một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh và nấm đối kháng

Lời cảm ơn
Trớc hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học
phân tử - Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên
trong phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập vừa
qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực
phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội và cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều
kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật.
1
Lời mở đầu
Viện Di truyền nông nghiệp đợc thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân của
Viện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay, Viện
nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội.
Chức năng chính của Viện là :
-Nghiên cứu, ứng dúng các phơng pháp di truyền học hiện đại và công
nghệ sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt,
chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trờng.
-Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lơng thực-
thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bền
vững và bảo vệ môi trờng.
-Tăng cờng hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Di
truyền và Công nghệ sinh học.
Để thực hiện đợc các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vị
nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 ngời trong đó có
3 tiến sĩ , 6 phó giáo s, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ.
Trong những năm qua, Viện đã đạt đợc rất nhiều thành tựu, đã thực hiện
và chủ trì 18 đề tài nhà nớc, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo đợc
nhiều giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra các
quy trình tiến bộ kỹ thuật đợc công nhận. Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự án
hợp tác quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO Nhờ các thành tự trên mà Viện đã
nhận đợc nhiều giải thởng có giá trị cả trong và ngoài nớc: Giải thởng quốc tế về

đóng góp phát triển nông nghiêph Châu á Thái Bình Dơng, huân chơng lao động
hạng 3
giới thiệu chung về bệnh học thực vật
I. Quan niệm về bệnh hại thực vật
Việc chỉ ra đợc chính xác lúc nào cây bị bệnh luôn là một vấn đề khó khăn
và đợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Ngời ta cho rằng một cây đợc coi
là khoẻ mạnh và phát triển bình thờng khi nó biểu hiện các chức năng sinh lý ở
mức tối đa tiềm năng di truyền của nó. Các tế bào mô phân sinh của cây khoẻ
mạnh thực hiện chức năng phân chia và chuyên hoá khi cơ thể đòi hỏi là cần
2
thiết. Các kiểu tế bào chuyên hoá khác nhau hấp thụ nớc và dinh dỡng từ đất, đa
nớc và dinh dỡng đến tất cả các bộ phận của cây, tiến hành quá trình quang tổng
hợp, các quá trình chuyển hoá và trao đổi chất, hoặc lu giữ các sản phẩm của quá
trình quang tổng hợp và tạo hạt hoặc các cơ quan tái tạo khắc cho khả năng sinh
tồn và phát triển. Bất cứ khi nào các tế bào của một cây hay một bộ phận nào đó
của cây có khả năng thực hiện một hay nhiều chức năng đặc biệt bị can thiệp do
các vi sinh vật hoặc là yếu tố môt trờng bất lợi thì các hoạt động của các tế bào
bị gián đoạn, bị thay đổi hay bị ức chế hoặc bị chết và cây trồng trở nên bị bệnh.
Đầu tiên bệnh mới chỉ xảy ra ở một vài tế bào và vẫn cha biểu hiện ra nh-
ng chỉ trong một thời gian ngắn, bệnh lan rộng và các bộ phận cây bị bệnh bắt
đầu thay đổi và biểu hiện ra ngoài các triệu chứng bệnh mà mắt thờng có thể
thấy đợc. Dựa vào những thay đổi mà cây thể hiện khi phản ứng lại sự xâm
nhiễm của vi sinh vật hay ảnh hởng của các yếu tố môi trờng bất lợi mà chúng ta
có thể biết đợc mức độ bệnh của cây. Từ đó bệnh của cây có thể đợc định nghĩa
là : một chuỗi các phản ứng của các tế bào và các mô thực vật với các vi sinh
vật gây bệnh hoặc với các yếu tố môi trờng mà ta có thể nhìn thấy đợc hoặc
không nhìn thấy đợc, dẫn đến những thay đổi bất lợi theo hình dạng, chức năng,
hoặc tình trạng nguyên vẹn của cây trồng và có thể dẫn đến sự suy yếu hoặc có
thể gây chết toàn phần hoặc từng phần của cây.
Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thờng gây bệnh bằng cách can thiệp vào

quá trình trao đổi chất của tế bào cây thông qua các enzyme, các chất độc tố, các
chất điều hoà sinh trởng và các loại chất khác mà chúng tiết ra khi tiếp xúc với
cây chủ, hoặc hấp thụ dinh dỡng của tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụng
của chúng. Một số sinh vật khác lại gây bệnh bằng cách sống ký sinh và phát
triển, sinh sản trong hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe và hậu quả tất
yếu là làm tắc nghẽn đờng vận chuyển lên xuống của nớc và của đờng. Ngoài ra,
các yếu tố môi trờng cũng gây bệnh trên thực vật khi tác động với mức ngoài ng-
ỡng chống chịu của cây.
Có rất nhiều loại bệnh hại cây trồng, chúng đợc phân nhóm theo rất nhiều
tiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo bộ phận cây bị bệnh, theo loại cây bị
bệnh Hiện nay, phổ biến nhất là ngời ta phân loại bệnh cây dựa vào loại tác
nhân gây bệnh. Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật đợc chia làm 2 loại: bệnh gây
ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh học. Theo
tiêu chuẩn này, ta có thể chỉ ra đợc nguyên nhân gây bệnh, quá trình tiến triển và
cách lan truyền bệnh từ đó suy ra đợc biện pháp phòng trừ bệnh
3
4
Phần i: Nuôi cấy mô tế bào thực vật
I. Khái niệm chung:
Nuôi cấy mô tế bào là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại
nuôi cấy những nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi tr-
ờng dinh dỡng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Bao gồm:
- Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
- Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật nh mẩu lá, mẩu rễ,
một đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả
- Nuôi cấy phôi non (phôi cha phân hoá hoàn toàn), phôi trởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus)
- Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào
trần
Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên tính toàn năng của tế bào

do Haberlandtf phát biểu (1898): Mỗi tế bào của cơ thể đa bào có khả năng tiềm
tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh trong điều kiện phù hợp. Cơ sở
vật chất của tính toàn năng là mỗi tế bào trong cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ vật
chất thông tin di truyền. Khi tạo đợc môi trờng nuôi cấy phù hợp, sử dụng các
chất điều khiển sinh trởng thực vật, ta có thể hoạt hoá gen cần thiết để bắt một tế
bào bất kỳ của cơ thể thực vật phát triển đợc thành cây hoàn chỉnh.
Phân hoá và phản phân hoá của tế bào cũng là cơ sở lý thuyết của công
nghệ này. Trong đó, sự phân hoá là việc chuyển những tế bào phôi sinh trở thành
các tế bào chuyên hoá để thực hiện những chức năng khác nhau về sinh lý, sinh
hoá; còn sự phản phân hoá là sự chuyển các tế bào đã chuyên hoá trở lại trạng
thái phôi sinh, có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới.
Điều kiện để tế bào thể hiện tính toàn năng qua con đờng phân hoá và phản
phân hoá là môi trờng nuôi cấy.
II.Môi trờng nuôi cấy mô tế bào thực vật:
Môi trờng nuôi cấy là yếu tố quan trọng, nó quyết định cho sự thành công
của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật tách rời. Thành phần chính bao gồm:
1. Nguyên tố khoáng đa lợng: Là các nguyên tố nh N, P, K, Mg, S,
Ca ,chiếm nhiều trong môi trờng nuôi cấy với hàm lợng của mỗi nguyên
5
tố thờng lớn hơn 30mg/l. Chúng là nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây
dựng nên thành phần cấu trúc.
2. Các nguyên tố khoáng vi lợng: Là các nguyên tố nh Fe, Mn, Mo, B, I,
Cu, Zn, Co với hàm lợng mỗi nguyên tố nhỏ hơn 30mg/l. Chúng là thành
phần của coenzim để xúc tác phản ứng hoá sinh diễn ra trong tế bào sống.
3. Nguồn cacbon: Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, các mô và tế bào
chuyển sang phơng thức sống dị dỡng nên cần phải cung cấp cho chúng
một nguồn cacbon hữu cơ, thờng là đờng mía saccaroza (trong một số tr-
ờng hợp còn sử dụng glucoza, maltoza, lactoza ).
Ngoài ra, manitol, sorbitol đợc sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù
và tế bào trần với chức năng ổn định áp suất thẩm thấu.

4. Vitamin: Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng
tổng hợp vitamin nhng lợng tổng hợp đợc không đủ nên phải bổ sung
vitamin ngoại sinh vào môi trờng cấy. Vitamin thờng dùng là nhóm B dễ
hoà tan vào trong nớc nh B
1
, B
2
, B
3
, B
5
, B
6
với hàm lợng từ một đến
một vài mg/l. Chúng là thành phần coenzim của hàng loạt enzim xúc
tác cho các phản ứng hoá sinh, vì vậy không thể thiếu trong môi tr-
ờng nuôi cấy.
*Myo-Inositol là một hợp chất thứ cấp có vòng thơm (cha đợc xếp vào
vitamin), do sự tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, có
tác động kích thích mạnh mẽ sự phân chia của tế bào, đợc sử dụng với l-
ợng lớn ~ 100 mg/l.
5. Chất điều khiển sinh trởng: Là thành phần quan trọng nhất của môi
trờng nuôi cấy, giúp điều khiển đợc quá trình phân hoá và phản phân
hoá tế bào, thể hiện đợc tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy tế bào
và mô thực vật tách rời. Ngời ta thờng sử dụng chủ yếu hai nhóm chất
điều khiển sinh trởng thực vật sau:
- Auxin: kích thích quá trình tăng trởng của tế bào, kích thích sự
hình thành mô sẹo và rễ bất định. Các loại thờng dùng là
IAA(axit indolaxetic), NAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit
indol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic) Hàm lợng

dùng nhỏ 10
-5
-10
-7
mol/l.
- Xytokinin: kích thích sự phân chia tế bào và tạo chồi bất định.
Các loại thờng dùng là Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin),
Zeatin, TDZ(Thidiazuron) với hàm lợng 10
-5
-10
-7
mol/l.
6
Ngời ta sử dụng phối hợp auxin và cytokinin với tỷ lệ và hàm lợng
phù hợp để đạt mục đích mong muốn. Quy luật tơng đối: tỷ lệ auxin
trên xytokinin lớn thì các mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình thì
mẫu cấy tạo mô sẹo, còn tỷ lệ thấp thì tạo chồi.
Ngoài ra hợp chất Gibberillin có vai trò quan trọng trong sinh lý ngủ
nghỉ của hạt, chồi, phát triển của hoa, tăng tởng chiều dài thực vật, sử
dụng nhiều trong nuôi cấy mô phân sinh; các hợp chất ức chế sinh tr-
ởng: axit absisic (ABA), CCC sử dụng trong bảo quản nguồn gen
invitro.
5. đây là thành phần thờng dùng nhng không bắt buộc trong môi trờng
nuôi cấy. Bao gồm nớc dừa, dịch nghiền một số rau, củ, quả: khoai
tây, chuối, táo, cà rốt dịch chiết nấm men, hợp chất cazein,
pepton để gia tăng các chất dinh dỡng, các chất có hoạt tính điều
khiển sinh trởng và sự phát triển của mẫu cấy.
6. Chất làm đông cứng môi trờng: Là giá thể cho mẫu cấy. Thờng
dùng nhất là Agar agar. Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan với
nớc khi ở nhiệt độ lớn hơn 80

0
C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ
hơn 40
0
C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nớc cao, chỉ
cần 6-12 g có thể làm đông đặc 1l nớc và khi ở trạng thái rắn thì tế
bào và mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu đợc các chất dinh dỡng từ
môi trờng.
III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào:
Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành
công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt đợc khi nó trải qua 5 bớc sau:
Bớc 0: Bớc chuẩn bị
Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau:
- Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần.
- Có khả năng sinh trởng và phát triển tốt.
- Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus.
- Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các
cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối u về điều kiện
chăm sóc, dinh dỡng, bảo vệ thực vật để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn.
7
Bớc 1: Nuôi cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thờng
sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra,
tuỳ thuộc từng đối tợng nuôi cấy ngời ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy
nh mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non.
Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trớc khi tiến hành để đảm bảo mẫu
sạch vi sinh vật nhng tỉ lệ sống cao. Hiện nay sử dụng chủ yếu là phơng pháp sát
trùng bề mặt bằng chất hoá học, thờng là HgCl
2
0,1% sát trùng trong 5-10 phút.

ít phổ biến hơn là các dung dịch hypoclorit nh NaOCl, Ca(OCl)
2
5% trong 20-30
phút. Ngoài ra còn dùng H
2
O
2
15%,dung dịch Brom 5-10% nhng hiệu quả không
cao.
Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đa mẫu cấy vào môi trờng thích hợp để
mẫu cấy tạo thành chồi mầm hoặc phôi vô tính. Việc lựa chọn môi trờng thích
hợp là rất khó khăn, cần phải đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lợng các chất điều
khiển sinh trởng trong môi trờng để làm cho mẫu cấy phát sinh đợc hình thái.
Bớc 2: Nhân nhanh mẫu
Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích
chính là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này đợc coi là
giai đoạn đánh giá tính u việt hay không u việt của phơng pháp nuôi cấy mô tế
bào.
ở giai đoạn này, môi trờng dinh dỡng nhân tạo để nuôi cấy thờng đợc đa
thêm vào chất điều khiển sinh trởng, các chất bổ sung khác nh nớc dừa, nớc chiết
nâm men, dịch thuỷ phân casein kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm
đạt đợc hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di truyền,
có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau . Tuy
nhiên, tuỳ từng đối tợng nuôi cấy, ngời ta có thể đạt đợc hệ số nhân cao bằng
việc kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các
chồi nách hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Bớc 3: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt đợc một kích thớc nhất định, các chồi đợc chuyển từ môi trờng
trong bớc 2 vào môi trờng tạo rễ. Thờng sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này
sẽ xuất hiện rễ. ở giai đoạn này, ngời ta bổ sung vào môi trờng các auxin vì auxin

là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
8
Tuy nhiên, ở một số loài nh chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt
đợc trong môi trờng không có chất điều hoà sinh trởng.
Bớc 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên
Giai đoạn đa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bớc cuối cùng của
quy trình nuôi cấy mô tế bào.
Cây lấy ra ống nghiệm phải đợc rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự
xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình
này sẽ thành công hơn nếu trớc khi đa cây con ra đất ta ơm cây trên cát có độ ẩm
90% từ 10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đợcc sinh ra
và bắt đầu hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình
thờng.
Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế
bào.Đó là:
- Sự bất định di truyền
+ Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy
ra hiện tợng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lí,
sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận đợc ở ngay giai
đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro.
+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điều
khiển và phát triển hình thái, giảm lợng chất điều khiển sinh trởng
sử dụng, từ đó giảm đợc ảnh hởng của chúng. Đồng thời, phải hạn
chế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tích
luỹ, gia tăng ảnh hởng của các chát điều khiển sinh trởng.
- Sự nhiễm mẫu cấy
+ Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâu
trong hệ thống mô dẫn của thực vật. Khi tế bào thực vật bắt đầu
phát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trờng sau 2-3
tuần nuôi cấy.

+ Khắc phục: Chọn và nuôi trồng cây mẹ đúng tiêu chuẩn, nếu cây
mẹ bị bệnh có thể dùng kháng sinh để khử trùng mẫu
- Sự tiết độc tố từ mẫu cấy
+ Sau 1-2 ngày đa vào môi trờng, mẫu cấy tiết ra những chất màu
đen, nâu làm hỏng môi trờng, chết mẫu. Các chất đó có thể là tanin,
polyphenol bị oxy hoá.
9
+ Khắc phục: Chọn mẫu non để giảm hàm lợng tanin, polyphenol ;
gây vết thơng cơ giới tối thiểu nhất; xử lý mẫu cấy bằng cách ngâm
trong dung dịch axit hữu cơ có tính khử mạnh: axit ascorbic, axit
xitric; bổ sung vào môi trờng than hoạt tính để hấp phụ các chất nói
trên.
- Hiện tợng thuỷ tinh hoá mẫu cấy
+ Khi nuôi cấy trong môi trờng lỏng và bình nuôi bị hạn chế về khả
năng trao đổi khí thì tế bào và mô thực vật bị mọng nớc, trở nên
trong suốt, có hình dạng không bình thờng
+ Khắc phục: Bổ sung vào môi trờng chất gây áp suất cao, chất ức
chế tổng hợp etilen, tăng cờng độ chiếu sáng và giảm nhiệt độ
phòng nuôi .
IV. ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác giống cây trồng:
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong công tác giống cây trồng, nuôi cấy in vitro đợc ứng dụng để:
- Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống.
- Duy trì, bảo quản, nhân nhanh các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, có
giá trị kinh tế cao.
- Làm sạch virus, phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh.
Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính cây trồng bằng phơng
pháp nuôi cấy in vitro đợc quan tâm hơn cả. Ngời ta ớc tính có khoảng 300 loại
cây có thể đợc nhân giống bằng phơng pháp này. Lợi ích của nó là ở chỗ: có thể
tạo ra một quần thể cây con với số lợng lớn mà vẫn giữ nguyên đặc tính cây mẹ,

đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sinh trởng tốt và cho năng
suất cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ diệt vong; có thể
trao đổi quốc tế nguồn gen và lu giữ, bỏ quản dạng cây in vitro. Chính nhờ kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào, ngời ta có thể tạo ra đợc hệ số nhân giống cao, sớm
phát huy đợc hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc
và dễ dàng khắc phục đợc những điều kiện bất lợi. Phơng pháp này tỏ ra đặc biệt
hiệu quả với những loại cây khó nhân giống bằng con đờng hữu tính, các giống
quý hiếm có số lợng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh.
ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nớc đã đợc
thành lập và cho đến nay đã thu đợc một số kết quả đáng kể. Tại viện Sinh vật-
Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã hoàn thiện quy trình nhân giống
10
in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu nh lúa, thuốc lá, khoai
lang, dứa sợi Tại trờng Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã hoàn thiện quy trình
nhân giống khoai tây chất lợng cao, bớc đầu đi vào sản xuất.Tại các tỉnh phía
Nam đã xây dựng đợc ngân hàng cà phê với 10 dòng khác nhau, hoàn thiện quy
trình nhân giống cây cao su . Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào
trong cả nớc đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa, cây
ăn quả, cây rừng, cây quý hiếm có giá trị cao.
Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay đợc đa vào trong các chơng
trình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý luận sinh
học cây trồng, vào thực tiễn nông nghiệp, mở ra một hớng đi mới cho nghiên cứu
di truyền học, hoá sinh, sinh lý thực vật , đặc biệt nó đem lại những ứng dụng to
lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng.
V.Kết quả và thảo luận
Thực hiện nuôi cấy mô đối với loại mẫu là cây hoa cúc lấy từ vờn của viện
Di truyền nông nghiệp.
- Mẫu cây đợc cắt bỏ lá và cắt thành những đoạn dài 5-7 cm.
- Rửa mẫu bằng nớc rửa bát loãng sau đó rửa lại bằng nớc sạch 3 lần.
- Rửa mẫu bằng cồn 70 độ trong 1 phút để sát trùng sơ bộ sau rửa lại bằng nớc

sạch 3 lần.
- Khử trùng mẫu bằng hydroperoxide trrong 10-15 phút sau đó tráng sạch bằng
nớc cất.
- Cắt cành thành từng đoạn ngắn, mỗi đoạn có ít nhất một mắt ngủ.
- Cấy mẫu vào môi trờng nuôi cấy có nồng độ aucin-cytokinin thích hợp, sau 3
tuần các mắt ngủ sẽ phát triển thành chồi.
- Thờng sau quá trình này câty đợc nuôi cấy bằng phơng pháp cắt lát mỏng để
có đợc hệ số nhân nhanh lớn.
-Sau khi đã có đợc chồi tiến hành xử lý ra rễ bàng cách cắt chồi cấy vào môi tr-
ờng thích hợp,sau khoảng 2 tuần sẽ có rễ.
- Khi cây đã có rễ có thể tiến hành việc thích nghi cây với điều kiện sống tự
nhiên trong vờn ơm :có giả thể thờng là đất trộn trấu hun có bổ sung các nguồn
chất dinh owỡng trong điều kiện chiếu sáng 50%.
- Một thời gian sau,nếu tỷ lệ cây sống đạt hơn 85% có thể đem cây con trồng
trong điều kiện bình thờng.
11
12
Phần ii: chẩn đoán bệnh
I.Khái niệm
1.Tình hình bệnh hại trên giống cây trồng thực vật ở Việt Nam.
Để đảm bảo an ninh lơng thực đồng thời phát triển nhanh nền kinh tế, trong
những năm gần đây Việt Nam đã nhập nhiều giống cây trồng và hoa cây cảnh từ
nhiều quốc gia trên thế giới. Điều này luôn kèm theo các nguy cơ xân nhập của
vi sinh vật gây hại, đặc biệt là các bệnh hại thực vật thuộc diện KDTV ở Việt
Nam.
Trên thế giới cũng nh ở Việt Nam, bệnh hai thực vật gây nên những thiệt
hại vô cùng to lớn và chúng đang làm ảnh hởng đáng kể đến chất lợng sản phẩm
cũng nh năng suất cây trồng. Đặc biệt là bệnh hại do virus gây ra: Virus PVY là
virus gây bệnh thối củ khoai tây, làm giảm năng suất củ tới 80%, nó cũng gây
thiệt hại đáng kể trên cây cà chua, ớt, thuốc lá. Khi thuốc lá bị nhiễm virus này

thì năng suất giảm tới 30%. Trong lĩnh vực hoa cây cảnh còn trầm trọng hơn.
Việc áp dụng những thành tựu khoa học kỹ thuật của CNSH, đặc biệt là sinh học
phân tử và Miễn dịch liên kết gắn enzim vào sản xuất là rất cần thiết nhằm tăng
năng suất cây trồng, chẩn đoán nhanh và chính xác tác nhân hại cây trồng, đáp
ứng đợc đòi hỏi cấp bách của KDTV.
Một số tác nhân gây bệnh thờng thấy trên cà chua, khoai tây, thuốc lá.
Virus khảm da chuột Cucumber Mosaic Viruses (CMV)
Loại virus này gây ra các loại khảm và biến dạng lá khác nhau, điển hình
nhất là dạng biến dạng hình kim, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng
trong sản xuất cà chua và thuốc lá. Virus này đợc lan truyền qua Aphis
gossyphii. Nó thuộc nhóm Cucumovirus có cấu trúc ARN mạch đơn. Xuất
hiện dịch bệnh không có quy luật báo trớc.
Virus khảm thuốc lá - Tobacco Mosaic Viruses (TMV)
Loại virus này gây ra các loại khảm và phồng lá khác nhau, điển hình nhất
là dạng khảm san hô gây nên những thiệt hại nghêim trọng trong sản xuất
cà chua, gây ảnh hởng đến chất lợng thuốc lá. Virus này đợc lan truyền
bằng con đờng cơ học, đồng thời đối với cà chua virus này còn lan truyền
qua hạt. Nó thuộc nhóm Tobamovirus có cấu trúc ARN mạch đơn.
Virus Y khoai tây Potato Y Viruses (PVY).
Loại virus này gây ra các loại khảm và các dạng hoại tử ở thịt và gân lá
khác nhau, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng trong sản xuất cà chua và
thuốc lá. Vectơ của virus này là các loại muội khác nhau. Nó thuộc nhóm
polyvirus có cấu trúc ARN mạch đơn.
13
2.Sự lan truyền virus trong tự nhiên

Virus thực vật không thể tự lây nhiễm vào các mô, tế bào của vật chủ mà
chúng chỉ thâm nhập vào khi các tế bào hoặc các mô của vật chủ bị tổn thơng.
Trong tự nhiên quá trình này đợc thực hiện thông qua các vi sinh vật khác,
những sinh vật mang virus từ cây này truyền cho cây khác gọi là vectơ truyền

bệnh. Ngày nay những phơng thức truyền bệnh của virus đã đợc xác định, bao
gồm những phơng thức sau:
2.1 Lây lan cơ học
Các virus thực vật truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ nếu nồng độ virus
trong cây bệnh và độ bền vững của virus là cao nh các bệnh khảm thuốc lá,
khảm cà chua, khảm da chuột chúng có thể truyền trực tiếp từ cây này
sang cây khác khi lá chạm vào nhau, hoặc gián tiếp qua môi trờng đất, nớc,
quần áo ngời lao động, chân tay Nhân giống vô tính cũng là phơng thức là
cho virus xâm nhập vào các vật chủ thông qua các dụng cụ chiết, cắt,
ghép
2.2 Lan truyền qua chất dinh dỡng
Virus có khả năng lây nhiễm vào tất cả các bộ phận của cây nh lá, thân, rễ,
củ mầm Những cây mới phát triển từ vật nhiễm virus đều duy trì cho virus
sống từ mùa này sang mùa khác là nguồn lan truyền bệnh virus ra nhiều
vùng trên thế giới.
2.3 Lan truyền qua hạt.
Trớc đây ngời ta cho rằng bệnh virus không lây lan qua hạt, đến năm 1910
đã phát hiện virus khảm cà chua, 1919 virus khảm đậu và ngày nay đã có
những bằng chứng về sự lây lan của bệnh virus thông qua hạt.
2.4 Lan truyền nhờ các vectơ truyền bệnh
Các vectơ truyền bệnh có thể là công trùng, rệp, bét, nấm ngời ta chia côn
trùng truyền bệnh thành 4 nhóm:
- Côn trùng sau khi mang virus lấy từ cây lây bệnh chỉ có khả năng truyền
bệnh sau đó 1-2h, lâu hơn nữa thì virus không còn khả năng lây nhiễm, đợc
gọi là tồn tại không vĩnh viễn (Non persistent).
- Côn trùng sau vài giờ mang virus từ cây bệnh mới có khả năng truyền
bệnh sang cây khác. Khả năng này chỉ tồn tại trong vài ngày liên tục, trờng
hợp này gọi là bán vĩnh viễn (semi-persistent).
14
- Côn trùng chỉ cần 15 phút lây nhiễm virus từ cây bệnh nhng chỉ có thể

truyền bệnh sau đó vài giờ và truyền bệnh liên tục trong một vài tuần, gọi là
truyền bệnh vĩnh viễn tuần hoàn (persistent circulative).
- Côn trùng sau 15 phút lây virus có thể truyền bệnh liên tục suốt cả chu
kỳ sống và cả thế hệ sau đó vẫn còn nguyên khả năng truyền bệnh, gọi là
truyền bệnh vĩnh viễn lan truyền (persistent psopagative).
3. Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym
( ELISA enzym linked immuno _sorbent assay)
Phơng pháp thử miễn dịch dựa trên phản ứng giữa một kháng nguyên và
một kháng thể là những protein có trọng lợng phân tử lớn thu đợc do tạo miễn
dịch ở máu nóng của động vật có vú ( chuột, thỏ, ngựa, dê ) bằng những phân tử
gây miễn dịch ( protein, polysaccharides, ARN 2 mạch bổ xung , ).Trong trờng
hợp này kháng thể đợc gọi là kháng thể đa dòng (polyclonaux) vì chúng đợc tạo
ra từ các dạng hoạt hoá của một quần thể dị chất của những tế bào limpho B
trong máu động vật. Chúng là một hỗn hợp của các kháng thể khác nhau phản
ứng với nhiều điểm cuối của kháng nguyên hoạc những đỉnh của phân tử gây
miễn dịch. Phản ứng kháng thể kháng nguyên là một công cụ rất hiệu nghiệm
để chuẩn đoán bệnh virut, vi khuẩn, nấm, mycoplasma, tuyến trùng và các véc tơ
truyền bệnh. Hiện nay kỹ thuật ELISA còn giúp chúng ta xác định đợc hàm lợng
thuốc trừ sâu (pesticide) tồn d trong đất. Các phân tử đánh dấu cũng là một phức
hợp kháng thể kháng nguyên đã đợc sử dụng từ lâu để chuẩn đoán bệnh cho
phép nhận thấy kết quả bằng mắt thờng. Hiện nay việc sử dụng các phân tử
phóng xạ để đánh dấu đã bị hạn chế .Bên cạnh đó, ngời ta thờng dùng enzym
(Alkaline phosphatasa), peroxidaza, chất floresence và Avidin Biotin để tăng
độ nhạy của phép chuẩn đoán ta cũng có thể sử dụng các chất huỳnh quang,
phosphattase alkaline
Phơng pháp miễn dịch liên kết enzym đợc nhiều tác giả hoàn thiện vào năm
1971 (Avrameanvà Cs; Van Weemen và Cs; Engvall và Cs ). Nhóm cuối cùng đã
sử dụng thuật ngữ ELISA (Enzym linked immuno sorbent assay) lần đầu tiên
vào năm 1971 để áp dụng vào phơng pháp định lợng một vài kháng thể đặc hiệu.
Đây là phơng pháp đợc phát triển bởi rất nhiều tác giả và là một phơng pháp

nhanh nhậy trong chuẩn đoán và định lợng một số kháng nguyên, kháng thể. Nó
đã đợc Voller và đồng nghiệp ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh virut thực vật
năm 1976. Clack và Adams ở Anh là hai trong những ngời đầu tiên dùng phơng
pháp này để chuẩn đoán 2 bệnh virut là AWM ( Arabis Mosaic Virus) và PPV
( Plum PoxVirut). Phơng pháp này rất nhạy, cho phép thăm dò ở mức nhiễm rất
15
thấp. Để thực hiện phơng pháp ELISA, ta phải tinh chế kháng thể (IgG) và biết
sử dụng kháng thể đánh dấu. Sự đánh dấu kháng thể cho phép nhìn thấy phản
ứng kháng nguyên kháng thể và tăng thêm khả năng thăm dò của những phản
ứng đặc hiệu. Phân tử đánh dấu có thể là enzym, chất phóng xạ (S
35
hoặc I
128
),
kim loại (hoặc chất keo ), hoặc chất huỳnh quang. Phản ứng miễn dịch diễn biến
ở pha rắn. Virus đợc giữ lại bằng cách chọn lọc và cố định bằng một kháng thể
đặc hiệu hấp thụ trên bề mặt vật cứng tại các going của một vi chuẩn độ ( plaque
de microtitration ) cấu tạo bằng polyvinyl hoặc polystyrene. Những phản ứng
khác nhau xảy ra liên tiếp và những phân tử tự do đợc loại trừ bằng các lần rửa.
Phản ứng của virus cũng tập trung và đợc tăng cờng bằng một pha đa thêm vào
một kháng thể đặc hiệu có gắn một enzym đánh dấu, có phản ứng hoàn toàn với
virus và đợc tìm ra bằng nhuộm màu trong diễn biến giảm dần của enzym ỏ chất
nền thích hợp. Sự thuỷ phân diễn ra qua một phản ứng màu quan sát đợc bằng
mắt hoặc đo bằng dụng cụ quang học. Trong trờng hợp không có virus trong mẫu
kiểm tra, enzym gắn với kháng thể không giữ lại đợc giữ lại và sẽ không có mẫu.
Phơng pháp ELISA không những đáp ứng đợc những tiêu chí phức tạp mà còn
dễ dàng tự động hoá và dễ dàng tìm kiếm những chất phản ứng trên thị trờng .
Ư'ng dụng của ELISA trong việc phòng chống và phát hiện bệnh:
- Nhận biết các tác nhân gây bệnh chủ yếu, đa ra những dữ liệu về bệnh dịch
học, xác định đợc mức độ nhiễm để quản lý đánh giá các giống kháng

bệnh
- Thu đợc các nguyên liệu thực vật sạch bệnh bằng quy trình chọn giống sạch
bệnh ở những giai đoạn nhân giống khác nhau.
- Kiểm tra nguyên liệu thực vật nhập nội và ngăn ngừa sự xâm nhập của các
bệnh lạ vào lãnh thổ.
- Theo dõi thờng xuyên các loại vi sinh vật, phát hiện và diệt trừ ổ dịch có thể
là các kho chứa các vật truyền bệnh (côn trùng, tuyến trùng, nấm)
II.Vật liệu và nghiên cứu
1.Vật liệu nghiên cứu.
1.1 Vật liệu thực vật.
Các mẫu cà chua thu thập tại vờn thí nghiệm của viện di truyền nông
nghiệp.
1.2 Vật liệu vi sinh
Loại bệnh đợc nghiên cứu là : Potato virus Y, Tobaco etch virus.
1.3 Các dung dịch đệm dung trong DAS-ELISA.
16
- Dung dịch Coating pH=9,6
NaCO
3
1,59g NaN
3
0,20g
NaHCO
3
2,93g Nớc cất 2 lần 1000ml
- Dung dịch PBS pH7,4
NaCl 8,00g KCl 0,20g
KH
2
PO

4
0,20g NaN
3
0,20g
Na
2
PO
4
42,9g Nớc cất 2 lần 1000ml
- Dung dịch PBS T: PBS + 0,5ml Tween 20.
- Dung dịch PBS T PVP
PBS T + 2% PVP (polyvinyl pyrolidone)
- Dung dịch hiện màu (Substrate) pH9,8
Diethanolamine 97,00ml
NaN
3
0,20g
Nớc cất 2 lần 900ml
2 Phơng pháp nghiên cứu
2.1 Phơng pháp chuẩn bị mẫu.
- 0,5 gam mẫu đợc lấy ở các vị trí khác nhau (Virus để chẩn đoán bệnh ta lấy
mẫu ở lá, một số mẫu lấy ở ngọn ) và đợc nghiền trong dung dịch chiết.
- Mẫu đợc nghiền trong dung dịch dịch chiết với tỷ lệ 1/10 (1mg/ 10ml dung
dịch đệm). Sau đó dịch nghiền đợc lọc qua bông thuỷ tinh để giữ lại những
phần thực vật không bị nghiền nát để thu đợc một dịch đồng nhất. Dịch này
đợc pha loãng với các tỷ lệ khác nhau để:
o Xác định ngỡng giới hạn của phép thử (Giới hạn độ hoà loãng kháng
nguyên).
o Tìm ra nồng độ hoà loãng tốt nhất, nó có nồng độ đủ để chẩn đoán l-
ợng tác hân gây bệnh và đông thời phép thử không bị che khuất bởi

sắc tố diệp lục của cây. (Để loại trừ diệp lục trong dịch chiết mẫu ở
nồng độ hoà loãng thấp ta tiến hành ly tâm ở 7000 rpm trong 5 phút)
2.2 Phơng pháp DAS-ELISA, các bớc tiến hành
*Nguyên lý của phơng pháp DAS-ELISA
Dùng kháng thể đa dòng bao phủ bề mặt giếng để bắt giữ kháng nguyên thích
hợp
17
Cho kháng nguyên vào
Kháng thể gắn enzyme đợc sử dụng để phát hiện
Cuối cùng là sự nhân biết các mẫu bằng phản ứng tơng tác với chất hiện màu.
18
Hình 1. Nguyên lý của phơng pháp ELISA Sandwich kẹp kháng thể 2 lần
Phơng pháp trực tiếp.
Các bớc tiến hành
1. Đặt kháng thể đặc hiệu đã đợc hoà loãng trong dung dịch đệm coating vào
giếng của đĩa plaque (100àl/giếng).
o ủ trong 2h ở 37
0
C
o Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS T.
2. Cho dịch cây nghiên cứu đã đợc hoà loãng trong dung dịch đệm PNS T
+ PVP vào giếng của đĩa plaque (100àl/giếng).
o ủ ở 37
0
C trong 2h hoặc 1 đêm ở 4
0
C.
o Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS T.
19
Enzyme

Thể cộng hợp
(Conjugate)
Đặt kháng thể
đặc hiệu
Kháng thể
Kháng
nguyênngngu
yên nguyên
Bề mặt cứng
Đặt kháng nguyên
Đặt kháng thể có gắn
ENZYME gọi là thể
cộng hợp (conjugate)
Kháng thể
Biểu hiện của
phản ứng
Chất nền cho
phản ứng nhuộm
màu
3. Đặt kháng thể gắn enzyme Phosphataza kiềm đã đợc hoà loãng trong dung
dịch đệm PBS T + PVP vào giếng của đĩa plaque (100àl/giếng).
o ủ ở 37
0
C trong 2h hoặc 1 đêm ở 4
0
C.
o Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS T.
4. Chất nền của enzyme là para Nitro Phenyl Phosphat (pNPP) pha vào dung
dịch đệm hiện màu substrate nồng độ 2mg/ml sau đó cho vào giếng của
đĩa plaque (100àl/giếng).

o ủ ở 37
0
C trong 30 phút đến 2h. Khi muốn dừng phản ứng thì dùng
50àl dung dịch NaOH 3M để dừng phản ứng.
5. Đọc kết quả bằng máy so màu quang học ở bớc sóng 405nm. Chỉ số
quang học D.O thể hiện kết quả của phản ứng O.D lớn gấp 2 lần O.D đối
chứng sạch bệnh là cây đã bị nhiễm virus (Theo Sanofi-Pasteur).
Iii: Kết quả và thảo luận
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Mẫu đối chứng đối với 10 giếng đầu tiên là TEV: kiểm tra mẫu cà chua.
Mẫu đối chứng đối với 10 giếng tiếp theo là TSV: kiểm tra mẫu cà chua.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B TP 1 4 7 10
- 3 6 9
C TP 1 4 7 10
- 3 6 9
D + 2 5 8
TP 1 4 7 10
E + 2 5 8
TP 1 4 7 10
F - 3 6 9
+ 2 5 8
G - 3 6 9
+ 2 5 8
H
Bảng tổng hợp kết quả đo O.D
20
Tên virus
Mẫu

TEV
(Tobacco Etch Virus)
TSV
(Tobacco Spot Virus)
1 1.6985 0.3165
2 1.6440 0.330
3 1.583 0.294
4 1.925 0.3075
5 2.548 0.3035
6 1.1665 0.3005
7 1.378 0.325
8 1.817 0.268
9 * 0.2815
10 1.870 0.440
TP 1.4205 0.206
P * 0.3385
N 1.945 0.318
Từ bảng kết qủa nói trên ta thấy:
Với bệnh do virus TEV gây ra trên cây cà chua, mọi mẫu phân tích đề cho
kết quả gần tơng tự nh mẫu đối chứng sạch, thậm chí có mẫu còn cho kết
quả nhỏ hơn, điêù này cho phép ta kết luận mẫu cà chua đem phân tích
hoàn toàn không bị nhiễm TEV.
Với bệnh do virus TSV gây ra, hầu hết các mẫu phân tích đều cho kết quả O.D
nhỏ hơn mẫu đối chứng sạch, chỉ có mẫu số 2 là cho kết quả lớn hơn nhng lại
chỉ lớn hơn có 1.037 lần. Mẫu số 10 có chỉ số O.D lớn hơn cả chỉ số mẫu đối
chứng dơng. Nh vậy kết quả mẫu phân tích cho ta thấy cây đêm phân tích bớc
đầu đẫ nhiễm virus TSV.
Các yếu tố ảnh hởng đến kết quả của DAS-ELISA:
1. ảnh hởng của nhiệt độ bảo quản:
- Mẫu sau khi tách chiết đợc chia ra bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau 20, -4,

-20 và -84
0
C cho những giá trị OD khác nhau rõ rệt. Từ số liệu thu đợc cho thấy
-84
0
C cho giá trị cao nhất.
2. ảnh hởng của thời gian bảo quản mẫu tới kết quả thí nghiệm:
- Mẫu tiến hành thí nghiệm ngay sau khi đợc tách chiết cho kết quả chính xác
nhất. Nghĩa là nêu skhông bắt buộc phải bảo quản mẫu trong -84
0
C cho kết quả
chính xác và nhạy nhất. Nếu sử dụng mẫu qua bảo quản kết quả sẽ cho độ nhạy
kém hơn và chỉ nên dùng một lần không nên lặp lại.
3. ảnh hởng của thời gian bảo quản đĩa tới kết quả thí nghiệm sau khi cho kháng
thể hút bám bề mặt các giếng:
- Khi so sánh giá trị OD đối với đối chứng bệnh và đối chứng sạch của thí
nghệim ở tại các thời điểm sau khi cho kháng thể hút bám bề mặt giếng cho thấy
thời gian bảo quản đĩa khác nhau không ảnh hởng tới giá trị OD.
21
4. ảnh hởng của bọt khí khi cho dung dịch chất hiện màu vào trong mỗi giếng
trớc khi đọc kết quả:
Giá trị OD thay đổi rất lớn trong cùng một mẫu khi có bọt khí và không có bọt
khí trong các giếng, thậm chí trong một số trờng hợp đối chứng sạch bệnh cho
kết quả dơng tính (bị bệnh). Vì vậy hết sức tránh có bọt khí khi đặt kháng
nguyên, kháng thể và chất nền để kết quả đợc chính xác hơn.
Phần III : Một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh và
nấm đối kháng.
I.Tổng quan
Mỗi loại cây đều có một hệ vi sinh vật đặc trng cho cây đó. Nghiên cứu về
hệ vi sinh vật tham gia vào sự sinh trởng, phát triển cũng nh duy trì nòi giống ở

thực vật là một trong những nội dung quan trọng giúp cho việc nâng cao sức
sống, năng suất cũng nh phẩm chất tốt của cây trồng.
*Nhóm vi sinh vật gây bệnh sống nhờ vào chất hữu cơ của thực vật đang
sống, chúng tiết ra các hợp chất phân huỷ mô và tế bào thực vật làm cây chết
(khác với nhóm hoại sinh- sống trên những tế bào thực vật đã chết). Vi sinh
vật gây bệnh có khả năng tồn tại trong đất hoặc trên tàn d thực vật từ vụ này
qua vụ khác dới dạng bào tử hoặc các dạng tiềm sinh khác tạo thành nguồn
bệnh tiềm tàng. Từ đó chúng đợc phát tán nhờ nớc ma, gió, dụng cụ lao
động, động vật và ngời, đặc biệt là nhờ côn trùng môi giới. Qua các con đ-
ờng đó chúng lây lan sang cây khoẻ và bắt đầu nảy mầm, xâm nhiễm vào
cây khi gặp điều kiện thuận lợi. Quá trình hoạt động của vi sinh vật gây bệnh
làm cho cây bị thay đổi các đặc tính sinh lý, sinh hoá sau đó thay đổi về hình
thái, cấu tạo tế bào và cuối cùng là xuất hiện những triệu chứng bệnh nh đốm
trên lá, trên thân
Nấm chỉ chiếm khoảng dới 1% tổng số vi sinh vật trong môi trờng sống của
thực vật nhng lại có những ảnh hởng lớn đến sự sinh trởng, phát triển bình th-
ờng của hầu hết các loại cây trồng.
Cũng nh các vi sinh vật gây bệnh khác nấm gây bệnh là một trong những
nguyên nhân chính gây nên sự sụt giảm năng suất, chất lợng, tàn phá mùa
màng.
22
Phần lớn nấm gây bệnh có hình thức sinh sản bằng bào tử và có vòng đời
ngắn do đó chúng lây lan với một tốc độ vô cùng lớn và rất khó ngăn chặn.
Chính vì vậy, việc phát hiện, nghiên cứu nấm bệnh là một nội dung vô cùng
quan trọng giúp cho việc tìm ra các biện pháp phòng ngừa, tiêu diệt và ngăn
chặn sự lây lan của chúng, bảo vệ mùa màng.
*Để tránh bệnh cho cây ngời ta sử dụng nhiều biện pháp hoá học, sinh học
cũng nh các biện pháp tổng hợp rất phong phú. Ngày nay, các biện pháp hoá
học bị hạn chế do những tác động phá hoại sự cân bằng sinh thái hay gây ô
nhiễm môi trờng của chúng. Các biện pháp sinh học nh sử dụng vi sinh vật

đối kháng, thuốc trừ sâu sinh học, chuyển gen chống chịu vào cây trồng
đang đợc nghiên cứu và áp dụng ngày càng nhiều nhờ những u điểm của
chúng.
Một trong những biện pháp sinh học có khả năng đem lại hiệu quả cao trong
bảo vệ cây trồng là sử dụng vi sinh vật chống lại các vi sinh vật hại cây hay
nói cách khác là tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cho cây nhờ các vi sinh vật đối
kháng với chúng.
Hiện nay, ngời ta đã tìm ra các cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh dựa
vào các chủng vi sinh vật đối kháng nh:
+ Sự cạnh tranh về dinh dỡng. Các chủng vi sinh vật đối kháng thờng phát
triển nhanh làm biến đổi dinh dỡng và không gian sống của vi sinh vật gây
bệnh.
+ Sinh chất kháng nấm
+ Tăng sức đề kháng ở vật chủ: Một số chủng vi sinh vật có khả năng kích
thích sự tạo thành các chất chống chịu ở vật chủ.
+ Tác động trực tiếp vào tác nhân gây bệnh: một số chủng vi sinh vật có khả
năng sinh ra enzim thuỷ phân ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác,
phân giải thành thành tế bào hay tạo ra các lỗ rò dẫn tới sự rò rỉ tế bào
Nghiên cứu các vi sinh vật đối kháng thì nấm đối kháng là một nội dung mới mẻ
và quan trọng, đang đợc đầu t ở Việt Nam.
II.Phơng pháp nghiên cứu
- Trong nội dung báo cáo này đề cập đến một số kỹ thuật phân lập nấm
bệnh và nấm đối kháng phục vụ cho nghiên cứu ảnh hởng của nấm đến
cây trồng cũng nh sản xuất ra các chế phẩm sinh học nhờ những nghiên
cứu ấy.
23
1.Kỹ thuật mồi nấm gây bệnh
* Nguyên tắc:
- Sử dụng mô của cây chủ sạch bệnh để bắt các vi sinh vật gây bệnh cho
cây cùng loại. Vi sinh vật có trong đất sẽ bị thu hút bởi mô thực vật mà nó

có thể sống kí sinh và gây bệnh trên đó, nhờ vậy ta tách riêng đợc chủng
VSV cần nghiên cứu.
* Cách tiến hành:
- Lấy mẫu đất bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh lấy từ cánh đồng, mang vào
phòng thí nghiệm, phơi khô và nghiền nhỏ.
- Lấy 100g đất cho vào đĩa Petri đã khử trùng, thêm nớc cất khử trùng để
làm ẩm
- Cắt lá cây chủ sạch bệnh kích thớc 1cm
2
đặt vào đĩa đó (khoảng 10 miếng
trên một đĩa).
- Giữ đĩa petri chứa đất ở nhiệt độ phòng và quan sát sự phát triển của nấm
trên mô chủ dới kính hiển vi độ phóng đại x10.
- Cấy chuyển sang môi trờng WA (hình 1) hoặc môi trờng trung gian PDA
cho đến khi tạo thành canh trờng thuần khiết (hình 2)
- Các bớc trên thực hiện trong box cấy vô trùng
Sơ đồ tiến hành: H1
* Phạm vi ứng dụng:
- Phơng pháp này dùng để phân lập nấm gây bệnh trong đất
- Cũng có thể phân lập nấm có trong mô thực vật bằng cách đặt mẫu cần phân
lập lên đất đã khử trùng sạch bệnh để nấm xâm nhiễm và đợc nhân lên nhờ
đất. Sau đó phân lập nấm bệnh từ đất theo các bớc trên.
2. Kỹ thuật tách vi sinh vật gây bệnh
* Nguyên tắc:
- Nuôi mô thực vật bị nhiễm nấm bệnh trên môi trờng nuôi cấy phù hợp
để nấm phát triển mạnh mẽ tạo thành khuẩn lạc, nhờ đó tách riêng chúng.
* Cách tiến hành:
- Các thành phần gây bệnh ở thực vật tập trung trên lá cây hoặc trên vỏ
cành cây con và quả. Những mẫu đó đợc đa tới PTN làm sạch dới vòi nớc
chảy, sau đó khử trùng bề mặt bằng Clorox 10%.

24
- Cắt mảnh lá rộng 1-2mm
2
chứa một nửa mô sạch và một nửa mô bệnh,
sau đó ngâm trong Clorox 10% trong 5 phút
- Cấy mô đã khử trùng bề mặt trên môi trờng WA, và giữ ở nhiệt độ
phòng.
- Quan sát khuẩn lạc của nấm mốc mọc lên trong môi trờng đó và cấy
chuyển nhiều lần sang môi trờng WA hoặc PDA cho đến khi tạo đợc canh
trờng thuần khiết.
- Các bớc trên thực hiện trong box cấy vô trùng
Sơ đồ tiến hành: H2
* Phạm vi ứng dụng:
- Phân lập đợc các chủng nấm gây bệnh trực tiếp từ mô thực vật.
3.Phơng pháp pha loãng
* Nguyên tắc:
- Nuôi cấy dung dịch loãng chứa VSV ở các nồng độ khác nhau trên môi
trờng phù hợp để tạo thành các khuẩn lạc. Nuôi cấy tách riêng các khuẩn
lạc đó để thu đợc các chủng nấm riêng biệt.
* Cách tiến hành
- Cho 1g đất mẫu vào trong ống nghiệm đã khử trùng
- Thêm 10ml nớc cất khử trùng để hoà tan đất sau đó lắc đều trong 20-30
phút.
- Pha loãng mẫu đất đã hoà tan trong nớc cất khử trùng và cấy lên môi tr-
ờng thạch thích hợp, mỗi độ pha loãng lấy 0.1ml.
- Giữ ở nhiệt độ 24-30
o
C trong vài ngày và đếm khuẩn lạc.
- Cấy chuyển nhiều lần trên môi trờng thích hợp để tạo ra khuẩn lạc thuần
khiết

- Các bớc trên thực hiện trong box cấy vô trùng
Sơ đồ tiến hành: H3
* Phạm vi ứng dụng:
- Phân lập VSV trong đất
- Xác định hàm lợng VSV trong đất
4. Mồi bắt vi sinh vật đối kháng:
25