Ứng dụng công nghệ sinh học lục lạp trong cải tiến giống cây trồng

BÀI TIỂU LUẬN
Ứng dụng công nghệ sinh học lục lạp
trong cải tiến di truyền cây trồng
Học viên: Lê Thị Mận
Lớp: K15 Cao học Sinh thái

Hà nội, 2012
Phần 1
MỞ ĐẦU
Tương lai, nhân loại phải đối mặt với những thách thức lớn do sự gia tăng
trong dân số toàn cầu, thay đổi khí hậu, kéo theo đó là nhu cầu ngày một tăng
của lương thực - thực phẩm, đồ tiêu dùng, thuốc chữa bệnh, trong khi nguồn
lực sản xuất như đất đai, nguồn nước, là có hạn, thậm chí đang dần bị suy kiệt
do hoạt động khai thác không có hoạch định của con người. Một trong những
giải pháp được đặt ra để giải quyết tình trạng trên là phải cải tiến di truyền cây
trồng theo hướng nâng cao năng suất, chất lượng, tăng tính chống chịu nhằm
đáp ứng nhu cầu con người và bảo vệ môi trường sống.
Trong khi đó, Công nghệ sinh học được biết đến là lĩnh vực nghiên cứu,
sử dụng các quá trình sinh học và ứng dụng kiến thức khoa học về công nghệ và
thương mại để giải quyết các vấn đề và tạo ra các sản phẩm hữu ích. Công nghệ
sinh học thực vật bao gồm các phương pháp công nghệ tế bào và công nghệ gen
để tạo ra các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu với
các yếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học; để tạo ra các chất có hoạt tính sinh
học phục vụ trong công nghiệp, nông nghiệp và y dược. Một trong những hướng
quan trọng và nhiều ưu việt của công nghệ sinh học thực vật là công nghệ sinh
học lục lạp.
Công nghệ sinh học lục lạp bao gồm các phương pháp trong công nghệ tế
bào và công nghệ gen thực vật được sử dụng để biến đổi hệ gen lục lạp. Việc
biến đổi DNA lục lạp có thể được tiến hành bằng việc chuyển nạp gen lục lạp
ngoại lai vào hệ gen lục lạp cây chủ tạo ra các tổ hợp gen lục lạp mới hoặc
chuyển các gen/DNA có nguồn gốc khác nhau (DNA/gen từ vi khuẩn, động vật,

DNA tái tổ hợp) vào hệ gen lục lạp nhằm tạo các giống cây trồng với các tính
trạng nông sinh học ưu việt và tạo ra vacxin hoặc các protein chức năng đặc biệt,
trong đó có các protein chữa bệnh.
Trong chuyên đề này, chúng tôi chỉ xem xét và làm nổi bật các nghiên
cứu của công nghệ sinh học lục lạp để cải thiện các đặc tính di truyền của cây
trồng (kháng thuốc diệt cỏ, tăng khả năng chịu hạn, chịu muối, chịu lạnh, ),
trong đó chủ yếu tập trung vào cải tiến cây trồng bằng kỹ thuật gen lục lạp - đây
là hướng nghiên cứu và ứng dụng chính của công nghệ sinh học lục lạp.
2
Phần 2
NỘI DUNG
2.1. Những ưu việt và ý nghĩa của kỹ thuật gen lục lạp:
Chuyển gen ở lục lạp có nhiều ưu việt , và những ưu việt này đã dẫn đến
việc tăng trưởng nghiên cứu kỹ thuật gen lục lạp nhằm tạo ra các sản phẩm công
nghệ sinh học thực vật có giá trị và thân thiện với môi trường. Góp phần phát
triển công nghệ sinh học an toàn và bền vững.
Trước hết phải nói đến đặc điểm di truyền theo đường mẹ (trong hạt phấn
không có lục lạp) ở hầu hết các loài cây, trừ rất ít loài như: thông, cỏ linh lăng,
lúa, đậu Hà lan. Nhờ đặc điểm này mà từ năm 1998 người ta đã khuyến cáo về
việc ngăn chặn sự lan truyền các gen chuyển nạp bằng phương pháp chuyển gen
vào lục lạp.
Bảng 2.1. Di truyền lục lạp ở một số loài cây
Loài Di truyền lục lạp Ghi chú
Helianthus annuus M
Impatiens capenicis M
Arabidopsis thaliana M Hoặc BM
Arabis albida M
Brassica campestris M
Beta vulgaris M
Chenopodium album M

Glycine max M
Avena sativa M
Hordium vulgare M
Oryza sativa M
Sorgum vulgare M
Triticum aestivum M Hoặc BM
Zea may M
Capsicum annuum M
Lycopersicon esculentum M
Nicotiana tabacun M Hoặc BM
Petunia hybrida M
Solanum tuberosum M Hoặc BM
Hypericum perforathum BM
Rhododendron indicum BM
Medicago sativa BM
Phaseolus vulgaris BM
3
Pisum sativum M
Ipomoea nil M
M. di truyền theo mẹ; BM. Di truyền theo bố, mẹ
Ưu việt thứ hai là có nhiều gen có tính nguy cơ cao đối với môi trường
như kháng chất diệt cỏ và kháng côn trùng hoạt động trong lục lạp. Điều này cho
phép chuyển các gen kháng chất diệt cỏ và kháng côn trùng vào lục lạp để tạo
các giống cây kháng các tác nhân mà không gây ảnh hưởng đến môi trường và
sức khỏe. Ngoài ra việc thể hiện các gen này ở lục lạp còn làm tăng hiệu quả
diệt côn trùng mà không ảnh hưởng tới hạt, quả và củ.
Cho đến nay, các nghiên cứu chuyển gen lục lạp thường sử dụng gen chỉ
thị kháng spectinomycin và streptomycin aadA được thiết kế cho thể hiện đặc
hiệu ở lục lạp. Chỉ thị này cho phép chọn lọc cây chuyển gen lục lạp đồng nhất
nhanh. Chuyển gen ngoại lai vào lục lạp thường theo hai bước: bước đầu tiên là

gen aadA xâm nhập vào phân tử DNA của các lục lạp trong tế bào; bước tiếp
theo là hệ gen lục lạp biến đổi mang gen aadA được chọn lọc trên môi trường
chứa spectinomycin và streptomycin cho đến khi loại bỏ hết lục lạp không được
chuyển gen. Gen aadA có thể loại bỏ khỏi cây chuyển gen bằng tăng số lượng
các đoạn lặp lại ngắn từ hai lên ba đoạn để tạo ra gen aadA không ổn định (véc
tơ tạm thời). Bằng cấu trúc này, trong quá trình chọn lọc gen aadA sẽ bị loại
khỏi cây chuyển gen. Phương pháp này cho phép chuyển các gen mã hóa các
protein có giá trị làm thuốc và gen kháng côn trùng vào lục lạp tạo ra cây
chuyển gen không mang gen kháng kháng sinh. Mặc dầu phương pháp này được
phát triển trên cây thuốc lá, nó có thể ứng dụng cho các loài cây khác như
Arabidopsis và cải dầu.
Một ưu việt khác nữa của chuyển gen ở lục lạp là các gen ngoại lai có
mức thể hiện cao do lục lạp có số bản gen lớn tới hàng trăm ngàn trong khi ở
nhân chỉ có một bản. Ngoài ra không có hiện tượng gen câm và các hiện tượng
không ổn định khác như trường hợp gen nhân [2].
Các sản phẩm của gen được giữ lại trong lục lạp, đặc điểm này rất có lợi
trong những trường hợp sản phẩm của gen có thể là có hại nếu nó được tổng hợp
trong tế bào chất (ví dụ đối với trehalose (Lee và cs., 2003) và xylanase
(Leelavathi cs., 2003). Tính ưu việt này đặc biệt có ý nghĩa cho phép chuyển các
gen tạo vacxin và các protein có giá trị làm thuốc, ngoài ra có thể tạo ra cây
chuyển gen có thành phần dinh dưỡng cao.
4
Ngoài ra, bộ máy tổng hợp protein ở lục lạp giống ở các cơ thể tiền nhân nên
có thể chuyển các gen của vi khuẩn được đồng thời nhiều gen của một quá trình
sinh tổng hợp vào lục lạp, trong khi nếu chuyển vào nhân thì phải chuyển từng gen
một kết họp với lai hồi giao để có thể tái cấu trúc chu trình sinh tổng hợp.
Như vậy, sự kết hợp giữa tính di truyền theo đường mẹ, định hướng chính
xác gen chuyển nạp, có thể loại bỏ được gen kháng kháng sinh, mức độ thể hiện
gen cao, có thể chuyển các gen có nguồn gốc tiền nhân và khả năng chuyển
đồng thời nhiều gen đã làm cho lục lạp trở thành đối tượng chuyển gen an toàn

và hiệu quả.
Từ những thông tin vừa trình bày, ta thấy kĩ thuật gen lục lạp sẽ thực sự
trở thành một trong những công cụ vô cùng quan trọng của công nghệ thực vật
trong tương lai.
Bảng 2.2. Một số ưu việt của chuyển gen ở lục lạp
Ưu việt của chuyển gen
lục lạp
Ứng dụng Ghi chú
Phần lớn gen lục lạp di
truyền theo đừng mẹ
Ngăn ngừa sự lan truyền
của gen biến nạp sang
các loài cây khác
Các loài cỏ linh lăng, lúa,
đậu Hà lan di truyền theo
cả bố và mẹ
Nhiều gen có tính nguy cơ
cao đối với môi trường
như kháng chất diệt cỏ và
kháng côn trùng hoạt
động trong lục lạp
Tạo các cây chuyển gen
kháng chất diệt cỏ và
kháng côn trùng
Không ảnh hưởng đến môi
trường. Gen thể hiện ở lục
lạp không ảnh hưởng tới
hạt và củ
Tái tổ hợp tương đồng
Đưa gen chuyển vào vị

trí chính xác
Tránh được hiện tượng gắn
các đoạn DNA không cần
thiết vào hệ gen tạo ra sản
phẩm không mong muốn
Sử dụng gen chỉ thị aadA
thể hiện đặc hiệu ở lục lạp
Tạo ra các cây chuyển
gen lục lạp đồng nhất
Có thể loại bỏ khỏi cây
chuyển gen
Gen chuyển nạp được
biểu hiện cao do có số
lượng bản gen nhiều
Tạo vác xin và protein;
tạo cây trồng có thành
phần dinh dưỡng cao
Lục lạp có tới 100.000 bản
gen, nhân chỉ có 1 bản gen
Bộ máy tổng hợp protein
giống ở các cơ thể tiền nhân
Chuyển các gen của cơ
thể tiền nhân vào lục lạp
Chú ý hiện tượng chuyển
gen ngang
Có thể chuyển được nhiều
gen
Chuyển các gen liên
quan đến toàn bộ chu
trình sinh tổng hợp

Chuyển vào nhân: phải
chuyển từng gen một kết hợp
với lai hồi giao để tái cấu trúc
chu trình sinh tổng hợp
5
2.2. Trở ngại của kĩ thuật gen lục lạp:
Bên cạnh những ưu việt của chuyển gen vào lục lạp cũng cần phải lưu ý
một số nhược điểm và nguy cơ như: i. không phải ở tất cả các loài cây lục lạp
đều di truyền theo đường mẹ, một số loài như thông, lúa, cỏ linh lăng, di
truyền theo cả bố và mẹ; ngoài ra, còn có hiện tượng gen “nhảy” từ lục lạp
vào nhân; ii. Việc thể hiện cao gen chuyển nạp đặc biệt là các gen mã hóa
protein có thể làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây; iii. Sự
giống nhau giữa hệ gen lục lạp và vi khuẩn có thể làm gia tăng tần số chuyển
gen ngang sang vi khuẩn.
Việc chuyển gen vào lục lạp phức tạp hơn chuyển gen vào nhân tế bào vì
có đến 100.000 bộ gen của lục lạp trong tế bào. Các dòng chuyển gen qua lục
lạp thường bền vững về di truyền chỉ khi tất cả các bản sao của lục lạp đều biến
đổi theo cùng một cách giống nhau. Điều này đạt được thông qua sự tái sinh
được lặp lại ở cùng điều kiện chọn lọc sau một khoảng thời gian nhất định.
Thách thức tiếp là khi đưa ADN ngoại lai vào vùng mô lá, mà vùng mô
này còn có chứa các thành phần khác: sắc lạp, bột lạp, tiền lục lạp, Hơn nữa,
hệ thống điều hòa biểu hiện gen là khá khác nhau ở các lục lạp trưởng thành.
Xác định trình tự đóng vai trò biểu hiện trong các loại lạp thể là cần thiết để đạt
được sự biểu hiện đúng của gen ngoại lai.
Việc chuyển gen và tái sinh cây của những cây được chuyển gen vào lục
lạp phức tạp về mặt công nghệ. Hiệu suất chuyển gen thấp. Mức độ biểu hiện
cao bị giới hạn ở mô lá.
2.3. Biến đổi di truyền lục lạp:
Hệ gen lục lạp chứa nhiều gen mã hóa cho các tính trạng nông sinh học
quan trọng của cây trồng như chịu bệnh, kháng chất diệt cỏ, chịu các điều kiện

bất lợi của môi trường. Ngoài ra, các gen có nguồn gốc khác nhau có thể chuyển
nạp vào hệ gen lục lạp và có mức độ thể hiện rất cao. Chính vì vậy, việc cải biến
di truyền lục lạp là một hướng rất quan trọng được các nhà khoa học quan tâm.
một số phương pháp có thể sử dụng để cải biến di truyền hệ gen lục lạp như: đột
biến lục lạp, chuyển nạp lục lạp nguyên vẹn và chuyển gen lục lạp.
* Đột biến lục lạp
Việc tạo và chọn lọc những đột biến lục lạp có ý nghĩa rất lớn trong
nghiên cứu biến đổi di truyền lục lạp. Hơn thế nữa nhiều đặc điểm di truyền có
lợi được mã hoá bởi các gen nằm trong lục lạp, do đó tìm hiểu và nghiên cứu
6
những đột biến lục lạp sẽ giúp cho chúng ta sử dụng chúng có hiệu quả trong
nghiên cứu cơ bản cũng như trong chọn giống cây trồng.
* Chuyển lục lạp
Một hướng rất quan trọng trong nghiên cứu biến đổi di truyền lục lạp là
chuyển lục lạp bao gồm chuyển lục lạp nguyên vẹn và chuyển gen lục lạp.
Chuyển lục lạp nguyên vẹn giúp cho việc nghiên cứu tính tương hợp giữa nhân
và lục lạp tạo ra tổ hợp nhân và lục lạp mới, còn chuyển gen lục lạp sẽ tạo ra các
tổ hợp gen lục lạp mới.
Chuyển lục lạp nguyên vẹn bằng sử dụng lục lạp tách rời: Trong thời kỳ
đầu các nhà khoa học đã cố gắng chuyển lục lạp tách rời vào tế bào trần để tạo
các thể lai tế bào chất nhằm cải biến di truyền lục lạp. Potrykus (1973) là người
đầu tiên công bố chuyển được lục lạp vào tế bào trần của cây Dạ yên (Petunia
hybryda) nhưng không có những số liệu chứng minh chắc chắn sự tồn tại của lục
lạp trong tế bào. Tiếp sau đó, Bonnet và Erikson (1974), Kung (1975) cũng đã
công bố kết quả chuyển lục lạp nguyên vẹn vào tế bào trần nhưng cũng ở tình
trạng tương tự
Từ những công trình trên, cho đến nay không có những công bố tiếp theo
về lĩnh vực này. Sở dĩ như vậy là do những hạn chế về việc tách nhận các bào
quan nguyên vẹn và giữ nguyên hoạt động của chúng. Đây là những vấn đề hết
sức khó khăn vì quá trình tách và làm sạch các bào quan đã làm giảm sức sống

cảu chúng. Ngoài ra, chúng còn dễ bị ảnh hưởng bởi các tác nhân trong quá trình
dung hợp dẫn đến hiệu xuất chuyển nạp còn rất thấp.
Chuyển lục lạp nguyên vẹn bằng dung hợp tế bào trần: Từ cuối những
năm 70, một số lượng lớn những cây lai tế bào chất trong cùng một loài có
những tổ hợp lục lạp và nhân mới đã được tạo ra từ những giống khác nhau
trong một loài. Điều này đã làm nảy sinh một vấn đề về giới hạn về khoảng cách
trong hệ thống phân loại đối với việc chuyển lục lạp. Và việc chuyển lục lạp
giữa các loài cây đã được tiến hành với mục đích tìm hiểu giới hạn tương thích
giữa nhân của tế bào cây chủ và lục lạp ngoại lai. Glimelius và Bonnett, (1986)
lần đầu tiên nhận được cây lai tế bào chất giữa Nicotiana với lục lạp của
Petunia. Sau đó, việc chuyển lục lạp đã được tiếp tục ở một vài tổ hợp trong cây
họ cà như giữa thuốc lá (Nicotiana) và salpiglossis, giữa thuốc lá và Solanum
v.v. (Thành và cs, 1988) [5]. Chuyển lục lạp có thể thực hiện bằng dung hợp tế
bào trần và sử dụng những đột biến lục lạp như kháng kháng sinh hoặc thể thiếu
hụt chlorophyll. Các tế bào dùng để cho lục lạp trong các thí nghiệm chuyển lục
7
lạp thường mang các lục lạp nguyên vẹn hoặc đột biến và thường được giết nhân
bằng chiếm xạ hoặc hóa chất trước khi dung hợp với tế bào chủ (các tế bào nhận
lục lạp ngoại lai).
Như vậy việc chuyển toàn bộ lục lạp có ý nghĩa rất quan trọng trong việc
tạo ra những tổ hợp lục lạp và nhân mới. Bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần
chúng ta có thể tạo ra được cây lai tế bào chất mang nhân của cây này nhưng lạp
thể của cây khác, điều này giúp tạo ra được những cây lai soma mang những đặc
tính mong đợi. Tuy nhiên trong một giới hạn nhất định, việc chuyển những lục
lạp nguyên vẹn còn gặp một số trở ngại đáng kể ở những loài xa nhau trong hệ
thống phân loại.
Ngoài ra, có thể chuyển lục lạp thông qua tái tổ hợp DNA: Trong những
tổ hợp lai giữa các loài xa nhau, khi mà hệ gen lục lạp nguyên vẹn không hoạt
động với những nhân lạ thì việc chuyển lạp thể có giới hạn bằng tái tổ hợp có
thể khắc phục được tính bất hợp này theo cách lai gần giống với lai soma không

đối xứng. Tuy nhiên sự di truyền lạp thể chỉ theo cha hoặc mẹ trong đa số các
loài thực vật đã cản trở sự hình thành lục lạp pha trộn (là điều cần trước hết của
tái tổ hợp). Những cố gắng để phục hồi sự tái tổ hợp trong các loài có sự di
truyền lạp thể ở cả bố và mẹ đã không thành công. Phân tích những cây lai
soma và lai tế bào chất từ những tổ hợp khác nhau cũng không thấy sự biểu lộ
bất cứ một dấu hiệu nào của tái tổ hợp lục lạp. Như vậy việc tái tổ hợp ở thực
vật bậc cao thường rất ít xảy ra. Nếu tạo được các tổ hợp gen lục lạp giữa các
loài cây sẽ có ý nghĩa rất lớn trong cải biến di truyền lục lạp.
Như vậy việc chuyển toàn bộ lục lạp nguyên vẹn hoặc chuyển một phần
lục lạp (thông qua tái tổ hợp lục lạp) bằng con đường dung hợp tế bào trần có
vai trò ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu và cải tạo giống cây trồng. Bằng
những phương pháp này, người ta có thể tạo ra được những tổ hợp nhân và lục
lạp mới mang những tính trạng di truyền lục lạp có lợi như chịu bệnh, các đột
biến kháng độc tố và kháng chất diệt cỏ cho cây trồng. Hơn nữa việc tạo ra tái tổ
hợp lục lạp có ý nghĩa rất quan trọng trong việc khắc phục tính bất hợp giữa
nhân và lục lạp ở những loài xa nhau trong hệ thống phân loại. Phương pháp này
được xem như là một công cụ có hiệu quả trong việc chuyển gen lục lạp.
* Chuyển gen lục lạp:
Chuyển gen là hướng biến đổi di truyền lục lạp đầy hứa hẹn. Có 2 hướng
chính trong chuyển gen lục lạp đó là chuyển gen lục lạp vào lục lạp và chuyển
8
gen có nguồn gốc khác vào lục lạp. Hiện nay cả hai hướng này đều đang đang
được áp dụng.
Chuyển gen lục lạp vào lục lạp: Cho đến nay có ba phương pháp chính để
chuyển gen lục lạp vào lục lạp đó là phương pháp thông qua Agrobacterium,
phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng xử lý PEG và phương pháp bắn gen [1].
Các gen lục lạp được chuyển nạp mới hạn chế ở một số gen kháng thuốc kháng
sinh và kháng chất diệt cỏ. Đối tượng chuyển nạp chủ yếu là thuốc lá. Các hệ
thống chuyển gen lục lạp ở lúa mới đang được nghiên cứu bước đầu. Ngoài ba
phương pháp chuyển gen đã được đề cập đến ở trên còn có một số phương pháp

khác như: Biến nạp bằng xung điện (Christou và cs., 1987) và biến nạp bằng kỹ
thuật vi dung hợp (Eigel, 1991) cũng được một số phòng thí nghiệm sử dụng để
chuyển gen vào lục lạp.
Cho đến nay, ngoài việc chuyển các gen lục lạp vào lục lạp, đã có nhiều
công bố chuyển nạp thành công các gen có nguồn gốc khác vào lục lạp. Chuyển
các gen lục lạp vào hệ gen lục lạp cho đến nay chủ yếu là các gen kháng kháng
sinh và kháng chất diệt cỏ. Việc phân lập và chuyển nạp các gen lục lạp có ý
nghĩa kinh tế vẫn còn rất hạn chế. Những kết quả cho thấy chuyển gen vào lục
lạp có thể khắc phục được sự lây lan các gen kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ
sang các cây trồng và cây hoang dại khác vì các gen lạp thể không di truyền qua
hạt phấn. Điều này hạn chế ảnh hưởng của cây chuyển gen đến môi trường. Gen
y - ECS (y - glutamylcysteine synthetase hoặc glutathione synthetase) từ E. coli
cũng đã được chuyển vào lục lạp với mục đích biến đổi quá trình tổng hợp
glutathione và acid amin trong lục lạp (Noctor và cs., 1998). Các tác giả đã nhận
được sự thể hiện của gen chuyển nạp rất ổn định và sự gia tăng hoạt tính của sản
phẩm gen tạo ra. Như vậy là khả năng tiếp nhận các gen chuyển nạp không có
nguồn gốc lục lạp và sự thể hiện các gen này trong lục lạp ổn định cùng với hoạt
tính của sản phẩm của gen chuyển nạp cao đã làm cho công nghệ di truyền lục
lạp trở nên hấp dẫn đối với các nhà khoa học.
2.4. Ứng dụng công nghệ sinh học lục lạp trong cải tiến di truyền cây trồng:
Rất nhiều điều kiện bất lợi (stresses) của môi trường như bệnh, côn trùng,
khô hạn, phèn, mặn, lạnh, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của
thực vật và kéo theo sự giảm thiểu về năng suất và chất lượng. Để cải tiến các
tính trạng của thực vật, kĩ thuật gen lục lạp là một trong những công cụ quan
trọng được các nhà khoa học quan tâm. Bởi vì, nhiều tính trạng nông học quan
9
trọng được điều khiển bằng vật chất di truyền lục lạp như: tính kháng chất diệt
cỏ, kháng côn trùng và tính chịu hạn, chịu mặn [7].
Những kết quả đầu tiên về cải tiến các tính trạng nông học bằng kĩ thuật
gen lục lạp có thể thấy trong bảng 2.3.

Bảng 2.3. Những thông báo đầu tiên về cải biến tính
trạng nông học bằng kỹ thuật gen lục lạp
Gen chuyển nạp Tính trạng Tác giả
Cry1A Kháng côn trùng
McBride KE et al.,
1995
Cry2Aa2 Kháng côn trùng Kota M el al., 1999
Cry2Aa2 operon Kháng côn trùng DeCosa B. et al., 2001
AroA Kháng chất diệt cỏ Daniell H. et al., 1998
Bar Kháng chất diệt cỏ
Iamtham S. & Day A.
(2000)
MSI-99 Kháng bệnh DeGray G. et al., 2001
Tps Chịu hạn Lee SB et al., 2003
Badh Chịu muối Kumar S et al., 2004
merA/merB Xử lý ô nhiễm chì bằng thực vật Ruiz ON et al., 2003
phaA Bất dục đực
Ruiz ON & Daniell H,
2009 [6]
Cho đến nay, ngoài việc chuyển các gen lục lạp vào lục lạp, đã có nhiều
công bố chuyển nạp thành công các gen có nguồn gốc khác vào lục lạp của cà
chua (Ruf và cs., 2001), Arabidopsis (Maliga và cs., 2002), cải dầu (Hou và cs.,
2003), Petunia (Zubkot và cs., 2004), cây bông (Kumar và cs., 2004), lúa (Lee
và cs., 2006), cà rốt (Ruhlman và cs., 2006), rau diếp (Kanamoto và cs., 2006)
và cây gỗ dương (Okumura và cs., 2006).
Kota và cs. (1999) đã nghiên cứu chuyển gen cry vào lục lạp và đã cho
thấy gen cry thể hiện rất mạnh trong lục lạp mà không cần chỉnh codon sử dụng
và biến đổi trình tự. Các tác giả thấy rằng lá của các cây chuyển gen có tính độc
cao đối với ấu trùng của côn trùng [4]. Dufourmantel và cs. (2005) đã thành
công trong tạo cây đậu tương chuyển gen lục lạp kháng côn trùng. Thành công

này đã mở ra triển vọng cho việc cải biến tính trạng ở cây trồng bằng chuyển
gen vào lục lạp.
Đối với bệnh nấm, DeGray và cs. (2001) đã chuyển gen MSI - 99 vào lục
lạp, gen MSI - 99 đã thể hiện rất mạnh: ở cây chuyển gen T1 ức chế tới 88% còn
10
ở T2 ức chế đến 96% sự phát triển của Pseudomonas syringae pv tabaci. Ngoài
vi khuẩn, cây chuyển gen còn kháng được cả nấm.
Kĩ thuật chuyển gen lục lạp đã ứng dụng thành công trong phát triển thực
vật với các tính trạng kháng mặn, kháng hạn và nhiệt độ thấp. Những nghiên
cứu của Rhodes và Hanson (1993) đã cho thấy sự thể hiện vượt trội enzyme
tổng hợp glycine betaine trong cây chuyển gen đã tăng cường tính chống chịu
một số stress phi sinh học. Kumar và cs. (2004) đã chuyển gen badh (betaine
aldehyde dehydrogenase) vào lục lạp cà rốt. Các tế bào được chuyển gen vào lục
lạp sinh trưởng trong môi trường chứa 100 mM NaCl đã tích lũy betaine cao gấp
50 - 54 lần so với tế bào không chuyển gen còn cây cà rốt chuyển gen lục lạp có
thể sinh trưởng trong điều kiện nồng độ muối lên tới 400 mM/l NaCl. Đây là
mức độ chịu hạn cao nhất trong các tài liệu đã công bố. Zhang và cs. (2008) đã
chuyển thành công gen mã hóa cho chorine monoxygenase thành betain
aldehyde từ cây củ cải (Beta vulgaris) vào hệ gen lục lạp của cây thuốc lá. Các
cây chuyển gen lục lạp có mức độ quang hợp cao hơn rõ ràng trong điều kiện có
150 mM/l NaCl. Stress muối là nguyên nhân làm thay đổi hiệu suất quang hóa
tối đa của hệ quang hợp II trong cây chuyển gen lục lạp và cây không chuyển
gen lục lạp. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy đường trehalose được tích lũy
nhiều trong điều kiện stress như lạnh, nóng, muối và hạn vì vậy người ta cho
rằng trehalose đóng vai trò bảo vệ tế bào khỏi sự phá hủy do các stress. Ở các
cây chuyển gen nhân, sự thể hiện của gen TPS1 (mã hóa cho enyme tổng hợp
đường trehalose) theo tính đa hiệu thậm chí ở mức thấp. Lee và cs. (2003) đã
chuyển gen TPS1 vào lục lạp và nhận được cây chuyển gen lục lạp sinh trưởng
bình thường và tích lũy hetralose tăng lên đến 25 lần. Các cây chuyển gen lục
lạp có mức độ chịu hạn cao, vẫn khỏe mạnh và xanh tốt khi xử lí 6% PEG.

Trong khi thực vật hoang dã hoàn toàn bị tẩy trắng.
Mức độ không bão hòa của axit béo trong lipid thực vật có vai trò quan
trọng trong tính đề kháng stress và chất lượng dinh dưỡng của thực vật. Gen Δ
9
desaturase có vai trò quan trọng trong chu trình trao đổi chất lipid đã được Craig
và cs. (2008) chuyển vào lục lạp thuốc lá. Kết quả này đã mở ta triển vọng trong
cải biến di truyền thành phần lipid trong mô sinh sản và sinh dưỡng để tăng khả
năng chịu lạnh của cây.
Sử dụng kĩ thuật gen lục lạp trong quản lí rủi ro cỏ dại cũng đã được tiến
hành. Daniel và cs. (1998), Lutz và cs. (2001) đã chuyển gen mà mã hóa tính ức
chế phosphinothricin acetyltransferase (PAT) vào lục lạp thuốc lá đã tạo ra cây
11
chuyển gen có mức biểu hiện enzyme cao ( ≥ 7% TSP) và kháng chất diệt cỏ
glufosinate trên đồng ruộng.
Những trường hợp này chứng minh rằng công nghệ lục lạp có thể đặc biệt
hữu ích để phát triển cây trồng kháng với các căng thẳng sinh học và phi sinh
học. Các lục lạp thiết kế để có đầy đủ các gen kháng điều kiện bất lợi hiệu quả,
kịp thời để bảo vệ thực vật trong lĩnh vực này.
Bảng 2.4. Chuyển gen lục lạp trên một số loài rau
Loài thực vật Yếu tố chọn lọc Tác giả
Bắp cải
Spectinomycin: 50 - 200
μg/ml
Liu et al.,2007
Súp lơ Spectinomycin: 50 μg/ml Nugent et al.,2006
Rau riếp Spectinomycin: 50 μg/ml
Ruhlman et
al.,2007
Cà tím
Spectinomycin: 200 μg/ml

& streptomycin : 200 μg/ml
Singh et al., 2010
Bạch dương Spectinomycin: 30 μg/l
Okumura et al.,
2006
Củ cải đường
Spectinomycin: 40, 300, 400
μg/ml
De Marchis et al.,
2005
Khoai tây
Spectinomycin: 300 μg/ml ,
ra rễ : 400 μg/ml
Nguyen et al.,
2005
Cà chua
Spectinomycin: 300 μg/ml
hoặc 500 μg/ml
Ruf et al., 2001
Bảng 2.5. Chuyển gen lục lạp bởi phôi vô tính
Loài
thực vật
Yếu tố chọn lọc Tác giả
Cà rốt
lần 1: Spectinomycin: 150 μg/ml
lần 2: Spectinomycin: 350 μg/ml
Kumar et al., 2004
Bông
lần 1: Kanamycin: 50 μg/ml
lần 2: Kanamycin: 100 μg/ml

Kumar et al., 2004
Lúa
lần 1: Streptomycin: 200 μg/ml
lần 2: Streptomycin: 500 μg/ml
Lee et al., 2006
Đậu nành
lần 1: Spectinomycin: 200/300 μg/ml
lần 2: Spectinomycin: 150 μg/ml
Dufourmantel et
al., 2004
Lúa mì
lần 1: Kanamycin: 50 μg/ml
lần 2: Kanamycin: 100 μg/ml
Cui et al., 2011
12
Sử dụng thực vật làm sạch ô nhiễm môi trường hiện nay được xem như
phương thức hiệu quả và thân thiện với môi trường cùng với ưu việt lớn về làm
sạch môi trường trên qui mô lớn. Tuy nhiên, khả năng xử lí mức ô nhiễm kim loại
nặng cao của thực vật còn bị hạn chế. Vì vậy, việc tạo thực vật có khả năng xử lí ô
nhiễm kim loại nặng cao là một hướng quan trọng trong công nghệ sinh học thực
vật. Thủy ngân là một trong những chất thải độc hại đe dọa sức khỏe và sinh thái.
Phần lớn các nghiên cứu sử dụng thực vật xử lí ô nhiễm thủy ngân dùng gen merA
hoặc merB để cải tiến thực vật thông qua hệ gen nhân hoặc lục lạp bằng sự thể hiện
enzyme lipase thủy ngân hữu cơ hoặc enzyme reductase ion thủy ngân trong tế bào
chất, mạng lưới nội bào hoặc trong lạp thể. Nhiều loài thực vật như Arabidopsis,
thuốc lá, cây dương, lúa, lạc, cỏ nước mặn và tảo Chlorella đã được chuyển các gen
này. Ruiz và cs. (2003) lần đầu tiên công bố về sử dụng công nghệ gen lục lạp cho
xử lí ô nhiễm môi trường bằng thực vật. Các tác giả đã sử dụng gen merA hoặc
merB từ vi khuẩn chuyển vào hệ gen lục lạp thuốc lá. Cây chuyển gen thể hiện tính
kháng thủy ngân rất cao, tới 400μM [6].

tế bào được chuyển gen lục lạp
Husein và cs. (2007) đã thông báo cây thuốc lá chuyển gen lục lạp thể hiện gen
merA hoặc merB có thể tích lũy thủy ngân ở rễ khi nồng độ thủy ngân trong đất
lên tới 200μg/g mà không có tác động bị hại nào và có thể tích lũy cao hơn 100
lần so với cây không chuyển gen. Ngoài ra, các cây chuyển gen còn làm bay hơi
hiệu quả HgO. Và điều này khẳng định rằng cả hai enzyme reductase ion thủy
ngân và lipase thủy ngân hữu cơ đều hoạt động trong cây chuyển gen lục lạp.
Bảng 2.6: Chuyển gen lục lạp và điều kiện chọn lọc cho một số loài thực vật
Loài thực vật
Phương
pháp
Chọn lọc
Gen được
chuyển
Tác giả
Nicotiana
tabacum (Thuốc lá)
Bắn gen Spectinomycin rrn14
Svab et al,
1990
Thuốc lá PEG Spectinomycin rrn14
Golds et al,
1993
13
Thuốc lá Bắn gen Kanamycin nptII
Carrer et al,
1993
Thuốc lá Bắn gen Spectinomycin uidA
Staub and
Maliga, 1995

Thuốc lá Bắn gen Spectinomycin hST
Staub et al,
2000
Thuốc lá Bắn gen Spectinomycin Bt
Cosa et al,
2001
Thuốc lá Bắn gen Spectinomycin
Bar &
aadA
Lutz et al,
2006
Arabidopsis thaliana Bắn gen Spectinomycin aadA
Sikdar et al,
1998
Solanum
tuberosum (Khoai tây)
Bắn gen Spectinomycin
aadA &
gfp
Sidorrov et
al, 1999
Lúa Bắn gen Spectinomycin
aadA &
gfp
Lee et al,
2006
Lycopersicon
esculentum (Cà chua)
Bắn gen Spectinomycin aadA
Ruf et al,

2001
Brassica napus Bắn gen Spectinomycin
aadA &
Cry1Aa10
Hou et al,
2003
Lesquerella fendleri Bắn gen Spectinomycin
aadA &
gfp
Skajinskaia et
al, 2003
Daucus carota (Cà rốt) Bắn gen Spectinomycin badh
Kumar et al,
2004
Gossypium hirsutum
(Bông)
Bắn gen Kanamycin aphA-6
Kumar et al,
2004
Glycine max (Đậu
tương)
Bắn gen Spectinomycin aadA
Dufourantel
et al, 2004
Petunia hybrida Bắn gen
Spectinomycin
& Streptomycin
aadA &
gus A
Zubko et al,

2004
Lactuca sativa (rau
diếp)
PEG Spectinomycin gfp
Lelivelt et al,
2006
rau diếp Bắn gen Spectinomycin gfp
Kanamoto et
al, 2006
Brassica olerace (Súp lơ)
Bắn gen &
PEG
Spectinomycin
aadA &
gus A
Nugent et al,
2006
Populus alba (Dương) Bắn gen Spectinomycin gfp
Okumura et
al, 2006
Brassica oleracea Bắn gen
Spectinomycin
& Streptomycin
aadA &
uidA
Liu et al,
2007
14
Như vậy, có thể thấy rằng công nghệ sinh học lục lạp đã có những đóng
góp to lớn cho cải tiến di truyền cây trồng. Ứng dụng này đã thành công trên

nhiều đối tượng, có thể kể ra một số ví dụ cụ thể cho đối tượng cây trồng nông
học quan trọng đã được áp dụng kĩ thuật này:
* Cà rốt chuyển gen lục lạp:
Cà rốt (Daucus carota L.) là một trong những cây rau quan trọng nhất được sử
dụng trên toàn thế giới cho con người và động vật tiêu dùng, vì nó là một nguồn
thực phẩm tuyệt vời cung cấp các loại đường, vitamin A và C, và chất xơ trong
chế độ ăn uống. Carrot là loài thực vật như là một chỉ thị muối nhạy cảm bởi vì
nó giảm 7% tăng trưởng cho mỗi tăng 10 mM độ mặn/20 mM [26]. Vì vậy, cà
rốt là một ứng cử viên lý tưởng cho thao tác di truyền để tăng khả năng chịu
mặn.
Đất bị nhiễm mặn là một tress vô sinh chủ yếu trong nông nghiệp đối với
cây trồng. Các vấn đề của độ mặn của đất đã kết hợp do thủy lợi và sử dụng quá
nhiều phân bón. Khoảng 20% vùng đất được tưới tiêu trên thế giới bị ảnh hưởng
bởi độ mặn [14]. Hiện nay, độ mặn cao giới hạn sản xuất cây trồng ở 30% diện
tích đất được tưới tiêu ở Mỹ và 20 triệu ha trên toàn cầu. Một trong những khả
năng thích nghi về mặt trao đổi chất trước điều kiện bất lợi này là tích lũy
smoprotectants. Glycine betaine bảo vệ các tế bào bằng cách duy trì một áp suất
thẩm thấu cân bằng với môi trường và bằng cách ổn định cấu trúc bậc bốn của
phức hợp protein. Điều này có được giải thích trong một số báo cáo về chuyển
gen nhân. Cây chuyển gen tích lũy biểu hiện betain glycine mức độ vừa phải đối
với stress muối [15].
Kumar và cs. (2004) đã đưa ra báo cáo đầu tiên về thành công chuyển gen
vào lục lạp thông qua con đường tái sinh phôi soma.
15
Hình 2.1: Cà rốt được chuyển gen lục lạp: (a) Cây cà rốt biến đổi gen. Biểu hiện của
betaine aldehyde dehydrogenase thúc đẩy sự hình thành màu xanh ở các tế bào
chuyển gen (b), so với mẫu không chuyển gen-mô sẹo màu vàng (c).(d) tế bào cà rốt
chuyển gen sinh trưởng trong môi trường lỏng bổ sung 100 mM NaCl, trong khi các tế
bào không chuyển gen thì hầu như không phát triển khi có sự hiện diện của muối(e).
(f-i) cây cà rốt chuyển gen phát triển mạnh trong chậu đất được tưới bằng 200-500

mM NaCl, trong khi các cây cà rốt không chuyển gen cho thấy sự tăng trưởng chậm
trong sự hiện diện của muối.
Mô sẹo được chuyển gen ALDH betaine (badh) biểu hiện màu xanh lá
trong trường hợp chưa bổ sung nhân tố chọn lọc, trong khi các tế bào không
chuyển gen màu vàng (hình 2.1 b, c). Hoạt động của enzyme badh được nâng
cao gấp tám lần trong nuôi cấy tế bào biến đổi gen cà rốt khi nuôi cấy trong môi
trường lỏng có mặt 100 mMNaCl và tăng bảy lần (dựa trên cân nặng tươi), khi
so sánh với các tế bào không chuyển gen (hình 2.1 d, e). Các tế bào cà rốt trồng
nuôi cấy trong môi trường chứa 100 mM NaCl đã tích lũy betain cao gấp 50-54
lần (đo bằng 1 H-NMR) so với tế bào không chuyển gen. Số liệu này cao như
mức betaine quan sát thấy trong các cây chịu mặn. Cây cà rốt chuyển gen lục lạp
còn có thể sinh trưởng trong điều kiện NaCl lên tới 400mM; hình 2.1f-i). Đây là
mức cao nhất của khả năng chịu mặn trong các tài liệu đã được công bố.
Ngoài ra Cà rốt còn là đối tượng lý tưởng cho việc sản xuất các vác xin ăn
được. Kỹ thuật di truyền lục lạp là thích hợp nhất để thể hiện siêu kháng nguyên
và sản xuất vắc xin của các protein có giá trị điều trị.
* Cây Bông chuyển gen lục lạp
16
Bông (Gossypium hirsutum L.) là một trong những loại cây trồng thương
mại quan trọng nhất trên thế giới. Năm 2002, bông biến đổi gen Bt và kháng
thuốc trừ cỏ (thiết kế thông qua bộ gen nhân) được trồng trên 13% tổng diện tích
trên thế giới so với đậu tương (63%) và ngô (19%). Bông GM được trồng trong
các khu vực của thế giới, nơi không có họ hàng hoang dã, để tránh lai xa tiềm
năng với cỏ dại có liên quan. Sự phân tán của phấn hoa từ cây bông biến đổi gen
để xung quanh nhà máy không chuyển gen đã được báo cáo [43].
Kumar và cs. (2004) đã chứng minh tính ổn định của hệ gen lục lạp của
bông chuyển gen và kể cả khi sử dụng cây chuyển gen này làm mẹ [12]. Cây
chuyển gen và cây không chuyển gen được thí nghiệm trong những điều kiện
tương tự (hình 2.2 a-i)
Hình 2.2: Bông chuyển gen lục lạp. Bông không chuyển gen, mô sẹo có màu kem (a)

trong khi bông chuyển gen có màu xanh trên môi trường chọn lọc sau 2 tháng. Cây
biến đổi gen (c) và cây bông không chuyển gen điều khiển (d) được thể hiện ở giai
đoạn có hoa và thiết lập hạt giống. Các phần khác nhau hoa bông không chuyển gen
kiểm soát (e-g) có thể so sánh với các bộ phận của hoa bông biến đổi gen (h-j).Cây
giống F1 sản xuất từ các phép lai giữa bông không chuyển gen x chuyển gen cho thấy
nảy mầm chậm (k), trong khi cây bông biến đổi gen (l) nảy mầm tốt trên vùng chọn lọc
chứa kanamycin.
* Đậu tương chuyển gen lục lạp:
Đậu tương (Glycine max L. Merr.) được coi như là nguồn protein quan trọng
nhất. Nó được sử dụng rộng rãi như thức ăn chăn nuôi và thực phẩm của con
người. Chất khô đậu nành có chứa dầu 20% về khối lượng và một nửa diện tích
17
canh tác đậu tương trên toàn thế giới. Điều này tương ứng với việc chấp nhận của
nông dân các giống cây trồng chịu được thuốc diệt cỏ glyphosate, một đặc điểm đã
được thiết kế thông qua chuyển gen nhân. Hiện nay, nhiều nỗ lực đang được dành
cho các kỹ thuật kháng sâu bệnh và cải thiện khả năng kháng bệnh và chất lượng
dầu. Việc chuyển gen của lục lạp đậu tương là một thách thức thực sự bởi vì các tế
bào phôi soma chứa lục lạp ít hơn và nhỏ hơn nhiều [16].
Kỹ thuật di truyền lục lạp đậu tương đầu tiên được thực hiện bởi Zhang và
cs.(2001) [49], với mục tiêu tăng khả năng quang hợp của nó. Sự thành công đầu
tiên phát triển các công nghệ di truyền lục lạp thông qua phát sinh phôi vô tính
của Dufourmantel et al. (2004)[13]. Việc chuyển gen lục lạp đậu tương đạt được
hiệu quả cao hơn 15-100 lần so với khoai tây [9], cà chua [10], Lesquerella
fendleri [11] và Arabidopsis thaliana [8]. Kiểu hình cây chuyển gen bình thường
thông qua phát sinh phôi vô tính (hình 3.3 a, b). Tất cả lục lạp của cây chuyển
gen có khả năng sinh sản và hạt giống có thể nảy mầm được. Thế hệ con T1
cũng kháng với kháng sinh và thể hiện sự di truyền ổn định (hình 3.3 c, d). Gen
được lựa chọn chẳng hạn như các gen kháng thuốc trừ cỏ hoặc badh có thể được
phát triển cho cây đậu tương [17]. Tuy nhiên, marker chọn lọc có những hạn
chế. Gen kháng thuốc diệt cỏ không thể được sử dụng cho vòng đầu tiên của

chọn lọc, spectinomycin gây tử vong cho cây trồng bao gồm bông. badh không
được sử dụng cho các loài có hàm lượng glycine betaine nội sinh cao.
Hình 2.3: Đậu tương chuyển gen lục lạp. Cây không chuyển gen (a) và
cây chuyển gen (b). Môi trường chọn lọc chứa Spectinomycin ảnh hưởng bất lợi đến
các cây con không chuyển gen (c), trong khi cây con chuyển gen (d) phát triển tốt.
18
Các gen lục lạp mã hóa cho các tính chống chịu như chịu nhiệt, chịu bệnh,
chịu các thuốc diệt cỏ, ngoài ra gen lục lạp còn mã hóa cho các protein liên quan
đến cấu trúc của lục lạp và khả năng quang hợp vì vậy mà liên quan đến năng
suất cây trồng; thứ hai là lục lạp di truyền theo đường mẹ vì vậy không có nguy
cơ lan truyền các gen biến nạp, đặc biệt là các gen kháng chất diệt cỏ và côn
trùng vào môi trường làm giảm tác động xấu của các cây chuyển gen đối với
môi trường sinh thái; thứ ba là các gen chuyển vào lục lạp được thể hiện ở lá sẽ
ít ảnh hưởng đến sự an toàn đối với các cây thu quả, hạt, củ làm thực phẩm và
thức ăn gia súc, ngoài ra đối với các gen diệt côn trùng sống trên lá sẽ có tác
dụng trực tiếp và hiệu quả hơn. Chuyển gen ở lục lạp còn được sử dụng để sản
xuất một số protein chức năng hoặc amino acid và vacxin.
Như vậy việc chuyển toàn bộ lục lạp nguyên vẹn hoặc chuyển một phần
lục lạp (thông qua tái tổ hợp lục lạp) bằng con đường dung hợp tế bào trần có
vai trò ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu và cải tạo giống cây trồng. Bằng
những phương pháp này, người ta có thể tạo ra được những tổ hợp nhân và lục
lạp mới mang những tính trạng di truyền lục lạp có lợi như chịu bệnh, các đột
biến kháng độc tố và kháng chất diệt cỏ cho cây trồng. Hơn nữa việc tạo ra tái tổ
hợp lục lạp có ý nghĩa rất quan trọng trong việc khắc phục tính bất hợp giữa
nhân và lục lạp ở những loài xa nhau trong hệ thống phân loại. Phương pháp này
được xem như là một trong những công cụ có hiệu quả trong việc chuyển gen
lục lạp.
Ngoài ra: công nghệ sinh học lục lạp còn góp phần vào việc sản xuất các
dược liệu sinh học như protein chữa bệnh, kháng nguyên vacxin và thực vật thân
thiện với môi trường.

Phần 3
19
KẾT LUẬN
Cho đến nay, những thành tựu mà công nghệ sinh học lục lạp đã đạt được
trong việc cải tiến di truyền cây trồng là rất lớn. Nhờ công nghệ này đã tạo ra
được những giống cây trồng có khả năng chống chịu những điều kiện bất lợi
như: kháng mặn, chịu lạnh, chịu nóng, kháng chất diệt cỏ, kháng côn trùng, mà
vẫn đảm bảo năng suất - chất lượng. Hơn nữa, đây là còn là một trong những
hướng ứng dụng đầy triển vọng do nó có nhiều ưu việt. Việc chuyển gen thông
qua lục lạp có nhiều ưu điểm như mức độ biểu hiện của gen ngoại lai cao, sản
phẩm của gen được giữ lại trong lục lạp, Những ưu việt này đã dẫn đến việc
tăng cường nghiên cứu công nghệ sinh học lục lạp nhằm tạo ra các sản phẩm
công nghệ sinh học thực vật có giá trị và thân thiện với môi trường, góp phần
vào sự phát triển an toàn - bền vững. Tuy nhiên, đây mới chỉ là bước đầu do còn
gặp phải một số khó khăn trong việc thanh lọc protein; mức độ kiểm soát biểu
hiện gen và việc đánh giá các cây chuyển gen lục lạp cần phải được đánh giá
nhiều hơn, ở qui mô rộng hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
20
Tài liệu tiếng Việt
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997) Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
2. Nguyễn Đức Thành (2011) Giáo trình sinh học lục lạp. Nhà xuất bản Khoa
học tự nhiên và công nghệ , Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
3. Daniell, H. et al. (2002) Milestones in chloroplast genetic engineering: an
environmentally friendly era in biotechnology. Trends Plant Sci. 7, 84–91.
4. Kota M., Daniell H., Varma S., Garzynski S.F., Guold F., and Moar W.J.
1999. Overexpression of the Bacillus thuringiensis (bt) Cry2Aa2 protein in
chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistance
insects. Proc Natl Acad Sci USA, 96, 1840-1845.

5. Thanh ND., Medgyesy M.1989. Limited chloroplast gene transfer via
recombination overcomes plastome-genome incompatibility between Nicotiana
tabacum and Solanum tuberosum. Plant Mol Biol,12:87-93.
6. Ruiz ON., and Daniell H. 2009. Genetic engineering to enhance mercury
phytoremendiation. Curr Opi Biotech, 20(2): 213 - 219
7. Wang HH., Yin WB., Hu ZM. 2009. Advances in chloroplast engineering. J
Genet Genom, 387 – 398
8. Sikdar, S.R. et al. (1998) Plastid transformation in Arabidopsis thaliana. Plant
Cell Rep. 18, 20–24
9. Sidorov, V.A. et al. (1999) Technical advance: stable chloroplast
transformation in potato: use of green fluorescent protein as a plastid marker.
Plant J. 19, 209–214
10. Ruf, S. et al. (2001) Stable genetic transformation of tomato plastids and
expression of a foreign protein in fruit. Nat. Biotechnol. 19, 870–875
11. Skarjinskaia, M. et al. (2003) Plastid transformation in Lesquerella fendleri,
an oilseed Brassicacea. Transgenic Res. 12, 115–122
12. Kumar, S. et al. (2004) Stable transformation of the cotton plastid genome
and maternal inheritance of transgenes. Plant Mol. Biol. 56, 203–214
13. Dufourmantel, N. et al. (2004) Generation of fertile transplastomic soybean.
Plant Mol. Biol. 55, 479–489
14. Zhu, J.K. (2001) Plant salt tolerance. Trends Plant Sci. 6, 66–71
15. Flowers, T.J. (2004) Improving crop salt tolerance. J. Exp. Bot. 55, 307– 319
21
16. Zhang, X.H. et al. (2001) Photosynthetic properties of two different soybean
suspension cultures. J. Plant Physiol. 158, 357–365
17. Daniell, H. et al. (2001) Marker free transgenic plants: engineering the
chloroplast genome without the use of antibiotic selection. Curr. Genet. 39, 109–114.
MỤC LỤC
22
Trang

Phần 1 Mở đầu 1
Phần 2 Nội dung 2
Phần 3 Kết luận 19
Tài liệu tham khảo
23