tách chiết và chuyển hóa chlorophylla từ vi khuẩn cyano bacteria

ĐA
̣
I HO
̣
C QUÔ
́
C GIA HA
̀
NÔ
̣
I
TRƯƠ
̀
NG ĐA
̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƯ
̣
NHIÊN
  


TRÂ
̀
N THI
̣
HIÊ

̀
N


TCH CHIT V CHUYN HA CHLOROPHYLL A
TƯ
̀
VI KHUÂ
̉
N CYANO BACTERIA





LUÂ
̣
N VĂN THA
̣
C SI
̃
KHOA HO
̣
C

H Ni - 2011

ĐA
̣
I HO
̣
C QUÔ
́
C GIA HA
̀
NÔ
̣
I
TRƯƠ
̀
NG ĐA
̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƯ
̣
NHIÊN
  


TRÂ
̀
N THI

̣
HIÊ
̀
N


TCH CHIT V CHUYN HA CHLOROPHYLL A
TƯ
̀
VI KHUÂ
̉
N CYANO BACTERIA


Chuyên nga
̀
nh: Hoá hữu cơ
M s: 60 44 27


LUÂ
̣
N VĂN THA
̣
C SI
̃
KHOA HO
̣
C

NGƢƠ
̀
I HƢƠ
́
NG DN KHOA HC
TS. Đoa
̀
n Duy Tiên

H Ni - 2011


MỤC LỤC

CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN
DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
BẢNG
HÌNH
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 3
1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp. 3
1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn .3
1.1.2 Chlorophyll 10
1.2 Giới thiệu về ngành vi khuẩn lam ( ngành cyanobacteria) 14
1.2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn lam 14
1.2.2 Cấu tạo tế bào 16
1.2.3 Phân loại 16
1.2.4 Ý nghĩa thực tiễn 17
1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nƣớc và quốc tế 18

1.4 Các dẫn xuất của chlorophyll a 19
1.5 Sinh tổng hợp chlorophyll a 20
1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic 20
1.5.2 Sinh tổng hợp pyrol (porphobilinogen) 21
1.5.3 Quá trình đóng vòng của 4 vòng pyrol (tetrapyrol) 22
1.5.4 Đƣa ion Mg
2+
vào hệ thống vòng 24
1.6 Tổng hợp toàn phần chlorophyll a theo Woodward 25
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27
2.1 Mục tiêu thực nghiệm 27
2.2 Xác định các tính chất vật lý. 27
2.2.1 Sắc kí bản mỏng 27
2.2.2 Phổ hồng ngoại (IR) 27

2.2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 27
2.2.4 Phổ khối (MS) 27
2.2.5 Phổ tử ngoại 27
2.3 Nội dung nghiên cứu 27
2.3.1 Nội dung 1 27
2.3.2 Nội dung 2 29
2.3.3 Nội dung 3 30
2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bằng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến,
phổ cộng hƣởng từ hạt nhân và phổ khối. 31
2.4.1 Cấu trúc của pheophytin a 31
2.4.2 Cấu trúc của metyl pheophobide a 32
2.4.3 Cấu trúc của chlorin e
6
– trimetylester 33
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Tách chiết và chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a. 34
3.2 Thực hiện phản ứng chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a. . 38
3.3 Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin – e
6
trimetylester 42
CHƢƠNG 4 : KẾT LUẬN 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG BÀI LUẬN VĂN

PS : Hệ thống quang hợp
IR : Phổ hồng ngoại
UV – VIS : Phổ tử ngoại và khả kiến
MS : Phổ khối lượng
1
H – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H.
MPP : Metyl pheophobide a
PP : Pheophytin a
ATP : Adenosin Triphotphat
NADP : Nicotinamit Adenin Dinucleotitphotphat
LHC : Phức hợp thu nhận ánh sáng



DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau 11

Bảng 3.1: Bảng dữ liệu phổ
1
H-NMR của pheophytin a 35
Bảng 3.2: Bảng dữ liệu phổ
1
H-NMR của metyl pheophobide a 39
Bảng 3.3: Bảng dữ liệu phổ
1
H-NMR của chlorin e
6
- trimetylester 44

HÌNH
Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ 3
Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp 4
Hình 1.3: Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía …………………… 5
Hình 1. 4: Hấp thụ ánh sáng của hệ thống ăng ten trong thực vật ……… 6
Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp………….……………………… 6
Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas
virdis 7
Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển của màng thylakoid 8
Hình 1.8: Cố định Cacbon C
6
theo chu trình Calvin-Benson. 9
Hình 1.9: Cố định cacbon theo chu trình C
4
10
Hình 1.10: Công thức cấu tạo của chlorophyll a 11
Hình 1.11. Tế bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena 15
Hình 1.12: Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự nhiên 18

Hình 1.13: Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang 20
Hình 1.14: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glyxin và sucxinyl-CoA 21
Hình 1.15: Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic 21
Hình 1.16: Quá trình tổng hợp vòng pyrol 22
Hình 1.17: Sự tạo thành tetrapyrol 22
Hình 1.18: Quá trình đóng vòng của tetrepyrol 23
Hình 1.19: Quá trình tạo thành protophyrin IX 23
Hình 1.20: Quá trình hình thành phân tử chlorophyll a
[10,30,33]
24

Hình 1.21: Tổng hợp chlorophyll a theo Woodward. 25
Hình 2.1: Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a 28
Hình 2.2: Chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a 29
Hình 2.3: Chuyển hoá trực tiếp thành metyl pheophobide a từ vi khuẩn lam 30
Hình 2.4: Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e
6
- trimetylester 31
Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của pheophytin a 36
Hình 3.2: Phổ UV – VIS của Pheophytin a 36
Hình 3.3: Phổ khối của pheophytin a 37
Hình 3.4: Phổ
1
H-NMR của pheophytin a 37
Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của metyl pheophobide a 40
Hình 3.6: Phổ UV – VIS của metyl pheophobide a 40
Hình 3.7: Phổ khối của metyl pheophobide a 41
Hình 3.8: Phổ
1
H – NMR của pheophobide a 41

Hình 3.9: Phổ UV – VIS của chlorin e
6
- trimetylester 45
Hình 3.10: Phổ hồng ngoại của chlorin e
6
- trimetylester 45
Hình 3.11: Phổ khối của chlorin e
6
– trimetylester 46
Hình 3.12: Phổ
1
H – NMR của chlorin e
6
- trimetylester 46


1
MỞ ĐẦU

Từ lâu các nhà khoa học rất quan tâm tới việc chiết tách các sắc tố từ lá xanh
của thực vật bậc cao. Cách đây hơn 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất
màu xanh từ lá và gọi chúng là Chlorophyll. Vào năm 1913, Richard Willstatter,
nhà hóa học người Đức đã chỉ ra rằng tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời
và cây xanh có một cách nào đó để hấp thụ năng lượng này. Tới năm 1919, ông đã
giải thích được chức năng của hợp chất hấp thụ năng lượng mặt trời chính là
Chlorophyll. Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ năng lượng bức xạ và
chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể.
Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang hợp, là chất
hấp thụ năng lượng ánh sáng trong hệ quang hợp. Chlorophyll chuyển năng lượng
ánh sáng thành năng lượng hóa học trong phân tử ATP, trong quá trình này xảy ra

các phản ứng chuyển dịch electron (phản ứng oxy hóa khử).
Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng là một đối tượng nghiên cứu hấp dẫn
và trở thành một lĩnh vực phát triển rộng lớn và được các nhà khoa học quan tâm
bao gồm các nghiên cứu về hệ thơm, khả năng hấp thụ ánh sáng, chuyển dời điện
tích, tính chất phổ, sinh tổng hợp và các nghiên cứu y dược.
Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng có nhiều ứng dụng khác nhau trong y
học và công nghiệp. Trong y học, chlorophyll được dùng như một thành phần cơ
bản trong khẩu phần ăn kiêng và thuốc chữa bệnh. Chẳng hạn, Cu-chlorophyllin
phòng chống ung thư từ thức ăn bị thiu mốc chứa hydrocacbon mạch vòng,
aflatoxin. Chlorophyll và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất nhạy sáng để
tiêu diệt các tế bào ung thư và chống virus, chất chữa vết thương và khử mùi hôi.
Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã
bị hư hại và ngăn cản tác hại của các chất gây ung thư. Chlorophyll còn có lợi cho
hệ tiêu hóa và có tác dụng dưỡng da.
Một số dẫn xuất chlorophyll có hoạt tính sinh học quí giá như tiêu diệt tế bào
ung thư tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma) theo cơ chế quang trị


2
liệu. Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis), chữa trị u xơ, giảm
mùi hôi, giảm đường máu của người bệnh cao tuổi.
Chlorophyll là một nhóm các hợp chất đa dạng bao gồm chlorophyll (a, b, c,
d,…), trong đó chlorophyll a phổ biến nhất trong tự nhiên, đó là chlorophyll trong
hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển và vi khuẩn quang hợp. Trong thực vật
bậc cao hệ thống quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và chứa nhiều loại chlorophyll
khác nhau. Quá trình tách các chlorophyll ra khỏi nhau rất khó khăn và phức tạp.
Trong các loại vi khuẩn quang hợp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quang hợp đơn
giản nên việc phân lập dễ dàng hơn. Vì vậy tôi đã lựa chọn “ Tách chiết và chuyển
hoá chlorophyll a từ vi khuẩn cyano bacteria” làm đề tài cho luận văn cao học của
mình. Mục tiêu của luận văn là tìm ra qui trình tách chiết chlorophyll a một cách

hiệu quả ở qui mô phòng thí nghiệm và chuyển hóa chúng để thu được các hợp chất
làm trung gian cho quá trình tổng hợp các hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp
quang, các chất màu thực phẩm, tổng hợp các hợp chất hấp thụ ánh sáng sử dụng
cho pin mặt trời và các sensor.








3
CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp
1.1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp ở thực vật và vi khuẩn
Quang hợp là cơ sở năng lượng của sự sống trên trái đất. Chlorophyll hấp thụ
năng ánh sáng mặt trời và chuyển quang năng thành hóa năng bởi trung tâm phản
ứng trong hệ quang hợp của vi khuẩn và thực vật dưới dạng NADPH và ATP được
sử dụng để tổng hợp cacbohydrat (hình 1.1).



Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ
Các chlorophyll hấp thụ và biến quang năng thành hoá năng với hiệu suất cao.
Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) được phân loại theo cấu trúc của trung tâm
phản ứng chia thành PSI của vi khuẩn lam, PSII của thực vật bậc cao và PS của vi
khuẩn tía đều bao gồm bốn thành phần chính là ăng-ten thu sáng, trung tâm phản
ứng, trung tâm chuyển điện tử và bộ máy cố định cacbon.

[3,5]




4

Hình 1.2: Các hệ thống quang hợp.
[28]

Trung tâm phản ứng của vi khuẩn tía gồm các tiểu đơn vị protein L và M liên
kết với các sắc tố hoạt động và có đối xứng bậc hai. Trung tâm phản ứng được bao
quanh bởi hệ thống ăng ten thu sáng (LH1). Các electron được chuyển vào trung
tâm phản ứng của một heme-binding cytochrome (cyt).
Trong PSII gồm protein D1 và D2 có cấu trúc và chức năng tương đồng với
các tiểu đơn vị L và M của trung tâm phản ứng ở vi khuẩn. Năng lượng ánh sáng
được hấp thụ bởi LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi protein-chlorophyll
CP43 và CP47. Quá trình chuyển dời điện tích thực hiện bởi phức hợp của mangan
để ôxi hóa nước và giải phóng oxi vào khí quyển.
Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một heterodimer giống PSII.
Mỗi PsaA và PsaB bao gồm một trung tâm phản ứng tương đương với D1 hoặc D2
và một ăng ten tương đương với CP43 hoặc CP47. Điện tử được lấy từ
plastocyanin (PC) ở bên trên lumen và chuyển đến sắt sunfua (FeS) ở phía trên
stroma để khử NADP
+
thành NADPH
[28]
.

5
Hệ thống ăng ten (hình 1.3 và hình 1.4) được tổ chức để thu nhận năng lượng
bằng chuyển electron từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích và chuyển tới
trung tâm phản ứng là nơi phản ứng quang hoá diễn ra. Cấu tạo của ăng ten LH1
bao gồm một heterodimer của chuỗi peptit và hai phân tử chlorophyll a hoặc b. LH2
bao gồm một heterodimer của chuỗi peptit và ba phân tử chlorophyll a hoặc b. Các
sắc tố khác như caroten (hình 1.5) không hoạt động hoá học nhưng có chức năng
như một ăng ten.

Hình 1.3 : Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tía.
[29]

Hệ thống ăng ten tăng hiệu quả hấp thụ photon bằng cách tăng số lượng sắc tố
để hấp thụ trong dải sóng từ 400nm-800nm. Nếu cường độ của ánh sáng mặt trời
thấp, mỗi phân tử chlorophyll chỉ hấp thụ một vài photon trong một giây. Bằng
cách kết hợp nhiều chất màu để hấp thụ ánh sáng hiệu suất quang có giá trị cao
nhất.
[1,4,7,12,15,26,27,29]



6

Hình 1. 4: Hấp thụ ánh sáng của hệ thống ăng ten trong thực vật
[15]

OH
OH
O
O

OH
OH
OH
OH
Zeaxanthin
Violaxanthin
Lutein
ß-Carotene

Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp.

Trung tâm phản ứng của hệ quang hợp bao gồm hàng trăm chlorophyll và
một cặp chlorophyll có tổ chức đặc biệt, nhờ cấu tạo này mà sự chuyển dời điện
tích xảy ra để thực hiện phản ứng khử NAD
+
thành NADPH. Phản ứng ở trung
tâm phản ứng loại I không có sự tạo thành oxy trong khi ở trung tâm phản ứng
loại II oxy được tạo thành.
Trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis bao gồm bốn
tiểu đơn vị protein (hình 1.6) và các nhóm hoạt động bao gồm chlorophyll dime có
tổ chức đặc biệt, hai phân tử pheophytin, phân tử quinon Q
A
, phân tử quinon Q
B
và


7
một ion sắt (Fe). Chuỗi chuyển dời điện tích bắt đầu từ Chlorophyll monome phía
bên trái qua chlorophyll dime sang pheophytin đến Chlorophyll monome phía bên

phải rồi qua pheophytin phía bên phải tới Quinon A sang Fe và chuyển về
pheophytin phía bên trái và trở về Chlorophyll monome ban đầu. Năng lượng kích
thích của electron đã được sử dụng để tổng hợp ATP cao năng từ ADP. Đó chính là
cơ sở và bản chất của quá trình quang hợp.


Hình 1.6: Cấu trúc trung tâm phản ứng trong hệ quang hợp
của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis .
[6]



8
Chuỗi vận chuyển điện tử là những hệ thống của các protein và enzyme thông
qua đó các electron di chuyển từ mức năng lượng cao hơn về một mức độ năng
lượng thấp một cách điều hòa để nâng cao hiệu quả sử dụng năng lượng (hình 1.7).
Trong chuỗi vận chuyển điện tử của màng thylakoid bao gồm các enzym khử sắt,
plastoquinon oxidoreductase và enzym ATP syntase. Dòng electron tách ra từ phân
tử nước tới NADP dưới tác dụng của PS. Chuỗi vận chuyển proton thực hiện qua
màng thylakoid và được sử dụng để tổng hợp ATP. Khi các electron di chuyển vào
chuỗi vận chuyển, các protein luân phiên bị oxi hoá và giải phóng ra proton đi vào
trong màng thylakoid. Nếu không có chuỗi vận chuyển điện tử từ trạng thái năng
lượng cao đến trạng thái năng lượng thấp thì sự mất mát năng lượng xảy ra quá
nhanh dẫn đến các tế bào sử dụng năng lượng ánh sáng với hiệu suất quá thấp.

Hình 1.7: Chuỗi eletron vận chuyển của màng thylakoid
Cacbohydrat được tổng hợp từ khí cacbonic và nước trong pha tối của bộ máy
cố định cacbon bằng cách sử dụng xúc tác enzyme và năng lượng từ ATP hoặc
NADPH theo chu trình Calvin-Benson C
6

(hình 1.8) hoặc chu trình C
4
(hình 1.9).


9

Hình 1.8: Cố định Cacbon C
6
theo chu trình Calvin-Benson
Cố định Cacbon dioxit theo chu trình Calvin-Benson C
6
xảy ra trong stroma
của lục lạp gồm 3 chuỗi phản ứng khác nhau. Pha đầu là phản ứng của dẫn xuất
đường 5 ribulose-1,5-bisphotphat với CO
2
và phân cắt dẫn xuất đường 6 thành hai
phân tử 3-photphoglyxerat. Pha hai là quá trình tái tạo cơ chất ribulose-5-photphat
còn pha ba là phản ứng của ribulose-5-photphat với ATP tạo thành ribulose-1,5-
bisphotphat. Quá trình cố định CO
2
xúc tác bởi enzym ribulose-1,5-bisphosphat
cacboxylase oxygenase (RuBisCO), phản ứng của RuBisCO với O
2
hoặc CO
2
phụ
thuộc vào nồng độ tương đối của chúng. Trong tất cả các sinh vật, CO
2
là chất nền

ưu tiên, nếu nồng độ CO
2
trở nên thấp hơn nhiều so với nồng độ oxy thì sự hô hấp
xảy ra ở mức độ đáng kể.



10


Hình 1.9: Cố định cacbon theo chu trình C
4

Ở một số loại thực vật, cơ chất cho quá trình cố định CO
2
là
phosphoenolpyruvate (PEP) theo chu trình C
4
. Tỷ lệ sử dụng ATP cho cố định CO
2

trong thực vật theo chu trình C
4
cao hơn so với chu trình C
6
.
1.1.2 Chlorophyll
1.1.2.1 Cấu tạo và tính chất của chlorophyll
1.1.2.1.1 Cấu tạo
Có 5 loại chlorophyll bao gồm chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c,

chlorophyll d, chlorophyll e. Ở thực vật bậc cao chỉ có 2 loại chlorophyll a và b; còn
chlorophyll c, d, e có ở vi sinh vật, rong, tảo, vi khuẩn.


11
Về công thức cấu tạo, phân tử chlorophyll a chia ra hai phần: nhân chlorophyll
và đuôi phân tử chlorophyll.
Mg
N
N
N
N
O
MeOOC
O
O phytyl
phytyl =
chlorophyll a
E
1
R
R

Hình 1.10: Công thức cấu tạo của chlorophyll a


Chlorophyll a
Chlorophyll b
Chlorophyll c1
Chlorophyll c2

Chlorophyll d
Công thức
phân tử
C
55
H
72
O
5
N
4
Mg
C
55
H
70
O
6
N
4
Mg
C
35
H
30
O
5
N
4
Mg

C
35
H
28
O
5
N
4
Mg
C
54
H
70
O
6
N
4
Mg
Nhóm C3
-CH=CH
2

-CH=CH
2

-CH=CH
2

-CH=CH
2

-CHO
Nhóm C7
-CH
3

-CHO
-CH
3

-CH
3

-CH
3

Nhóm C8
-CH
2
CH
3

-CH
2
CH
3

-CH
2
CH

3

-CH=CH
2

-CH
2
CH
3

Nhóm C17
-CH
2
CH
2
COO-
Phytyl
-CH
2
CH
2
COO-
Phytyl
-CH=CHCOOH
-CH=CHCOOH
-CH
2
CH
2
COO -

Phytyl
Liên kết
C17-C18
Đơn
Đơn
Kép
Đơn
Kép
Tần suất
Phổ biến
Đa số thực vật
Các loại tảo
khác nhau
Các loại tảo
khác nhau
Vi khuẩn lam
(cyanobacteria)

Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau

Nhân chlorophyll là phần quan trọng nhất trong phân tử diệp lục, gồm 1
nguyên tử Mg ở trung tâm liên kết với 4 nguyên tử N của 4 vòng pyrol trong đó có


12
2 liên kết phối trí. Phần nhân chlorophyll bao gồm 4 vòng pyrol liên kết với nhau
qua liên kết metylen, do có mạch liên hợp dài, phân tử chlorophyll có khả năng hấp
thụ ánh sáng rất mạnh.
Đuôi phân tử chlorophyll là gốc rượu phytol có 20 nguyên tử cacbon. Đuôi
chlorophyll có tính ưa lipit nên có vai trò định vị phân tử chlorophyll trên màng

quang hợp thilakoit có tính lipit.
1.1.2.1.2 Tính chất của chlorophyll
 Bản chất hoá học của chlorophyll
Chlorophyll không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ. Khi
muốn chiết xuất chlorophyll ra khỏi lá xanh phải dùng các dung môi như este,
axeton, rượu, benzen.
Chlorophyll là este của axit chlorophyllic với hai rượu là phytol và metanol
nên chúng có các phản ứng đặc trưng của một este là phản ứng xà phòng hoá khi tác
dụng với kiềm để tạo nên muối chlorophylat vẫn có màu xanh.
Mg
N
N
N
N
O
MeOOC
COO Phytyl
+2NaOH
Chlorophyll a
Mg
N
N
N
N
O
NaOOC
COONa
+ CH
3
OH

+ C
20
H
39
OH

Chlorophyll tác dụng với axit để tạo nên hợp chất pheophytin có kết tủa màu
nâu, trong đó nhân Mg bị thay thế bới 2H. Pheophytin không hoạt động huỳnh
quang như diệp lục. Điều đó chứng tỏ nguyên tử Mg có vai trò rất quan trọng quyết
định tính chất quang hóa của diệp lục.


13
N
NH
HN
N
O
MeOOC
COO Phytyl
Mg
N
N
N
N
O
MeOOC
COO Phytyl
+2H
+

+ Mg
2+
Chlorophyll a Pheophytin a

Pheophytin có thể tác dụng với một kim loại khác và kim loại này sẽ đẩy 2H
để thay thế vào vị trí của Mg trong phân tử chlorophyll tạo nên hợp chất có màu
xanh rất bền. Trong môi trường axit mạnh, đun nóng, pheophytin có thể bị thủy
phân liên kết este với rượu phytol tạo thành hợp chất pheophorbide.
Sự mất màu của diệp lục: Chlorophyll ở trong tế bào khó bị mất màu vì nằm
trong phức hệ với protein và lipit. Trong dung dịch, có ánh sáng và O
2
, chlorophyll
sẽ mất màu do phản ứng quang oxi hoá.
 Tính quang học của diệp lục
Tính huỳnh quang: Khi quan sát ánh sáng phản xạ từ dung dịch chlorophyll
thấy dung dịch có màu huyết dụ, nếu tắt nguồn sáng thấy dung dịch có màu xanh
như cũ.
Tính lân quang: cũng gần tương tự như huỳnh quang nhưng chỉ khác là khi tắt
nguồn sáng thì ánh sáng màu huyết dụ còn lưu lại một thời gian ngắn nữa.
1.1.2.1.3 Vai trò của chlorophyll trong hệ quang hợp
Hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời: nhờ cấu trúc đặc trưng của phân tử
chlorophyll mà nó có thể hấp thụ năng lượng ánh sáng với hiệu suất cao.
Vận chuyển năng lượng vào trung tâm phản ứng: từ phân tử chlorophyll hấp
thu ánh sáng cho đến trung tâm phản ứng của quang hợp phải qua một hệ thống cấu
trúc trong màng thilakoid gồm rất nhiều phân tử chlorophyll khác nhau. Năng lượng
ánh sáng phải truyền qua các phân tử chlorophyll để đến được trung tâm phản ứng.
Tham gia biến đổi năng lượng ánh sáng thành năng lượng hoá học tại trung
tâm phản ứng.

14
1.2 Giới thiệu về ngành vi khuẩn lam ( ngành cyanobacteria)
1.2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn lam
Vi khuẩn lam có sức sống rất dẻo dai, chúng phân bố rộng rãi trong tất cả các
môi trường. Đại bộ phận sống trong nước ngọt, ở các ao hồ có nhiều chất hữu cơ và
góp phần hình thành hệ sinh vật nổi (plankton) của các thủy vực; một số phân bố
trong nước mặn hoặc nước lợ, bùn lầy hay đất ẩm ướt, trên đá, trên vỏ cây ẩm, ngay
cả những nơi có điều kiện rất khắc nghiệt như trong tuyết và ở những suối nước
nóng đến 69°C.
Vi khuẩn lam thuộc loại ưa nhiệt, có tính bền vững với nhiệt độ. Nhiều loài có
thể phát triển ở nhiệt độ cao, cả trong các suối nước nóng (70 - 80°C). Tảo lam có
thể chịu được nhiệt độ cao như vậy là nhờ trạng thái keo đặc biệt của chất nguyên
sinh. Mặt khác, một số vi khuẩn lam cũng có khả năng tồn tại ở nhiệt độ thấp
(những vi khuẩn sống trong băng tuyết, hay ở Nam cực, nhiệt độ tới -83°C vẫn tìm
thấy một lượng lớn vi khuẩn Nostoc).
Vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao (vào các tháng nóng trong năm). Với
các vi khuẩn nước ngọt, nhiệt độ phát triển thích hợp là 30°C.
Khi sinh trưởng phát triển mạnh, vi khuẩn gây nên hiện tượng “nước nở hoa”.
Tuy nhiên, một số loài thuộc chi Oscillatoria lại gây “nước nở hoa” trên băng ở
nhiệt độ gần 0°C. Khi có hiện tượng “nước nở hoa” do vi khuẩn lam gây ra thì nước
không sử dụng được vì khi đó sinh khối của tảo đạt tới mức khá lớn (tối đa tới 450-
500g/m
3
) mà trong đó rất ít loài có thể dùng làm thức ăn cho các sinh vật khác, sau
đó chúng chết hàng loạt và phân hủy. Các chất do vi khuẩn tiết ra và các sản phẩm
phân hủy của chúng khi chết đều gây hại.
Trong số các cơ thể tự dưỡng được thì vi khuẩn lam được xem là nhóm
nguyên thủy nhất. Di tích hóa thạch của các vi khuẩn lam dạng sợi phát hiện được
cách nay khoảng 3,5 tỷ năm. Mặc dầu tế bào không có cấu trúc phức tạp so với các
vi khuẩn khác nhưng nó vẫn là đại diện có vai trò quan trọng ở các hệ sinh thái. Vi

khuẩn lam là sinh vật quang hợp đầu tiên tổng hợp chất hữu cơ và cũng là tế bào
đầu tiên có hai hệ thống tiếp nhận ánh sáng (hệ thống quang loại I và II) và giải


15
phóng O
2
. Nhiều loài vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm, chuyển Nitơ trong khí
quyển từ thể tự do sang dạng Nitơ sử dụng được như amoni (

4
NH
), amino axit và
một loạt hợp chất nitơ khác.
Vi khuẩn lam chưa có nhân điển hình, không có màng nhân, vật chất di truyền
được tập trung trong chất nhân (nucleoid), không có lưới nội sinh chất, ty thể, thể
golgi, lạp thể và không mang roi, chỉ chứa chlorophyll, sắc tố liên kết với protein
thường làm cho chúng có màu lam (có khả năng tự dưỡng). Chúng cũng chưa có sự
sinh dục hữu phái.
Về tổ chức cơ thể, vi khuẩn lam có cấu tạo đơn giản, một số có dạng đơn bào,
phần lớn dưới dạng tập đoàn hay đa bào hình sợi, hình chuỗi hạt đơn hay phân
nhánh.
Đại đa số tế bào vi khuẩn lam dạng sợi – chuỗi hạt thường có tế bào dị hình (dị
bào). Dị bào là những tế bào đặc biệt, lớn hơn các tế bào bình thường khác, có màng
đôi, dày, trong suốt, không có oxy và không có hệ thống quang II do đó không sản
xuất ra oxy trong quá trình quang hợp. Dị bào có 1 hoặc 2 lỗ (ở đầu tiếp xúc với tế
bào dinh dưỡng) tùy theo vị trí ở đầu hay ở giữa sợi (đặc biệt trong phân loại) qua
đó lưu thông tế bào chất với các tế bào nằm cạnh nó. Khoảng cách của dị bào trên
sợi chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường. Dưới kính hiển vi quang học, chất tế
bào trông đồng nhất nhưng dưới kính hiển vi điện tử nó có một hệ thống màng,

thường có màu xanh vàng do có chlorophyll a và caroten nhưng thiếu phycoxyanin.
Dị bào có vai trò trong việc cố định đạm trong điều kiện hiếu khí.


Hình 1.11. Tế bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena


16
Trong sự phát triển của sợi, sợi có thể bị tách ra ở bên cạnh các dị bào này và
tạo thành một nhánh mới đi ra từ sợi chính. Đó là sự phân nhánh giả của sợi, phân
biệt với sự phân nhánh thật được bắt đầu từ một tế bào sinh dưỡng nào đó của sợi
phân chia dọc và sau đó tế bào non mới hình thành tiếp tục phân chia tạo nhánh bên.
1.2.2 Cấu tạo tế bào
Màng tế bào vi khuẩn lam khá dầy, gồm 4 lớp, bên ngoài thường hóa nhầy, có
khi tạo thành bao chuyên hóa, bao xung quanh tế bào hoặc nhóm tế bào hay toàn bộ
sợi.
Chất nguyên sinh ở vi khuẩn lam được phân biệt thành 2 phần:
- Phần ngoài tập trung các phiến mỏng quang hợp (lamen), thể ri bô và các thể
hạt (hạt chất tế bào) khác.
- Phần trong chứa chất nhân (nucleoprotein). Ở giữa ranh giới giữa 2 phần
không rõ ràng chỉ nhận ra khi dùng phẩm Feulgen nhuộm trung bào chất chứa chất
nhân.
Các chất màu (sắc tố) phân bố trên các lamen ở phần ngoài nên phần này có
màu (xanh đen hoặc xanh lục).
Chất màu gồm có: chlorophyll a (có màu lục); phycoxyanin màu lam và
phycoerythrin màu hồng và các dẫn xuất của caroten, oxycaroten.
Chất dự trữ của tế bào là glycogen, volutin, không có tinh bột.
1.2.3 Phân loại
Ngành vi khuẩn lam có khoảng 1500 - 2000 loài, tập hợp thành một số bộ, họ
khác nhau. Hiện nay con số các bộ không thống nhất tuỳ theo tác giả. Có người chia

ngành này thành 3 lớp với nhiều bộ, có người lại chia thành 1 lớp với 4 bộ:
Bộ Chroococcales: Vi khuẩn đơn bào, đơn độc hay tập đoàn. Tế bào tròn
không phân biệt gốc và đỉnh, không có nội và ngoại bào tử.
Tế bào đơn độc hay tập đoàn nhưng không sắp xếp thành hàng hay sợi (họ
Chroococcaceae), thường gặp như: Chroococcus, Microcystis.
Bộ Dermocarpales: đơn bào.
Bộ Pleurocapsales: Vi khuẩn đa bào dạng sợi đơn, có phân nhánh hoặc không,


17
sinh sản cách phân chia tế bào hoặc nội bào tử.
Các chi điển hình: Cyanocystis, Pleurocapsa.
Bộ Hormogonales: đa bào dạng sợi lông, hoặc phân nhánh, thường có tế bào
dị hình, có khi sợi lại tập hợp thành tập đoàn.
Các chi điển hình: Nostoc, Anabaena, Aphanizomenon,
Tác giả khác lại chia thành 2 bộ: Chroococcales với những dạng đơn bàn hay
tập đoàn và Hormogonales với những dạng đa bào.
1.2.4 Ý nghĩa thực tiễn
Trong thực tiễn, vi khuẩn lam có vai trò tích cực và tiêu cực
Trong nông nghiệp, vai trò quan trọng của vi khuẩn lam là làm tăng độ phì cho
đất nhờ khả năng cố định đạm. Hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng 50 loài, phần
lớn thuộc họ vi khuẩn chuỗi (Nostocaceae) có khả năng này. Ðặc biệt đáng chú ý là
loài Anabaena azollae cộng sinh trong bèo hoa dâu, một loại cây dùng làm phân
xanh và làm thức ăn gia súc có ý nghĩa kinh tế rất lớn ở nước ta.
Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ sự phát triển của vi khuẩn lam trong
ruộng lúa mà hằng năm mỗi hécta đất trồng lúa có thể lấy được thêm từ không khí
khoảng 15 - 50 kg nitơ, trung bình là 20 - 25 kg, đôi khi thu được đến 80 kg hay
nhiều hơn nữa.
Những năm gần đây, một số vi khuẩn lam có hàm lượng protein cao như
Spirulina maxima, S. platensis được nuôi trồng với quy mô công nghiệp để thu sinh

khối nhằm bổ sung nguồn protein cần thiết cho chăn nuôi và cho con người.
Vi khuẩn lam tích lũy ở đáy thủy vực, tham gia vào việc hình thành bùn
sapropen được dùng làm phân bón, thức ăn gia súc giàu vitamin, chế biến làm than
cốc, khí hơi và dùng chữa bệnh
Một số vi khuẩn lam được dùng làm thức ăn cho người như Nostoc commune,
Nostoc pruniforme. Ðây là một loại thực phẩm ngon và quí đối với người Trung
Quốc, giàu protein và vitamin.
Ngoài ra, cùng với vi khuẩn và các động vật nguyên sinh, vi khuẩn lam còn được
dùng làm sạch sinh học các nguồn nước thải ra từ sản xuất công nghiệp.


18
Vi khuẩn lam cũng có những tác dụng tiêu cực: khi phát triển mạnh chúng gây
hiện tượng "nước nở hoa' làm giảm phẩm chất của nước, ảnh hưởng tới động vật
đáy và biến đổi hệ sinh thái thủy vực.
Vi khuẩn lam ít có ý nghĩa dinh dưỡng đối với động vật phù du, do chúng có
cấu trúc màng nhầy, động vật thường không sử dụng được và chúng thường sinh ra
độc tố. Chỉ có một số ít cá sử dụng một số vi khuẩn lam để ăn.
1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nƣớc và quốc tế
Quốc tế: Chlorophyll a được phân lập vào năm 1913 và cấu trúc hoàn chỉnh
đã được xác định vào năm 1940 bởi Hans Fischer. Sự phân lập chlorophyll a từ các
nguồn tự nhiên rất khó khăn do các phản ứng phân hủy như: đề kim loại hóa, đề
phytyl hóa, oxi hóa quang hóa, solvat hóa, allomerization và đề metoxycacbonyl
hóa. Chlorophyll a đóng vai trò rất quan trọng trong hệ thống quang hợp do khả
năng hấp thụ ánh sáng và biến đổi quang năng thành hoá năng với hiệu xuất cao,
quá trình này xảy ra trong hệ quang hợp của thực vật bậc cao, tảo biển và vi khuẩn
quang hợp.
[11,18,19,31,32]

Mg

N
N
N
N
O
MeOOC
O
O phytyl
Mg
N
N
N
N
O
MeOOC
O
O phytyl
CHO
Mg
N
N
N
N
O
MeOOC
O
O phytyl
CHO
phytyl =
chlorophyll a

E
R
R
chlorophyll b chlorophyll d
1
2
3


Hình 1.12: Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự nhiên
Chlorophyll và các dẫn xuất của nó là một đối tượng rất hấp dẫn cho các
nghiên cứu lý thuyết hóa hữu cơ như cấu trúc điện tử, tính thơm, quá trình chuyển
dời điện tử, quang hóa và quá trình quang hợp. Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp
chlorophyll a cũng đạt được những thành tựu to lớn .
[11,18,19,32]