Tải bản đầy đủ (.docx) (27 trang)

góp phần làm sạch nước sinh hoạt thủ đô bằng cách khử độc tố microcystins bằng vi khuẩn pseudomonas flourescens.

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.36 MB, 27 trang )

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI
TRƯỜNG THPT CHUYÊN NGUYỄN HUỆ - HÀ ĐÔNG
**************
ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT
DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015).
Tên đề tài:
GÓP PHẦN LÀM SẠCH NGUỒN NƯỚC SINH HOẠT THỦ ĐÔ QUA VIỆC
NGHIÊN CỨU VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG XỬ LÝ ĐỘC TỐ TẢO LAM Ở
HỒ HOÀN KIẾM BẰNG BIỆN PHÁP SINH HỌC
Lĩnh vực: Sinh học môi trường.
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
- TS Nguyễn Thị Hoài Hà
- Đơn vị công tác: Viện Vi sinh và
Công nghệ Sinh học - ĐHQG Hà Nội.
- ThS.Trịnh Việt Văn
- Đơn vị công tác: Trường THPT
Chuyên Nguyễn Huệ.
TÁC GIẢ:
1. Nguyễn Hữu Hải Trung, Lớp: 11 Sinh,
Trường: THPT Chuyên Nguyễn Huệ.
2. Huỳnh Đức Anh, Lớp: 11 Sinh, Trường:
THPT Chuyên Nguyễn Huệ.
Hà Nội, tháng 12 năm 2014
1
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn 3
PHẦN I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 4
1.1. Lý do chọn đề tài 4
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 4


PHẦN II. TỔNG QUAN 5
2.1. Tổng quan nghiên cứu 5
2.2. Điểm mới và tính sáng tạo của đề tài 6
2.3. Lợi ích của đề tài 6
PHẦN III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 7
3.1. Nghiên cứu lý thuyết 7
3.2. Phương pháp nghiên cứu 14
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
4.1. Sàng lọc vi tảo lam thuộc chi Microcystis trong mẫu tự nhiên : 17
4.2. Phân loại VKDD Pseudomonas SP8 19
4.3. Mô hình xử lý độc tố microcystin trong phòng thí nghiệm 22
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 26
2
LỜI CẢM ƠN
Nhóm khoa học thuộc đề tài: GÓP PHẦN LÀM SẠCH NƯỚC SINH HOẠT
THỦ ĐÔ THÔNG QUA VIỆC XỬ LÝ ĐỘC TỐ TẢO LAM Ở HỒ HOÀN
KIẾM BẰNG BIỆN PHÁP SINH HỌC xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới BGH
trường THPT CHUYÊN NGUYỄN HUỆ đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chúng em
trong thời gian thực hiện đề tài.
Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo thuộc Viện Vi sinh
vật và công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã đưa ra những lời khuyên
cũng như giúp nhóm thực hiện đề tài.
Nhóm chúng em xin cảm ơn cố vấn khoa học TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, ThS.
Phạm Thị Bích Đào - Trường đại học Khoa học Tự nhiên và thầy giáo - ThS. Trịnh
Việt Văn, trường THPT Chuyên Nguyễn Huệ đã hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện để
nhóm tác giả hoàn thành tốt đề tài.
Cuối cùng nhóm tác giả xin gửi lòng biết ơn đến cha mẹ, anh chị, gia đình và bạn
bè đã giúp đỡ, động viên nhóm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
NHÓM TÁC GIẢ

3
PHẦN I: LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
1.1. Lý do chọn đề tài:
- Qua các phương tiện thông tin đại chúng, chúng em nhận thấy trong nguồn nước
chảy cung cấp cho thành phố Hà Nội có nhiễm chất độc microcystins (MCs) của tảo
Mycrocystis aeuroginosa chưa được xử lý, có ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử
dụng.
- Từ những quan sát thực tế trong chuyến tham quan hồ Hoàn Kiếm, một địa danh
nổi tiếng ở thủ đô Hà Nội, chúng em nhận thấy hồ đang chịu tác động lớn từ việc sinh
sản nhanh của tảo độc do tình trạng ô nhiễm nặng nề bởi rác thải hữu cơ, gây hiện
tượng “phú dưỡng” trong hồ.
- Sự nhân nhanh của nhóm tảo độc M.aeruginosa làm cho lượng độc tố MCs do
chúng tạo ra cũng tăng lên, đây là độc tố có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức sống
của các sinh vật thủy sinh trong hồ.
- Trong chương trình sinh học THPT chúng em được biết, tảo lam bị cạnh tranh
bởi nhiều vi sinh vật khác cùng sống trong môi trường nước hồ Hoàn Kiếm, chúng có
khả năng phân giải độc tố MCs của tảo lam, đảm bảo sự cân bằng sinh thái trong môi
trường nước hồ, đồng thời không tạo ra các loại độc tố khác ảnh hưởng đến môi
trường hồ. Điển hình trong nhóm này là vi khuẩn Pseudomonas fluorescens.
- Do đó chúng em liên hệ giữa đối tượng chúng em quan tâm là loài tảo độc M.
aeruginosa ở nguồn nước cung cấp cho Hà Nội ở đây là dòng nước ở sông Đà. Việc
xử lý độc tố ở ngay tại địa điểm Hồ Hoàn Kiếm sẽ thuận tiện hơn. Từ đó chúng em có
thể áp dụng xử lý với đối tượng là nguồn nước sông Đà.
Từ những lý do trên chúng em tiến hành thực hiện đề tài:
“Góp phần làm sạch nước sinh hoạt thủ đô thông qua việc xử lý độc tố tảo lam
ở hồ Hoàn Kiếm bằng biện pháp sinh học.”
1.2. Mục tiêu của đề tài:
- Xác nhận tính hiệu quả của loài vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong việc xử
lý các độc tố MCs trong môi trường nguồn nước sinh hoạt cung cấp cho thành phố Hà
Nội;

- Đề xuất hướng xử lý các độc tố MCs trong nguồn nước hồ cũng như nguồn nước
sinh hoạt cung cấp cho thành phố Hà Nội bằng phương pháp sinh học.
- Nâng cao hiệu quả xử lí MCs của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens;
4
PHẦN II: TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan nghiên cứu:
2.1.1. Sự ô nhiễm M.aeruginosa ở hồ Hoàn Kiếm:
- Tại cuộc hội thảo về hồ Gươm, nhiều ý kiến của các nhà khoa học đều khẳng định
môi trường nước hồ Gươm đang bị ô nhiễm nặng, chất lượng nước hồ ngày một suy
giảm, trong số 51 loài vi tảo thì có gần 90% là tảo lam độc hại.
- Đáng chú ý, sự xuất hiện thường xuyên và dày đặc của các loại tảo mà chủ yếu là
tảo lam độc thuộc chi Mycrocystis đã tạo nên đặc điểm nổi bật của hồ Gươm: độ pH
luôn ở mức cao 9,4 - 10,5 (số liệu quan trắc 2009-2010), hồ bị phì dưỡng cao, hàm
lượng các chất dinh dưỡng (NH4, TN, TP, COD) và các chất hữu cơ trong bùn rất
cao.
2.1.2. Về sự ô nhiễm M.aeruginosa ở sông Đà:
- Theo tài liệu nghiên cứu năm 2012, tình trạng ô nhiễm bởi M.aeruginosa môi trường
nước ở khu vực tỉnh Hòa Bình đạt mức nhẹ [30]. Tuy nhiên độc tố MCs có tính tích
lũy nên vẫn có thể ảnh hưởng tới sức khỏe con người nếu không được xử lý và còn
tồn tại trong nước cung cấp sinh hoạt cho dân cư.
- Hơn nữa thời điểm 2012 cách đây 2 năm. Có thể môi trường thay đổi có thể tạo điều
kiện cho loài tảo độc này phát triển. Do đó nguy cơ độc tố có trong nguồn nước ảnh
hưởng sức khỏe con người vẫn còn thậm chí tăng cao.
- Một số bài báo cho biết, khả năng sông Hồng nhiễm tảo độc không tránh khỏi bơi
đoạn sông Đà đổ vào đập thủy điện Hòa Bình có rất nhiều tảo độc. Khi đóng đập tảo
bị ứ lại, phát triển nhanh. Bên cạnh đó có những dấu hiệu cho hiện tượng phát triển
nhanh của loài tảo độc này là sự chuyển màu xanh của nước sông vốn đỏ màu phù sa.
[3]
2.1.3. Các công trình nghiên cứu về MCs trước đây:
Các MCs là các hợp chất có cấu trúc mạch vòng, có tính chất vật lý và hóa học

bền vững đối với các yếu tố pH, nhiệt độ và sự chiếu xạ. Những hợp chất này có thể
tồn tại một vài giờ trong nước đun sôi, còn trong điều kiện tự nhiên, không khí khô và
nhiệt độ phòng, chúng có thể tồn tại trong nhiều năm mà không bị phân hủy. Tuy
nhiên, ozon và một số tác nhân oxi hóa mạnh có thể phá hủy cấu trúc của MCs, hoặc
ánh sáng chứa tia cực tím cường độ cao. MCs cũng có thể bị phân hủy chậm trong
điều kiện đủ ánh sáng mặt trời, đặc biệt khi có mặt các sắc tố hòa tan trong nước. Đây
có thể là lý do hiện nay đã có nhiều phương pháp xử lý độc tố như: phương pháp vật
lý (lắng và lọc), phương pháp hóa học (kết tủa, keo tụ và clo hóa ) và ứng dụng bức
xạ điện từ (sử dụng tia cực tím ).
5
Mặc dù vậy, MCs là các nội độc tố trong tế bào vi khuẩn lam khỏe mạnh, sẽ được
thải vào môi trường khi các tế bào bị ly giải hoặc chết đi bên cạnh đó hiệu quả xử lý
của các phương pháp đó cũng không cao và việc sử dụng các phương pháp làm giết
chết tế bào đồng loạt như trên sẽ làm tế bào bị phân hủy với số lượng lớn gây ô nhiễm
môi trường, do đó các phương pháp ở trên hiện nay không còn được khuyến cáo sử
dụng [6; 21].
Các độc tố đi vào hệ thống xử lý nước như các hợp chất hòa tan trong nước thô và
trong các tế bào tảo lam. Vì vậy, hệ thống xử lý nước phải loại bỏ các tế bào tảo lam
sống mà không làm phá hủy tế bào cũng như loại bỏ độc tố của chúng từ nước thô. Do
đó, phương pháp sử dụng quần thể các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để phân hủy
độc tố MCs có hiệu quả và bền vững đang là phương pháp nghiên cứu mới đầy hứa
hẹn cho việc loại bỏ độc tố MCs mà không ảnh hưởng môi trường. Bằng cách sử dụng
độc tố MCs là nguồn N và C cho sinh trưởng đã có nhiều báo cáo công bố về việc tìm
ra được các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy độc tố MCs, như các chủng thuộc
chi Sphingomonas, Pseudomonas, Sphingosinicella, Sphingopyxis, Paucibacter và
Burkholderia. Trong đó, các chủng thuộc chi Pseudomonas và Sphingomonas đã được
chứng minh là chứa phức hệ đa enzyme có khả năng mở vòng độc tố MCs do đó
chúng có tiềm năng ứng dụng lớn trong việc phân hủy độc tố MCs [2; 14].
2.2. Lợi ích của đề tài:
- Góp phần nâng cao chất lượng nguồn nước sinh hoạt cung cấp cho dân cư ở Hà

Nội, bảo vệ sức khỏe con người thông qua phương pháp sinh học làm sạch độc tố
MCs trong nước.
- Bảo vệ môi trường và cảnh quan các hồ và thủy vực ở Hà Nội bị nhiễm
M.aeuroginosa.
- Áp dụng xử lý với mọi đối tượng bị nhiễm MCs bởi M.aeruginosa.
2.3. Điểm mới và tính sáng tạo của đề tài:
- Đây là đề tài đầu tiên sử dụng đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas flourescens
trong việc xử lý độc tố MCs do M.aeruginosa gây ra trong nước hồ Hoàn Kiếm.
- Đề xuất tạo màng sinh học từ P.fluorescens để xử lý độc tố MCs, hiệu quả cao và
tiết kiệm thời gian, công sức trong việc xử lý độc tố MCs.
- Lần đầu tiên đề xuất biện pháp làm sạch nguồn nước sinh hoạt thông qua việc áp
dụng việc sử dụng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens vào việc xử lý độc tố tảo lam -
MCs.
- Từ công trình nghiên cứu có thể áp dụng trên các khu vực có điều kiện tương tự,
đặc biệt là xử lý giảm thiểu lượng độc tố MCs trong nguồn nước sinh hoạt từ sông Đà
cung cấp cho thủ đô Hà Nội.
6
PHẦN III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT:
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
3.1.1.1. Vi tảo lam Microcystis aeruginosa và độc tố microcystins:
a) Vi tảo lam gây độc
Vi tảo lam là những cơ thể nhân sơ (procaryot), có khả năng quang hợp hiếu khí
(quang tự dưỡng vô cơ) và dùng H
2
O làm chất cho điện tử trong quá trình quang hợp.
Vi tảo lam chứa chlorophyll a và phycocyanin- phycobiliprotein. Một số loài có sắc tố
đỏ phycoerythrin.Chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu nâu.Màng liên kết với
phycobilisom. Đơn bào hoặc đa bào dạng sợi. Không di động hoặc di động bằng cách
trườn (gliding), một số loài có không bào khí (gas vesicles). Nhiều loại có dị tế bào

(heterocysts) và có khả năng cố định nitơ. Vi tảo lam có mặt ở khắp mọi nơi, trong
đất, trên đá, trong suối nước nóng, trong nước ngọt và nước mặn. Chúng có năng lực
chống chịu cao hơn so với thực vật đối với các điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, pH
thấp. Các hóa thạch có niên đại cổ nhất đều cho thấy dấu hiệu của vi tảo lam [3].
Vi tảo lam có khả năng hình thành một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó
nhiều chất có hoạt tính sinh học hoặc sinh hóa và một số đã được xác định là chất độc
mạnh (cyanotoxins). Các độc tố tảo lam được phân loại dựa vào đích tác động của
chúng đến cơ thể là: độc tố gan, chất độc thần kinh, cytotoxins, dermatotoxins và độc
tố kích thích. Dựa theo cấu trúc hóa học của họ, cyanotoxins rơi vào một số nhóm
chính: peptide, hợp chất dị vòng (alkaloid) hoặc các hợp chất lipit [11].
b) Vi tảo lam Microcystis
Thuộc bộ Chroococcales với các đặc điểm là các tế bào nhỏ, màu xanh lam sống
thành tập đoàn gồm hàng nghìn tế bào kích thước 2-3µm và ở mỗi tế bào đều có chứa
không bào khí giúp chúng nổi trên mặt nước để có thể thu nhận ánh sáng tốt trong quá
trình quang hợp. Microcystis phân bố khắp mọi nơi, gây ra hiện tượng “nở hoa” và
sinh các độc tố MCs. Trong các loại vi tảo lam sinh độc tố thì Microcystis xuất hiện
thường xuyên và phổ biến nhất, chúng dễ “nở hoa” khi môi trường có đầy đủ các yếu
tố: dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, tốc độ gió (gió nhẹ hoặc không có gió) và một số
yếu tố khác, tổ hợp các yếu tố này dễ tồn tại ở hồ thủy điện Hòa Bình, cũng như điều
kiện Hoàn Kiếm vào thời điểm đầu mùa hè (tháng 3,4,5), nên đó là thời điểm hồ xảy
ra “nở hoa” tảo lam dữ dội nhất.
Microcystis “nở hoa” không chỉ sinh ra độc tố có hại mà ảnh hưởng từ hiện tượng
“nở hoa” cũng rất lớn như: làm giảm đa dạng loài (trong đó ở hồ Hoàn Kiếm có nhiều
loài vi tảo quý hiếm); tăng độ đục; tỷ lệ bồi lắng tăng gây giảm tuổi thọ của hồ và làm
giảm lượng oxy hòa tan trong nước hồ cũng như nguồn nước bị nhiễm Mycrocystis.
7
Hình 3.1.1.a. Microcystis nhìn dưới kính hiển vi (x400) [2]
Hình 3.1.1.b. Tế bào Microcystis dưới kính hiển vi điện tử [2]
c) Độc tố microcystins.
Độc tố MCs thuộc nhóm độc tố gan (hepatotoxin), đã được phân lập từ nhiều chi

vi khuẩn lam, bao gồm Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Planktothrix,
Chroococcus và Nostoc. Trong đó phổ biến nhất là loài tảo lam Microcystis
aeruginosa do chúng có khả năng phân bố rộng và phát triển tốt triên nhiều kiểu khí
hậu khác nhau, do đó chúng trở thành mối đe dọa toàn cầu cho sức khỏe con người
[11]. Tên gọi microcystins (MCs) xuất phát từ việc hợp chất này được tách ra lần đầu
tiên từ loài tảo lam Microcystis aeruginosa.
Cấu trúc phân tử
Microcystin là peptide đơn vòng nhỏ với khối lượng phân tử khoảng 1000
Daltons, bao gồm 7 amino acid trong cấu trúc. Cấu trúc hóa học là vòng (-D-Ala1-
X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-Glu6-Mdha7) trong đó X và Z là các L-amino acid, D-
MeAsp là axit D-erytho-β-methylaspartic và Mdha là N-methyldehydroalanin. Adda
là axit (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic,
8
đây là cấu trúc duy nhất chỉ có trong nhóm các độc tố peptide dạng vòng của tảo lam
và cực kỳ quan trọng trong việc biểu hiện các hoạt tính sinh học của MCS [18].
Hình 3.1.1.2. Cấu trúc phân tử độc tố MC-LR [7]
1. D - Alanine
2. Leucine (X - có thể thay thế bởi các amino acid)
3. D - Methyl aspartic acid
4. Arginine (Z - có thể thay thế bởi các amino acid)
5. Adda
6. D - Glutamic acid
7. N- Methyl-dehydro-alanine
Các độc tố MCs khác nhau tạo thành thường do sự thay đổi các gốc amino acid ở
các vị trí 2; 3; 4 và 7 như hình trên. Trong khi ở các vị trí số 3 là D-erythro-β-
methylaspartic acid (D-MeAsp) và số 7 là N-methyldehydroalanine (Mdha) sự thay
đổi thường là có hay không sự methyl hóa, còn sự thay thế các L-acid amin ở vị trí
2(X) và 4(Z) là sự thay đổi chính và thường tạo ra các biến thể độc tố MCS phổ biến
nhất như trong bảng 3.1. dưới đây [12]. Và dựa vào thành phần các amino acid cấu
thành nên độc tố MCS thì chúng được chia thành hai loại kỵ nước vào không kỵ nước,

các độc tố MCs kỵ nước là dạng thường. Cho đến nay đã có hơn 90 biến thể khác
nhau của MCs được biết đến.
9
Bảng 3.1. Các amino acid cơ bản xuất hiện trong cấu trúc của microcystin
Tên
Amino acid vị
trí X
Amino acid vị trí
Z
Khối lượng phân
tử
Microcystin LA Leucine (L) Alanine (A) 910.06
Microcystin
YR
Tyrosine (Y) Arginine (R) 1045.19
Microcystin RR Arginine (R) Arginine (R) 1038.2
Microcystin LR Leucine (L) Arginine (R) 995.17
Độc tính của microcystins:
Ở cấp độ phân tử các độc tố MCs đã được chứng minh là có khả năng ức chế
protein photphatase nhóm 1 và 2A (PP1 và PP2A). Protein photphatase là enzyme xúc
tác cho việc loại các gốc photphoryl của serine hoặc threonine, sự ức chế các protein
phosphate có thể dẫn tới sự phosphoryl hóa quá mức các vi sợi, vi ống, sợi liên bào,
dẫn đến làm phân hủy bộ khung tế bào và phá hủy cấu trúc siêu vi gan. Sự co rút của
các tế bào gan so với các tế bào liền kề và các mao mạch dẫn đến chảy máu trong các
mô gan. Điều này dẫn đến kết quả cuối cùng là sự tổn thương cục bộ, mất chức năng
của các cơ quan và xuất huyết [15;16;18].
Hình 3.1.1.3. Quá trình ức chế photphatases P1 và 2A [18]
Sự tiếp xúc lâu dài với nồng độ MCs thấp trong nước uống là nhân tố gây ra ung
thư gan ở người. Các nghiên cứu cơ chế động học tế bào đã cho biết microcystin ảnh
hưởng lớn đến cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân, điều này giúp giải thích khả

năng kích thích gây ung thư của chúng. Các độc tố này gây ảnh hưởng xấu đến hai
loại enzyme là serin - photphatase và threonin - photphatase liên quan tới sự điều hòa
phát triển các tế bào nhân thật (Eukaryote), điều khiển sự hoạt động của tế bào động
thực vật trong quá trình phân chia, sinh trưởng, trao đổi chất, sao chép ADN và sự
biểu hiện các tính trạng có liên quan. Điều đó cho thấy microcystin có thể ảnh hưởng
10
đến các chức năng của tế bào nhân thật ở mức độ phân tử và từ đó có thể ảnh hưởng
tới các động vật thủy sinh sống trong môi trường có sự tiếp xúc với độc tố này [2].
Mặc dù chưa có báo cáo về trường hợp tử vong do uống phải Microcystins nhưng
đã có báo cáo về một loạt ảnh hưởng sức khỏe sau khi tiếp xúc với độc tố trong nước
uống hoặc tiếp xúc do bơi lội. Tổn thương gan là dấu hiệu phổ biến nhất của con
người khi tiếp xúc với MCs. Năm 1999, Tổ Trức Y Tế Thế Giới (WHO) đã nghiên
cứu và xem xét toàn diện về lĩnh vực này. “Khi so sánh mối nguy tới sức khỏe của
MCs với các độc tố liên quan tới nước khác, ta có thể thấy rằng MCs đã gây ra nhiều
vụ nhiễm độc và gây tử vong nhiều nhất đối với vật nuôi và động vật hoang dã, nhưng
chưa có trường hợp tử vong của con người qua đường uống đã được ghi nhận".
Vào tháng 2 năm 1996, 116 trong 131 bệnh nhân ở Cauruaru-Brazil xảy ra tình
trạng rối loạn thị giác, buồn nôn, nôn mửa, yếu cơ và phải lọc máu thường xuyên.
100 người trong số những người đó đã bị suy gan cấp tính và 52 người cuối cùng đã
chết do các triệu chứng mà giờ ta gọi là “Hội chứng Caruaru ” . Nguyên nhân của hội
chứng này được xác định là do MCs từ các hồ chứa không được xử lí lọc, khử trùng.
MCs được tìm thấy trong máu và gan bệnh nhân .
Các nghiên cứu đã đưa ra giá trị LD50 đối với loại độc tố MCs phổ biến MC-LR
là 50µg trên một kg cơ thể chuột, giá trị này đối với độc tố MC-RR là 600µg. Tổ chức
y tế thế giới (WHO) đã đưa ra nồng độ chấp nhận được tối đa của độc tố MC-LR
trong nước uống là 1µg/L [13;20].
3.1.2.1. Vi khuẩn Pseudomonas và khả năng phân hủy độc tố MCs
a) Vi khuẩn Pseudomonas:
Pseudomonas là những vi khuẩn dị dưỡng (VKDD), Gram âm, hiếu khí, hình
que, không sinh bào tử và có khả năng di động nhờ các lông roi. Chúng có khả năng

tiết các sắc tố ra ngoài môi trường, như sắc tố huỳnh quang màu vàng-xanh
pyoverdine, sắc tố lục pyocyanin, sắc tố thioquinolobactin.
Hình 3.1.2.1. Tế bào vi khuẩn Pseudomonas [23]
Các loài thuộc chi Pseudomonas có sự phân bố rộng rãi ở đất, nước, trong mô
động vật và thực vật, vì vậy chi Pseudomonas có lịch sử nghiên cứu từ rất sớm và cho
đến nay chúng ta đã có rất nhiều thông tin về đặc điểm loài này cũng như về hệ gen
11
của chúng. Các loài thuộc chi Pseudomonas đã được tập trung nghiên cứu nhiều bao
gồm: nhóm gây bệnh ở người, ví dụ như P. aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh nổi
tiếng; gây bệnh thực vật như P. syringae; nhóm vi khuẩn đất như P. putida và nhóm
thúc đẩy sinh trưởng ở thực vật, P. fluorescens [21].
Một số loài thuộc chi Pseudomonas là những sinh vật hiếu khí chịu khí, trong điều
kiện không có O
2
chúng có thể sử dụng NO
3
-
là chất nhận điện tử, vì vậy chúng có thể
sống ở dưới đáy ao hồ nơi có nồng độ O
2
thấp và lượng chất mùn hữu cơ cao. Nhiều
loài trong đó cũng được chứng minh là có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản, chúng có thể
sinh trưởng tốt trong môi trường muối khoáng có bổ sung thêm đa dạng nguồn
cacbon. Đã có nhiều nghiên cứu khai thác được khảnăng phân hủy hoàn toàn hoặc
một phần của loài P. fluorescens đối với các chất ô nhiễm như styrene, TNT và
polycyclic aromatic hydrocarbons [27].
b) Tính an toàn của Pseudomonas flourescens
* Đối với người:
Nhiều tài liệu khoa học trên thế giới đã khẳng định P. fluorescens là vi khuẩn rất
có giá trị trong công nghệ nông nghiệp. Chúng phân giải một số chất độc và các chất

ô nhiễm trong đó có styrene, polycyclic aromatic hydrocarbons và TNT. Chúng cũng
bảo vệ cây khỏi bị nhiễm trùng do các mầm bệnh bằng cách tiết ra các chất để chuyển
hóa thành thuốc kháng sinh và hydrogen cyanide để tiêu diệt vi khuẩn và nấm khác.
Chúng cũng tiêu diệt các mầm bệnh bằng cách loại trừ cạnh tranh (do sự phát triển
nhanh chóng của chúng). Nhiều nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết rằng P. fluorescens
có thể là một lựa chọn tốt để dung làm thuốc trừ sâu tổng hợp vì độc tính của chúng
ức chế ấu trùng và nhộng của muỗi, hai mối quan tâm chính trong kinh doanh nông
nghiệp.
Chúng cũng rất hữu ích cho con người. Các loại kháng sinh giúp bảo vệ rễ cây
cũng được sử dụng để điều trị nhiễm trùng ở người. Tác dụng của mupirocin được sử
dụng trong việc điều trị một căn bệnh nguy hiểm do Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus gây ra, điều mà số ít kháng sinh có thể làm được. Bên cạnh đó
chúng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Chúng phân giải protein và tạo
hương vị chua . Điều mà tạo nên thương hiệu.của nhiều hãng sữa.
Chúng chỉ được biết đến là tác nhân của sự suy giảm miễn dịch như bệnh nhân
ung thư và những người có bệnh suy giảm miễn dịch như lupus. Tất cả chỉ là một tỉ lệ
nhỏ và cả trong sự hư hỏng thực phẩm. Chúng có thể phát triển thuận lợi ở nhiệt độ
25-35 độ C và cũng có thể duy trì ở 4 độ C. Vậy vi khuẩn này cũng thuộc trong số
những tác nhân gây hỏng thức ăn trong tủ lạnh [23; 24; 26; 28; 29; 31].
* Đối với động vật thủy sinh (cá):
12
Các tài liệu chuyên ngành về vi khuẩn Pseudomonas flourescens cũng đã khẳng
định sự an toàn của vi khuẩn này đối với động vật thủy sinh (cá). [29]
* Con đường phân giải MCs:
Chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy độc tố MCs đầu tiên được công bố là phân
lập từ nước ở Murrumbidgee River, Australia bởi Jones và cộng sự, đó là chủng
Pseudomonas sp. đã được xác định là có khả năng phân hủy hoàn toàn MC-LR và
MC-RR trong 3 ngày.
Sau đó, tại Nhật Bản, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu và đưa ra báo cáo về
khả năng phân hủy MCs của vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. Năm 1996, Bourne và

cộng sự đã phân loại lại chủng Psedomonas sp.
Jones và cộng sự cũng đã xác định được sự phân hủy MCs bởi phức hệ đa enzyme
và được chia ra thành 3 giai đoạn. Sau đó vào năm 2001 Bourne và cộng sự đã mô tả
cụ thể con đường phân hủy đó [4;9].
Phức hợp đa enzyme phân hủy MCs bao gồm 4 enzyme chính:
− Microcystinase: một metalloprotease (MlrA)
− Một serine peptidase 2 (MlrB)
− Một metalloprotease 3 (MlrC)
− MlrD - một protein vận chuyển
Các enzyme trên được mã hóa bởi đoạn trình tự gen kích thước 5,8 Kb, bao gồm
các đoạn gen mlrA, mlrB, mlrC vàmlrD. Trong đó enzyme MlrA được mã hóa bởi gen
mlrA, xúc tác cho việc thủy phân và mở vòng độc tố ở vị trí mạch peptide Adda-Arg,
việc mở vòng này làm giảm đến 160 lần độc tính của độc tố MCs nên đây là enzyme
có vai trò chủ đạo trong phức hệ đa enzyme. Sản phẩm phân cắt của enzyme này đối
với độc tố MC-LR là hợp chất mạch thẳng (NH
2
-Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu-MeAsp-
Arg-OH).Enzyme MlrB mã hóa bởi gen mlrB xúc tác cho việc thủy phân liên kết
peptide Ala-Leu của MC-LR mạch thẳng để tạo ra các tetrapeptide (NH
2
-Adda-Glu-
Mdha-Ala-OH) và tripeptide (NH
2
-Leu-MeAsp-Arg-OH). Sự phân cắt thành công khi
enzyme MlrC mã hóa bởi gen mlrC xúc tác thủy phân thành các peptide nhỏ hơn và
các amino acid [5].
13
Hình 3.1.2.2. Con đường phân hủy MC-LR của vi khuẩn di dưỡng Pseudomonas
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phân lập vi khuẩn dị dưỡng từ nước hồ nở hoa:

Các mẫu nuôi được thực hiện trong phòng thí nghiệm: nước mẫu từ hồ Hoàn
Kiếm thu được trong vùng “nở hoa” của vi tảo lam Microcystis ngay lập tức được lọc
qua lưới 20µm, sau đó tiếp tục được lọc qua phin lọc. Tiến trình lọc nhằm loại bỏ
phần lớn động vật nguyên sinh.
Lấy 1ml nước hồ pha loãng ở các nồng độ pha loãng thích hợp. Nhỏ 1ml dịch pha
loãng trên môi trường dịch thể NA có bổ sung 10µg/l microcystins. Sau 24 giờ nhỏ
100µl dịch cấy trang đều trên mặt thạch. Sau 20-24giờ, quan sát các khuẩn lạc riêng
rẽ. Tách khuẩn lạc, quá trình lặp lại nhiều lần cho đến khi thu được các khuẩn lạc
thuần khiết.
Nuôi giữ chủng VKDD này trên môi trường thạch nghiêng, bảo quản ở nhiệt độ
4°C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Đếm số lượng tế bào (số khuẩn lạc trên đĩa thạch):
Tế bào vi sinh vật sống là tế bào có khả năng sinh trưởng để tạo thành một quần
thể. Trên bề mặt môi trường đặc, quần thể này tạo những đám có hình dạng, màu sắc
riêng biệt được gọi là khuẩn lạc. Từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch suy ra số tế bào
sống có trong mẫu đã cấy trên mặt thạch.
Cách tiến hành: Để tách rời các tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc mạnh dịch
đã pha loãng. Cấy trải dịch pha loãng trên đĩa thạch LB. Sau đó đem nuôi cấy ở nhiệt
14
độ 28
o
C trong 24 - 48 giờ và đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa. Chú ý cần phân biệt các
khuẩn lạc lạ hình thành do tạp nhiễm và không tính chúng.
Số lượng tế bào được tính theo công thức:
Số lượng tế bào được tính theo công thức:
a: số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng độ pha loãng.
v: thể tích dịch pha loãng được cấy trên mặt đĩa thạch.
k: độ pha loãng của dịch cấy.
Ở đây đơn vị tính là CFU/ml hoặc CFU/g, nghĩa là số đơn vị hình thành khuẩn lạc
trong 1 ml đơn vị thể tích hoặc gam chế phẩm

3.2.3. Phân tích giải trình tự 16S rADN:
Ở công đoạn này, chúng em đã liên hệ với phòng thí nghiệm “First base of
Singapore” để nhờ phân tích giải trình tự 16S rADN của vi khuẩn, từ đó có thể xác
định chính xác loài vi khuẩn được sử dụng là Pseudomonas flourescens.
• Tách chiết ADN [55]
• Nhân đoạn gen bằng phản ứng PCR [36]
• Xác định trình tự gen bằng máy tự động (ABI Prism 3100 Avant)
• Xây dựng cây phát sinh loài: của loài nghiên cứu với các loài tương ứng được
công bố trong ngân hàng genbank NCBI, bằng chương trình ClustalW và Mega
5.10.
3.2.4. Nghiên cứu xây dựng mô hình phân hủy độc tố microcystin
Mục đích của thí nghiệm: Xác định tốc độ phân hủy độc tố microcystin của các
VKDD trong chế phẩm trong bể chứa vi khuẩn dạng tự do và bể có gắn màng sinh
học.
3.2.4.1. Xử lý trực tiếp (vi khuẩn dạng tự do):
Nguồn nước sử dụng trong nghiên cứu: nước hồ Hoàn Kiếm
Bể nghiên cứu bằng nhựa kích thước: dài × rộng × cao = 60 × 20 ×20 cm. Lấy 20
lít nước, bổ sung microcystin để được điều kiện nghiên cứu là 20µg/l. Bổ sung dịch
thể chế phẩm sinh học đã được hoạt hóa để được nồng độ 10
8
FCU/ml.
Theo dõi hàm lượng microcystin trong bể vào các thời gian: 0; 1; 3; 5 và 6 ngày
thí nghiệm. Nhiệt độ thí nghiệm: 30
o
C. Sử dụng chế độ sục khí tạo sự đồng đều trong
suốt thời gian thí nghiệm.
3.2.4.2. Xử lý bằng bể có gắn màng sinh học:
15
• Sự hình thành màng sinh học trên vật liệu dính bám
Để lựa chọn vật liệu tốt cho xử lý bể gắn màng sinh học, các bề mặt phi sinh vật

được sử dụng từ vật liệu PS (polystyrene), PVC và thủy tinh (nhóm chọn PS do vật
liệu này dễ tạo màng hơn và an toàn hơn PVC) cho xác định sự hình thành màng sinh
học. Tấm nhựa PS được cắt thành các bản có kích thước 1 × 2 cm. Bản nhựa PS được
làm sạch bằng ethanol 70%, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng. Đặt các bản này
vào đĩa Petri vô trùng và sấy ở 40°C cho đến khô. Dịch nuôi VKDD bổ sung vào các
các đĩa, nuôi cấy tĩnh ở 28-30
o
C, trong 24, 48 và 72 giờ. Sự hình thành màng sinh học
trên các bản vật liệu được kiểm tra bằng cách sử dụng dung dịch tinh thể tím 1%. Thu
các tế bào nhuộm màu trên bề mặt các bản vật liệu và đo quang phổ ở bước sóng
600nm. Cách tính như sau:
Trong đó:
Am là giá trị OD
600
mẫu bản vật liệu thu được sau nhuộm.
Ac là giá trị OD
600
của mẫu dịch VKDD trên đĩa Petri cùng thời điểm nuôi cấy
Khả năng hình thành màng sinh học được phân lớp bằng cách sử dụng tiêu chuẩn
của Stepanovic, Cirkovic, Ranin và Svabic-Vlahovic (2004) [20] như sau:
A ≤ Ac - không hình thành màng sinh học
Ac < A ≤ (2×Ac) - hình thành màng sinh học yếu
(2×Ac) < A ≤ (4×Ac) - hình thành màng sinh học vừa phải
(4×Ac) < A - hình thành màng sinh học mạnh
• Xử lý bằng bể có gắn màng sinh học
Nguồn nước sử dụng trong nghiên cứu: nước hồ Hoàn Kiếm. Bể nghiên cứu bằng
nhựa kích thước: dài × rộng × cao = 60 × 20 ×20 cm. Lấy 20 lít nước, bổ sung
microcystin để được điều kiện nghiên cứu là 20µg/l.
Màng sinh học được cố định trên vật liệu dính bám loại sợi polystyrene (PS)
Theo dõi hàm lượng microcystin trong bể theo thời gian: 0; 1; 3; 5 và 6 ngày thí

nghiệm. Nhiệt độ thí nghiệm 30
o
C. Sử dụng chế độ sục khí tạo sự đồng đều trong suốt
thời gian thí nghiệm.
16
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Sàng lọc vi tảo lam thuộc chi Microcystis trong mẫu tự nhiên
Trong nghiên cứu này chúng em dựa trên đặc điểm đặc trưng của M.
aeruginosa có không bào khí (gas vacuoles) nên chúng thường nổi trên bề mặt. Do
vậy, chúng em tiến hành thu thập mẫu từ tự nhiên, ly tâm ở 9.000 vòng/15 phút. Sau
đó mẫu được quan sát trên kính Zeiss độ phóng đại 400 lần.
Kết quả thể hiện hình 4.1.1a và 4.1.1b:
Hình 4.1.1a. Hình dạng tế bào chủng
Microcystis sp.
Dạng tập đoàn, tế bào hình cầu màu
xanh lam với nhiều không bào khí,
đường kính tế bào 3 - 6μm, bao nhầy
dày không màu.
Hình 4.1.1b. Hình dạng tế bào chủng
Microcystis sp.
Tập đoàn với tế bào hình cầu, tế bào có
màu xanh nhạt, đường kính tế bào 3-
7μm, tập hợp thành từng tập đoàn nhỏ có
bao nhầy rõ rệt.
Ở hình 4.1.1a và 4.1.1b chúng em nhận thấy những đặc điểm hình thái của các
mẫu thu thập được có nhiều điểm tương đồng với lý thuyết mô tả về chúng, như tế
bào đều dạng hình cầu, tập đoàn với bao nhầy rõ rệt, tế bào hình cầu với đường kính 2
- 5μm, với nhiều không bào khí bên trong, đường kính tế bào 3 - 7µm. Miêu tả trên
của chúng em cũng phù hợp với những miêu tả của Watanabe [13]. Các mẫu chúng
em ký hiệu lần lượt là MC01 và MC02.

Tiếp theo, để định danh mẫu thu được có phải M.aeruginosa không. Chúng em
tiến hành phân tích kết quả giải trình tự 16S rADN.
Nghiên cứu thu nhận sinh khối và quy trình đông khô sinh khối vi tảo lam độc
M.aeruginosa từ hồ Hoàn Kiếm với lượng lớn:
Trong nghiên cứu này, chúng em nhằm mục đích, thu thập một lượng lớn sinh
khối từ tự nhiên, đồng nghĩa nó cung cấp lượng lớn hỗn hợp các MCS tự nhiên có mặt
trong sinh khối. Chúng em tiến hành các bước nghiên cứu sau:
17
Mẫu vi tảo lam được thu vào những ngày nắng, nóng của mùa hè trong năm
Hình 4.1.2. Thu thập mẫu tại Hồ Hoàn Kiếm
Quy trình đông khô
Dựa trên quy trình đông khô sinh khối xây dựng hình 3.22. Trong tháng 4 và tháng 5
thu được một lượng lớn 200 gam sinh khối khô vi tảo lam Microcystis aeruginosa .
Lượng sinh khối này chúng em sẽ dùng làm cơ chất cho tất cả các nghiên cứu tiếp
theo.
Thu mẫu bằng lưới No 75 (1)

Ly tâm (7000/20 phút) (2)

Thu sinh khối vi tảo lam nổi (Microcystis aeruginosa chiếm >90%) (3)

Kiểm tra hình thái ở vật kính (×40) của kính hiển vi phản pha Zeiss (4)

Sơ bộ xác định vi tảo lam Microcystis aeruginosa (5)

Rửa sinh khối (muối sinh lý 1‰) (6)

Đông khô chân không sinh khối vi tảo lam ở -83
o
C tới khi khô (7)


Bảo quản trong túi nilon (8)

18
Hình 4.1.3. Sinh khối vi tảo lam Microcystis aeruginosa đông khô
4.2. Phân loại VKDD Pseudomonas SP8
4.2.1. Đặc điểm hình thái học:
Trong nghiên cứu này, chúng em quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch, có
bổ sung MCs thô, nhuộm Gram. Mô tả hình dạng tế bào được quan sát dưới kính hiển
vi điện điện tử quét ở độ phóng đại 1500 lần. Chúng em nhận thấy VKDD SP8 Gram-
âm, có tiên mao, có khả năng tiết sắc tố ra ngoài môi trường nuôi và phát quang dưới
tia cực tím
Hình 4.2.1a. Hình thái khuẩn lạc
VKDD SP8 (24h nuôi cấy)
Hình 4.2.1b. Tế bào VKDD SP8
quan sát dưới kính hiển vi điện tử
quét (SEM)
Ở hình 4.2.1b chụp dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 15000
lần cho thấy VKDD SP8 có tế bào hình trụ, kích thước khoảng 1-2 µm, các tế bào
nằm trong lớp màng nhày. Do vậy, khó quan sát được tiên mao.
19
Kết luận: Dựa trên các đặc điểm hình thái và đồng thời dựa vào các khóa phân
loại khác chúng em sơ bộ phân loại VKDD SP8 thuộc chi Pseudomonas được ký hiệu
là Pseudomonas SP8. Kết quả này chưa đủ thông tin để định danh chính xác chủng
VKDD SP8 thuộc loài nào của chi Pseudomonas. Thí nghiệm tiếp theo chúng em
cùng các cán bộ hướng dẫn tiến hành phân tích giải trình tự 16S rADN.
4.2.2. Phân tích giải trình tự 16S rADN:
Nhờ sự giúp đỡ của phòng thí nghiệm “First base of Singapore” trong việc phân
tích ADN, chúng em đã nhận được kết quả giải trình tự 16S rADN của VKDD SP8.
VKDD Pseudomonas SP8 có mối

quan hệ gần gũi, có độ tương đồng
đến 99% với trình tự gen của loài
Pseudomonas fluorescens
KC773765 và 14 loài khác đã được
đăng ký trong ngân hàng gen quốc
tế.
Hình 4.2.2. Sản phẩm PCR của
VKDD Pseudomonas SP8
Khoảng cách tiến hóa được tính toán để thiết lập cơ sở dữ liệu bao gồm trình tự
của VKDD Pseudomonas SP8 và các trình tự khác của nhóm Pseudomonas, thuộc
phân lớp gamma của Proteobacteria. Cây phả hệ đã được xây dựng lại trên cơ sở các
số liệu ma trận về khoảng cách thu được như hình 3.4, neighbour joining thước đo =
0,0005 Knor trong trình tự nucleotid. Các giá trị hiển thị tại các nhánh cây là kết quả
phân tích boostrap với độ lặp lại 1000 lần. Giá trị bootstrap cao trên nhánh giữa
VKDD và Pseudomonas fluorescens KC773765 (96%) dùng hỗ trợ đánh giá cao mối
quan hệ gần gũi giữa chúng.
Kết luận: chúng em dựa vào các kết quả hình thái học và phân tích giải trình tự rADN
16S và đồng dựa vào các khóa phân loại khác. Định danh VKDD SP8 thuộc loài
Pseudomonas fluorescens, với vị trí phân loại khoa học như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Pseudomonadales
Họ: Pseudomonadaceae
Chi: Pseudomonas
Loài: Pseudomonas fluorescens
Trong quá trình tìm hiểu và tham khảo các nguồn tài liệu, các kết quả nghiên cứu
của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Chúng em nhận thấy các loài thuộc chi
20
Pseudomonas thường biết đến là các loài gây bệnh cho con người, động vật và thực

vật như: Pseudomonas aeruginosa trực khuẩn gây mủ xanh ở người. Pseudomonas
syringae gây bệnh đốm dầu ở thực vật. Tuy nhiên, loài Pseudomonas fluorescens
được chứng minh là không độc, loài này còn được biết đến với khả năng kháng lại
một số loài nấm gây bệnh ở lá và rễ cây và thúc đẩy sinh trưởng thực vật. Ngoài ra,
đã có nhiều nghiên cứu về Pseudomonas fluorescens có khả năng phân hủy các hợp
chất mạch vòng thơm khó phân hủy như naphthalene [23] và phân hủy độc tố MCs
của vi tảo lam M.aeruginosa. [31]
4.2.3. Thu sinh khối VKDD Pseudomonas fluorescens SP8:
Chúng em tiến hành lên men thu sinh khối Pseudomonas fluorescens SP8 trong
thiết bị lên men 10 lít.
VKDD P. fluorescens SP8 được nuôi cấy lắc trong bình tam giác trên môi trường
LB, sau 24 giờ ở pha sinh trưởng, giống được cấy vào thiết bị lên men 10 lít với tỷ lệ
cấy giống khác nhau (2, 5, 7, 10 và 15%) được nuôi cấy trong điều kiện thích hợp,
thay đổi tốc độ khuấy trộn (50, 100, 150, 200 và 250 vòng/phút), lượng khí cung cấp
khác nhau (0,6; 0,8; 1; 1,2 và 1,4 lít khí/lít dịch/phút) và các thời gian khác nhau (12,
24, 36, 48, 60 và 72 giờ). Kết quả thể hiện ở hình 3.7.
VKDD P. fluorescens SP8, sinh trưởng tăng dần theo các thời gian lên men, đạt
cao nhất tại 36 giờ với OD là 1,89 và giảm dần ở các giờ nuôi cấy tiếp theo, đến 72
giờ OD giảm chỉ còn 1,55 (hình 3.6). Tốc độ khuấy có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng
của vi khuẩn P. fluorescens SP8, với tốc độ khuấy 200 vòng/phút OD sinh trưởng đạt
cao nhất 1,87.

Hình 4.2.3. Điều kiện lên men thích hợp của VKDD P. fluorescens SP8 trong thiết
bị lên men 10 lít
Sinh trưởng cũng gia tăng cùng với lưu lượng khí đưa vào, OD sinh trưởng đạt
1,92 tại lưu lượng khí đưa vào là 1 lít khi/lít dịch/phút và bắt đầu giảm khi lưu lượng
khí tăng tới 1,4 lít khi/lít dịch/phút còn 1,72. Như vậy, tốc độ khuấy giúp cho môi
trường được đảo trộn và khí phân tán đều vào môi trường tăng tiếp xúc bề mặt của vi
khuẩn và làm tăng khả năng hấp thụ oxy. Tỷ lệ cấy giống thích hợp là 5-7% với OD
đạt 1,81 đến 1,83.

Dịch lên men ly tâm thu sinh khối, đông khô tạo thành một “bánh” dạng rắn chứa
2-4% nước. Sau đó nghiền, bột VKDD được trộn với chất mang là cám đã khử trùng,
21
đóng gói và bảo quản ở nhiệt độ 4
o
C và độ ẩm kiểm soát chặt chẽ để có được nồng độ
vi sinh vật mong muốn (10
8
) và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.3. Mô hình xử lý độc tố microcystin trong phòng thí nghiệm
4.3.1. Xử lý trực tiếp (vi khuẩn dạng tự do)
Chế phẩm P. fluorescens SP8 được hoạt hóa trong môi trường 1/10 LB, nhiệt độ
28-30
o
C, trong 36 giờ. Giống VKDD ban đầu được bổ sung (1×10
8
tế bào/m
2
) vào bể
dung tích 25 lít chứa 20 lít nước hồ Hoàn Kiếm với nồng độ microcystin 20µg/l. Sự
phân hủy sinh học MCS ở nhiệt độ 30
o
C. Sau 2 ngày, thu mẫu một lần và xác định
nồng độ microcystin còn lại trong bể. Kết quả thu được hình 3.12.
Từ hình 3.12 cho thấy, VKDD P.fluorescens SP8 bổ sung vào bể ở dạng tự do
trong môi trường, tốc độ phân hủy sinh học của chúng trong 5 ngày làm giảm lượng
microcystin từ 20 µg/l xuống còn dưới 1 µg/l. Ở ngày thứ 3, hàm lượng microcystin
trong mẫu nghiên cứu còn 6,54 µg/l.
Hình 4.3.1. Phân
hủy sinh học

microcystin của
VKDD P.
fluorescens SP8 ở
dạng tự do
VKDD P.fluorescens SP8 là loài có tiêm mao, nên sự hình thành màng có thể
giúp cho vi khuẩn di chuyển tốt hơn đồng thời tạo nên các tương tác giữa bề mặt và tế
bào. Đồng thời việc hình thành màng giúp cho VKDD trao đổi dinh dưỡng và chuyển
hóa chất hiệu quả hơn trong môi trường thể tích lớn hoặc đáp ứng với những tác động
của môi trường sống như nguồn dinh dưỡng và oxy. Trong nghiên cứu tiếp theo, ứng
dụng màng sinh học trong xử lý nước nhiễm độc tố microcystin.
Khả năng phân hủy của VKDD P.fluorescens SP8 trong bể khi xử lý trực tiếp có
sự tương đồng với VKDD Sphingomonas S1 theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoài
Hà và cộng sự [2].
4.3.2. Xử lý bằng bể có gắn màng sinh học
Các chủng vi sinh vật trong tự nhiên ít khi tồn tại riêng rẽ mà thường hình thành
tập hợp quần xã vi sinh vật với một loạt các hoạt động chức năng sinh lý và sinh hóa.
Sự tạo thành màng sinh vật diễn ra tại bề mặt rắn tiếp xúc với môi trường chất lỏng.
Trong nghiên cứu xây dựng mô hình, nhóm nghiên cứu sử dụng vật liệu PS cho cố
định màng sinh học của VKDD.
Mô tả chi tiết bể xử lý:
22
Bể xử lý màng sinh học bao gồm máy sục khí, phin lọc khí kích thước màng 0,22
µm, một bể chứa nhựa có kích thước 60×20×20 cm. Khi hoạt động, màng sinh học
hình trụ/hộp chữ nhật đã được đặt tại trung tâm của bể chứa và một hệ thống màng PS
đặt theo chiều thẳng đứng xung quang bể, một đế tản khí bên dưới (hình 3.14). Màng
sinh học trong đó các tế bào VKDD được cố định, có chiều dài 20-30 cm và chiều cao
10 cm. Theo mặt cắt ngang, có nhiều màng xếp song song khoảng cách 3 mm tạo diện
tích bề mặt lớn cho thành màng sinh học. Không khí được cung cấp liên tục qua
đường ống dẫn khí đến đế tản khí/quả sục khí ở dưới bể thông qua một phin lọc vô
trùng có kích thước 0,22 µm.

Hình 4.3.2. Mô hình bể xử lý gắn màng sinh học
Chú thích:
1- Lỗ thông khí 2- Phin lọc khí 3- Máy sục khí
4- Đế tản khí/quả sủi 5- Màng sinh học PS trụ/hộp chữ nhật
6- Màng sinh học PS 7- Bể chứa nhựa
Hình 4.3.3. Hình ảnh thực tế bể xử lý gắn màng sinh học.
Cố định màng sinh học:
Chế phẩm P. fluorescens SP8 được hoạt hóa trong môi trường dịch thể 1/10 LB,
lắc 200 vòng/phút, và 30°C. Sau 24 giờ, dịch nuôi cấy VKDD được đổ/phun vào
23
trong và lên xung quanh màng trong bể chứa, các tế bào bắt đầu hình thành màng sinh
học trên bề mặt của màng PS ở 30°C trong 24 giờ.
Sau khi màng sinh học được hình thành, màng được rửa bằng 10 lít nước hồ để
loại bỏ các tế bào bám dính lỏng lẻo và mở rộng ra môi trường nuôi cấy. Nước hồ
Hoàn Kiếm với nồng độ microcystin 20 µg/l được bổ sung vào bể xử lý.
Bể xử lý đặt ở nhiệt độ 28-30
o
C cho quá trình phân hủy sinh học được diễn ra.
Không khí sạch được cung cấp liên tục thông qua phin lọc kích thước 0,22 µm vào
trong thùng chứa vi sinh.
Sự tuần hoàn không khí qua đế tản khí/quả sục khí. Sau 1 ngày, mẫu được lấy ra
và xác định hàm lượng microcystin.
Kết quả thể hiện trên hình 4.3.4.
Ở hình 4.3.4 cho thấy cùng nồng độ microcystin (20 µg/l), điều kiện nhiệt độ xử
lý như nhau nhưng xử lý bằng màng sinh học VKDD P. fluorescens SP8 cho hiệu quả
cao hơn so với xử lý bằng VKDD dạng tự do.
Chỉ sau 3 ngày nồng độ microcystin đã giảm xuống chỉ còn 5,2% tương ứng với
1,04 µg/l microcystin. Đến ngày thứ 4 không thấy sự có mặt của microcystin trong
mẫu nước nghiên cứu.
Hình 4.3.4.

Phân hủy sinh
học microcystin
bằng màng sinh
học VKDD P.
fluorescens SP8
Tốc độ xử lý của hệ thống màng sinh học nhanh hơn so với xử lý trực tiếp bằng
VKDD dạng tự do 1-2 ngày. So với việc sử dụng các VKDD trôi nổi trong nước để
xử lý nước thì việc xử lý nước bằng màng VKDD mang lại nhiều lợi ích đáng kể:
- Một là, số lượng các VKDD trong màng cao hơn nhiều, tạo điều kiện xử lý tối
đa nguồn nước;
- Hai là, chúng ta bỏ qua được giai đoạn loại bỏ VKDD khỏi môi trường sau khi
xử lý nước.
24
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. Kết luận:
- Đề tài đã chứng minh được khả năng xử lý độc tố MCs của vi khuẩn Pseudomonas
flourescens.
- Bước đầu xây dựng được quy trình xử dụng màng sinh học từ P.flourescens để xử lý
độc tố MCs trong các môi trường có nhiễm độc tố ở hồ Hoàn Kiếm
- Đã so sánh đối chiếu hiệu quả sử dụng của hai phương pháp sử dụng trong nghiên
cứu và cho thấy hiệu quả của phương pháp xử lý bằng màng sinh học cao hơn so với
phương pháp xử lý bằng vi khuẩn tự do.
- Đề tài đã đưa ra hướng nghiên cứu, xử lý tiếp theo đối với đối tượng sông Đà-
nguồn nước sinh hoạt của người dân cũng như các hồ có tình trạng tương tự áp dụng
phương pháp sử dụng trong việc xử lý độc tố trong hồ Hoàn Kiếm
- Bên cạnh đó chứng minh được tính an toàn đối với động vật thủy sinh của chế phẩm
bằng thực nghiệm và với động vật, con người nói chung qua tài liệu tham khảo. Từ đó
có thể sử dụng trực tiếp phương pháp xử lý của đề tài để áp dụng vào thực tế
5.2. Kiến nghị:
- Do điều kiện thời gian còn hạn chế nên đề tài mới chỉ dừng lại ở một loài vi khuẩn

P.flourescens trong việc xử lý độc tố MCs có trong nước hồ Hoàn Kiếm.
- Đề tài có thể được mở rộng để xử lý các nguồn nước có nhiễm độc tố MCs do
Mycrocystis aeruginosa gây ra, như nước sông Đà cung cấp cho dân cư thủ đô Hà Nội
hiện nay.
- Để xử lý làm sạch MCs có nhiễm trong nước sông Đà cấp cho thủ đô Hà Nội và các
vùng khác, chúng em mong muốn các ban ngành có ý kiến chỉ đạo việc xây dựng một
hồ chứa nước sông Đà để xử lý độc tố MCs trước khi cung cấp cho các nhà máy nước
để nước sinh hoạt đưa đến từng hộ dân không còn nhiễm mycrocystins, đảm bảo sức
khỏe cộng đồng và giảm nguy cơ gây ung thư.
25

×