nghiên cứu chiết tách kaempferol từ lá chè xanh việt nam

Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
PHẦN 1
LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Tuy có diện tích trồng chè xanh rất lớn, chất lượng vào loại tốt nhất
thế giới nhưng nước ta chỉ chú trọng vào việc sử dụng làm đồ uống mà bỏ
qua Kaempferol, một hoạt chất quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh
ung thư – căn bệnh nan y của thế giới.
Sau khi được học xong bài tách chiết các chất hữu cơ, cùng với các tư
liệu mà các thầy cô giáo cung cấp, chúng em thấy việc tách Kaempferol là
không khó nên chúng em quyết định thực hiện ý tưởng này.
Mục đích đề tài của chúng em là chiết tách kaempferol từ lá chè xanh
nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có trong nước, góp phần
giảm bớt giá thành thuốc chữa ung thư – thường có giá rất cao. Đồng thời
nếu thành công và ứng dụng trong thực tế chúng ta còn có thể chủ động
nguồn nguyên liệu trong nước mà không phụ thuộc vào nước ngoài.
Từ những lý do trên, nhóm chúng em đã chọn đề tài: " NGHIÊN CỨU
CHIẾT TÁCH KAEMPFEROL TỪ LÁ CHÈ VIỆT NAM"
1
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
PHẦN 2
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về đề tài
Thực trạng bệnh ung thư: Theo thông tin từ Bộ Y tế Việt Nam và Tổ
chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000
-200.000 người mắc bệnh ung thư mới và khoảng 75.000 - 100.000 người tử
vong vì căn bệnh này. Ung thư hiện nay đang là nguyên nhân thứ hai gây tử
vong ở Việt Nam và thực sự là mối quan tâm của cả quốc gia.
Kaempferol là một trong những dược chất được các nhà nghiên cứu
trên thế giới và Việt Nam nghiên cứu trong việc điều trị và phòng tránh
nhiều bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư khoang
miệng…

Qua nhiều nguồn tin điện tử và sách báo, chúng em được biết rằng ở
nước ta có nhiều loài cây có chứa Kaempferol như: Bạch quả, Bạch thược,
Bát giác liên, Bòng bong, Bóng nước, Bông, Cây cứt lợn, Chàm lá nhỏ, Chè,
Cỏ lào, Dầu giun, Đại táo, Đào, Đậu tây, Đơn lá đỏ, Địa liền…Vì vậy, chúng
em mong muốn thực hiện đề tài chiết tách Kaempferol từ các loài cây gần
gũi và phổ biến ở Việt Nam.
2.2. Tính mới của đề tài:
Ở Việt Nam chưa có đề tài nào nghiên cứu tách chiết Kaempferol từ lá chè
xanh.
2
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
PHẦN 3
QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ
3.1. Hóa chất, thiết bị, nguyên liệu:
3.1.1. Nguyên liệu:
Lá chè xanh tươi được thu mua tại Hoà Bình, loại tạp, sau đó đem
phơi khô. Bảo quản nơi khô ráo
3.3.2. Hóa chất nghiên cứu:
TT Tên hóa chất Nguồn gốc
1 Methanol Merck
2 Cloroform Trung Quốc
3 Ethyl acetat Trung Quốc
4 Aceton Merck
5 Silicagel Trung Quốc
6 Sephadex LH20 Singapore
7 Natri clorua Trung Quốc
8 Natri sunphat Trung Quốc
9 Nước cất Viện KNVSATTP quốc gia
3.3.3. Thiết bị nghiên cứu:
Các thiết bị dụng cụ tại Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm

Quốc gia, Học viện Quân y, Viện Hoá học - Viện hàn lâm khoa học Việt
Nam gồm có:
Máy móc
– Máy cất quay chân không Eyela (Nhật Bản)
– Tủ sấy Memmert (Đức).
– Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức).
– Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S ( Thụy Sỹ).
– Máy cất quay chân không Büchi R-220 (Thụy Sỹ).
– Bếp ôm bình cầu có bảo ôn Heating Mantle (Trung Quốc).
– Máy đo nhiệt độ nóng chảy Memmert (Đức).
3
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
– Máy UV – VIS (Nhật).
– Thiết bị xác định phổ hồng ngoại (IR) Perkin Elmer.
– Thiết bị xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500
FT-NMR Spectrometer.
– Thiết bị xác định phổ khối lượng Varian 320 MS (Mỹ).
– Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản)
Dụng cụ
– Phễu chiết 500mL và 1000mL ( Đức)
– Pipet
– Ống đong 100mL ( Đức)
– Cột thủy tinh
– Bình hút ẩm
– Bình cô quay 100mL, 250mL và 500mL
– Và các dụng cụ thuỷ tinh khác…
3.2. Khảo sát quá trình chiết xuất flavonoid từ lá chè xanh
Lá chè xanh được đem sấy ở 60
0
C trong 24h, sau đó đem xay thành

bột rồi đem chiết xuất theo quy trình như sau:
Cân 100g lá chè rồi cho vào bình cầu 2L. Cho thêm 1L MeOH ở các
nồng độ khác nhau (60%, 70%,80%). Ngâm trong khoảng 6 giờ rồi rút dịch
chiết lần thứ nhất. Thực hiện ngâm bã dược liệu trên với 500ml MeOH trong
khoảng 2 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ hai. Gộp các dịch chiết methanol, cô
cạn dung môi dưới áp suất giảm bằng máy hút chân không thu được cắn.
Thêm một ít nước nóng vào hòa tan cắn bám quanh thành ống nghiệm sau
cô cạn. Kết quả thu được dung dịch có màu xanh lá đậm.
Dung dịch được xử lý theo 2 cách:
Cách 1 (không acid hoá): Lắc đều 3 lần với CHCl
3
với thể tích của
CHCl
3
mỗi lần 50mL. Cả 3 lần đều lọc bỏ phần phân lớp màu xanh lắng
xuống. Cho HCl 10% vào để cân bằng pH của dung dịch về khoảng 3 – 4
sau đó đem chiết tiếp với etylacetat mỗi lần 50mL. Lọc dịch chiết etylacetat,
4
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
cho bột Na
2
SO
4
khô để hút nước rồi cô cạn dưới áp suất giảm thu được cắn
flavonoid toàn phần.
Cách 2 (acid hoá): Cho 10mL HCl đậm đặc vào dung dịch, thủy phân
trong khoảng 8 tiếng rồi cho dung dịch thu được vào bình chiết. Sau đó tiến
hành tương tự như phương pháp 1.
Sau khi thực hiện theo các cách đem đi xác định khối lượng cắn
flavonoid toàn phần. Mỗi thí nghiệm lặp 3 lần và lấy kết quả trung bình.

Bảng1. Kết quả khảo sát hàm lượng cắn flavonoid toàn phần từ lá chè
Dung môi
Hàm lượng cắn flavonoid thu được (g)
Cách 1 Cách 2
Methanol 60% 2,55 3,55
Methanol 70% 2,99 3,87
Methanol 80% 3,08 4,00
Nhận xét:
Ở cả 2 phương pháp chiết, dung môi chiết xuất là methanol 80% đều
cho hiệu suất cao nhất và ở các trường hợp dịch chiết được acid hoá cho hiệu
quả tốt hơn.
Sau khi thu được cắn flavonoid toàn phần, chúng em tiến hành xác
định xem trong đó có chứa kaempferol hay không bằng phương pháp sắc ký
lớp mỏng (TLC) với các điều kiện như sau: Bản mỏng silica gel GF
254
(Merck) được hoạt hóa ở 110
0
C trong 1 giờ. Hệ dung môi triển khai:
Toluen : Ethyl acetat : Acid formic (5 : 4: 1). Hiện vết bằng hơi ammoniac
bão hòa .
Kết quả:
Trên sắc ký đồ cho thấy các vết đã được tách rõ ràng. Các vết này
đậm màu hơn khi hơ trên miệng lọ amoniac đặc, chứng tỏ trong đó có chứa
hỗn hợp nhiều flavonoid. Vết trên cùng (có Rf là 0,54) tương ứng với vết
Kaempferol chuẩn, chứng tỏ trong hỗn hợp này có chứa kaempferol.
5
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam

Hình 1. Kết quả sắc ký lớp mỏng cắn flavonoid
Như vậy, có thể khẳng định trong cắn flavonoid toàn phần chiết được

có chứa kaempferol. Chúng em tiếp tục đem các mẫu cắn đi xác định hàm
lượng kaemprefol, nhằm mụch đích tối ưu hoá quá trình lựa chọn dung môi
chiết.
Tiến hành như sau: Cân một lượng chính xác cắn EtOAc, hòa tan
trong methanol, định mức thành 25 ml dung dịch. Lọc qua màng lọc kích
thước 0,45 μm. Dung dịch này được bơm vào hệ thống HPLC với điều kiện
sắc kí như sau: Cột sắc kí ODS-3 (250mm x 4,6mm x 5μm), nhiệt độ cột
40
0
C, detector DAD, λ = 370 nm, pha động: đệm phosphat 10mM, pH = 2,5:
Acetonitril (60 : 40), tốc độ dòng pha động: 1,2 ml/phút, thể tích bơm mẫu là
50μl, thời gian chạy sắc kí 12 phút. Với mỗi cắn EtOAc, tiến hành định
lượng 3 mẫu, tính kết quả trung bình.
6
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200

mAU
366nm,4nm (1.00)
/14.797/8413554
Hình 2. Sắc đồ kaempferol với điều kiện lựa chọn
Bảng 2. Hàm lượng kaempferol trong cắn flavonoid
Dung môi
Hàm lượng kaemferol trung bình trong cắn (%)
Cách 1 Cách 2
Methanol 60% 0,14 0,50
Methanol 70% 0,16 0,48
Methanol 80% 0,13 0,78
Kết quả thu được với phương pháp chiết bằng methanol 80% và acid
hoá cho hàm lượng kaempferol thu được là cao nhất, vì vậy chúng em quyết
định lựa chọn phương pháp này để tiến hành thực nghiẹm các bước tiếp
theo.
Từ các kết quả khảo sát thu được ở trên, nâng khối lượng lá chè nên
500g chúng em đề ra quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần trong lá chè
như sau:
Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá chè:
Cân 500g lá chè rồi cho vào bình cầu 10L. Cho thêm 5L MeOH 80%.
Ngâm trong khoảng 6 giờ rồi rút dịch chiết lần thứ nhất. Thực hiện ngâm bã
dược liệu trên với 2,5L MeOH 80% trong khoảng 2 giờ rồi rút dịch chiết lần
thứ hai. Đuổi bớt dung môi ở các lần chiết, gộp các dịch chiết methanol, cô
cạn dung môi dưới áp suất giảm bằng máy hút chân không thu được cắn.
Thêm nước nóng vào hòa tan cắn bám quanh thành ống nghiệm sau cô cạn,
thu được dung dịch có màu xanh lá đậm. Cho 50mL HCl đậm đặc vào dung
7
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
dịch, thủy phân trong khoảng 8 tiếng rồi cho dung dịch thu được vào bình
gạn. Lắc đều 3 lần với CHCl

3
với thể tích của CHCl
3
mỗi lần là 250mL. Cả 3
lần đều lọc bỏ phần phân lớp màu xanh lắng xuống. Cho HCl 10% vào để
cân bằng pH của dung dịch về khoảng 3 – 4 sau đó đem chiết tiếp với
etylacetat mỗi lần 250mL. Lọc dịch chiết etylacetat, cho bột Na
2
SO
4
khô để
hút nước rồi cô cạn dưới áp suất giảm thu được cắn flavonoid toàn phần.
Hình 3. Cô quay chân không dịch chiết
Hình 4. Bột flavonoid toàn phần
Như vậy, quy trình chiết xuất flavonoid được tóm tắt như sau:
Sơ đồ 1. Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá chè xanh
8
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
3.3. Phân lập Kaempferol từ flavonoid toàn phần của lá chè xanh
9
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
3.3.1. Phân tách trên cột silicagel
Chuẩn bị cột:
Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính 2 cm, chiều dài 40 cm,
lắp thẳng đứng trên giá, phía dưới cột có van để điều chỉnh tốc độ dung môi.
Khóa van, cho một ít dung môi rửa giải vào cột. Lót một lớp bông mỏng ở
phía đáy cột, ngay trên van để chất nhồi sau khi được nhồi vào cột không
gây tắc cột
Nhồi cột:
Cân 20 g chất nhồi cột silica gel 60 , thêm 30 ml cloroform, trộn đều,

đổ từ từ lên cột. Mở khóa cột để dung môi chảy từ từ để các hạt chất nhồi
cột lắng xuống .Trong quá trình này luôn bổ sung CHCl
3
lên cột, tránh để
không khí tiếp xúc với silica gel. Ổn định cột trong khoảng 20 phút, đến khi
khoảng cách từ mặt trên lớp chất nhồi đến mặt trên dung môi rửa giải còn
khoảng 1 cm thì đóng khóa cột.
Xử lý mẫu:
Hòa tan 4 g flavonoid toàn phần trong cloroform, 4 g chất nhồi cột
silica gel 60 ,trộn đều, cô cạn dung môi thu được hỗn hợp bột. Chuyển nhẹ
nhàng vào cột, tránh xáo động lớp chất nhồi trong cột, dùng pipet tráng vòng
quanh bên trong cột trước khi thêm dung môi rửa giải. Dùng hệ dung môi
giửa rải lần lượt như sau:
Lần 1: 80mL CHCl
3
Lần 2: 40mL CHCl
3
+ 0,5mL Aceton + 0,5mL CH
3
COOC
2
H
5
+
0,5mL CH
3
OH
Lần 3: 40mL CHCl
3
+ 1mL Aceton + 1mL CH

3
COOC
2
H
5
+ 1mL
CH
3
OH
Bỏ qua dịch rửa giải của phân đoạn 1 và 2, chỉ thu dịch rửa giải của
phân đoạn 3. Tiến hành lặp lại cho đến khi hết cắn flavonoid toàn phần. Cô
cạn dịch rửa giải thu được 1,0g cắn.
10
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
Hình 5. Sản phẩm sau khi qua cột silica gel
3.3.2. Phân tách trên cột Sephadex
Chuẩn bị cột:
Dùng cột thủy tinh trung tính có đường kính 2 cm, chiều dài 40 cm,
lắp thẳng đứng trên giá, phía dưới cột có van để điều chỉnh tốc độ dung môi.
Khóa van, cho một ít dung môi rửa giải vào cột. Lót một lớp bông mỏng ở
phía đáy cột, ngay trên van để chất nhồi sau khi được nhồi vào cột không
gây tắc cột
Nhồi cột:
Cân 20 g Sephadex LH-20 ngâm trong methanol. Khuấy đều để tạo
hỗn dịch sau đó rót liên tục và từ từ lên cột (dùng một đũa thủy tinh giúp rót
hỗn dịch lên thành cột, tránh tạo bọt khí). Mở khóa cột để dung môi chảy từ
từ, hứng dung môi đổ ngược trở lại cột, tránh để khô cột. Cho dung môi
chảy tiếp tục như trên đến khi cột ổn định. Đến khi khoảng cách từ mặt trên
lớp chất nhồi đến mặt trên dung môi rửa giải còn khoảng 1 cm thì đóng khóa
cột.

Xử lý mẫu:
Hòa 0,2g cắn với 4ml MeOH rồi đổ vào trong cột (đổ từ từ vào thành
cột để tránh xáo động lớp chất nhồi trong cột), dùng pipet tráng vòng quanh
bên trong cột trước khi thêm methanol. Rửa giải bằng methanol, bỏ qua
dung dịch đầu cho đến khi màu của cắn chạm tới đáy cột. Cô cạn dịch rửa
giải thu được 0,8g chất.
Quy trình tách kaempferol từ flavonoid toàn phần được tóm tắt như
sau:
11
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
Sơ đồ 2.Quy trình phân lập kaempferol từ flavonoid toàn phần
12
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
3.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm
3.4.1. Nhiệt độ nóng chảy
Tiến hành đo điểm chảy của sản phẩm Kaempferol theo phương pháp
đo trong mao quản. Kết quả đo điểm chảy cho thấy điểm chảy của sản phẩm
là 279,1 ± 0,3. So với giá trị lý thuyết là 277 ± 1.
Nhận xét: Điểm chảy đo được của các hợp chất nghiên cứu phù hợp
với điểm chảy lí thuyết của hợp chất này.
3.4.2. Sắc ký lớp mỏng
Tiến hành sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu kaempferol của viện
kiểm nghiệm thuốc trung ương thấy sản phẩm thu được có giá trị thời gian
lưu

phù hợp với chất chuẩn.
Hình 6. Kết quả sắc ký lớp mỏng của sản phẩm
3.4.3. Kết quả đo phổ
3.4.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS
Mẫu thử được hòa tan trong MeOH, nồng độ 0,01 mg/ml. Đem quét

phổ trên máy thu được λ
max
= 266,366 nm, phù hợp với giá trị lý thuyết.
13
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
3.4.3.2. Phổ hồng ngoại IR
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm xuất hiện các đỉnh: 3344 cm
-1
của
nhóm OH, và đỉnh 1611 cm
-1
của nhóm C=O
3.4.3.3. Phổ khối lượng ESI MS
Tiến hành đo phổ ESI-MS của hợp chất nghiên cứu, trên phổ đồ xuất
hiện pic 287,1 ứng với mảnh [M+H]+, tương ứng khối lượng phân tử 286,1
(C
15
H
10
O
6
).
Kết quả cho thấy chất phân tích đều cho mảnh ion phân tử phù hợp
với khối lượng phân tử tương ứng.
3.4.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ 1 chiều cho thấy các hợp chất nghiên cứu có công
thức phân tử và cấu trúc hoàn toàn phù hợp với các dữ liệu phổ đã được
công bố cho các hợp chất này.
Nhận xét chung: Từ các giá trị hằng số vật lý và dữ liệu phổ đo được,
có thể khẳng định sản phẩm thu được là kaempferol và có độ tinh khiết cao.

14
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
PHẦN 4
KẾT LUẬN
Đa số các tác giả đã nghiên cứu tách chiết hợp chất này đều đưa ra
phương pháp chiết xuất, phân lập để lấy được hợp chất tinh khiết dùng cho
nghiên cứu phổ (qui mô phân lập từ vài milligram đến vài chục milligram).
Song, các tài liệu trên các tác giả chỉ quan tâm đếnviệc lấy được hợp chất và
nhận dạng đúng chất bằng một số phương pháp phổ màchưa tiến hành khảo
sát lựa chọn phương pháp tối ưu để chiết xuất, phân lập và tinhchế hợp chất.
Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng em đã khảo sát các phương pháp
chiết xuất, phân lập để lựa chọn phương pháp phù hợp nhất cho mục đích
tách được kaempferol, mục đích để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, với các
dung môi thong dụng và rẻ tiền. Cụ thể với việc chiết xuất Kaempferol:
Kaempferol là hợp chất tương đối phân cực do có nhiều nhóm –OH trong
cấu trúc phân tử, Kaempferol tan tốt trong methanol, ethanol, diethylether,
tan trong dung dịch kiềm, không tan trong cloroform, benzen. Xuất phát từ
đặc điểm này, chúng em đã lựa chọn methanol là dung môi chiết xuất. Khảo
sát các nồng độ khác nhau và pH môi trường (có acid hóa và không acid hóa
dịch chiết nước trước khi chiết bằng ethyl acetat). Kết quả khảo sátcho thấy,
trong tất cả các phương pháp, phương pháp ngâm lạnh bằng MeOH 80%,
acid hóa là phương pháp cho hàm lượng Kaempferol cao nhất. Với nhiều
nhóm –OH trong cấu trúc phân tử, Kaempferol tan khá tốt trong các dung
môi phân cực, tuy nhiên phương pháp ngâm lạnh trong methanol 80% cho
hiệu suất chiết cao nhất có thể là vì với độ cồn cao hơn thì methanol làm
đông vón tế bào thực vật tốt hơn, giúp giải phóng các chất trong tế bào tốt.
Phân lập Kaempferol: Phương pháp phân lập Kaempferol được tiến
hành qua hai giai đoạn, giai đoạn một sử dụng cột silicagel, giai đoạn hai
tiếp tục phân lập trên cột Sephadex LH-20.
Như vậy, chúng em đã thực hiện thành công việc chiết tách

Kaempferol từ là chè Việt nam.
15
Báo cáo nghiên cứu chiết tách Kaempferol từ lá chè Việt Nam
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Về xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế
Chúng em sẽ khảo sát độ tinh khiết của sản phẩm thu được,nếu chưa
đạt tiêu chuẩn dược dụng sẽ tiếp tục nghiên cứu để tinh chế cho đạt tiêu
chuẩn nguyên liệu dung làm thuốc.
Nếu thời gian cho phép, chúng em sẽ gửi mẫu chiết tách được đi thử
nghiệm tác dụng lâm sàng trên động vật.
2. Tiếp tục hoàn thiện báo cáo
Hoàn chỉnh nội dung, trình bày đầy đủ các hình ảnh, các bảng biểu kết
quả thực nghiệm. Các phụ lục và tài liệu tham khảo đầy đủ sẽ được hoàn
thiện.
16