phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid,
flavonoid, polysaccharid.
+ Thử tác dụng giảm đau của phân đoạn chứa alcaloid có độc tính
thấp, tác dụng tăng cường miễn dịch của phân đoạn dịch chiết chứa
polysaccharid, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân đoạn
dịch chiết chứa flavonoid
3. Những đóng góp mới của luận án
* Về thực vật:
- Đã áp dụng phương pháp giải trình tự gen ADN để xác định được
tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang là: Aconitum
carmichaeli Debx.
3

* Về hóa học:
- Đã áp dụng phương pháp ICP-MS xác định được hàm lượng 12
kim loại nặng (Pb, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Ag, As)

trong Ô đầu, Phụ tử
- Đã chiết xuất phân lập được 5 alcaloid, 4 flavonoid, 2 sitosterol và
5 chất nhóm acid béo, este. Trong đó có 2 chất mới là: 5,7,3
'
-
trimethoxyquercetin 3-O-β-D-fructofuranosid và (Z)-3-
hydroxypentan-2-yl-10-aminooctacos-9-enoat. Các chất lần đầu tiên
phân lập được từ chi Aconitum là: acid 9-chlorooctadecanoic, acid 3-
chloroicosanoic, acid 8-chlorohexadecanoic, 3-hydroxypropane-1,2-
diyl dihenicosanoat, 7,4′-O-dimethylluteolin 5-O-[α-L-
arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid], quercetin 3-O-

-L-
rhamnopyranosid, quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid
* Về độc tính cấp và tác dụng sinh học:
- Đã xác định được LD
50
của 2 phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid là:
991.36 ± 176.78 (mg/kg) và 27.257 ± 7.071 (mg/kg)
- Đã xác định ở liều tối đa chuột có thể uống 12g phân đoạn dịch
chiết chứa flavonoid/kg và 15 g phân đoạn chứa polysaccharid/kg tể
trọng chuột mà không có chuột nào chết.
- Phân đoạn alcaloid (PĐ E) chiết xuất từ Phụ tử với liều 12.5
mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày uống trong 3 ngày
liên tục, thấy có tác dụng giảm đau thông qua kéo dài thời gian phản
ứng với nhiệt độ, làm tăng khoảng cách gây phản xạ đau và làm giảm
số cơn quặn đau ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với lô chứng.
- Phân đoạn polysaccharid (PĐ I) chiết xuất từ Phụ tử với liều 100
mg/kg và 300 mg/kg thể trọng chuột, thấy có tác dụng kích thích
4

miễn dịch thông qua mẫu thử làm tăng phục hồi số lượng bạch cầu,
tăng nồng độ cytokine IL-2, nồng độ globulin miễn dịch và hạn chế
một phần tổn thương trên giải phẫu vi thể tổ chức lympho.
- Phân đoạn flavonoid (PĐ C) chiết từ lá với liều 30mg/kg thể trọng
chuột thấy có tác dụng chống viêm gan cấp và chống oxy hóa thông
qua làm giảm hoạt độ enzym (39.23 %) và làm giảm hàm lượng
MDA trong gan (15.96 %) so với lô chứng.
4. Ý nghĩa của luận án
Luận án có những ý nghĩa về mặt khoa học và thực tế như sau:
+ Xác định tên khoa học của cây giúp khẳng định rõ nguồn gốc dược
liệu, góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu.
+ Giám định tên khoa học của cây bằng phương pháp giải trình tự
gen ADN, đây là phương pháp mới được áp dụng tại Việt Nam có độ
chính xác, độ tin cậy cao.
+ Chiết xuất, phân lập các chất, xác định hàm lượng nhóm chất góp
phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu, xác định nhanh
nguyên nhân gây ngộ độc có phải do Ô đầu, Phụ tử hay không.
+ Phân lập được 2 chất mới trong tự nhiên và một số chất mới với
chi Aconitum, với loài, góp phần bổ sung vào bộ dữ liệu của cây và
của chi, tạo thuận lợi cho những nghiên cứu ứng dụng sau này.
+ Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp cho thấy mức độ độc và góp
phần định hướng sử dụng các phân đoạn này.
+ Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học khẳng định thêm những
tác dụng chưa được nghiên cứu hoặc ứng dụng nhiều, minh chứng rõ
hơn về công dụng của Ô đầu, Phụ tử dùng trong Y học cổ truyền, gợi
mở hướng sử dụng trong Y Dược học hiện đại.
5

Kết quả của đề tài luận án góp phần thúc đẩy việc trồng và phát triển

cây Ô đầu tại tỉnh Hà Giang, từ đó nâng cao đời sống nhân dân địa
phương.
5. Bố cục luận án
Luận án gồm 4 chương, 40 bảng, 47 hình, 153 tài liệu tham
khảo, 23 phụ lục. Luận án có 124 trang gồm các phần chính: Đặt
vấn đề (2 trang), tổng quan (27 trang), nguyên vật liệu và phương
pháp nghiên cứu (13 trang), kết quả nghiên cứu (57 trang), bàn luận
(23 trang), kết luận và kiến
nghị (2 trang).
B. NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
Đã tập hợp và trình bày có hệ thống các kết quả nghiên cứu
từ trước tới nay về thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng
sinh học của chi Aconitum trên thế giới và ở Việt Nam.
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
Thu hái mẫu cây Ô đầu trồng ở huyện Quản Bạ tỉnh Hà
Giang. Lấy củ mẹ, củ con khi cây đã ra quả và lụi. Lấy lá cây khi cây
mới ra quả. Nguyên liệu được sấy khô ở 60
0
C, bảo quản trong túi
polyetylen kín, khô ráo. Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng
cả 2 giống khoẻ mạnh, khoảng 06 tuần tuổi, trọng lượng khoảng 20±
2 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung Ương
cung cấp.


6

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Nghiên cứu về thực vật:
Phân tích đặc điểm hình thái thực vật, chiết và phân tích ADN, giải
trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen của loài thuộc chi
Aconitum.
Nghiên cứu về hóa học:
- Định tính các nhóm chất hữu cơ.
- Định lượng alcaloid toàn phần theo phương pháp acid-base
- Định lượng aconitin bằng phương pháp HPLC
- Định lượng flavonoid toàn phần và polysacharid toàn phần bằng
phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến
- Xác định hàm lượng các kim loại nặng trong mẫu Ô đầu, Phụ tử
bằng phương pháp đo phổ ICP-MS
- SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien
60GF
254
. Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha
thường (cỡ hạt 0.040-0.063 mm, 0.063-0.200 mm, Merck) và silica
gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex
G100 .
- Xác định cấu trúc các chất phân lập dựa trên thông số vật lý và các
phương pháp phổ gồm: điểm chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng,
phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và 2 chiều
Nghiên cứu tác dụng sinh học:
- Đánh giá độc tính cấp của các phân đoạn dịch chiết trên chuột nhắt
trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon và
phương pháp Bliss.
- Đánh giá tác dụng giảm đau của phân đoạn chứa alcaloid trên chuột
7

nhắt trắng bằng phương pháp Koster, mâm nóng và máy tail-flick.
- Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch của phân đoạn chứa
polysaccharid trên mo hình gây suy giảm miễn dịch cấp bởi
cyclophosphamid
- Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân đoạn
chứa flavonoid trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng
CCl
4

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật
- Căn cứ vào kết quả phân tích đặc điểm hình thái, khóa phân loại
thực vật chí Trung Quốc (2001) và giải trình tự gen ADN, so sánh
với ADN của loài thuộc chi Aconitum để xác định tên khoa học cây
Ô đầu ở Hà Giang là: Aconitum carmichaeli Debx.
3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học
3.2.1. Xác định thành phần hóa học
- Định tính các nhóm chất hữu cơ: đã xác định trong cây có các
nhóm chất chính là alcaloid, flavonoid, polysaccharid, ngoài ra còn
có một số nhóm chất khác: acid béo, este, sterol…
- Định lượng các nhóm chất alcaloid, flavonoid, polysaccharid:
+ Áp dụng phương pháp acid-base để xác định hàm lượng alcaloid
toàn phần trong Ô đầu, Phụ tử cùng 2 phân đoạn D, E chiết từ Phụ tử
cho kết quả lần lượt như sau: 0.93 %, 0.70 %, 28.61 %, 26.83 % tính
theo aconitin.
+ Áp dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng aconitin
trong Phụ tử, Ô đầu cùng 2 phân đoạn D, E chiết từ Phụ tử cho kết
quả lần lượt như sau: 0.072 %, 0.125 %, 0.066 %, 0.015 %.
8

+ Xây dựng, thẩm định và áp dụng phương pháp đo quang phổ UV-
Vis để xác định hàm lượng:
* Flavonoid toàn phần trong lá, trong phân đoạn dịch chiết C, E lần
lượt là: 1.60 %, 38.24 %, 30.42 % tính theo quercetin.
* Polysaccharid toàn phần trong Phụ tử, Ô đầu, trong phân đoạn I, II
chiết từ Phụ tử lần lượt là: 19.63 %, 14.52 %, 87.6 %, 72.8 % tính
theo D-glucose.
+ Áp dụng phương pháp đo ICP-MS đã xác định hàm lượng 12 kim
loại nặng trong Ô đầu, Phụ tử sống là: Pb, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu,
Zn, Cd, Hg, Ag, As nằm trong giới hạn cho phép quy định đối với
thuốc, thực phẩm.
3.2.2.Chiết xuất và phân lập các chất từ Ô đầu, Phụ tử
- Phụ tử (2,8 kg) ngâm chiết bằng ethanol 96 %. Chiết xuất phân lập
các chất bằng sắc ký cột thu được các chất: (OD1, OD2, OD3, OD4,
OD5, OD6, OP7, OD8, OD9, OD10).
- Ô đầu (3,2 kg) ngâm chiết bằng ethanol 96 %. Chiết xuất phân lập
các chất bằng sắc ký cột thu được các chất: OD4, OD6, OD7.
- Bột Phụ tử 500 g ngâm chiết bằng nước cất ở 90
o
C. Dịch chiết
được tủa bằng ethanol 96 % và ly tâm thu tủa polysaccharid. Tách
được phân đoạn I, II bằng cột sắc ký sephadex G100.
3.2.3. Chiết xuất phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu
Lá cây Ô đầu (1,5 kg) chiết bằng ethanol 96 %. Chiết xuất phân lập
các chất bằng sắc ký cột thu được các chất: F1, F2, F3, F4, F5, F6,
F7.
3.2.4. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập đƣợc từ
cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang
9

Căn cứ vào phản ứng hóa học đặc trưng để dự kiến nhóm chất, căn
cứ vào phổ IR, MS,
13
C-NMR,
1
H-NMR, DEPT 135, DEPT 90,
HSQC, HMBC và so sánh với dữ liệu phổ đã công bố của chất tương
ứng để xác định cấu trúc của các chất phân lập được như sau:
Chất OD7:




Hình 3.18. Cấu trúc của chất OD7
OD7 hiện màu với thuốc thử Dragendorff nên dự kiến chất OD7
thuộc nhóm alcaloid. Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại

đặc trưng
cho các nhóm liên kết O-H, C-H, C-N, C-O-C. Phổ khối ESI-MS của
chất cho pic ion phân tử ở m/z 590 [M+H]
+
tương ứng với khối lượng
phân tử M= 589. Phổ
13
C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 cho thấy chất
OD7 xuất hiện 31 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho sự có mặt của
31 nguyên tử carbon trong đó có 1 nhóm methyl, 4 nhóm methoxy, 6
C trong vòng benzen thế, 4 nhóm methylen, 11nhóm methin bão hòa,
2 carbon bậc 4 và 3 carbon C-OH. Phổ
1

H-NMR xuất hiện tín hiệu
cộng hưởng đặc trưng cho chất 43 nguyên tử hidro, với các tín hiệu
đặc trưng như: 4.25 (m, 1H, H-1), 2.97 (s, 3H, - NCH
3
), 3.32 (s, 1H,
H-17), các tín hiệu (3.35s, 3.39 s, 3.43 s, 3.75 s, 3H) đặc trưng cho 5
nhóm methoxy, 7.49 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H),
7.63 (m, 1H) đặc trưng cho nhóm benzoyl. Kết hợp phổ cộng hưởng
từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC) và so sánh với dữ liệu đã công
bố của chất benzoylmesaconitin, chất OD7 được xác định là:
10

benzoylmesaconitin. Khi so sánh giữa chất OD7 và OP7 (trong Phụ
tử) thấy: cả hai chất cùng hiện màu với thuốc thử Dragendorff, giá trị
R
f
khi triển khai SKLM trong cùng hệ dung môi và phổ MS, phổ
13
C-
NMR của 2 chất này giống nhau, như vậy xác định chất OP7 phân
lập từ Phụ tử cũng là benzoylmesaconitin.
Chất OD5, OD8, OD9, OD10 sau khi so sánh với phổ của OD7, đặc
điểm phổ NMR, so sánh với dữ liệu phổ của các chất tương ứng:
hokbusin A, fuzilin, delcosin, karacolin, xác định như sau: chất OD5
là: hokbusin A, chất OD8 là fuzilin, chất OD9 là delcosin, chất
OD10 là karacolin, cấu trúc các chất như sau:

N
H
3
CH
2
C
OCH
3
OH
HO
OCH
3
OH
OH
OCH
3
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13
14
15
16
17
18
19

Cấu trúc OD5: Hokbusin A
Cấu trúc OD8: Fuzilin
N
H
3
CH
2
C
OCH
3
OCH
3
OH
OH
OH
HO
H
H
OCH
3

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
17
12
13
14
15
16
18
19

N
H
3
CH
2
C
HO
OH
H
H

OH
OCH
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

Cấu trúc OD9: Delcosin
Cấu trúc OD10: Karacolin
Chất OD4:Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho
nhóm O-H, C-H, C=O, C-O-C. Phổ ESI-MS của chất cho pic ion
phân tử ở m/z: 709 [M+H]
+
tương ứng với khối lượng phân tử M=

11

708. Phổ
13
C-NMR và DEPT 90, DEPT 135 cho thấy tín hiệu đặc
trưng của chất có 45 nguyên tử carbon với 2 nhóm CH
3
, 41 nhóm
CH
2
, 2 nhóm C=O. Phổ
1
H-NMR cho thấy sự có mặt của 88 proton
phù hợp với công thức phân tử C
45
H
88
O
5
, đồng thời phổ
1
H-NMR
cho các pic điển hình như: 1.52-1.99 (m, 2H) đặc trưng cho nhóm
CH
2
CO, 3.53 (m, 2H) đặc trưng cho nhóm CH
2
OH, 4.10 (dd, J=4.0
Hz, 7.0 Hz) đặc trưng cho nhóm CHOOC. Các dữ liệu trên, kết hợp
so sánh với dữ liệu phổ đã công bố, khẳng định chất OD4 là: 3-

hydroxypropan-1,2-diyl dihenicosanoat.

Hình 3.23.Cấu trúc OD4: 3-hydroxypropan-1,2-diyl dihenicosanoat
Chất OD3: Dữ liệu phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại

đặc trưng
cho nhóm O-H, C-H, C=O, C-Cl. Phổ ESI-MS của chất cho pic ion
phân tử ở m/z: 291 [M+H]
+
tương ứng với khối lượng phân tử M=
290. Phổ
1
H-NMR cho thấy sự có mặt của 31 proton phù hợp với
công thức phân tử C
16
H
31
ClO
2
đồng thời có sự xuất hiện các tín hiệu
đặc trưng cho các nhóm CHCl, CH
2
COOH. Căn cứ vào phổ
13
C-
NMR, DETP 90 và DEPT 135 cho thấy chất OD3 có 16 nguyên tử
carbon trong đó có 13 nhóm CH
2
, 1 nhóm CH
3

, 1 nhóm CH và 1
nhóm C=O. Các dữ liệu trên, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ đã
công bố, khẳng định chất OD3 là: acid 8-clorohexadecanoic.

Hình 3.24. Cấu trúc OD3: acid 8-clorohexadecanoic
Chất OD1, OD2: khi so sánh phổ IR, NMR của 2 chất này với chất
OD3, với dự liệu phổ đã công bố, khẳng định chất OD2 là acid 3-
cloroicosanoic, chất OD1 là: acid 9-clorooctadecanoic.
Cấu trúc các chất như sau:
12



Hình 3.25. Cấu trúc OD2: acid 3-cloroicosanoic

Hình 3.26. Cấu trúc OD1: acid 9-clorooctadecanoic
Chất OD6: phản ứng với thuốc thử H
2
SO
4
10%/EtOH cho màu hồng
tươi rồi chuyển xanh tím dần chứng tỏ OD6 thuộc nhóm sterol. Phổ
IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho nhóm O-H, C-H,
>C=C<, C-O-C. Phổ khối ESI-MS của chất cho pic ion phân tử ở
m/z: [M+Na]
+
=599 tương ứng với khối lượng phân tử M=576. Phổ
1
H-NMR có các tín hiệu đặc trưng cho hợp phần β-D-Glucozit như:
gồm 8 tín hiệu đặc trưng cho 8 nguyên tử hidro. Đối với hợp phần β-

Sitosterol: gồm 20 tín hiệu đặc trưng cho 20 nguyên tử hidro. Phổ
13
C-NMR của chất OD6 xuất hiện 35 tín hiệu carbon, với 29 tín hiệu
thuộc khung sterol và 6 tín hiệu của một đường glucose, các tín hiệu
đặc trưng như tín hiệu tại 140.1 và 121.8 ppm thuộc về liên kết đôi
tại vị trí C
5
và C
6
, tín hiệu tại 100.7 ppm là carbon anomeric của
đường. Từ các kết quả nêu trên đối chiếu với dữ liệu phổ đã công bố
chất OD6 được xác định là: sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (hay
còn gọi là daucosterol), cấu trúc như sau:






Hình 3.27. Cấu trúc của chất OD6
13

- Chất F7: khi so sánh phổ MS,
1
H-NMR, kết quả SKLM, định tính
bằng thuốc thử H
2
SO
4
10%/EtOH

của chất F7 với chất OD6 thấy
giống nhau. Như vậy xác định chất F7 phân lập từ lá cũng là
daucosterol.
Chấ t F1: so sánh với phổ IR, NMR của F1 với OD6 thấy có nhiều
điểm tương đồng. Căn cứ điểm khác nhau trên phổ NMR, phổ MS,
kết hợp so sánh dữ liệu phổ đã công bố, khẳng định chất F1 là:
Stigmast-4-ene-3,6-dion.

O
CH
3
CH
3
CH
3
O

CH
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13
14
15
16
17
20
22
23
24
25
29
28
27
18
19
21
26

Hình 3.28. Cấu trúc F1: Stigmast-4-ene-3,6-dion
Chất F2: Trên phổ ESI-MS của chất F2 thấy xuất hiện pic ion tại
m/z:547 [M+Na]
+
, tương ứng với khối lượng phân tử M = 524, phù
hợp với công thức phân tử C
33
H
65
NO

3
. Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp
thụ cực đại đặc trưng của nhóm -NH
2
, C-H bão hòa, C=O, C-N, C-
O-C. Trên phổ
1
H-NMR của F2 xuất hiện tín hiệu doublet với J = 7.5
Hz tại 5.69 là dạng tín hiệu đặc trưng của liên kết đôi dạng cis. Ngoài
ra, trên phổ
1
H-NMR của F2 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của
nhóm methyl liên kết với methin với J =7.0 Hz tại 1.09 ppm, hai
nhóm methyl liên kết với methylen với J = 14 Hz, hai tín hiệu của
nhóm methin tại 4.00-4.03 và 3.62 (d, J = 5 Hz) và tín hiệu của 27
nhóm methylen. Trên phổ
13
C-NMR, phổ DEPT 90 và DEPT 135
cho thấy chất F2 xuất hiện tín hiệu của nhóm carbonyl tại 173.1 ppm,
tín hiệu của cacbon bậc 4 olefin liên kết với N tại 162.1 ppm, hai tín
hiệu của nhóm methin liên kết với oxy tại 76.7 ppm và 74.4 ppm, tín
14

hiệu của 3 nhóm methyl và tín hiệu của 27 nhóm methylen. Kết hợp
phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC) và so sánh
dữ liệu phổ đã công bố của chất octacosanoic acid và chất pentanol,
khẳng định chất F2 là (Z)-3-hydroxypentan-2-yl-10-am
inooctacos-9-enoat. Cấu trúc như sau:

Hình 3.29. Cấu trúc của chất F2

-Các chấ t F3, F4, F5, F6: phân tích dữ liệu phổ cho thấy chúng có
cấu trúc của chất thuộc nhóm flavonoid và có nhiều điểm tương
đồng. Chất F5: Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho
nhóm O-H, C-H, C=O, C-O-C. Phổ ESI-MS của chất cho pic ion
phân tử ở m/z: 507.3 [M+H]
+
tương ứng với khối lượng phân tử M=
506. Phổ
13
C-NMR và DEPT 90, DEPT 135 của F5 có 24 tín hiệu
carbon, trong đó một tín hiệu của nhóm carbonyl ở 177.4 ppm, 4 tín
hiệu của nhóm CH thơm, 4 tín hiệu cộng hưởng của carbon bậc 4
nhân thơm có gắn kết với nhóm chứa oxy tại 162.2, 148.9, 145.1,
147.5 ppm, ba tín hiệu cộng hưởng của nhóm methoxy tại 55.9, 55.8,
53.7 ppm, 6 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của glucosid trong
khoảng 60.2 đến 111.7 ppm trong đó có 2 C cộng hưởng ở 60.3 và
60.2 ppm điều này khẳng định glucosid là fructose. Phổ
1
H-NMR
của F5 xuất hiện các tín hiệu vùng thơm đặc trưng của nhân
quercetin. Ba tín hiệu của proton thơm tại vùng trường thấp 8.25
(1H, s), 8.13 (1H, d, J =7.0 Hz) và 8.12 (1H, d, J = 7.0 Hz) ứng với
các vị trí H-2”, H-5” và H-6” của nhân thơm B. Hai tín hiệu proton
thơm ở vùng trường cao hơn là 6.79 ppm và 6.19 ppm được gán cho
proton ở các vị trí H-6 và H-8 của nhân thơm A. Kết hợp phổ cộng
15

hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC) và so sánh với phổ của
chất 3,7,4
’

-trimethoxyquercetin, 7,3
’
,4
’
trimethoxyquercitin, khẳng
định F5 là glucosid của quercetin, có tên là: 5,7,3
'
-
trimethoxyquercetin-3-O-β-D-fructofuranosid. Căn cứ vào điểm đặc
trưng của dữ liệu phổ, so sánh dữ liệu phổ của các chất F3, F4, F5,
F6 với nhau và với các chất có cấu trúc tương ứng, khẳng định chất
F3 là: quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid, chấ t F4 là quercetin 3-O-
β-D-galactopyranosid, chất F6 là 7,4’-O-dimethylluteolin 5-O-[α-L-
arabinofuranosyl-(16)-β-D-glucopyranosid]. Cấu trúc các chất:







Hình 3.30. Cấu trúc chất F3
Hình 3.31. Cấu trúc chất F4

Hình 3.32. Cấu trúc chất F5
Hình 3.33. Cấu trúc chất F6
3.3. Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp và tác dụng sinh học
3.3.1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp
+ Thử độc tính cấp, tiến hành thử trên chuột nhắt trắng, theo đường
uống đối với các phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid, flavonoid,
polysaccharid cho kết quả như sau:
16

- Xác định được LD
50
của 2 phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid E và
D lần lượt là: 991.36 ± 176.78 (mg/kg) và 27.257 ± 7.071 (mg/kg).
- Xác định ở liều uống 12g bột PĐ dịch chiết flavonoid từ lá (PĐ
C)/kg thể trọng chuột và ở liều uống 15g bột PĐ dịch chiết
polysaccharid (PĐ I)/kg thể trọng chuột, không có chuột nào chết.
3.3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học
3.3.2.1. Tác dụng giảm đau của phân đoạn E
+ Tác dụng giảm đau của PĐ E chứa alcaloid được đánh giá trên 3
mô hình: mâm nóng, máy tail-flick, gây quặn đau bằng acid acetic
đối với chuột nhắt trắng dùng thuốc thử 3 ngày liên tục cho kết quả
như sau:
* Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của phân đoạn E bằng
mô hình mâm nóng
- Codein có tác dụng kéo dài rõ rệt thời gian phản ứng với nhiệt độ
của chuột (p
2-1
< 0.001 và p so với trước khi uống codein < 0.01).
- PĐ E cả 3 liều 12.5mg/kg/ngày, 25mg/kg/ngày và 50mg/kg/ngày,

uống trong 3 ngày liên tục, có tác dụng kéo dài rõ rệt thời gian phản
ứng với nhiệt độ của chuột so với trước khi uống thuốc (p<0.01) và
so với lô chứng (p<0.05).
- Thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột ở 3 lô uống PĐ E không
có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh 3 lô với nhau
(p>0.05).
- Thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột ở lô uống codein kéo dài
hơn so với chuột ở 3 lô uống PĐ E có ý nghĩa thống kê (p<0.05).
* Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của PĐ E bằng máy tail-
flick
17

- Codein phosphat có tác dụng làm tăng rõ rệt khoảng cách gây phản
xạ đau trên máy tail-flick của chuột (p
2-1
<0.001 và p so với trước khi
uống codein phosphat p<0.01).
- PĐ E ở cả 3 liều 12.5 mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày, 50 mg/kg/ngày,
uống trong 3 ngày liên tục, có tác dụng làm tăng rõ rệt khoảng cách
gây phản xạ đau trên máy tail-flick của chuột so với trước khi uống
thuốc (p<0.01) và so với lô chứng (p<0.05 và p<0.01). Khoảng cách
gây phản xạ đau trên máy tail-flick của chuột ở 3 lô uống PĐ E khác
biệt không có ý nghĩa thống kê khi so sánh 3 lô với nhau (p>0.05).
- Khoảng cách gây phản xạ đau trên máy tail-flick của chuột ở lô
uống codein tăng có ý nghĩa thống kê so với chuột ở 3 lô uống PĐ E
(p<0.05).
* Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của PĐ E bằng phương
pháp gây đau bởi acid acetic
- Aspirin liều 150 mg/kg có tác dụng làm giảm số cơn quặn đau ở tất
cả các thời điểm nghiên cứu (p<0.01 hoặc p<0.001).

- PĐ E cả 3 liều 12.5 mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày,
uống trong 3 ngày liên tục, có tác dụng làm giảm rõ rệt số cơn quặn
đau ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với lô chứng (p<0.05 và
p<0.01).
- Số cơn quặn đau ở các thời điểm nghiên cứu ở 3 lô chuột uống PĐ
E, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh 3 lô với
nhau (p>0.05). Số cơn quặn đau ở các thời điểm nghiên cứu của
chuột ở lô uống aspirin giảm có ý nghĩa thống kê so với chuột 3 lô
uống PĐ E chiết từ Phụ tử (p<0.05 và p<0.01).
18

Như vậy phân đoạn alcaloid chiết từ Phụ tử (PĐ E) được thử tác
dụng giảm đau bằng 3 mô hình mâm nóng, máy tail-flick và gây
quặn đau bằng acid acetic, liều dùng 12.5 mg/kg/ngày, 25
mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày, uống trong 3 ngày liên tục có tác
dụng giảm đau rõ rệt.
3.3.2.2. Tác dụng tăng cƣờng miễn dịch của phân đoạn chứa
polysaccharid chiết từ Phụ tử (PĐ I)
PĐ I được tiến hành thử tác dụng tăng cường miễn dịch trên mô hình
gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid trên chuột nhắt trắng
trong 7 ngày liên tục và cho kết quả như sau:
* Kết quả đánh giá tình trạng chung của hệ miễn dịch
Trọng lượng tuyến ức tương đối
Trọng lượng tuyến ức tương đối ở lô mô hình (lô 2: 2.39± 0.22
mg/g) giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (lô 1: 4.17 ± 0.22 mg/g)
với p ≤ 0.001. Trọng lượng tuyến ức ở các lô uống levamisol (1.89 ±
0.30 mg/g) và PĐ I cả hai liều 100 và 300mg/kg thể trọng chuột
(1.75 ± 0.28, 1.80 ± 0.14 mg/g) không có khác biệt có ý nghĩa thống
kê so với lô mô hình.
Số lượng bạch cầu:

Kết quả khi so sánh giữa các lô chuôt thí nghiệm cho thấy: CY làm
giảm rõ rệt số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi của chuột.
Levamisol 100 mg/kg có tác dụng làm tăng bạch cầu máu ngoại vi so
với lô mô hình. PĐ I cả 2 liều không có tác dụng làm tăng bạch cầu
máu ngoại vi so với lô mô hình.
* Kết quả đánh giá miễn dịch dịch thể
19

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ IgG máu
ngoại vi cho thấy: CY làm giảm rõ rệt nồng độ IgG máu ngoại vi
(77.20 ± 1.14 pg/ml) so với lô chứng sinh học (84.98 ± 0.55 pg/ml)
(p < 0.001). Levamisol làm tăng nồng độ IgG máu ngoại vi so với lô
mô hình. PĐ I cả 2 liều 100 và 300 mg/kg thể trọng chuột có tác
dụng làm tăng nồng độ IgG máu ngoại vi (81.92 ± 0.34, 82.44 ±0.49
pg/ml) so với lô mô hình (p < 0.05).
* Kết quả đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào
+ Phản ứng bì với kháng nguyên OA:
Kết quả thử ảnh hưởng của PĐ I đến phản ứng bì với kháng nguyên
OA cho thấy không có sự khác biệt giữa các lô thử so với lô mô hình
và so với lô chứng sinh học.
+ Định lượng các cytokin trong máu ngoại vi:
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc thử đến nồng độ IL-2 cho
thấy: Lô mô hình CY làm giảm rõ rệt nồng độ IL-2 trong máu ngoại
vi (2.97 ± 0.46 pg/ml) so với lô chứng sinh học (7.73 ± 0.23 pg/ml).
Levamisol 100 mg/kg có tác dụng làm tăng nồng độ IL–2 (7.21 ±
1.51

pg/ml) so với lô mô hình. PĐ I liều 100 và 300 mg/kg thể trọng
chuột có tác dụng làm tăng nồng độ IL -2 (5.74 ± 0.97, 7.52 ± 1.24

pg/ml) so với lô mô hình (p < 0.05) và tương đương chứng dương ở
liều 300 mg/kg thể trọng chuột.
- Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc thử đến nồng độ TNF-α
cho thấy: CY gây gia tăng rõ rệt nồng độ TNF-α (16.55 ± 2.75
pg/ml) trong máu ngoại vi so với lô chứng sinh học. Levamisol 100
mg/kg có tác dụng làm giảm có ý nghĩa thống kê nồng độ TNF-α
(8.33 ± 1.40 pg/ml) so với lô mô hình (p < 0.05). PĐ I cả 2 liều
20

không làm thay đổi có ý nghĩa thống kê nồng độ TNF-α so với lô
chứng sinh học (p > 0.05).
+ Giải phẫu vi thể tuyến ức:
Kết quả giải phẫu vi thể tuyến ức cho thấy chuột ở lô chứng sinh
hinh học bình thường, lô mô hình giảm số lượng lympho bào, lô
chứng dương làm tăng lympho bào, lô chuột dùng liều PĐ I 100, 300
mg/kg thể trọng chuột làm giảm nhẹ lympho bào.
3.3.2.3. Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của PĐ C chứa
flavonoid
*Tác dụng bảo vệ gan của phân đoạn C
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của PĐ C trên hoạt độ enzym ALT,
AST và hàm lượng bilirubin huyết thanh chuột cho thấy PĐ C có tác
dụng làm giảm hoạt độ enzym AST và ALT phụ thuộc vào liều
lượng. Ở liều 10 mg/kg thể trọng làm giảm hoạt độ enzym ALT 15.8
% và, AST 4.71 % so với lô chứng bệnh lý với p > 0.05. Khi tăng
liều lên 20 mg/kg và 30 mg/kg thể trọng chuột thì sự giảm hoạt độ
enzym ALT tăng lên rõ rệt là 21.16 % và 39.23 % so với lô chứng
bệnh lý với P < 0.05. Tác dụng của PĐ C liều 30mg/kg trên hoạt độ
enzym ALT, AST gần tương đương với silymarin liều 100 mg/kg thể
trọng chuột và ức chế sự tăng hàm lượng bilirubin so với lô chứng
bệnh lý.

*Tác dụng chống oxy hoá của phân đoạn C:
Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của PĐ C thông qua khả năng làm
giảm hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan chuột thí nghiệm cho
thấy: PĐ C có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA trong quá trình
peroxy hoá do CCl
4
gây ra trên chuột nhắt trắng. Tác dụng giảm hàm
21

lượng MDA phụ thuộc liều lượng. Với liều 10 mg và 20 mg/kg thể
trọng chuột trong 8 ngày không có tác dụng làm giảm sự tăng hàm
lượng MDA (p > 0.05), nhưng với liều 30 mg/kg thể trọng chuột có
tác dụng làm giảm sự tăng hàm lượng MDA trong gan rõ rệt (15.96
% ) so với lô chứng bệnh lý với p < 0.05. Tác dụng của liều 30
mg/kg tương đương với thuốc đối chứng silymarin liều 100 mg/kg
thể trọng (15.96 % so với 17.7 %).

BÀN LUẬN
Trước kia, một số công bố cho thấy các tác giả mới nghiên
cứu về cây Ô đầu ở Sa Pa, tỉnh Lào Cai, cây Ô đầu Hà Giang chưa
thấy có nghiên cứu nào được công bố. Mặt khác, trong các điều kiện
sinh thái khác nhau, một loài thực vật vẫn có sự thay đổi về hàm
lượng, thành phần hóa học, tác dụng sinh học. Đề tài đã xác định tên
khoa học của cây Ô đầu trồng ở Hà Giang bằng phương pháp phân
tích đặc điểm hình thái và giám định ADN giúp xác định rõ nguồn
gốc của cây. Nghiên cứu hóa học đã cung cấp thêm những dữ liệu
hóa học quan trọng (hàm lượng nhóm chất chính, chất mới…) tạo
điều kiện thuận lợi cho công tác kiểm nghiệm dược liệu và các sản
phẩm liên quan đến Ô đầu, Phụ tử. Nghiên cứu độc tính cấp và tác
dụng sinh học gợi mở hướng sử dụng cây Ô đầu trong phòng chữa

bệnh. Đề tài đã nghiên cứu sâu về cây Ô đầu theo hướng tạo tiền đề
phát triển dược phẩm, tạo điều kiện phát triển vùng trồng cây Ô đầu
một cách bền vững, từ đó góp phần xóa đói giảm nghèo cho nhân
dân địa phương.

22

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
* Về thực vật:
Đã mô tả đặc điểm hình thái và trình tự gen ADN, so sánh với loài
thuộc chi Aconitum để xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở
tỉnh Hà Giang là: Aconitum carmichaeli. Debx, họ Ranunculaceae.
* Về thành phần hóa học:
- Đã xác định trong các bộ phận: củ, thân, lá, hoa, quả của cây đều có
alcaloid, flavonoid, polysaccharid. Ngoài ra còn có caroten, acid béo,
đường tự do.
- Đã xác định được hàm lượng:
+ Alcaloid toàn phần trong Phụ tử sống, Ô đầu sống, phân đoạn dịch
chiết D, E lần lượt là: 0.93 %, 0.70 %, 28.61 %, 26.83 % tính theo
aconitin.
+ Aconitin trong Phụ tử sống, Ô đầu sống và 2 phân đoạn dịch chiết
chứa alcaloid D, E lần lượt là: 0.072 %, 0.125 %, 0.066 %, 0.015 %.
+ Flavonoid toàn phần trong lá, phân đoạn dịch chiết C, E lần lượt là:
1.60 %, 38.24 %, 30.42 % tính theo quercetin.
+ Polysaccharid toàn phần trong Phụ tử, Ô đầu, phân đoạn I, II chiết
từ Phụ tử lần lượt là: 19.63 %, 14.52 %, 87.6 %, 72.8 % tính theo D-
glucose.
+ 12 kim loại nặng trong Ô đầu, Phụ tử sống là: Pb, Cr, Mn, Fe, Co,
Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Ag, As nằm trong giới hạn cho phép quy định

đối với thuốc, thực phẩm.
- Đã phân lập được 16 chất gồm: 5 alcaloid, 4 flavonoid, 2 sitosterol
và 5 chất nhóm acid béo, este. Trong đó:
23

+ Từ Phụ tử sống và Ô đầu sống phân lập được 10 chất, gồm 4 chất
lần đầu tiên phân lập từ chi Aconitum là: acid 9-chlorooctadecanoic,
acid 3-chloroicosanoic, acid 8-chlorohexadecanoic, 3-
hydroxypropane-1,2-diyl dihenicosanoat, chất lần đầu phân lập từ
loài A. carmichaeli là: delcosin và 5 chất khác là fuzilin, karacolin,
benzoylmesaconitin, hokbusin A, daucosterol.
+ Từ lá phân lập được 7 chất, gồm 2 chất mới là: 5,7,3
'
-
trimethoxyquercetin 3-O-β-D-fructofuranosid và (Z)-3-
hydroxypentan-2-yl-10-aminooctacos-9-enoat, 3 chất lần đầu tiên
phân lập từ chi Aconitum là 7,4′-O-dimethylluteolin 5-O-[α-L-
arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid], quercetin 3-O-

-L-
rhamnopyranosid, quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid và 2 chất
khác là: stigmast-4-ene-3,6-dion, daucosterol.
* Về thử độc tính cấp và tác dụng sinh học:
+ Thử độc tính cấp:
- Đã xác định được LD
50
của 2 PĐ dịch chiết chứa alcaloid E và D
lần lượt là: 991.36 ± 176.78 (mg/kg) và 27.257 ± 7.071 (mg/kg).
Phân đoạn D độc tính cao nên không sử dụng nghiên cứu tiếp và
không ứng dụng trên thực tế được.

- Đã xác định ở liều uống 12 g bột PĐ dịch chiết chứa flavonoid từ lá
(PĐ C)/kg thể trọng chuột và ở liều uống 15 g bột PĐ dịch chiết chứa
polysaccharid (PĐ I)/kg thể trọng chuột mà không có chuột nào chết.
+ Thử tác dụng sinh học:
- Phân đoạn chứa alcaloid (PĐ E) chiết xuất từ Phụ tử với liều 12.5
mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày uống trong 3 ngày
liên tục, thấy có tác dụng giảm đau rõ rệt thông qua kéo dài thời gian
24

phản ứng với nhiệt độ, làm tăng khoảng cách gây phản xạ đau và làm
giảm số cơn quặn đau ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với lô
chứng. Mức liều 25 mg/kg/ngày của PĐ E phù hợp để có thể nghiên
cứu ứng dụng.
- Phân đoạn chứa flavonoid (PĐ C) chiết từ lá với liều 30 mg/kg thể
trọng chuột thấy có tác dụng chống viêm gan cấp và chống oxy hóa
thông qua làm giảm hoạt độ enzym (39.23 %) và làm giảm hàm
lượng MDA trong gan (15.96 %) so với lô chứng.
- Phân đoạn chứa polysaccharid (PĐ I) chiết xuất từ Phụ tử với liều
100 mg/kg và 300 mg/kg thể trọng chuột, thấy có tác dụng kích thích
miễn dịch, thông qua mẫu thử làm tăng phục hồi số lượng bạch cầu,
tăng nồng độ cytokine IL-2, nồng độ globulin miễn dịch và hạn chế
một phần tổn thương trên giải phẫu vi thể tổ chức lympho trung
ương.
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu theo hướng tạo dược phẩm với tác dụng
tăng cường miễn dịch; giảm đau; chống oxy hóa, bảo vệ gan từ cây
Ô đầu.