sử dụng enzyme laccase sinh từ nấm đẩm để loại bỏ chất ô nhiễm nồng độ thấp (micropollutants)

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI
TRƯỜNG THPT VIỆT ĐỨC QUẬN HOÀN KIẾM – HÀ NỘI
**************
ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT
DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015)
Tên đề tài:
SỬ DỤNG ENZYME LACCASE SINH TỪ NẤM ĐẨM ĐỂ LOẠI BỎ
CHẤT Ô NHIỄM NỒNG ĐỘ THẤP (MICROPOLLUTANT)
Lĩnh vực: Công nghệ sinh học
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
- GS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà
- ThS. Ngô Thị Huyền Trang
- Đơn vị công tác: Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam
TÁC GIẢ:
- Đặng Trần Quang
- Lớp 12A3 Trường THPT Việt Đức
Hà Nội, tháng 12 năm 2014
MỤC LỤC
Trang
I. Lý do chọn đề tài 2
II. Tổng quan 3
III. Quá trình nghiên cưu và kết quả 3
3.1. Vật liệu 3
3.1.1. Laccase 3
3.1.2. Micropollutants (MPs) 4
3.1.3. Chất hóa học sử dụng để nghiên cứu 6
3.1.4. Thiết bị và máy móc 6

3.2. Phương pháp 6
3.2.1 Phương pháp phân lập, sàng lọc, tuyển chọn vi sinh
vật sinh tổng hợp enzyme ngoại bào
6
3.2.2. Xác định hoạt tính laccase 7
3.2.3. Loại bỏ MPs 7
3.2.4. Đánh giá hiệu quả loại bỏ MPs 7
3.3. Kết quả 7
3.3.1. Sự loại bỏ MPs 7
3.3.2. Ảnh hưởng của chất gắn kết (CGK) tới hiệu suất
loại bỏ MPs
7
3.3.3. Thảo luận 8
IV. Két luận 17
V. Lời cảm ơn 17
VI. Tài liệu tham khảo 18
MỤC LỤC
Trang
Hình 1.1. Công thức hóa học của Bisphenol A 6
Hình 1.2. Công thức hóa học của Triclosan 7
Hình 3.1: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA bởi
laccase từ FPT5
11
Hình 3.2: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS bởi
laccase từ FPT5
12
Hình 3.3: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA bởi
laccase từ FBV25
12
Hình 3.4: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS bởi

laccase từ FBV25
13
Hình 3.5: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA bởi
laccase từ FBV41
13
Hình 3.6: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS bởi
laccase từ FBV41
14
Bảng 3.1: Hiệu suất loại bỏ bỏ Bisphenol A và Triclosan 10
Bảng 3.2: Thống kê một số nghiên cứu về loại bỏ Bisphenol A và
Triclosan sử dụng enzyme laccase
16
I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trong thời gian gần đây, sự xuất hiện của các chất gây ô nhiễm nồng
độ thấp (Micropollutants – MPs) trong môi trường nước đã trở thành một
vấn đề môi trường toàn cầu. Khoảng 80% các dòng sông ở Mỹ (108 trên
139 dòng được khảo sát) bị ô nhiểm bởi hàng loạt MPs, bao gồm cả
Bisphenol A và Triclosan (Kolpin và cộng sự, 2002). Chúng được sử dụng
trong dược phẩm, sản phẩm chăm sóc cá nhân, các chất thay đổi hormone
sử dụng cho người, hóa chất công nghiệp, thuốc trừ sâu và nhiều hợp chất
khác.
MPs tồn tại trong nước ở nồng độ rất thấp, từ một vài pg / L tới một
vài µg / L. Sự đa dạng cũng như nồng độ rất thấp của MPs của các chất gây
ô nhiễm này nên quan trắc, đánh giá chúng rất phúc tạp. Các phương pháp
xử lý nước thải truyền thống cũng không xử lý được các chất ô nhiễm này
(Yunlong và cộng sự. 2012) khiến MPs thoát thẳng vào môi trường nước
một cách dễ dàng. Sự thải liên tục MPs vào môi trường dẫn tới nhiều hậu
quả lâu dài cho hệ sinh thái (Daughton và cộng sự, 1999).
Ở Việt Nam, nồng độ Bisphenol A được tìm thấy ở Hà Nội và thành
phố Hồ Chí Minh cao hơn 3 lần so với các khu vực khác (từ 5.3 µg/l tới 11

µg/l). Nonylphenol được tìm thấy trong các kênh nước thải của Hà Nội và
thành phố Hồ Chí Minh với nồng độ từ 0.02 – 9.7 µg/l tới 2 – 20 µg/l . Nồng
độ nonylphenol trong các sông của Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh đã
được kiểm định có thể gây nguy hại cho hệ sinh thái dưới nước (Yamamoto
và cộng sự., 2014). Hơn nữa, gần đây nồng độ quá mức cho phép của
Triclosan được tìm thấy trong kem đánh răng đã gây ra tranh cãi. Tuy nhiên,
giải pháp thích hợp để xử lý vấn đề này chưa được công bố. Ở Việt Nam,
cũng chưa có nhiều nghiên cứu về MPs.
Trong nghiên cứu 2 năm trước của chúng tôi cho thấy laccase sinh
tổng hợp từ Cerrena sp. FBV41 đã loại được nhiều màu thuốc nhuộm hoạt
tính và có hiệu quả cao trong tiền xử lý rơm rạ để tạo đường. Thực tế,
laccase đã được các nhà nghiên cứu chứng minh khả năng oxy hóa MPs
(Chairin và cộng sự, 2013). Sử dụng laccase có thể cản trở hoạt động của các
chất kháng sinh trong nước thải (De Gunzburg và cộng sự, 2012), ngăn chặn
ô nhiễm môi trường. Ví dụ, Margot và cộng sự cũng đã chỉ ra rằng 25%
diclofenac và 95% mefenamic acid có thể bị loại trong 20 giờ bằng laccase
từ chủng Trametes versicolor. Vì thế, laccase đã được chọn làm đối tượng
nghiên cứu. Đây là nghiên cứu có tính kế thừa và chọn đối tượng là một số
MPs là một nhiệm vụ có tính mới và có tính ứng dụng cao.
II. TỔNG QUAN
Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát khả năng loại 2 chất MPs đại
diện gồm Bisphenol A và Triclosan bởi enzyme laccase tạo ra từ 3 chủng
FBV41, FBV25 và FPT5 thuộc bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ Sinh
học Tái tạo Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
Hiện nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới chưa hề có tiêu chuẩn,
quy chuẩn nào về nồng độ các chất ô nhiễm nồng độ thấp được cho phép xả
thải ra môi trường (Deblonde và cộng sự, 2011), cũng vì thế mà chúng được
thải ra ngoài môi trường mà việc thải liên tục có thể dẫn tới nhiều hậu quả
khó lường. (Daughton và cộng sự, 1999).

Điểm mới và tính sáng tạo của đề tài là đưa ra giải pháp kỹ thuật sử
dụng enzyme laccase từ nấm đảm chủ động phân lập từ Việt Nam với nguồn
đa dạng cao, hoạt tính laccase cũng rất cao và có thể sản xuất dễ dàng để xử
lý ô nhiễm môi trường bởi MPs vốn vẫn chưa có giải pháp loại bỏ triệt để.
Đây là biện pháp sinh học không gây ra ô nhiễm thứ cấp cho môi trường, chi
phí không cao và nếu được đầu tư nghiên cứu nghiêm túc và sự kết hợp với
các công nghệ khác thì ý tưởng này có tính ứng dụng đại trà. Nghiên cứu
này là nghiên cứu bước đầu để tìm ra giải pháp loại bỏ hoàn toàn các chất ô
nhiễm nguy hiểm nói trên khỏi môi trường khi các chất ô nhiễm nguy hiểm
này ảnh hưởng đến cuộc sống thường ngày và sức khỏe của cộng đồng.
Hướng nghiên cứu mà chúng tôi thực hiện nhằm tạo cơ sở đầu tiên trong
thiết kế, xây dựng công nghệ hiệu quả và bền vững. Ngoài sử dụng chính
bản thân nấm sống và enzyme tự do thì cố định laccase lên các vật liệu nano
để chế tạo các màng xử lý sinh học phục vụ cho việc xử lý các loại nước thải
chứa MPs và các chất đa vòng thơm khác là một định hướng có tính áp dụng
thực tế cao đối với Việt Nam.
III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ
3.1. Vật liệu
3.1.1. Laccase
Các chủng nấm FBV25 đã được phân lập từ gỗ mục từ rừng quốc gia
Ba Vì và FPT5 từ tỉnh Phú Thọ. Riêng chủng FBV41 đã được nhóm nghiên
cứu của chúng tôi phân lập từ đất rừng Ba Vì năm 2012 và đã được sử dụng
để loại màu thuốc nhuộm có hiệu quả. Ba chủng nấm này được lựa chọn để
nuôi cấy thu dịch enzyme laccase thô cho nghiên cứu này.
Laccase (EC 1.10.3.2) là các hợp chất oxi hóa polyphenol có khả năng
xúc tác sự oxi hóa của nhiều hợp chất hữu cơ đa vòng thơm, đặc biệt là
những chất có nhóm chức cho electron như phenol (-OH) hay aniline (-NH2)
bằng cách sử dụng bằng cách sử dụng phân tử oxi làm chất oxi hóa
(Gianfreda và cộng sự. 1999). Laccase là một trong những enzyme khá phổ
biến trong tự nhiên có mặt ở nhiều loại thực vật, nấm cũng như ở một số loài

vi khuẩn và côn trùng và có nhiều chức năng như phân hủy các hợp chất
polymer phức tạp (lignin, humic acid), lignin hóa, phân hủy độc, bệnh nhân
tạo, tạo hình thái, hình thành bào tử, trùng hợp melanin
(Strong & Claus
2011). Khả năng xúc tác của laccase từ nấm (một mình hoặc có sự trợ
giúp của chất gắn kết) sự oxi hóa của dược phẩm và chất diệt cỏ được
diễn ra ở một vài chất, ví dụ như các hợp chất nội tiết (Auriol và cộng
sự. 2008; Cabana và cộng sự. 2007), thuốc giảm đau và chống viêm (Lu
và cộng sự 2009;. Marco-Urrea và cộng sự 2010; 2013b Margot và
cộng sự), kháng sinh (Schwarz và cộng sự 2010;. Suda và cộng sự 2012),
bộ lọc tia cực tím (Garcia và cộng sự. 2013b 2011), chất diệt sinh vật
(Margot và cộng sự.) và thuốc trừ sâu halogen khác (Torres-Duarte và
cộng sự. 2009). Do phổ cơ chất rộng và yêu cầu duy nhất của là oxi làm
hợp chất nền, laccase là một chất xúc tác sinh học đầy hứa hẹn với khả
năng phân hủy hữu cơ các hợp chất micropollutants trong nước thải thứ
cấp.
3.1.2. Micropollutants (Chất ô nhiễm nồng độ thấp)
Các chất Bisphenol A, Triclosan là đại diện của MPs đã được sử dụng
cho nghiên cứu loại chất ô nhiễm nồng độ thấp này.
3.1.2.1. Micropollutant là gì?
MPs là các hợp chất ô nhiễm được tìm thấy chỉ với nồng độ từ vài
pg/L tới vài µg/L trong môi trường. Nhiều MPs có mặt trong nước thải thành
thị, từ dược phẩm hay chất diệt cỏ, rất khó để bị loại bỏ bằng các phương
pháp xử lý sinh học truyền thống nên chúng liên tục thải vào môi trường
nước
. Những hợp chất này có cấu trúc bền vững nên rất khó phân hủy
bởi rất nhiều tác nhân khác nhau. Chính vì vậy mà chúng ảnh hưởng tới
các sinh vật nhạy cảm dù với nồng độ rất thấp
(
Yunlong và cộng sự.

2012

).
3.1.2.2. Bisphenol A
Bisphenol A (BPA) là một hợp chất carbon tổng hợp có công thức hóa
học (CH
3
)
2
C(C
6
H
4
OH)
2
thuộc nhóm dẫn xuất diphenyl-mê-tan và
bisphenols, với hai nhóm hydroxyphenyl. Nó đã được sử dụng trong thương
mại từ năm 1957 (Gemma và cộng sự., 2014). BPA cũng là một chất phá
hủy nội tiết (Krishnan và cộng sự, 1993; Fujimoto và cộng sự, 2006) và
được biết là gây độc cấp tính cho sinh vật với nồng độ 1-10lgL 1 (Alexander
và cộng sự, 1988.).
Hình 1.1. Công thức hóa học của Bisphenol A
BPA được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu cho sản xuất nhựa
polycarbonate và nhựa epoxy. Nó xuất hiện trong môi trường do các nhà
máy sản xuất BPA, kết hợp BPA thành nhựa (Staples và cộng sự, 1998), lọc
các chất thải nhựa (Sajiki và Yonekubo, 2003) hoặc các bãi chôn lấp
(Asakura và cộng sự, 2004) thải ra. Nồng độ BPA có thể lên tới 21 µgl
-1
ở bề
mặt và dưới nước biển (Belfroid và cộng sự, 2002) và lên đến 702 ngl

-1
trong
nước thải . Vi khuẩn có khả năng giảm BPA đã được phân lập từ một nhà
máy xử lý nước tải (Lobos và cộng sự, 1992) và nước sông (Kang và cộng
sự, 2004). BPA cũng là một chất phá hủy hệ nội tiết (Krishnan và cộng sự,
1993; Fujimoto và cộng sự 2006) và được biết răng có khả năng gây độc cho
các sinh vật dưới nước ở nồng độ từ 1-10 g/L (Alexander và cộng sự 1988).
Đã có một số nghiên cứu trước đây cho thấy BPA có thể bị loại bỏ bởi
enzyme từ nấm (Kim và Nicell, 2005; Cabana và cộng sự 2012).
3.1.2.3. Triclosan
Triclosan (2,4,4 '-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether) là một hợp chất
đa vòng thơm có chứa clo. Nhóm chức của nó bao gồm cả phenol và ete.
Triclosan lần đầu tiên được đăng ký là một thuốc trừ sâu vào năm 1969.
(Cabana và cộng sự, 2006)
Hình 1.2. Công thức hóa học của Triclosan
TCS là một tác nhân kháng khuẩn có phổ rộng. Nó được sử dụng trong
nhiều loại PCP như kem đánh răng, lăn khử mùi, xà phòng và nước rửa tay.
TCS được tìm thấy chủ yếu trong nước thải cùng cặn từ các nhà máy xử lý
nước thải. Nồng độ TCS trong nước thải từ các nhà máy xử lý nước thải có
thể lên tới 37.8 µgl
-1
(Hua và cộng sự, 2005) và mặt nước lên đến 431 ngl
-1
(Morrall và cộng sự, 2004). Do tính kị nước cao của hóa chất này (Log K
ow
= 4.8), sự tản của nó trong môi trường nước xảy ra bởi sự hấp phụ của các
hạt và trầm tích và thường tích lũy trong sinh vật dưới nước (AdolfssonErici
và cộng sự, 2002). TCS được chú ý là bởi có sự giống nhau ở cấu trúc hóa
học với BPA xenoestrogen và chất gây ô nhiễm có độc tính cao như dioxin.
Một số thông tin cho thấy TCS có khả năng can thiệp và suy giảm hệ nội

tiết. Các nghiên cứu về medaka (Oryzias latipes) cho thấy TCS có thể là một
chất androgenic yếu (Foran và cộng sự, 2000) và sản phẩm chuyển hóa của
nó có thể hoạt động như thụ thể đối kháng estrogen (Ishibashi và cộng sự,
2004). TCS cũng được loại bỏ tới 65% sau 8 giờ khi sử dụng enzyme
laccase từ chủng nấm Coriolopsis polyzona (Cabana và cộng sự, 2007)
3.1.3. Chất hóa học sử dụng để nghiên cứu
Các chất hóa học đã sử dụng trong nghiên cứu bao gồm Bisphenol A,
Triclosan, Violuric acid, ABTS, guaiacol, di-sodium hydrogen phosphate
buffer, sodium acetate, citric acid, methanol, HCl, CuSO
4
, NaOH v.v. từ
Sigma- Alrich, Merck, Fermentas.
3.1.4. Thiết bị và máy móc
Nghiên cứu này được thực hiện bằng trang thiết bị của phòng Công
nghệ Sinh học Tái tạo môi trường của viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các thiết bị chính bao gồm: bình
tam giác, cân kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô trùng Laminar của
Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc ở các nhiệt độ khác nhau, tủ nuôi
ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf, tủ lạnh cách loại 4 ºC, -20ºC; máy đo quang
phổ Novaspec II, lò vi sóng, pipet man của hãng Eppendorf, đầu côn,
v.v.Thiết bị phân tích LC-MS/MS và HPLC-DAD của Trung Tâm I, Bộ
KHCN.
3.2. Phương pháp
3.2.1. Phương pháp phân lập, sàng lọc, tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng
hợp enzyme ngoại bào
Các chủng vi sinh vật được phân lập theo phương pháp pha loãng– gạt
đĩa thạch theo nồng độ pha loãng hay đặt trực tiếp các mẫu gỗ mục và rơm
mục (kích thước 2-3 mm) có sợi nấm lên các đĩa thạch chứa môi trường có
chất chỉ thị. Phương pháp này thường nhanh và sợi nấm xuất hiện chỉ sau
16-20 giờ.

Chất chỉ thị được sử dụng để nhận biết khả năng sinh tổng hợp laccase
của các chủng nấm là guaiacol (0,01%). Trên môi trường thạch, chủng nào
oxy hóa guaiacol tạo ra màu nâu đỏ thì có thể chủng đó sẽ sinh tổng hợp
enzyme ngoại bào trong đó có laccase.
Cuối cùng, FBV41, FBV25 và FPT5 được nuôi cấy trong các môi
trường thích hợp để tạo laccase thô.
3.2.2.Xác định hoạt tính laccase
Phương pháp xác định laccase được Eggert và cộng sự (1996) công bố và
cho đến nay vẫn được xem là phương pháp thường qui đã được sử dụng cho
nghiên cứu này.
Nguyên tắc: Hoạt độ của laccase được xác định bằng sự tăng độ hấp
thụ ánh sáng của sản phẩm được tạo thành ở bước sóng 420 nm ở điều kiện
phòng thí nghiệm.
Hỗn hợp phản ứng đo hoạt tính laccase gồm 0,2 ml ABTS 2,5 mM;
0,6 ml đệm natri axetat 20 mM và 0,2 ml dịch enzyme laccase thô đã được
ly tâm.
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để
tạo thành 1 µM sản phẩm từ cơ chất ABTS (2,2-azino-bis 3-
ethylbenzothiazoline-6sulfonic acid) trong thời gian 1 phút, ở điều kiện
phòng thí nghiệm.
3.2.3. Thí nghiệm loại bỏ MPs
Hỗn hợp phản ứng gồm 5 mg/L của một trong các chất BPA hoặc
TCS, enzyme laccase thô của FBV41, FBV25 và FPT5, đệm citrate
disodium hydrogen phosphate pH 5 và 1% v/v methanol. Hoạt tính của
laccase trong phản ứng là 1000 U/L. Ngoài ra, 50µM Violuric acid được bổ
sung với vai trò chất gắn kết đối với các phản ứng loại bỏ MPs. Các mẫu thí
nghiệm được ủ ở 40
o
C trong 4 giờ. Dừng phản ứng bằng cách đun sôi dung
dịch trong 15 phút. Dung dịch sau khi đun được phân tích bởi HPLC-DAD

(Bisphenol A) và LC-MS/MS (Triclosan).
3.2.4. Đánh giá hiệu suất loại bỏ MPs
Như đã đề cập ở trên Triclosan được phân tích bằng phương pháp LC-
MS/MS theo một giao thức chuẩn (QHFSS Document No 27701:PPCP
trong nước; chuẩn bị và phân tích bởi SPE và LCMSMS) và Bisphenol A
phân tích bằng HPLC-DAD.
3.3.Kết quả
3.3.1. Hiệu suất loại bỏ MPs
Sau 4 giờ phản ứng, dung dịch được phân tích bởi các thiết bị chuyên dụng chủ yếu nêu trên. Hệ số thu hồi
của phản ứng rất tốt nằm trong khoảng trên dưới 100 % lần lượt là 5.044 mg/L đối với BPA và 4.995 mg/L đối
với TCS (Bảng 3.1). Hiệu suất loại bỏ Bisphenol A và Triclosan bằng laccase thô từ 3 chủng FPT5, FBV25,
FBV41 từ 85.66 – 100% sau 4 giờ phản ứng (Bảng 3.1). Trong đó laccase từ chủng FBV41 loại MPs tốt nhất đối
với cả Bisphenol A và Triclosan lần lượt là 100 và 99,8%. Kết quả lý thú thu được là không cần có chất gắn kết chỉ
có laccase đơn lẻ của 3 chủng hiệu suất loại cả 2 loại MPs nghiên cứu cao từ 85,66 - 97,7% (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Hiệu suất loại bỏ bỏ Bisphenol A và Triclosan
3.3.2. Ảnh hưởng của chất gắn kết (CGK) tới hiệu suất loại bỏ MPs
Việc sử dụng các chất oxy hóa có trọng lượng phân tử thấp trong nhóm chất xúc tác của laccase nâng cao
hoạt tính của enzyme này. Quá trình oxy hóa trung gian này gồm hai bước oxy hóa. Trong bước đầu, laccase oxy
hóa chất nền, chất gắn kết. Chất này sẽ hoạt động như một hợp chất vận chuyển electron. Sau đó, chính chất gắn
kết sẽ chuyển electron cho cơ chất chính cần phản ứng. Những chất gắn kết tăng khả năng phản ứng của laccase
Mẫu
MPs
Đối
chứng
Chủng FPT5 Chủng FBV25 Chủng FBV41
Laccase
Laccase
+VIO
Laccase Laccase+VIO Laccase Laccase+VIO
Nồng

độ
(mg/L
)
Nồng
độ
(mg/L
)
Hiệu
suất
loại
(%)
Nồng
độ
(mg/L
)
Hiệu
suất
loại
(%)
Nồng
độ
(mg/L
)
Hiệu
suất
loại
(%)
Nồng
độ
(mg/L

)
Hiệu
suất
loại
(%)
Nồng
độ
(mg/L
)
Hiệu
suất
loại
(%)
Nồng độ
(mg/L)
Hiệu
suất
loại
(%)
BPA 5,04 0,43 91,46 0,26 94,8 0,21 95,9 0,25 95,08 0,611 87,8 0,000 100
TCS 4,99 0,72 85,66 0,24 95,3 0,38 92,5 0,19 96,30 0,12 97,7 0,013 99,8
(Bourbonnais và Paice, 1990). Trong nghiên cứu này Violuric acid (ViO) đã được sử dụng làm chất gắn kết để tìm
hiểu vai trò của nó trong phản ứng xúc tác của laccase đối với khả năng thay đổi cấu trúc của 2 MPs nêu trên. Đối
với chủng FBV25, FPT5, chất gắn kết hầu như không có vai trò gì để tăng hiệu quả xử lý. Nhìn trên sắc ký đồ, các
peak của BPA và TCS giảm đi rõ rệt so với mẫu đối chứng (hình 3.1,3.2,3.3,3.4), BPA đã gần như bị loại bỏ hoàn
toàn. Còn đối với TCS, đã bị loại bỏ và phân hủy thành các hợp chất khác. Đối với các mẫu sử dụng laccase từ
chủng FBV41, chất gắn kết đóng vai trò rõ rệt hơn khi đã tăng hiệu suất loại bỏ từ 87.8% (khi không dùng CGK)
lên 100 % khi sử dụng CGK. Peak của BPA đã không còn nhìn thấy trên sắc ký đồ (Hình 3.5). Khi có mặt của ViO
đã xuất hiện một peak mới, có thể phỏng đoán chất gắn kết đã “giúp” laccase hoạt động theo chiều hướng khác để
tạo nên chất háo học mới. Tuy nhiên phải có thêm các nghiên cứu nữa để xác định chất tạo ra mới đó có bản chất

háo học là gì?.
A B C
Hình 3.1: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA bởi laccase từ FPT5
(A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO)
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250

4.867 526924 0 Bis phenol A 5.044
DAD-CH1 217 nm
14-11-BPA-C-Ch.dat
Retention Time
Area
Name
ESTD concentration
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
200

225
4.893 44655 6 Bis pheno l A 0.427
DAD-CH1 217 nm
14-11-BPA-PT5E-ch.dat
Retention Time
Area
Nam e
ESTD concentration
Minutes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
mAU
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
mAU
20
40
60
80
100
120

140
160
180
200
220
240
4.627 8667 12 0.000
4.800 271375 Bis phenol A 0.260
DAD-CH1 217 nm
14-11-BPA-PT5EM-ch.dat
Retention Tim e
Area
Name
ESTD concentration
Peak BPA
Peak BPA
Peak BPA
A B C
Hình 3.2: Sắc ký đồ của sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS bởi laccase từ FPT5
(A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO)
A B C
Hình 3.3: Sắc ký đồ của sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA bởi laccase từ FBV25
(A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO)
Peak TCS
Peak TCS
Peak TCS
Peak BPA Peak BPA
Peak BPA
A B C
Hình 3.4: Sắc ký đồ của sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS bởi laccase từ FBV25

(A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO)
A B C
Hình 3.5: Sắc ký đồ của sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA bởi laccase từ FBV41
(A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO)
Peak TCS Peak TCS Peak TCS
Peak BPA
Peak BPA
Peak BPA
A B C
Hình 3.6: Sắc ký đồ của sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS bởi laccase từ FBV41
(A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO)
Peak TCS
Peak TCS
Peak TCS
3.3.3 Thảo luận
Để nghiên cứu khả năng loại bỏ MPs của laccase từ 3 chủng nấm
FPT5, FBV25 và FBV41, đề tài đã thiết kế và thực hiện thí nghiệm tìm hiểu
phản ứng xúc tác của 3 loại laccase từ 3 chủng nấm đảm nêu trên với
Bisphenol A và Triclosan là 2 đại diện của MPs dự trên đặc tính cả các
enzyme và tham khảo các công bố quốc tế.
Các minh chứng thu được đã khẳng định rằng với các laccase có
nguồn gốc khác nhau đã loại bỏ được Bisphenol A và Triclosan với hiệu suất
cao khi có mặt và không có mặt của chất gắn kết (tử 85,66-100%). Hơn thế
nữa các enzyme laccase từ 3 chủng phân lập tại Việt Nam có kiểu xúc tác
khác nhau để không chỉ loại bỏ được MPs mà còn có thể tạo ra các chất trao
đổi chất có bản chất không giống nhau. Tuy nhiên rất nhiều nghiên cứu nữa
cần được tiếp tục như sự ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian phản ứng, hoạt
tính của laccase đến hiệu suất loại màu. Hơn thế nữa, sự kết hợp cùng lúc
cảu 3 hay nhiều laccase cũng cần phải khảo sát. Việc cố định enzyme lên các
vật liệu nano cũng là một định hướng quan trọng để có thể áp dụng thực tế ở

qui mô công nghiệp. Trước mắt có thể sử dụng chủng sinh laccase, hay
laccase thô để loại màu thuốc nhuộn hay MPs cũng mang tính khae thi cao.
Bên cạnh đó, tuy sắc ký đồ có cho thấy các sản phẩm trao đổi chất
khác nhau ở các điều kiện có và không có chất gắn kết và 3 nguồn laccase
khác nhau nhưng bản chất hóa học vẫn chưa được xác định. Theo Hirano và
đồng tác giả (2000), sau khi Bisphenol A được loại bỏ bằng laccase, các chất
được tạo thành sau phản ứng được xác định là 4-isopropylphenol và
hexestrol. Các chất nêu trên không còn độc tính như BPA nữa.
So với các công bố liệt kê ở Bảng 3.2 thì tiềm năng của 3 loại laccase
từ 3 chủng FBV41, FPT5 và FBV25 rất cao trong loại bỏ MPs.
Bảng 3.2: So sánh hiệu suất loại bỏ Bisphenol A và Triclosan
bằng laccase với các công bố quốc tế tương tự
MPs
Hiệu
quả
loại
bỏ
(%)
Điều kiện thí nghiệm
Tác giả
Nồng độ
MPs
(mM)
Chủng
Hoạt tính
enzyme
(U/L và
U/g)
pH
Nhiệt

độ
(
0
C)
Nồng độ CGK
(mM)
Thời
gian
(h)
BPA
88,3 4
Paraconiothyriu
m variabile
5000 5 50 ABTS 5 0,5
Asadgol
và cộng
sự, 2014
97 0,75 Grifola frondosa 1,5 4 28 HBT 2 6
Nitherano
nt và cộng
sự, 2011
100 5 Chaetomiaceae 50 7 40 - - 24
Saito và
cộng sự.,
2004
100 0,022
Coriolopsis
polyzona
5 5 40 ABTS 0,001 4
Cabana và

cộng sự,
2007
80 1
Coriolus
versicolor
10 3 - - 2,33
Okazaki
và cộng
sự, 2002
~96 0,12
Trametes
versicolor
150 5 25 ABTS 1 1
Kim và
Nicell ,
2005
18
0,67-
0,87
Trametes
versicolor
888 7,3 40 - - 2,53
Margot và
cộng sự,
2013
100 0,01
Trametes
polyzona
640 4 28 HBT 2 3
Chairin và

cộng sự,
2012
50 0,22
Trametes
versicolor
100 30 HBT 0,2 0,5
Tsutsumi
và cộng
sự, 2000
77 0,2 Hetero Basidium 250-600 4,5 30 - - 72
Lee và
cộng sự,
2005
100 0,022 FBV41 1000 5 40 Vio 0,05 4
Nghiên
cứu của
chúng tôi
TCS
65 0,018
Coriolopsis
polyzona
5 5 50 ABTS 0,001 8
Cabana và
cộng sự,
2007
56,5 0,2
Ganoderma
lucidum
5 4 30 - - 24
Murugesa

n và cộng
sự, 2009
90 0,2
Ganoderma
lucidum
5 4 30 HBT 1 24
100 0,05
Trametes
versicolor
250 5 40 - - 6
Cabana và
cộng sự,
2011
60 0,05 Cerrena unicolor
43 U/g
(cố định)
5 - - - 1
Debaste
và cộng
sự, 2013
99,75 0,023 FBV41 1000 5 40 Vio 0,05 4
Nghiên
cứu của
chúng tôi
KẾT LUẬN
 Với hoạt tính 1000 U/L, điều kiện phản ứng pH 5 và 40
o
C, laccase
thô thu được từ các chủng nấm FPT5, FBV25 và FBV41 đã loại được
các chất ô nhiễm nồng độ thấp Bisphenol A và Triclosan ở nồng độ

5mg/L với hiệu quả cao từ 85,66 -100% có mặt và không có mặt của
chất gắn kết ViO.
 Tạo ra các chất trao đổi chất khác nhau khi sử dụng laccase có nguồn
gốc từ 3 chủng nấm đảm và chất gắn kết khác nhau.
 Hiệu suất loại bỏ Bisphenol A và Triclosan bởi FPT5 lần lượt là 91,46
% BPA, 94,8 % khi có mặt chất gắn kết và 85,66 % TCS, 95.27 % khi
khi có chất gắn kết.
 FBV25 loại được 95,9 % BPA, 95,08 % khi có mặt chất gắn kết; loại
92,45% TCS và 96,3% khi có mặt chất gắn kết.
 FBV 41 loại được 87,78 % BPA và 100 % khi có mặt chất gắn kết;
97,69 % TCS và 97,7% khi có bổ sung chất gắn kết.
 Công trình này mở ra triển vọng mang tính ứng dụng công nghiệp để
xử lý loại bỏ các chất Micropollutant trong nước thải, sinh hoạt và
các chất đa vòng thơm khác.
V. LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Phó Giáo sư, Tiến
sĩ Đặng Thị Cẩm Hà cùng Thạc sỹ Ngô Thị Huyền Trang cũng như những
thành viên khác của phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Tái tạo môi
trường, những người đã cho em sự hướng dẫn tận tình trong suốt quãng thời
gian em tham gia nghiên cứu (từ năm 2012).
Đồng thời, em cũng xin cảm ơn tới trường THPT Việt Đức và ban tổ
chức cuộc thi khoa học kỹ thuật INTEL-ISEF vì đã cho em cơ hội được thực
hiện đề tài này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bolong N, Ismail AF, Salim MR, Matsuura T.Areview of the effects of
emerging contaminants in wastewater and options for their removal.
Desalination 2009;239:22946.
H. Cabana, J. P. Jones, S. N. Agathos, 2007:Elimination of Endocrine
Disrupting Chemicals using White Rot Fungi and their Lignin Modifying
Enzymes: A Review

Hubert Cabana, Jean-Louis Habib Jiwan, Raoul Rozenberg, Vladimir
Elisashvili, Michel Penninckxe, Spiros N. Agathos, J. Peter Jones, 2006:
Elimination of endocrine disrupting chemicals nonylphenol and bisphenol A
and personal care product ingredient triclosan using enzyme preparation
from the white rotfungus Coriolopsis polyzona
Deblonde T, Cossu-Leguille C, Hartemann P. Emerging pollutants in
wastewater: A review of the literature. Int J Hyg Envir Heal
2011;214:4428.
Hirano T, Honda Y, Watanabe T, Kuwahara M. Degradation of bisphenol A
by the lignin-degrading enzyme, manganese peroxidase, produced by the
white-rot basidiomycete, Pleurotus ostreatus. Biosci Biotechnol Biochem
2000;64(9):1958–62
Kim, Y.J., Nicell, J.A., 2006. Impact of reaction conditions on the
laccasecatalyzed conversion of bisphenol A. Bioresour. Technol. 97, 1431–
1442.
Margot J, Maillard J, Rossi L, Barry DA, Holliger C (2013b) Influence of
treatment conditions on the oxidation of micropollutants by Trametes
versicolor laccase. N Biotechnol 30(6):803-813
Yunlong L., Wenshan G., Huu H.N., Long D.N., Faisal I.H., 2012. A review
on the occurrence of micropollutants in the aquatic environment and their
fate and removal during wastewater treatment