phân tích hoạt chất kích thích sinh trưởng axit giberillic trong rau xanh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



CAO THỊ HƯỜNG




PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG AXIT
GIBERILLIC TRONG RAU XANH




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC





Hà Nội – Năm 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Cao Thị Hường

PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG AXIT
GIBERILLIC TRONG RAU XANH

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. TẠ THỊ THẢO


Hà Nội – Năm 2
MỤC LỤC




MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Khái niệm về chất kích thích sinh trƣởng 2
1.2. Tổng quan về axit giberillic(GA3) 4

1.2.1. Đặc điểm cấu tạo, tính chất hóa học 4
1.2.2. Vai trò của GA3 với sinh trƣởng cây trồng 5
1.2.3. Độc tính 7
1.2.4. Dƣ lƣợng GA3 trong cây trồng 7
1.3. Phƣơng pháp xác định axit giberellic 8
1.3.1. Phƣơng pháp trắc quang UV-VIS 8
1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký hiệu năng cao 8
1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản động học mixen 9
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 11
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 11
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 11
2.1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 11
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 11
2.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch chiết 11
2.2.2. Dụng cụ 12
2.2.3. Thiết bị 12
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 12
2.4. Điều kiện phân tích 14
2.4.1. Tiến trình phân tích 14


2.4.2. Tính toán 14
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15
3.1. Nghiên cứu điều kiện tối ƣu xác định GA3 theo phổ UV-VIS 15
3.1.1. Phổ hấp phụ 15
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng các yếu tố đến phép đo 16
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của thể tích etanol 16
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ HCl 17
3.1.2.3. Ảnh hƣởng của thể tích nƣớc 18
3.1.3. Khảo sát trên điều kiện tối ƣu theo mặt mục tiêu 19

3.2. Đánh giá phƣơng pháp 23
3.2.1. Đƣờng chuẩn 23
3.2.1.1. Xây dựng đƣờng chuẩn 23
3.2.1.2. Giới hạn phát hiện LOD 26
3.2.1.3. Giới hạn định lƣợng LOQ 27
3.2.2. Khảo sát điều kiện chiết giberillic trong rau xanh 27
3.2.3. Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp 29
3.2.3.1. Độ chụm 29
3.2.3.2. Độ đúng 32
3.3. Phân tích hàm lƣợng GA3 trong phân bón 32
3.4. Phân tích dƣ lƣợng GA3 trong mẫu rau 33
KẾT LUẬN 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 : Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc KTST
Bảng 3.1 : Độ hấp thụ quang của GA3 khi thay đổi thể tích etanol
Bảng 3.2 : Độ hấp thụ quang của GA3 khi thay đổi nồng độ HCl
Bảng 3.3 : Độ hấp thụ quang khi thay đổi thể tích nƣớc
Bảng 3.4 : Bảng qui hoạch thực nghiệm xác định điều kiện tối ƣu
Bảng 3.5 : Kết quả thực nghiệm trong thiết kế thực nghiệm
Bảng3.6 : Các hệ số hồi quy thu đƣợc từ thực nghiệm
Bảng 3.7 : Độ hấp thụ quang ở các nồng độ xây dựng đƣờng chuẩn
Bảng 3.8 : Bảng giá trị b„ ở các nồng độ
Bảng 3.9 : Bảng giá trị SS và S
2

Bảng 3.10 : Ảnh hƣởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất thu hồi

Bảng 3.11 : Hàm lƣợng hoạt chất GA3 trong các mẫu điều tra
Bảng 3.12 : Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn
Bảng 3.13 : Hàm lƣợng GA3 trong các mẫu phân bón
Bảng 3.14 : Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc KTST trên rau cải theo thời gian
Bảng 3.15: Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc KTST trên rau diếp cá theo thời gian
Bảng 3.16: Kết quả xác định dƣ lƣợng thuốc KTST trên rau muống theo thời gian


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 : Công thức cấu tạo của GA3
Hình 1.2 : GA3 phân hủy kìm hãm sinh trƣởng DELL
Hình 3.1 : Phổ của GA3
Hình 3.2 : Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng GA3 trong khoảng tuyến tính
Hình 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi
Hinh 3.4 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau cải
Hình 3.5 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau diếp cá
Hình 3.6 : Diễn biến dƣ lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng trên rau muống
Hình 3.7 : Các đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất kích thích sinh trƣởng
với thời gian trên mẫu khảo nghiệm rau cải
Hình 3.8 : Các đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất kích thích sinh trƣởng
với thời gian trên mẫu khảo nghiệm rau diếp cá
Hình 3.9 : Các đồ thì thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất kích thích sinh trƣởng
với thời gian trên mẫu khảo nghiệm rau muống

BNG Kí HIU CC CH VIT TT

STT
Ký hiu
Chỳ thớc
1
BVTV
Bảo vệ thực vật
2
KTST
Kích thích sinh tr-ởng
3
LOD
Giới hạn phát hiện
4
LOQ
Giới hạn định lng
5
MRL
Mức d- l-ợng tối đa cho phép ( mg/kg)

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề đáng báo động với ngƣời
dân và các cấp quản lý. Nhiều vụ việc nhƣ sử dụng những hoá chất cấm trong nuôi
trồng, chế biến nông thủy sản, thực phẩm, sản phẩm kém chất lƣợng lƣu hành trên
thị trƣờng đang gây ảnh hƣởng xấu đến xuất khẩu và tiêu dùng, các vụ ngộ độc
thực phẩm ngày càng gia tăng, trong đó có ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật (BVTV),
càng làm bùng lên sự lo âu của ngƣời tiêu dùng.
Một trong nhiều nguyên nhân gây ra thực trạng ô nhiễm hóa chất BVTV trong
nông sản là chi phí phân tích cao, đầu tƣ thiết bị phân tích lớn, quá trình phân tích
sử dụng nhiều dung môi hữu cơ độc hại, quy trình phân tích phức tạp…Vì vậy việc
phát triển các phƣơng pháp phân tích theo hƣớng thân thiện với môi trƣờng, chi phí
thấp, cách làm đơn giản là phƣơng án cần chú trọng.
Trƣớc tình trạng chạy theo lợi nhuận lạm dụng thuốc kích thích sinh trƣởng
trên rau tại các vùng sản suất rau ở Hà Nội, Hà Tây nên việc điều tra thống kê, tiến
hành khảo nghiệm loại thuốc kích thích sinh trƣởng đang sử dụng là hết sức cần
thiết để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng, để làm cơ sở cho
công tác quản lý.
Trên cơ sở điều tra luận văn sẽ tập trung vào loại thuốc KTST dùng phổ biến
nhất. Phƣơng pháp phân tích đƣợc xây dựng theo hƣớng hóa học xanh sử dụng ít
dung môi hữu cơ, dùng các chất vô cơ không độc hại, quy trình phân tích đơn giản.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN


1.1. Khái niệm chất kích thích sinh trƣởng
Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng, cây trồng cần các chất
cơ bản nhƣ nƣớc, cacbon dioxit, chất khoáng, chất dinh dƣỡng…Sự phát triển cây
trồng còn phụ thuộc vào một số yếu tố bên ngoài ( ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm …) và
yếu tố bên trong của cây ( hoạt động của các phản ứng sinh hóa, trong đó có sự
tham gia của một số hóa chất)[14].
Ở thực vật cũng nhƣ động vật, sự điều tiết quá trình chuyển hóa, sinh trƣởng,
phát triển… phụ thuộc vào những tín hiệu hóa học, gọi là các hormon ( bắt nguồn từ
tiếng Hy Lạp horman là kích thích ). Các hormon giữ một vị trí quan trọng trong
việc điều tiết các quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây. Các chất điều tiết sinh
trƣởng thực vật chia thành hai nhóm : các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức
chế sinh trƣởng. Sự cân bằng giữa hai nhóm này quyết định đến quá trình sinh
trƣởng phát triển của cây.
Các hormon thực vật ( planthormon ) là các chất hữu cơ có bản chất hóa học
khác nhau, đƣợc tổng hợp với lƣợng rất nhỏ ở các cơ quan bộ phận nhất định của
cây và từ đó chuyển đến những cơ quan bộ phận khác. Chúng tham gia điều tiết các
quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây, duy trì mối quan hệ giữa các cơ quan, bộ
phận trong cây. Tùy thuộc vào từng loại chất điều hòa sinh trƣởng mà chúng có thể
tham gia vào các quá trình cơ bản nhƣ [5]:
- Điều khiển các quá trình ra lá, phát triển chồi, tăng trƣởng chiều cao và

đƣờng kính thân cây.
- Điều khiển quá trình ra hoa, đậu quả chính vụ và trái vụ.
- Điều khiển quá trình ra rễ cho cây, cành giâm cành chiết.
- Điều khiển quá trình bảo quản hoa, quả trên cây và trong kho.
- Điều khiển quá trình già của các bộ phận của cây.
3

Để nghiên cứu ảnh hƣởng của từng chất, ngƣời ta có thể phun trực tiếp lên
từng bộ phận của cây trồng các chất riêng biệt ở các nồng độ khác nhau.
Hiện nay có ba con đƣờng thu nhận các chất điều hòa sinh trƣởng: Chiết xuất
từ thực vật, bằng con đƣờng lên men vi sinh vật, và bằng con đƣờng tổng hợp hóa
học.
+ Con đƣờng chiết xuất từ thực vật: Các chất điều hòa sinh trƣởng đều có
mặt trong các bộ phận của cây trồng, nhƣng chúng ở nồng độ rất thấp, do vậy bằng
con đƣờng chiết xuất thì thực vật thì hiệu suất thu hồi thấp, dẫn tới giá thành cao. Vì
vậy, trong thực tế nếu chất nào có thể thu nhận đƣợc bằng con đƣờng hóa học hoặc
vi sinh vật thì không bao giờ thu nhận bằng phƣơng pháp chiết xuất từ thực vật.
+ Thu nhận bằng con đƣờng lên men vi sinh vật: Chất điều hòa sinh trƣởng
nổi tiếng và mang lại nhiều ứng dụng nhất là gibberellin đã đƣợc thu nhận bằng con
đƣờng này. Bằng những kỹ thuật lên men, các nhà khoa học đã nuôi cấy nấm Fusa-
rium moniliforme Trong quá trình phát triển nấm Fusarium moniliforme đã tổng
hợp đƣợc chất kích thích sinh trƣởng gibberellin và tiết vào môi trƣờng lên men.
Bằng kỹ thuật tách chiết, gibberellin đã đƣợc tách khỏi nuôi cấy và kết tinh dƣới
dạng tinh thể màu trắng. Ở Việt Nam, gibberellin cũng đã đƣợc thu nhận đƣợc bằng
con đƣờng lên men vi sinh vật đang ứng dụng rộng ở Việt Nam.
+ Thu nhận bằng con đƣờng hóa học: Có nhiều chất điều hòa sinh trƣởng
đƣợc sản xuất bằng đƣờng hóa học nhƣ nhóm chất auxin, etilen… Đây là con
đƣờng sản xuất kinh tế nhất. Hiện nay ở nƣớc ta thu nhận các chất nhƣ auxin, ety-
len bằng con đƣờng hóa học đang đƣợc tiến hành phổ biến ở một số Viện và các
Trung tâm hóa học.

Chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc đƣa vào cây trồng dƣới các hình thức: phun
lên cây; ngâm củ, cành vào dung dịch; bôi lên cây; tiêm trực tiếp lên cây. Tuỳ theo
mục đích và yêu cầu mà ngƣời ứng dụng các chất điều hòa sinh trƣởng có thể sử
dụng một trong trong những phƣơng pháp trên, hoặc có thể cùng sử dụng vài
phƣơng pháp cho cùng một đối tƣợng nghiên cứu và sản xuất [5].
4

1-Phun lên cây: Dùng để phun cho các cây trồng lấy lá hoa, quả và thân. Nồng độ
phun đƣợc tính bằng mg/lít. Tùy từng giai đoạn phát triển của cây mà có nồng độ
phun thích hợp. Trong một đời cây có thể phun nhiều lần. Khi phun chú ý điều kiện
ngoại cảnh để nâng cao hiệu quả hấp thụ của cây.
2-Ngâm củ, cành vào dung dịch: Để tăng thời gian tiếp xúc và khả năng hấp thu,
ngƣời ta có thể ngâm các củ và cành vào dung dịch có chứa chất điều hòa sinh
trƣờng có nồng độ thích hợp.Trƣờng hợp này dùng để kích thích nẩy mầm, phá ngủ
một số củ và hạt, nhân nhanh các giống cây bằng phƣơng pháp giâm cành để kích
thích cành giâm nhanh ra rễ.
3- Bôi lên cây: Khi hai phƣơng pháp trên không thực hiện đƣợc thì ngƣời ta dùng
phƣơng pháp bôi trực tiếp dung dịch có nồng độ đậm đặc hơn lên cây. Chất điều
hòa sinh trƣởng có thể đƣợc nhào trộn với các chất mang khác nhau (ví dụ nhƣ cao
lanh…) thành một chất dẻo để đắp lên cây. Trƣờng hợp này thƣờng dùng để chiết
cành cây giống, tạo cho cành chiết nhanh ra rễ.
4-Tiêm trực tiếp lên cây: phƣơng pháp này chủ yếu dùng trong công tác nghiên
cứu ứng dụng. Ví dụ, tiêm thẳng vào chồi, vào mắt ngủ của củ hoặc vào thân cây
(qua từng đốt, lóng…), qua đó xác định hiệu ứng của từng chất điều hòa sinh trƣởng
ở các nồng độ khác nhau lên đối tƣợng nghiên cứu.
Hiện nay đã biết đƣợc 5 nhóm hormon thực vật gồm: Auxin, giberellin, cy-
tokintin, axit abscisic và etilen. Trong đó nhóm kích thích tăng trƣởng gồm: Auxin,
gibberellin, cytokinin, còn nhóm có tác dụng ức chế sinh trƣởng là: Axit abscisic và
etilen và các chất giải phóng etilen.
1.2. Tổng quan về axit giberillic (GA3)

1.2.1. Đặc điểm cấu tạo, tính chất hóa học
Axit giberelic (GA3) là chất có nhiều ứng dụng nhất trong nhóm Giberellin.
Hoạt chất đƣợc các nhà hóa học Nhật Bản phân lập và xác định cấu trúc từ những
năm 30 của thế kỷ XX. Đây là chất có cấu trúc phân tử phức tạp, gồm các nhị vòng
và 8 trung tâm không gian. Mỗi cấu trúc có hoạt tính sinh học riêng và tác động lên
5

cây trồng theo những cách khác nhau. Tùy vào mục đích sử dụng, ngƣời ta có thể
tạo ra những đồng phân có cấu trúc phù hợp đƣợc xác định. [14]

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của GA3
GA3 có khối lƣợng mol 346,4 đvc, thể kết tinh rắn nhiệt độ nóng chảy 223 –
225
0
C đƣợc công ty ICI Plant Protection ( bây giờ là tập đoàn Syngenta AG) lần
đầu tiên đƣa vào nông nghiệp ở dạng sản phẩm thƣơng mại.
Một trong những quá trình có liên quan đến cơ chế tác động của giberellin
đƣợc nghiên cứu khá kỹ, là hoạt động của enzyme thủy phân trong các hạt họ lúa
nảy mầm. Giberellin gây nên sự giải ức chế gen màchịu trách nhiệm tổng hợp các
enzyme này mà trong hạt đang ngủ nghỉ chúng hoàn toàn bị trấn áp bằng các pro-
tein histon. Giberellin đóng vai trò nhƣ là chất cảm ứng mở gen để hệ thống tổng
hợp protêin enzyme thủy phân hoạt động. Ngoài vai trò cảm ứng hình thành enzyme
thì gibberellin còn có vai trò kích thích sự giải phóng các enzyme thủy phân vào nội
nhũ xúc tiến quá trình thủy phân các polime thành các monome kích thích sự nảy
mầm của các loại hạt
Axit giberellic là chất ổn định, dễ bắt cháy và không tƣơng thích với các axit
và các chất ôxi hóa mạnh
1.2.2. Vai trò của GA3 với sinh trƣởng cây trồng
Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của GA3 là kích thích mạnh mẽ sự sinh trƣởng
kéo dài của thân, sự vƣơn dài của lá. Hiệu quả này có đƣợc là do GA3 kích thích

mạnh lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc. Vì vậy khi xử lý giberellin cho cây đã
làm tăng nhanh sự sinh trƣởng dinh dƣỡng nên làm tăng sinh khối của cây. Dƣới tác
6

động của gibberellin làm cho thân cây tăng chiều cao rất mạnh (đậu xanh, đậu
tƣơng thành dây leo, cây đay cao gấp 2 – 3 lần). Nó không những kích thích sự sinh
trƣởng mà còn thúc đẩy sự phân chia tế bào. GA3 kích thích sự nảy mầm, nảy chồi
của các mầm ngủ, của hạt và củ, do đó nó có tác dụng trong việc phá bỏ trạng thái
ngủ nghỉ của chúng. Hàm lƣợng gibberellin thƣờng tăng lên lúc chồi cây, củ, căn
hành hết thời kỳ nghỉ, lúc hạt nảy mầm. Trong trƣờng hợp này gibberellin kích
thích sự tổng hợp của các enzyme amilaza và các enzyme thuỷ phân khác nhƣ pro-
tease, photphatase và làm tăng hoạt tính của các enzyme này, vì vậy mà xúc tiến
quá trình phân hủy tinh bột thành đƣờng cũng nhƣ phân hủy các polime thành mo-
nome khác, tạo điều kiện về nguyên liệu và năng lƣợng cho quá trình nảy mầm.
Trên cơ sở đó, nếu xử lý gibberellin ngoại sinh thì có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ
của hạt, củ, căn hành kể cả trạng thái nghỉ sâu.[15]
Trong nhiều trƣờng hợp gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt. Ảnh hƣởng
đặc trƣng của sự ra hoa của gibberellin là kích thích sự sinh trƣởng kéo dài và
nhanh chóng của cụm hoa. Gibberellin kích thích cây ngày dài ra hoa trong điều
kiện ngày ngắn. [5]
Gibberellin ảnh hƣởng đến sự phân hóa giới tính của hoa, ức chế sự phát
triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực. Gibberellin có tác dụng giống aux-
in là làm tăng kích thƣớc của quả và tạo quả không hạt. Hiệu quả này càng rõ rệt khi
phối hợp tác dụng với auxin.
Gibberellin thƣờng đƣợc sử dụng trong các thí nghiệm là GA3 hay axit gib-
berellic có tác dụng chính là kéo dài tế bào (cellular elongation) thông qua việc
phân hủy một nhóm protein kìm hãm sinh trƣởng ở thực vật là DELLA protein.
7

Hình 1.2. GA3 phân hủy kìm hãm sinh trƣởng DELL
1.2.3. Độc tính GA3
Axit giberillic có thể có tác động nhƣ là một chất gây kích thích dị ứng đối
với mắt. Liều gây tử vong đối với 50% mẫu chuột cống thử nghiệm bằng đƣờng
miệng là 6,300 mg/kg. Các chỉ dẫn về an toàn sức khỏe là S26: Nếu tiếp xúc với
mắt, cần rửa mắt ngay lập tức bằng nhiều nƣớc và tìm kiếm hỗ trợ y tế, S36: Sử
dụng quần áo bảo hộ lao động thích hợp.[5]
1.2.4. Dƣ lƣợng GA3 trong cây trồng [11]
Về mức dƣ lƣơng cho phép (MRL – Maximum Residue Level) của Gibberel-
lin trên rau là 0,001 ppm.[5]
Năm 1995, Cục Bảo vệ Môi trƣờng Hoa Kỳ (nơi cấp phép cho các hóa chất
đƣợc sử dụng trong nông nghiệp) đã xếp GA3 nằm ở nhóm chất độc nhóm II. EPA
cho phép sử dụng GA3 ở Hoa Kỳ mà chƣa có cảnh báo cụ thể về ảnh hƣởng của nó
đối với môi trƣờng cũng nhƣ vật nuôi và sinh vật hoang dã (theo Environmental
Protection Agency, 1995). Tổ chức WHO và một số nƣớc khác cũng xếp GA3 vào
nhóm độc II. Tại New zealand cũng không áp dụng mức dƣ lƣợng tối đa cho phép
(MRL) đối với GA3 mà chỉ cần điều kiện dùng <200 ha/năm. Tại Đài Loan, MRL
của GA3 đối với rau là 5 mg/kg, Nhật Bản là 0,2mg/kg. Có thể nói GA3 tƣơng đối
an toàn cho ngƣời sử dụng rau quả.
8

Ngày nay trên thị trƣờng GA3 đƣợc sản xuất bởi các hãng khác nhau mang
các tên thƣơng phẩm khác nhau, chẳng hạn nhƣ 920 (BSI), Berelex (ICI), Gib-Tabs
(Elanco), Gib-sol (Elanco), pro-Gibb (Abbott), Pro-Gibb Plus (Abbott), Activol
1.3. Các phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng GA3
1.3.1. Phƣơng pháp trắc quang UV – VIS
Phƣơng pháp phổ quang học đƣợc đề xuất bởi Holbrook et al (1961), đây là
một trong những phƣơng pháp đơn giản nhất và đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định
GA3 trong nghiên cứu sự lên men. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện bằng cách cho
thêm HCl vào mẫu và đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 254nm trong 75 phút.

Trong suốt thời gian đó, độ hấp thụ quang tăng đến giá trị lớn nhất sau đó giảm dần.
Điều này đƣợc giải thích là do ảnh hƣởng của hai phản ứng: (i) GA3 chuyển thành
axit gibberellenic (GE) và GE phân hủy thành gibberic và axit allogibberic. Những
chất đó không hấp thụ trong khoảng UV.[16]
Xử lý mẫu: Mẫu thực chứa GA3 ở dạng dung dịch đƣợc chuyển vào phễu
chiết 100ml. Điều chỉnh pH của mẫu bẳng dung dịch HCl 0,1M sao cho pH nằm
trong khoảng 1 đến 2. Tiến hành chiết GA3 bằng 20ml CH
3
COOC
2
H
5
. Phần dịch
chiết thu đƣợc tiếp tục mang đi chiết với 20, 15 và 10ml dung dịch đệm photphat
(pH= 7,4). Thu phần dịch chiết vào bình định mức 50ml. Dùng đệm photphat pH =
7.4 định mức đến vạch, ta thu đƣợc mẫu phân tích.
Xác định GA3 bằng cách lấy 1ml mẫu đã đƣợc xử lý nhƣ trên cho vào bình
định mức 10ml, thêm 1ml etanol tuyệt đối. Sau đó định mức bằng HCl 3.75M đến
vạch. Đo độ hấp thụ quang ở 254nm và ghi 20s một lần giá trị trong 2 phút.
1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động
là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc
biến đổi bằng lien kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa
trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích thƣớc (rây phân
tử).
9

Để xác định GA3 bằng phƣơng pháp HPLC sử dụng cột tách 5µm Betasil C
8

250mm x 46mm. Pha động chứa 35% methanol và 65% nƣớc. Điều chỉnh pH của
pha động bằng axit H
3
PO
4
sao cho pha động luôn có pH 3.0. Tốc độ dòng 1ml/phút.
Xử lý mẫu: Mẫu đƣợc lọc qua màng lọc có kính thƣớc lỗ 42 và đƣợc điều
chỉnh pH bằng HCl 0.1M để pH 3.0. Lấy 3,0ml mẫu trên cho ống thủy tinh 10ml.
Thêm 4ml CH
3
COOC
2
H
5
vào ống thủy tinh chứa mẫu. Hỗn hợp này đƣợc lắc trong
4 phút để GA3 đƣợc chiết vào trong CH
3
COOC
2
H
5
. Tiến hành chiết, ta thu đƣợc
dịch chiết, tiếp đến dịch chiết này cho vào một ống thủy tinh khác có chứa NaHSO
4

để loại nƣớc. Tiếp đến dung dịch thu đƣợc chuyển vào một ống thủy tinh khác và
đƣợc làm bay hơi trong chân không để loại bỏ CH
3
COOC

2
H
5
ở 35
o
C. Thêm 0,3ml
pha động vào ống dung dịch GA3 và những phần còn lại. Dung dịch mẫu đƣợc lọc
ở màng lọc 0,45 µm. Sau 30 phút đem đi phân tích bằng HPLC.[15]
Ngoài ra, còn có thể xác định dƣ lƣợng axit giberillic trên thiết bị HPLC-
MS/MS [14]. Với phƣơng pháp này việc xử lý mẫu dựa vào phƣơng pháp sử dụng
axetonitrin để chiết dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật ra khỏi nông sản, tách lớp hữu
cơ và pha nƣớc ở trong mẫu bằng MgSO
4
. Làm sạch bằng cách chiết pha rắn (SPE)
để loại bỏ các axit hữu cơ, lƣợng nƣớc thừa, các hỗn hợp khác cùng với sự kết hợp
của chất hấp thụ (GCB) và MgSO
4
. Sau đó dịch chiết đƣợc phân tích bằng thiết bị
MS.
Điều kiện đo mẫu: cột tách là cột Agilent ZorbaxSB C18 (chiều dài: 15cm,
đƣờng kính: 4,6mm; nhiệt độ cột: 40
o
C), tốc độ dòng pha động là 0,7ml/phút, chế
độ ion hóa: APCI – negative, thế mao quản: 2500V, điện thế phân mảnh: 142V,
năng lƣợng va chạm: 34V.
1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản động học mixen (MEKC)
Phƣơng pháp động học mixen giống nhƣ phƣơng pháp sắc ký, nhƣng phƣơng
pháp MECK sử dụng hiện tƣợng điện học để thực hiện quá trình phân bố chất tách.
Để xác định GA3 sử dụng mao quản không phủ silica có độ dài 57cmx50µm
ở nhiệt độ 25

o
C. Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, mao quản đƣợc rửa bằng dung
dịch NaOH 0,1M trong khoảng 15 phút. Sau đó mao quản đƣợc rửa tiếp bằng dung
10

dịch đệm của MECK trong khoảng 15 phút. Mẫu và dung dịch chuẩn đƣợc bơm vào
ở áp suất 0,5 psi trong 4 giây. Thế trong suốt quá trình tách là +30kV. Sử dụng de-
tector UV ở bƣớc sóng 214nm. Mỗi thí nghiệm chạy 3 lần.[16]
Nhu vậy, ta thấy rằng trong các phƣơng pháp xác định Giberillic thì phƣơng
pháp trắc quang UV-VIS đơn giản, sử dụng ít hóa chất, thiết bị sử dụng ít và chí phí
thấp. Chính vì vậy chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp này để xác định dƣ lƣợng
axit gibberillic trong rau xanh.

11


CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật trong nông nghiệp đã, đang và sẽ trở
thành công cụ không thể thiếu đối với nƣớc ta, song chúng cũng gây ra những tác
động không mong muốn cho con ngƣời và môi trƣờng. Điều tra cuả cục BVTV cho
thấy thực trạng báo động về ô nhiễm hóa chất và vi sinh vật độc theo từng đối tƣợng
nông sản, theo từng năm, và có chiêu hƣớng tăng lên, không thể kiểm soát đƣợc
nhất là tại các vùng chuyên canh, sản xuất mang tính hàng hóa. Đặc biệt tình trạng
sử dụng thuốc kích thích tăng trƣởng tràn lan không rõ nguồn gốc trên rau xanh.[11]
Vì vậy việc xác định dƣ lƣợng của các loại thuốc kích thích tăng trƣởng hiện
nay đang sử dụng là rất cần thiết để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho ngƣời
tiêu dùng.
Đối tƣợng nghiên cứu trong đề tài luận văn là phân tích đánh giá dƣ lƣợng
GA3 trong một số mẫu rau diếp cá, rau cải và rau muống thu thập tại một số chợ ở
Hà Nội.
2.1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
- Xây dựng phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợng axit Giberillic rau trên máy
quang phổ UV-VIS 1601.
- Xác định hàm lƣợng thuốc kích thích sinh trƣởng sử dụng phổ biến trên
rau.
- Phân tích dƣ lƣợng GA3 trong mẫu rau.

2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch chiết
Các loại hóa chất dùng trong phân tích đều thuộc loại hóa chất tinh khiết
phân tích (PA) gồm:
- Chất chuẩn Gibberellic axit 98%
12

- Etanol tuyệt đối
- HCl đặc 37%
- Natrihidrophotphat (Na
2
HPO
4
)
- Kalidihidrophotphat (KH
2
PO
4
)
- Etylaxetat (CH
3
COOC
2
H
5
)
* Dung dịch chuẩn
+ Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml
Cân khoảng 0.01 gam chất chuẩn GA3 chính xác tới 10
-5

g vào bình định mức
10ml, hòa tan và định mức tới vạch định mức bằng etanol tuyệt đối đƣợc dung dịch
gốc.
+ Dung dịch chuẩn làm việc
Bằng cách pha loãng liên tục và định mức bằng etanol tuyệt đối đƣợc các
dung dịch chuẩn có mức nồng độ chuẩn làm việc 2, 4, 6, 8, 10 µg/ml.
* Dung dịch chiết
Hòa tan 4,3g muối Na
2
HPO
4
và 1,1790g muối KH
2
PO
4
trong 800ml nƣớc
cất, để nguội và định mức thành 1lit thu đƣợc dung dịch chiết pH=7,42.
2.2.2. Dụng cụ
- Bình định mức 10ml, 50ml, 100ml, 1000ml, loại A
- Ống đong dung tích 100ml, 50ml
- pipet chia vạch loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml
- Phễu chiết 100ml
- Bình đựng mẫu chiết
2.2.3. Thiết bị
- Máy xay BL – 100, Coex
- Máy quang phổ UV-VIS 1601PC –Shimadu-Nhật, bƣớc sóng làm việc từ
190 – 900nm, cuvet thạch anh chiều dày 1 cm.
- Cân phân tích có độ chính xác đến 0,00001g
- Máy đo pH: pH meter 744
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

13

* Phương pháp khảo nghiệm:
Tiến hành thí nghiệm ở diện tích hẹp khoảng 1m
2
. Khảo nghiệm thuốc KTST
có nồng độ nhƣ bảng 2.1
Các mức nồng độ của thuốc khảo nghiệm đƣợc khảo sát trên cả 3 loại rau:
rau cải, rau diếp cá và rau muống.
Bảng 2.1 : Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc KTST
STT
Tên thuốc khảo nghiệm
Liều lƣợng
1
Tăng phọt 920
10ml/mg/m
2
2ml/mg/m
2
1ml/mg/m
2

2
Viên sủi GA3
10ml/mg/m
2

1ml/mg/m
2

3
An khang 20WT
10ml/mg/m
2

5ml/mg/m
2
4
Megafarm 200WT
10ml/mg/m
2
5ml/mg/m
2
* Phƣơng pháp phân tích
Tiến hành xác định GA3 bằng phƣơng pháp trắc quang UV-VIS: Lấy 1ml
mẫu phân tích cho vào bình định mức 10ml rồi thêm 1 ml etanol tuyệt đối. Định
mức bằng HCl 3,75M thu đƣợc 10ml mẫu. Sau đó mang đi đo độ hấp thụ quang ở
bƣớc sóng 254nm.
Dƣ lƣợng GA3 trong mẫu rau xử lý theo quy trình sau: Lấy 200gam rau
đƣợc rửa sạch, thái nhỏ từ 1-2cm . Rồi mang đi xay nhuyễn với một ít nƣớc, dung
dịch thu đƣợc lọc và lấy dung dịch. Lấy 10ml dung dịch thu đƣợc cho vào phễu
chiết 100ml, thêm 5ml HCl 0,1M. Tiến hành chiết 2 lần với 20ml etylaxetat. Phần
dịch chiết thu đƣợc, đƣợc cho thêm than hoạt tính (GCB), rồi mang đi quay li tâm
gạn lấy dung dịch. Phần dịch thu đƣợc chuyển vào phễu chiết 100ml, tiếp tục đƣợc
chiết với 20, 15 và 10ml dung dịch đệm photphat pH 7,4. Phần dịch chiết thu đƣợc,
14

đƣợc chuyển vào bình định mức 50ml. Dùng dung dịch đệm photphat pH 7,4 định
mức đến vạch mức, ta thu đƣợc 50ml mẫu.
2.4. Điều kiện phân tích

2.4.1. Tiến trình phân tích
- Xây dựng đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan giữa độ hấp thu quang và
nồng độ chất chuẩn của hợp chất Gibberellic tại các mức nồng độ 2, 4, 6, 8, 10, 20,
30 µg/ml.
- Xác định hàm lƣợng Gibberillic trong phân bón.
- Tiến hành phun lên rau (3 loại rau: rau cải, rau muống và rau diếp cá) các
loại phân bón với các liều lƣợng nhƣ ở bảng 2.1.
- Tiến hành chiết tách Gibberillic trong rau xanh.
- Sau khi chiết tách GA3 ra khỏi rau, mang đi đo độ hấp thụ quang và xác
định nồng độ dựa vào đƣờng chuẩn.
2.4.2. Tính toán :
Xác định dƣ lƣợng GA3 trong rau dựa vào đƣờng chuẩn. Dƣ lƣợng GA3 có
trong mẫu đƣợc xác định theo công thức sau:

m
PVCm
kgmgR

)/( 

Trong đó
- Cm: là nồng độ mẫu đƣa vào (µg/ml)
- V: Thể tích định mức cuối cùng trƣớc khi đem đo, ml
- m: khối lƣợng mẫu thử (g)
- P: Độ tinh khiết của mẫu, %

15



CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


3.1. Nghiên cứu điều kiện tối ƣu xác định GA3 theo phổ UV-VIS
3.1.1. Phổ hấp thụ
Chuẩn bị dung dich chuẩn gốc nồng độ 8µg/ml, tiến hành lấy chất theo thứ
tự sau: lấy 1ml GA3 chuẩn có nồng độ 8µg/ml cho vào bình định mức 10ml, thêm
1ml etanol tuyệt đối. Sau đó định mức bằng HCl 3,75M đến vạch mức ta thu đƣợc
10ml mẫu thử. Đem đo dải phổ trong khoảng 200–400nm với dung dịch so sánh là
mẫu trắng. Mẫu trắng đƣợc chuẩn bị bằng cách lấy 1ml etanol tuyệt đối vào bình
định mức 10ml, sau đó dùng dung dịch HCl 3,75M để định mức đến vạch mức ta
thu đƣợc 10ml mẫu trắng. Kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.1

Hình 3.1. Phổ của GA3
(cuvet 1 cm, nền mẫu dung dịch HCl 3,75M và etanol tuyệt đối, nồng độ GA3
50mg/ml)
16

Dựa vào kết quả trên ta thu đƣợc 1 cực đại của GA3 trong khoảng 200-
400nm tại bƣớc sóng 254nm. Do đó, chọn bƣớc sóng 254nm để đo GA3 trong các
thí nghiệm còn lại.
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng các yếu tố tới phép đo
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của thể tích etanol
Chuẩn bị dung dịch gốc nồng độ GA3 5µg/ml, giữ nồng độ HCl là 3,75M,
thể tích nƣớc là 0ml, thay đổi thể tích etanol thêm vào với các mức 0; 0,5; 1; 1,5;

2ml. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch tại λ = 254nm với dung dịch so sánh là
mẫu trắng chứa HCl và etanol tuyệt đối, đƣợc bảng kết quả 3.1.
Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang của GA3 khi thay đổi thể tích etanol
Thể tích etanol (ml)
0
0,5
1,0
1,5
2,0
Độ hấp thụ quang trung bình
(Ā)
0,123
0,12
0,151
0,149
0,137

Để xác định ảnh hƣởng của thể tích etanol đến độ hấp thụ quang, chúng tôi
tiến hành so sánh sai khác các kết quả thí nghiệm khi thay đổi các mức thể tích eta-
nol bằng các so sánh phƣơng sai do sự thay đổi mức nghiên cứu gây nên với
phƣơng sai chung σ
2
của thí nghiệm xem chúng có khác nhau đáng tin cậy hay
không. Nếu sự khác nhau không đáng tin cậy thì có thẻ kết luận thể tích etanol sẽ
ảnh hƣởng không đáng kể đến kết quả thí nghiệm và ngƣợc lại. Sử dụng phầm mềm
Minitab 14 ta thu đƣợc kết quả sau:
Nguồn
DF
SS
MS

F
P
V
C2H5OH
4
0,0018703
0,0004676
269,75
0,00
Sai số thí nghiệm
10
0,0000173
0,0000017


17

Tổng
14
0,0018876



S=0,001317
R-Sq=99,08%
R-Sq(adj)=98,71%
Kết quả trên cho ta thấy với độ tin cậy P = 95%, ta thu đƣợc trị số
P
value
=0.000 tức là nhỏ hơn α = 0,05, điều này chứng tỏ sự khác nhau giữa hai

phƣơng sai là có nghĩa tức là các giá trị trung bình trong những điều kiện khác nhau
là khác nhau. Nhƣ vậy là thể tích etanol có ảnh hƣởng đến độ hấp thụ quang. Tại
V
etanol
= 1ml thì A là lớn nhất (A = 0,155), độ hấp thụ quang ổn định. Do đó từ các
thí nghiệm sau độ hấp thụ quang A đo với V
etanol
= 1ml.
3.1.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ HCl
Chuẩn bị dung dịch gốc nồng độ GA3 5µg/ml, giữ thể tích etanol là 1ml, thể
tích nƣớc là 0ml, thay đổi nồng độ HCl thêm vào với các mức 3, 3.25, 3.5, 3.75,
4M, đo độ hấp thụ quang của dung dịch tại λ = 254nm với dung dịch so sánh là mẫu
trắng chứa nền mẫu là etanol và HCl. Mỗi mức nồng độ làm lặp lại 3 lần. Kết quả
thu đƣợc bảng 3.2:
Bảng 3.2. Đô hấp thụ quang của dung dịch GA3 khi thay đổi nồng độ HCl
Nồng độ HCl (M)
3,0
3,25
3,5
3,75
4,0
Độ hấp thụ quang trung bình
(Ā)
0,102
0,116
0,128
0,155
0,135

Để xác định sự ảnh hƣởng của nồng độ HCl đến độ hấp thụ quang, chúng tôi

tiến hành so sánh phƣơng sai do sự thay đổi các mức nồng độ HCl gây nên với
phƣơng sai chung của thí nghiệm xem chúng có khác nhau hay không với độ tin cậy
P = 95%. Sử dụng phần mềm Minitab 14 ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

18

Nguồn
DF
SS
MS
F
P
C
HCl
4
0,0046116
0,0011529
596,33
0,00
Sai số thí nghiệm
10
0,000193
0,0000019


Tổng
14
0,0000019

S=0,001390
R-Sq=99,58%
R-Sq(adj)=99,42%
Theo nhƣ tính toán trên, ta thu đƣợc P
value
= 0,000<0,05. Vậy có sự sai khác
có nghĩa giữa hai phƣơng sai, chứng tỏ nồng độ của axit HCl có ảnh hƣởng đến độ
hấp thụ quang. Dựa vào bảng kết quả 3.2 ta chọn C
HCl
= 3,75M để đo.
3.1.2.3. Ảnh hƣởng của nƣớc
Chuẩn bị dung dịch gốc nồng độ GA3 5µg/l, giữ nồng độ HCl là 3.75M, thể
tích etanol là 1ml, thay đổi thể tích nƣớc thêm vào với các mức 0, 0.5, 1, 1.5, 2ml.
Đo độ hấp thụ quang của dung dịch tại λ = 254nm với dung dịch so sánh là mẫu
trắng với nền mẫu chứa etanol tuyệt đối và HCl, đƣợc bảng kết quả 3.3.
Bảng 3.3: Độ hấp thụ quang của GA3 khi thay đổi thể tích nƣớc
Thể tích nƣớc (ml)
0
0,5
1,0
1,5
2,0
Độ hấp thụ quang trung bình
(Ā)
0,151
0,120
0,117
0,104
0,096

Để xác định ảnh hƣởng của thể tích nƣớc đến độ hấp thụ quang, chúng tôi
tiến hành so sánh sai khác các kết quả thí nghiệm khi thay đổi các mức thể tích
nƣớc bằng các so sánh phƣơng sai do sự thay đổi mức nghiên cứu gây nên với
phƣơng sai chung σ
2
của thí nghiệm xem chúng có khác nhau đáng tin cậy hay
không. Nếu sự khác nhau không đáng tin cậy thì có thẻ kết luận thể tích etanl sẽ ảnh