tiểu luận kỹ thuật di truyền- kỹ thuật rapd (random amplified polymorphic dna)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
o0o
MÔN HỌC: KỸ THUẬT DI TRUYỀN
CHỦ ĐỀ: KỸ THUẬT RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)
GVHD: THS. TRẦN THỊ DUNG
NHÓM THỰC HIỆN:
1. BÙI MINH TRÍ 61203161
2. HUỲNH THUẬN PHÁT 61203109
3. NGUYỄN THỊ NGỌC TRINH 61203163
I. Giới thiệu:
_ Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những
primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân
bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các
primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực
hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các
đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau.
_ Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu
nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá
thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Một trong những giới
hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di
truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị các primer 23 tương
ứng.
_ Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một
giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thập kỷ 90, một kỹ
thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random
amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí
nghiệm khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991).
Hình ảnh một trong các bước thực hiện phương pháp RAPD (PCR)
II. Nguyên lý:
_ Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước: Tách

chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR; điện di trên gel agarose
hoặc gel polyacrylamid; xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần
mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập
dendrogram)

Hình ảnh của kỹ thuật PCR
_ Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được
nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự
nucleotide ngẫu nhiên. Thường primer này chứa từ 9 - 12 oligonucleotit,
tối thiểu là 4 bp. Có hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhưng số
lượng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế.
_ Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau
ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm
trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 - 2000 nucleotide) thì
đoạn DNA sẽ được nhân lên.
_ Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di trên
gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn toàn
hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các
primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các đoạn
tương đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một
phương pháp có hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide
giữa các cá thể 24.
Ví dụ: tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer ở cây
Arabidopsis thaliana là 0,5 / 1 primer ở cây đậu tương, 1 / 1 primer ở ngô.
III. Các ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật RAPD:
1. Ưu điểm:
_ Về mặt kỹ thuật:
+ Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần
biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu.
+ Thao tác đơn giản.

+ Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao.
+ Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.
_ Về mặt kinh tế:
+ Chi phí thực hiện thấp.
+ Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ
thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân
tử có độ tin cậy cao
_ Chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide của đoạn
DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa
hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ DNA tính bằng nanogam và
trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn.
_ Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa
hình. Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ
thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác
lai tạo hoặc phân loại.
_ Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể
tiến hành với các bước như sau:
+ Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.
+ Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.
+ Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông
dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.).
Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và
nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị
RAPD cũng được sử dụng cho những mục đích sau:
+ Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một
tính trạng nào đó như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng
kháng virus ở cà.
+ Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.
+ In dấu vân tay (DNA fingerprinting).
+ Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal

variation).
2. Nhược điểm:
_ Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng
chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế như sau:
+ Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những
gen lặn hay cá thể dị hợp tử.
+ Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không
thống nhất.
+ Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.
+ Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân.
_ Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao.
_ Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp).
_ Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng
xuất hiện đa hình thấp
_ Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không
cao.
IV. Những khác biệt của RAPD với PCR:
_ Do tính chất ghép cặp ngẫu nhiên nên primer vừa là primer xuôi
vừa là primer ngược.
_ RAPD không cho băng nhân bản nếu:
+ Không có trình tự nu giống trình tự primer trong genom của
đối tượng nghiên cứu.
+ Có các trình tự này nhưng lại cũng nằm trên một sợi hay
các trình tự nằm ở hai sợi quá xa nhau hay khi ghép cặp các primer không
hướng vào nhau.
_ Phải sử dụng nhiều primer khác nhau mới có thể phát hiện được
những đa hình hay các khác biệt của genom của đối tượng nghiên cứu.
_ Có thể dùng phối hợp vài primer cùng một phản ứng để tăng số
băng nhân bản.
V. Ứng dụng:

_ Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD được phát minh và
sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin
cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm dễ thực hiện và
chi phí thấp.
_ Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:
+ Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các đối
tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây,
cà chua,… Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm,
chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình
cao.
+ Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã được áp
dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau như:
Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not, Corynespra cassiicola,
Rhizoctonia solani,
+ Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa
dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gene và kiểu hình phản ánh
bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam
VI. Những cải tiến của kỹ thuật RAPD:
+ Kỹ thuật thứ nhất: sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau
thay vì sử dụng 1 primer như kỹ thuật RAPD thông thường. Phương pháp
này có thể làm tăng hoặc giảm đi số băng so với khi sử dụng một primer.
Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp
cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa
hình.
+ Kỹ thuật thứ hai: cắt DNA bằng các enzyme giới hạn
trước hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra
hai kết quả. Một là có thể làm giảm số lượng các băng khó xác định
(complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di
truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình. Tuy
nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lược nhằm làm tăng

số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt được các chỉ thị đồng trội. Những cải
tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc
độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn