xác định gián tiếp cloxacillin bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o







PHÙNG THỊ PHƢƠNG




XÁC ĐỊNH GIÁN TIẾP CLOXACILLIN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ
(F-AAS)



Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60 44 29


TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Luận

HÀ NỘI - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o







PHÙNG THỊ PHƢƠNG




XÁC ĐỊNH GIÁN TIẾP CLOXACILLIN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ
(F-AAS)

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC













HÀ NỘI – 2011

1
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 5
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 7
1.1. Giới thiệu chung chất kháng sinh 7
1.1.1. Lịch sử ra đời 7
1.1.2. Phân loại 7
1.1.3. Đánh giá tác dụng 8
1.2. Giới thiệu Cloxacilin 8
1.2.1. Cấu tạo phân tử và tính chất 8
1.2.2. Đặc điểm và tác dụng 9
1.2.3. Điều chế chung 10
1.2.4. Giới hạn cho phép của Cloxacilin trong thực phẩm 11

1.2.5. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện
nay 11
1.3. Các phƣơng pháp phân tích Cloxacilin 14
1.3.1. Phương pháp quang học 14
1.3.2. Phương pháp điện hóa 15
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 16
1.3.4. Sắc ký bản mỏng (TLC) 18
1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 19
1.3.6. Phương pháp phân tích vi sinh (ELISA) 22
1.3.7. Phương pháp phân tích dòng chảy (FIA) 22
1.3.8. Phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử 23
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu 26

2
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu 26
2.1.2. Phương pháp áp dụng 26
2.1.3. Nội dung ngiên cứu 27
2.2. Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất 28
2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ 28
2.2.2. Hoá chất 28
CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30
3.1. Khảo sát điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa của Ag 30
3.1.1. Khảo sát chọn vạch phổ hấp thụ 30
3.1.2. Khảo sát khe đo 31
3.1.3. Khảo sát cường độ dòng đèn catot rỗng 32
3.1.4. Khảo sát thành phần hỗn hợp khí cháy 33
3.1.5. Khảo sát tốc độ dẫn mẫu 34
3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới phép đo phổ F – AAS của Ag. 35
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của các loại axit và nồng độ axit 35

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng thành phần nền của mẫu 36
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các cation 39
3.3. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá phép đo F – AAS của Ag 47
3.3.1 .Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính và xây dựng đường
chuẩn 47
3.3.2. Kiểm tra hằng số trong phương trình hồi quy 50
3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)51
3.3.4. Tính nồng độ chất phân tích dựa trên dường chuẩn 52
3.4. Đánh giá sai số và độ lặp lại của phƣơng pháp đo Ag 53
3.5. Tổng kết các điều kiện đo phổ F – AAS của Ag 55

3
3.6. Khảo sát các điều kiện phân huỷ Cloxacilin 55
3.6.1. Ảnh hưởng của môi trường KOH đến hiệu suất phân huỷ
Cloxacilin giải phóng clo. 56
3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất 57
3.6.3. Ảnh hưởng của thời gian phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất 58
3.6.4. Ảnh hưởng của thời gian đến kết tủa AgCl 59
3.7. Giới hạn phát hiện 60
3.8. Xác định Cloxacilin trong mẫu thực 61
3.8.1. Lấy mẫu 61
3.8.2. Xử lý mẫu 62
3.8.3. Chuẩn bị mẫu và phân tích mẫu 63
3.8.4. Xác định độ thu hồi 65
3.9. Kết quả phân tích một số mẫu thực 66
KẾT LUẬN 68

4
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AAS
Atomic absorption spectrometry
(Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử)
Abs
Ag

Absortion of Siliver
(Độ hấp thụ quang của Ag)
AMO
Amoxicillin
AMP
Ampicilin
A6AP
Acid 6-amino penicillanic
CE
Capillary electrophoresis (Điện di mao quản)
CLO
Cloxacillic
CZE

Capillary zone electrophoresis
(Điện di mao quản vùng)
F-AAS
Flame atomic absorption spectrometry
(Phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa)
HCL
Hollow cathde lamp
(Đèn catốt rỗng)
LOD
Limit of detection
(Giới hạn phát hiện)
LOQ
Limit of quantity
(Giới hạn xác định)
RSD
Relative standard deviation
(Độ lệch chuẩn tương đối)
OXA
Oxacillin
SS
Sum of square (tổng các bình phương)

5

MỞ ĐẦU
Từ lâu việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh bổ sung vào thức ăn gia súc
cho thấy chúng không những được dùng để chống nấm mốc mà còn có tác dụng
kích thích tăng trưởng, tăng cường hiệu quả sử dụng thức ăn, giảm tỉ lệ chết và
còi cọc, tăng khả năng sinh sản. Tuy nhiên, sử dụng thức ăn có bổ sung kháng
sinh trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm,

lượng kháng sinh tồn dư này có thể gây dị ứng, gây bệnh cho con người khi sử
dụng sản phẩm đó. Đồng thời bổ sung kháng sinh vào thức ăn gia súc sẽ gây hiện
tượng nhờn thuốc phát triển các loại vi khuẩn độc hại kháng thuốc.
Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của một số tác giả, kháng sinh được sử dụng
tràn lan trong thức ăn cho lợn, gia cầm và tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt
là phổ biến. Các nghiên cứu đều cho rằng hầu hết các cơ sở chăn nuôi đều sử
dụng kháng sinh không hợp lí (không xét nghiệm kháng sinh đồ, sử dụng theo
kinh nghệm không đúng liều lượng), một số cơ sở chăn nuôi không dùng thuốc
đúng quy định, bán chạy khi sử dụng thuốc không hiệu quả. Từ đó dẫn đến tồn
dư kháng sinh trong thực phẩm cao gấp hàng chục cho đến hàng nghìn lần so với
tiêu chuẩn quốc tế(CODEX).
Chính vì vậy, kháng sinh là một trong những đối tượng cần phải kiểm soát
dư lượng trong thực phẩm bởi những độc tính, những tác dụng phụ có thể gây ra
cho con người khi sử dụng thực phẩm có tồn dư lượng kháng sinh.
Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích mới để xác định dư lượng
kháng sinh trong thực phẩm là yêu cầu cần thiết.
Trên thế giới, phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) đã
được ứng dụng rất phổ biến. Phương pháp này có nhiều ưu điểm: độ nhạy và độ

6
chọn lọc cao, có thể xác định nhiều ion trong cùng một dung dịch, cho phép phân
tích nhanh hàng loạt với độ chính xác và lặp lại cao, các thao tác tiến hành đơn
giản và thuận tiện, có thể tự động hoá quá trình phân tích. Ở nước ta phương
pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử đã là một trong các phương pháp tiêu
chuẩn để phân tích lượng vết các kim loại trong nhiều đối tượng khác nhau như:
đất, nước, không khí, thực phẩm,…Ngày nay bằng cách gián tiếp người ta đã xác
định hàng trăm chất hữu cơ và các phi kim với độ nhạy, độ chính xác cao. Với
các kết quả đó chúng tôi nhận thấy phương pháp AAS là một phương pháp thích
hợp để xác định gián tiếp Cloxacilin trong thực phẩm.
Vì vậy trong bản luận văn này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm điều

kiện phù hợp để xây dựng quy trình xác định Cloxacilin trong thực phẩm. Từ kết
quả thực nghiệm xây dựng một quy trình xác định gián tiếp Cloxacilin bằng
phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS).

7
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung chất kháng sinh (1,2,26)
1.1.1. Lịch sử ra đời
Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của
nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau
đó là hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển
mạnh do tác dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc
kháng sinh khác.
Giới y học định nghĩa: Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá
sinh học, có tác dụng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ
thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh
tự nhiên.
1.1.2. Phân loại
Các chất kháng sinh được phân lọai dựa vào cấu tạo hoá học gồm các
nhóm sau:
- Kháng sinh
β
-lactam
- Kháng sinh Aminoglycosid
- Kháng sinh Tetracylin
- Cloramphenicol và dẫn xuất
- Kháng sinh Macrolid
- Kháng sinh Lincosamid
- Kháng sinh polypeptide
- Các kháng sinh khác: Rifamycin

8
1.1.3. Đánh giá tác dụng
Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho các sản phẩm kháng sinh
thiên nhiên, không nguyên chất.
Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho các chế phẩm
kháng sinh bán tổng hợp.
1.2. Giới thiệu Cloxacilin
Cloxacilin là một thành viên trong nhóm kháng sinh penicillin thuộc họ β-
lactamase
1.2.1. Cấu tạo phân tử và tính chất
a. Cấu tạo phân tử

N
O
S
COONH

N
O
H
H
CH
3
CH
3
COOH
Cl

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử cloxacillin

b. Tính chất vật lý
Thuốc ở dạng bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng, hơi có mùi, vị đắng
dễ hút ẩm. Dễ tan trong nước và methanol, tan trong etanol 96%, thực tế không
tan trong ethylacetat.
c. Tính chất hoá học
Tác dụng cản trở không gian đối với penicillinase là do nhân isoxazol
mang hai nhóm 5-methyl và 3-phenyl ở vị trí ortho đối với vị trí 4- nối với -CO
Do tác dụng hút điện tử của nhân isoxazol, kháng sinh này bền với axit và
hấp thụ tốt khi uống nên có thể dùng cả đường uống và đường tiêm.

9
Có hoạt phổ hẹp, chủ yếu trên vi khuẩn gram(+). Phổ IR được dùng phổ
biến để định tính phổ. Hấp thụ quang UV có cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân
phenyl.
Cloxacilin kém bền với ánh sáng. Vì vậy ta phải bảo quản chúng trong lọ
kín, tối tránh ánh sáng trực tiếp.
1.2.2. Đặc điểm và tác dụng
Cơ chế:
Cloxacilin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá
trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào
bị ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, Cloxacilin còn hoạt
hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết
quả là vi khuẩn bị tiêu diệt.
Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu
kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn.
Kháng thuốc:
Thuốc đã bị nhiều loại vi khuẩn kháng lại do nó được sử dụng rộng rãi
trong điều trị cũng như làm thức ăn bổ sung như: vi khuẩn đường ruột, nhiều
chủng tụ cầu, liên cầu, phế cầu.
Độc tính:

Kháng sinh Cloxacilin có độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc:
dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là
sốc phản vệ.
Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú.
Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc.

10
Ngoài ra Cloxacilin còn có tác dụng phụ là làm chuyển màu xỉn men răng,
giảm liên kết răng lợi, giòn xương và cản trở sự phát triển xương, răng ở trẻ em
trong thời kỳ phát trển (dưới 8 tuổi).
Chỉ định:
Dùng cho các nhiễm tụ cầu sinh penicillinase gây ra như các nhiễm khuẩn
đường niệu, đường hô hấp, ở các mô mềm, xương khớp, da
Thường dùng theo đường uống. Thức ăn có ảnh hưởng tới hấp thu. Tiêm
đối với trường hợp bệnh nặng, cấp tính. Có thể phối hợp với các kháng sinh khác
đặc biệt là ampicillin, để mở rộng phổ tác dụng.
Uống 0,25-0,50g/lần

4 lần/24 h. Nếu tiêm tương đương với liều uống.
Cloxacilin được dùng rất phổ biến.
1.2.3. Điều chế chung
Sinh tổng hợp:
Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc
Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp. Chiết xuất
dạng kết tinh và muối natri hoặc kali. Để cho hiệu suất cao thường gây đột biến
bằng mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn,
đồng thời thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng
cho quá trình sinh tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào
là acid phenylacetic. Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được
quá trình lên men. Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid

→ polypeptide. Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men.
Bán tổng hợp:
Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic
(A6AP).

11
Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, Khi đó môi trường dồi
dào A6AP, chiết lấy trực tiếp.
Tách phần phenylacetyl ( C
6
H
5
-CH
2
-CO-) khỏi phân tử penicillin G bằng
acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi
trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thu HCl giải phóng ra trong phản ứng
được penicillin khác.
Tổng hợp hoá học:
Chưa được ứng dụng rộng rãi.
1.2.4. Giới hạn cho phép của Cloxacilin trong thực phẩm
Theo công văn số: 571 QLCL-CL1 ngày 14/04/2011 [4] của Cục quản lí
chất lượng Nông lâm sản và Thuỷ sản cho phép mức dư lượng thuốc thú y tối đa
trong thực phẩm có nguồn gốc động vật để giết thịt bao gồm cả gia cầm và cá
nuôi ao, nuôi lồng như sau:
Bảng 1.1. Hàm lượng tối đa cho phép Cloxacilin trong thực phẩm [4]
Kháng sinh
Loại thực phẩm
mg/kg
Cloxacilin

Thịt
0,3
Mỡ
0,3
Gan
0,3
Thận
0,3
Sữa
0,03

1.2.5. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện
nay
Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các
cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với

12
các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi
(virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn
kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi
trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá
nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách.
Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275
triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R.
Gonzales [5,27], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp
trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không
cần và không điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến
enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus
kháng vancomycin. Theo báo cáo của A.W. McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ
pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm

2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc
tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.
Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với
phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế
giới trong vòng 24 giờ. D.P. Raymond [19] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người
bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng
kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến
10 tỉ đô-la.
Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [10],
năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh,
71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới
5 ngày).

13
Theo [10] qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện
Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có
không ít trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất,
dễ gây tử vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu,
thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám
đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh
đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng
sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy,
viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%,
Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết
và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%
Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng
kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo,
các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp
Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia
nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước

đang phát triển.
Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế hoạch toàn cầu để kiểm
soát sự đề kháng Kháng sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả
các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng
cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng
và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong
máu. Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành
của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc
giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất.

14
Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta
sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của thuốc kháng sinh,
hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.
1.3. Các phƣơng pháp phân tích Cloxacilin
1.3.1. Phương pháp quang học
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang
học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các
phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi
xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm. Tuy nhiên khả năng ứng dụng của
phương pháp này bị giới hạn vì trong dược phẩm thường chứa các tá dược có
khả năng hấp thụ ánh sáng tại vùng phổ phân tích, gây sự chen lấn phổ.
Các penicillin hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng
cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong
nhiều trường hợp, các penicillin được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để
phân tích.
Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các kháng sinh β-
lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản
ứng quang hóa của các β-lactam.
A. Fernández-González và cộng sự [15] dùng Cu

2+
thủy phân và tạo phức
với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện
thu được 4.10
-7
M (0,16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy
cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc
uống, huyết thanh…
Theo [21], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống
bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của

15
kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl
2
, KCl 2M. Kết quả tạo ra
phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l
và giới hạn phát hiện của AMO là 0,73 mg/l, AMP là 0,76 mg/l.
Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ
luminol-K
3
Fe(CN)
6
kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân
tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ
nhạy cao: PEN là 0,5 mg/l, cefradine 0,04 mg/l, cefadroxil là 0,08 mg/l, 0.1 mg/l
CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS,
nồng độ CEP trong mẫu là 0,1 mg/l.
Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp,
các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng
sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất

phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất
phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp
này.
1.3.2. Phương pháp điện hóa
Nguyên tắc của phương pháp này là đo thế cân bằng của các điện cực
nghiên cứu để xác định nồng độ chất cần phân tích hoặc theo dõi sự biến thiên
nồng độ chất trong phản ứng chuẩn độ của nó.
Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các kháng
sinh nhưng không phổ biến nhiều.
Theo [18], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích
AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong môi trường đệm axetat
0,1M pH=5,2.

16
C.M. Couto, J.L.F.C. Lima, M. Conceicao, B.S.M. Montenegro đã xác
định Chlortetracyclin bằng việc sử dụng phương pháp điện thế kết hợp với
phương pháp dòng chảy, dùng điện cực màng ống kép, màng là tinh thể đồng
nhất CuS/Ag
2
S. Khi đó Chlortetracyclin được xác định dựa vào việc tính độ
giảm nồng độ Cu(II) do tạo phức với Chlortetracyclin [6].
Saad.S.M.Hassan và M.H.Eldesouki đã xác định Chlortetracyclin trong
các chế phẩm dược có sử dụng điện cực chọn lọc ion cadmi. Phương pháp dựa
trên phản ứng khử nhóm nitro bằng cadmi kim loại, phản ứng xảy ra hoàn toàn
và định lượng trong môi trường axit HCl, ion cadmi giải phóng ra và được định
lượng bằng cách chuẩn độ với EDTA ở pH = 10. Hiệu suất thu hồi của phương
pháp là 99,3%, độ lệch chuẩn tương đối

0,5% [6].
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về
hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã
được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối
tượng mẫu khác nhau.
L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [25] sử dụng phương pháp điện
di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm
điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8,5. Tiến hành phân tích tại thế
điện di 10 kV, nhiệt độ 20
0
C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép
tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng
dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện
từ 0,14 đến 0,27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0,25 đến 0,86%,
diện tích pic 1,3 đến 4,15%. Độ thu hồi trên 96%.

17
Biyang Deng và cộng sự [16] đã sử dụng phương pháp điện di với detector
điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp
0,31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ
lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/
mẫu.
Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng
sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone
electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6,8.
Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát
hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,
cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim,
ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới
hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục
đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ

Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25
0
C, +4
0
C và -18
0
C). Kết
quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ
phòng sau khi pha loãng.
Theo [12], Chen và Gu đã tách đồng thời oxytetracylin, tetracylin,
chlortetracylin trong sữa, huyết thanh và nước tiểu bằng CE. Các mẫu được
deprotein bằng đệm succinat và các tetracylin ở dạng huyền phù được làm sạch
bằng cột sắc ký ái lực chelat kim loại. Các muối được giải hấp từ cột được loại
bỏ bằng trimetylsilan C18. Độ thu hồi của các kháng sinh tetracylin từ các mẫu
là 40

84%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) là 3,3

9,1%
M.I.Bailon-Perez và cộng sự [25] sử dụng phương pháp CZE và detector
UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol,

18
dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng
thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước
( nước sông, nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30;
0,30; 0,9; 0,08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối
thấp hơn 10%.
Phương pháp MEKC cũng được M.I. Bail´on P´erez, L. Cuadros Rodr´
ıguez, C. Cruces-Blanco [25] xác định 9 loại kháng sinh gồm CLO, dicloxacillin,

OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược
phẩm. Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH =
8,5 làm chất nền điện di và thế điện di 25 kV. Giới hạn phát hiện LOD 0,35 đến
1,42 mg/l, giới hạn định lượng 2,73 đến 5,74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời
gian lưu từ 1,5 đến 1,7%. Độ thu hồi từ 91 – 95,6%.
1.3.4. Sắc ký bản mỏng (TLC)
Sắc ký bản mỏng là khái niệm đưa ra phương pháp sử dụng lớp mỏng pha
tĩnh phủ trên một bản mỏng thuỷ tinh hay nhựa plastic. Pha động là các dung
môi khác nhau có thể là phân cực hoặc không phân cực hoặc dung dịch đệm.
Sau khi phủ lớp pha tĩnh lên bản mỏng, nạp chất phân tích vào một phía
sau của bản mỏng rồi cho bản mỏng tiếp xúc với pha động ở phía mẫu (nên thực
hiện trong hệ kín, không khí bão hoà pha động). Sau một thời gian nhất định, lấy
bản mỏng ra cho hiện chất phân tích. Tiến hành định tính và định lượng chất
phân tích.
Trong sắc ký bản mỏng pha tĩnh rất đa dạng: chất hấp phụ, trao đổi ion,
chất rây phân tử. Do vậy sắc ký bản mỏng cũng có đầy đủ bốn cơ chế tách là hấp
phụ, trao đổi ion, phân bố hoặc rây phân tử tuỳ thuộc vào pha tĩnh sử dụng.[6,12]

19
Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để
kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích tỏ ra tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu
cùng một lúc song song rất tiện lợi. Khi TLC được trang bị phần phát hiện là
một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng. Phương pháp này
được sử dụng để phân tích các đối tượng khác nhau như: phân tích các cation
kim loại nặng, phân tích glucoza, tách các amin…trong công nghiệp, lâm sàng,
dược phẩm.
1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô
cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác
nhau, nhất là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu,

hoá học hợp chất thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân
tích lượng vết các chất.
Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh
β
-lactam bằng phương
pháp HPLC
Theo [28], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích
penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện
chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2

(4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN –
(C
2
H
5
)
3
N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong
sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg.
J.M. Cha và cộng sự [26] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-
lactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C
18
(2,1 mm×50 mm, 2,5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol
(MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8
phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25 ml/phút;

20
nhiệt độ cột 45
0
C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin,

CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước
bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử
lý.
Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh
quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [16] C.Y.W Yang
và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích
AMO trong sữa bò (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5,6 – 24/76;
detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5
μg/kg và 0,3 μg/kg. Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ
chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [18, 15] nên chỉ áp dụng với số ít
chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều
kháng sinh cùng lúc được.
Tác giả Chu Đình Bính trong luận văn thạc sĩ của mình đã ứng dụng kĩ
thuật HPLC để tách và xác định đồng thời Chloramphenicol, Dexamethason
acetate và Hydrocortison acetate trong mẫu dược phẩm. Cột tách sử dụng chất
nhồi cột là pha đảo Hypersil C18, 5

m pha động là MeOH/H
2
O/ACN: 33/47/20.
Các chất phát hiện tại bước sóng 248nm. Kết quả thu được có độ lặp lại, độ
chính xác, độ thu hồi tốt, và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tá dược trong
mẫu [3].
Trong [23, 24], Boison J.O. và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2
(250mm*4,6mm, 5nm)’; pha động: CAN –Na
2
S
2
O
3

15,7mM trong đệm photphat
0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng
thời AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-
5

g/kg.

21
Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ
dẫn… để phân tích các β-lactam.
Trong [17], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO,
OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt hiệu suất thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91%.
Còn trong [28], WJ Blanchflower và cộng sự dùng diclometan và hexan để tách
penịillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, hiệu suất
đạt 89-117%.
Khi tách và làm giàu các

-lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật SPE
thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C
18
) và trao đổi
ion dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ.
K. Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C
18
và dung môi
rửa giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt
hiệu suất thu hồi 83-89%.
Còn trong [22] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàu
AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt hiệu
suất thu hồi 77,1-95,9%.

Trong [20] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để tách
AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong
nước thải cho hiệu suất thu hồi 76-100%.
Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp
như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương
pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với
nền mẫu và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ. Do đó việc kết hợp phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu

22
đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích

-lactam do có độ nhạy, độ chính xác và
độ lặp lại cao.
1.3.6. Phương pháp phân tích vi sinh (ELISA)
Phương pháp này dựa vào khả năng phản ứng của chất phân tích trong
điều kiện phản ứng xảy ra được xúc tác bằng các loại enzyme đặc hiệu trong một
môi trường nuôi cấy thích hợp. Phản ứng thường tạo thành các hợp chất màu hay
các hợp chất có khả năng phát huỳnh quang.
Phương pháp này có ưu điểm là phân tích nhanh, độ nhạy cao nhưng độ
chính xác và độ lập không cao do bản thân phương pháp bị ảnh hưởng của các
điều kiện môi trường tiến hành phản ứng và các phản ứng cạnh tranh, độ chọn
lọc cũng kém.
D. S. Aga, R. Goldfish và P. Kuksrestha đã sử dụng phương pháp để xác
định Chlortetracyclin trong phân súc vật, theo dõi sự thay đổi của kháng sinh
trong đất được bón loại phân này. Kháng sinh được đo độ hấp thụ ở bước sóng
450 nm. Giới hạn phát hiện là 0,5ppm và khoảng xác định là 0,5ppm đến
200ppm [6].
1.3.7. Phương pháp phân tích dòng chảy (FIA)
Dựa trên kĩ thuật bơm trực tiếp một thể tích mẫu xác định dung dịch mẫu

phân tích vào một dòng chất mang có thành phần thích hợp (thường chứa thuốc
thử phân tích), chảy liên tục với tốc độ không đổi. Chất phân tích trong dung
dịch mẫu tạo với thuốc thử trong dòng chất mang một vùng nhỏ chứa sản phẩm
tạo ra, có thể phát hiện theo một tính chất hoá lí nhất định, phù hợp nhất và được
dòng chất mang đưa đến bình dòng chảy của detector. Detector đo tín hiệu và
được máy ghi dưới dạng pic. Nếu trong điều kiện thuận lợi thích hợp thì chiều

23
cao hoặc diện tích pic tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích. Quá trình này
thường được thực hiện một cách tự động với tốc độ phân tích nhanh.
Kĩ thuật FIA được phát triển và sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
kiểm tra sản xuất và kiểm tra môi trường bởi các tính ưu việt của nó như: Kĩ
thuật phân tích nhanh, có độ nhạy, độ lập lại và độ chính xác tương đối cao, tốc
độ phân tích mẫu lớn 40 – 200 mẫu/giờ. Lượng mẫu tiêu hao ít, thích hợp cho
phân tích hàng loạt mẫu cùng đối tượng.
Tác giả Thiraporn Caaroenraks, Sanit Palaham, Kate Grudpan, Weena
Siangproh và Orawon Chailapakul đã xác định Chlotetracyclin trong thuốc với kĩ
thuật FIA. Hàm lượng Chlotetracyclin tìm được là 33,76
μA/mM
[6]

1.3.8. Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử
Khi ta chiếu đám hơi nguyên tử tự do một chùm sáng đơn sắc có năng
lượng phù hợp, có bước sóng trùng với vạch phổ phát xạ đặc trưng của nguyên
tố cần phân tích, chúng sẽ hấp thụ tia sáng đó và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử.
Cơ sở phân tích định lượng theo AAS là dựa vào mối quan hệ giữa cường
độ vạch phổ hấp thụ với nồng độ nguyên tố cần phân tích theo phương trình:
A
k
= k.

b
C
( 0< b

1)
Trong đó:
A
k
: cường độ vạch phổ
k: hệ số thực nghiệm
C: nồng độ nguyên tố
b: hằng số bản chất